363 elfo magyar)¡ció_elektro… · (microsoft powerpoint - szediment\341ci\363_elfo_magyar)...
Post on 01-Jun-2021
2 Views
Preview:
TRANSCRIPT
3/11/2015
1
PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEMÁLTALÁNOS ORVOSTUDOMÁNYI KAR
www.aok.pte.hu
SZÉTVÁLASZTÁSI MÓDSZEREK:
BIOFIZIKA 2.2015. március 10.Dr. Bugyi BeátaBiofizikai Intézet
� SZEDIMENTÁCIÓ� ELEKTROFORÉZIS
Alkalmazásokhematológia - vér frakcionálása
1000 g, 5- 10 min
vérplazma (55 %)
fehérvérsejtekvérlemezke (< 1%)
vörösvérsejt (45 %)
Példa: teljes vérkép
Alkalmazásokvérszérum elektroforézise
Forrás: http://bestpractice.bmj.com/best-practice/monograph/179/diagnosis/step-by-step.html
Példa: egészséges (A, C) és mielóma multiplex (plazmasejtes mielóma, Kahler betegség, plazmasejt rák)-ben szenvedő páciens (B, D) elektroforetogrammja Biofizikai aspektus
� RÉSZECSKÉK MOZGÁSA ERÕTEREKBENRÉSZECSKÉK MOZGÁSA ERÕTEREKBENRÉSZECSKÉK MOZGÁSA ERÕTEREKBENRÉSZECSKÉK MOZGÁSA ERÕTEREKBEN
� SZEDIMENTÁCIÓ
részecskék mozgása centrifugális erõtérben
� ELEKTROFORÉZIS
részecskék mozgása elektromos erõtérben
Szedimentáció, elektroforézis
3/11/2015
2
Folyamatábra
� vizsgált objektum: részecske szuszpenzió (vér-, vizelet, csontvelõminta, sejt, sejtalkotók, fehérjék, nuklein savak…)
� mûszer: laboratóriumi centrifuga/elektroforéziskészülék
� mért mennyiségek: optikai jel (abszorpció, fényszórás, fluoreszcencia emisszió)
� információ/eredmény: fizikai, kémiai, biológiai jellemzõk (méret, molekulatömeg, alak, sûrûség, izoelektromos pont, nukleotid szekvencia)
� SZEDIMENTÁCIÓSZEDIMENTÁCIÓSZEDIMENTÁCIÓSZEDIMENTÁCIÓ� részecskék mozgása centrifugális erõtérben
� ANALITIKAI ULTRACENTRIFUGÁLÁSANALITIKAI ULTRACENTRIFUGÁLÁSANALITIKAI ULTRACENTRIFUGÁLÁSANALITIKAI ULTRACENTRIFUGÁLÁS• részecskék tömegének és méretének meghatározása
� SZEDIMENTÁCIÓS SEBESSÉGI MÓDSZER� SZEDIMENTÁCIÓS EGYENSÚLYI MÓDSZER
� PREPARATÍV ULTRACENTRIFUGÁLÁSPREPARATÍV ULTRACENTRIFUGÁLÁSPREPARATÍV ULTRACENTRIFUGÁLÁSPREPARATÍV ULTRACENTRIFUGÁLÁS• részecskék elválasztása
� DIFFERENCIÁLCENTRIFUGÁLÁS» méret és molekulatömeg alapján
� GRADIENS CENTRIFUGÁLÁS» sûrûség alapján
Szedimentáció
��ú��ó�á� ���� ��ó��ő
����é��é�
� ���1 �
����
�
���� ��ó � !"� � #"$�
��ú��ó�á� � %
����é��é� � !� � #$�
A TEST „RÉSZECSKE” ÜLEPEDÉSI (SZEDIMENTÁCIÓS) SEBESSÉGE
tömeg
alak
sűrűség
gyorsulásgravitációs
erőtér
�
Részecskék mozgása a Föld gravitációs erõterében
& �'(
��
'(
6*+,
! � ����é��é� - ��ú��ó�á� - ���� ��ó
� 9.81�
12
��: sűrűségközeg < �:sűrűségrészecske
Részecskék mozgása a Föld gravitációs erõterében� Becsüljük meg, hogy a fenti körülmények között mennyi ideig
tart, míg egy fehérje a Föld gravitációs terében 1 cm-tülepszik?
A) néhány nap
B) hónapok
C) több száz évC) több száz évC) több száz évC) több száz év 4 �1
�~107�1~300é�
� ��
� �1 �
��
��
nem a részecskére jellemző, hanem az erőtérre
� HOGYAN?GYORSÍTHATÓ A RÉSZECSKE ÜLEPEDÉSE?TÉRERŐ > DIFFÚZIÓ
� MIÉRT?GRAVITÁCIÓS TÉRERŐ < DIFFÚZIÓ!
�~1092:' , &~10977;<
=,
' � 1.38 ∗ 1092?@
A, ( � 273D,
� 9.81;
=<, 1 � 1092�
3/11/2015
3
Mûszer – laboratóriumi centrifuga Egy kis kitekintés
20 G centrifuga (NASA Ames Research Center, Kalifornia)
��ú��ó�á�
���� ��ó��ő�E����F�á��
��: sűrűségközeg < �:sűrűségrészecske
���� ��ó � !"�GH � #"$�G
H
��ú��ó�á� � %
�E����F�� � !�GH � #$�GH
A RÉSZECSKE ÜLEPEDÉSI (SZEDIMENTÁCIÓS) SEBESSÉGE
�
forgástengely
I � 2π�
körfrekvencia
Részecskék mozgása a centrifuga erõterében helyett KI2
� ���1 �
����
�KI2
tömeg
alak
sűrűséggyorsulás
centrifugális erőtér
forgó mozgás
A részecske sebessége a forgástengelyhez közeledvecsökken.
& �'(
�~
'(
6*+,
! � �E����F�á�� - ��ú��ó�á� - ���� ��ó
Részecskék mozgása a centrifuga erõterében helyett KI2
LMNO �LPNQRMSTUVáOS=�KI
2�
�0.011KW2
K � 10X�
RELATÍV GYORSULÁS
GRAVITÁCIÓS GYORSULÁS: g = 10 m/s2
sebesség változás: 36 km/h másodpercenkéntAz emberek átlagosan 3-5*g-t tolerálnak.
MAGAS FORDULATSZÁMN ~ 100.000 rpm (100x)
��� � Y.Y"". """*g (10.000x!! = 1002)
visszatérve a fehérjére
4 �1
�~10Z1~3óKL
ALACSONY FORDULATSZÁMN ~ 1000 rpm ��� � YY"*g
visszatérve a fehérjére
4 �1
�~10[1~3é�
3/11/2015
4
�\]^_^4á1 �1`]`11é
`Kő4éK
SZEDIMENTÁCIÓS MOBILITÁS (S: Svedberg, Theodore Svedberg)
a ��
KI2�
��1 �b�b�
�
Svedberg:� a részecskék ülepedését jellemző fizikai mennyiség� szedimentációs sebesség egységnyi erőre� [Svedberg] = 1S = 10-13s (SI egység)
Szedimentációs mobilitás
& �'(
�~
'(
6*+,
Szedimentációs mobilitás
részecskeszedimentációs mobilitás
(S, 10-13 s, 20oC)molekulatömeg
(Dalton)
O2 0.12 32
glükóz 0.18 180
inzulin monomer 1.5 6000
ribonukleáz 1.75 13.683
lizozim 2.03 17.200
inzulin 1.84 24.430
szérum albumin 4.3 68.460
kataláz 10.7 250.000
dohánymozaik vírus 175 31.340.000
a � 175a � 175 ∗ 1097?s
KI2 � 10e�
12% � aKI2 � 175 ∗ 1097?s ∗ 10e
�
12�
� Yf.g ∗ Y"9h!
��ij
k�
Analitikai ultracentrifugálásszedimentációs sebességi módszer
forgástengelytől mért távolság (r)
a részecskék koncentrációjának időbeli eloszlása a forgástengely mentén: X�K, 4�
tömeg
Boltzmann állandóhőmérséklet
X�K, 4� →a
&~��1 �
b�b�
'(
diffúziós együttható(mérni kell!)
ülepedésülepedésülepedésülepedésnX
n4� &
n2X
nK2-1
K
nX
nK� aI2oK
nX
nK- 2Xp
időidőidőidő
E��, ��
A tömeg meghatározása diffúziós mérésekkel!
~ centrifugálás sebességekoncentráció (c)
~abszorpció~ fluoreszcencia
N magas
Analitikai ultracentrifugálásszedimentációs egyensúlyi módszer
forgástengelytől mért távolság (r)
a részecskék egyensúlyi koncentráció eloszlása a forgástengely mentén (Boltzmann eloszlás): X�K�
X�K�~��1 �
b�b�I2
'(
tömeg
Boltzmann állandóhőmérséklet
~ centrifugálás sebessége
X�K� � X�`qr��1 �
b�b�I2
'(�K2 � K�
2
2�
koncentráció~abszorpció~ fluoreszcencia
diffúziódiffúziódiffúziódiffúzió ülepedésülepedésülepedésülepedés ülepedési sebesség = 0egyensúly a diffúzió és az ülepedés között
E���
A tömeg meghatározása!
N alacsony
3/11/2015
5
szövet homogenizátum
sejt, sejtmag, citoszkeleton, membrán
mitokondrium, lizozómák, perixóma
mikroszóma (ER, kis vezikulák)
riboszómák, makromolekulák
Preparatív ultracentrifugálásdifferenciálcentrifugálás
SZÖVETALKOTÓK SZÉTVÁLASZTÁSA ÜLEPEDÉSI SAJÁTSÁGAIK ALAPJÁN
� ���Y �
#"#�
�KI2
# � #" → % � "
SŰRŰSÉG GRADIENS
minta
Preparatív ultracentrifugálásgradiens centrifugálás
ALKOTÓK SZÉTVÁLASZTÁSA SŰRŰSÉGÜK ALAPJÁN
� ELEKTROFORÉZISELEKTROFORÉZISELEKTROFORÉZISELEKTROFORÉZIS� részecskék mozgása elektromos erõtérben
� SZABAD ELEKTROFORÉZISSZABAD ELEKTROFORÉZISSZABAD ELEKTROFORÉZISSZABAD ELEKTROFORÉZIS� GÉLELEKTROFORÉZISGÉLELEKTROFORÉZISGÉLELEKTROFORÉZISGÉLELEKTROFORÉZIS
• POLIAKRILAMID GÉLELEKTROFORÉZIS POLIAKRILAMID GÉLELEKTROFORÉZIS POLIAKRILAMID GÉLELEKTROFORÉZIS POLIAKRILAMID GÉLELEKTROFORÉZIS –––– fehérjék fehérjék fehérjék fehérjék � NATÍV GÉLELEKTROFORÉZIS
» részecskék szétválasztása méret, alak és töltés alapján
� DENATURÁLÓ GÉLELEKTROFORÉZIS» részecskék szétválasztása méret alapján
� IZOELEKTROMOS FÓKUSZÁLÁS» részecskék szétválasztása izoelektromos pont alapján
� 2D ELEKTROFORÉZIS» részecskék szétválasztása méret és izoelektromos pont alapján
• AGARÓZ GÉLELEKTROFORÉZIS AGARÓZ GÉLELEKTROFORÉZIS AGARÓZ GÉLELEKTROFORÉZIS AGARÓZ GÉLELEKTROFORÉZIS –––– nukleinnukleinnukleinnuklein savaksavaksavaksavak» részecskék szétválasztása méret alapján
Elektroforézis Mûszer – elektroforézis készülék
3/11/2015
6
��ú��ó�á� � %
�stF�t!u � vw � x�w
Pozitív Pozitív Pozitív Pozitív elektróda
Negatív Negatív Negatív Negatív elektróda
negatív részecskékanionok
pozitív részecskékkationok
po
ten
ciál
külö
nbsé
g
��ú��ó�á�
�stF�t!u
A RÉSZECSKE ELEKTROFORETIKUS SEBESSÉGE
töltés
Részecskék mozgása elektromos erõtérben
� �y`
�z
alak
elektromos térerősség
! � �stF�t!u - ��ú��ó�á�
Elektroforetikus mobilitás
u:� a részecske elektroforetikus mobilitását jellemzi� a részecske elektroforetikus sebesség egységnyi erőre � [u] = m2*V-1*s-1
�\]^_^4á1 �1`]`11é
4éK`Kő
ELEKTROFORETIKUS MOBILITÁS
F �%
w�x�
Gélelektroforézismátrix, gél
� poliakrilamid (PAGE: polyacrylamide gel electrophoresis), agarózalapú térhálós polimer� térháló pórusméret� makromolekulák méret szerinti szétválasztása
akrilamidkoncentráció
(%)
lineáris szétválasztási
tartomány(kDa)
agarózkoncentráció
(%)
DNS méret (bázispár)
5 57-212 0.2 5000-40000
7.5 36-94 0.4 5000-30000
10 16-68 0.6 3000-10000
15 12-43 0.8 1000-7000
1 500-5000
2 200-1500
3 100-1000
koncentráció ↑pórusméret ↓
mérebartomány↓
Natív és denaturáló gélelektroforézis
NATÍV DENATURÁLÓ (SDSPAGE)
REDUKÁLÓ ÉS DENATURÁLÓ KÖRNYEZETREDUKÁLÓ ÉS DENATURÁLÓ KÖRNYEZETREDUKÁLÓ ÉS DENATURÁLÓ KÖRNYEZETREDUKÁLÓ ÉS DENATURÁLÓ KÖRNYEZET
� SDS (nátrium dodecil szulfát, anionos detergens)� negatív töltésnegatív töltésnegatív töltésnegatív töltés
� β−MEA (β-merkaptoethanol) � diszulfid hidak felbomlása
� hőkezelés �denaturációdenaturációdenaturációdenaturáció
szétválasztás:szétválasztás:szétválasztás:szétválasztás:MÉRET SZERINTMÉRET SZERINTMÉRET SZERINTMÉRET SZERINTfüggetlen a részecske natív töltésétőlfüggetlen a részecske natív alakjától
NEM REDUKÁLÓ ÉS NEM DENATURÁLÓ NEM REDUKÁLÓ ÉS NEM DENATURÁLÓ NEM REDUKÁLÓ ÉS NEM DENATURÁLÓ NEM REDUKÁLÓ ÉS NEM DENATURÁLÓ KÖRNYEZETKÖRNYEZETKÖRNYEZETKÖRNYEZET
� natív állapotú fehérje
szétválasztás:szétválasztás:szétválasztás:szétválasztás:MÉRET MÉRET MÉRET MÉRET SZERINTSZERINTSZERINTSZERINTALAK SZERINTALAK SZERINTALAK SZERINTALAK SZERINTTÖLTÉS SZERINTTÖLTÉS SZERINTTÖLTÉS SZERINTTÖLTÉS SZERINT
3/11/2015
7
Izoelektromos fókuszálás
KEZDETBEN: inhomogén eloszlás
pH gradienspH gradienspH gradienspH gradiens
pH gradienspH gradienspH gradienspH gradiens
EREDMÉNY: izoelektromos pont szerinti eloszlás
pozitív töltésűnegatív töltésű
szétválasztás:szétválasztás:szétválasztás:szétválasztás:IZOELEKTROMOS PONT SZERINTIZOELEKTROMOS PONT SZERINTIZOELEKTROMOS PONT SZERINTIZOELEKTROMOS PONT SZERINT
2D elektroforézis
1D: pH gradiensizoelektromos fókuszálás
1D: SDSPAGEméret szerinti szétválasztás
2D elektroforézis
Egér agyából származó minta 2D elektroforézise, forrás: www.bio-rad.com
izoelektromos pont
méret
Gélek színezése
Coomassie bluefehérje
ezüst festésfehérje
fluoreszcensfestés
fehérje
ethidiumbromide
DNS/RNS méret (bázispár)
érzékenység 5 - 25 ng 0.25 - 1 ng 0.25 – 8 ng 0.5 - 5.0 ng
mechanizmus
Coomassie bluekötődése a bázikus
és hidrofób aminosavakhoz
ezüst ionok kötődnek a karboxilsav,
imidazol, szulfhidril, amino csoportokhoz
DNS interkalátor
megjelenésabszorpció
kékabszorpciósötétbarna
fluoreszcenciaemisszió
fluoreszcenciaemisszió
3/11/2015
8
Alkalmazásokkvantitaív és kvalitatív elemzés
kvalitatív elemzés:� MÉRET (MOLEKULATÖMEG, BÁZISPÁR)
MEGHATÁROZÁS� MENNYISÉG MEGHATÁROZÁS� IZOELEKTROMOS PONT MEGHATÁROZÁS
kvantitatív elemzés, szétválasztás:� MÉRET SZERINT (MOLEKULATÖMEG,
BÁZISPÁR)� TÖLTÉS SZERINT� ALAK SZERINT� IZOELEKTROMOS PONT SZERINT
Alkalmazásokkvalitatív elemzés – molekulatömeg meghatározás
http://www.biochem.arizona.edu/classes/bioc462/462a/NOTES/Protein_Properties/protein_purification.htm
1. ismeret molekulatömegű fehérjék (standard)2. ismeretlen molekulatömegű fehérje
Alkalmazásokvérszérum elektroforézise
protein normál érték
Albumin Albumin Albumin Albumin 55.8 55.8 55.8 55.8 ---- 65% 65% 65% 65%
α1 α1 α1 α1 globulinglobulinglobulinglobulin 2.2 2.2 2.2 2.2 ---- 4.6 % 4.6 % 4.6 % 4.6 %
α2 α2 α2 α2 globulinglobulinglobulinglobulin 8.2 8.2 8.2 8.2 ---- 12.5 % 12.5 % 12.5 % 12.5 %
β(1+2) β(1+2) β(1+2) β(1+2) globulinglobulinglobulinglobulin 7.2 7.2 7.2 7.2 ---- 14.2 % 14.2 % 14.2 % 14.2 %
γ γ γ γ globulinglobulinglobulinglobulin 11.5 11.5 11.5 11.5 ---- 18.8 % 18.8 % 18.8 % 18.8 %
mennyiség
elektroforetikusmobilitás
ELEKTROFORETOGRAMM
www.aok.pte.hu
Szedimentáció, elektroforéziskulcsfogalmak� Részecskék mozgása erõterekben (centrifugális, elektromos)Részecskék mozgása erõterekben (centrifugális, elektromos)Részecskék mozgása erõterekben (centrifugális, elektromos)Részecskék mozgása erõterekben (centrifugális, elektromos)
� Analitikai és Analitikai és Analitikai és Analitikai és preparatívpreparatívpreparatívpreparatív ultracentrifugálási módszerekultracentrifugálási módszerekultracentrifugálási módszerekultracentrifugálási módszerek
� SzabadSzabadSzabadSzabad----, és , és , és , és gélgélgélgél----elektroforéziselektroforéziselektroforéziselektroforézis
� Natív, denaturáló Natív, denaturáló Natív, denaturáló Natív, denaturáló gélelektroforézisgélelektroforézisgélelektroforézisgélelektroforézis, izoelektromos fókuszálás, 2D , izoelektromos fókuszálás, 2D , izoelektromos fókuszálás, 2D , izoelektromos fókuszálás, 2D gélektroforézisgélektroforézisgélektroforézisgélektroforézis
� Minõségi és mennyiségi elemzésMinõségi és mennyiségi elemzésMinõségi és mennyiségi elemzésMinõségi és mennyiségi elemzés
Korábban ismertetett fogalmak:
� hidrosztatika - felhajtóerõ, abszorpció, fluoreszcencia, fényszórás
top related