实验二

实验内容实验内容1.1. 观察上次实验结果观察上次实验结果2.2. EE 花环形成试验（花环形成试验（ EACEAC ））3.3. 免疫荧光（示教）免疫荧光（示教）

实验二实验二

试管法　试管法　实验结果及判定实验结果及判定

不要摇动试管，先观察管底有无凝集物。对照管不要摇动试管，先观察管底有无凝集物。对照管(( 第第 88 号管号管 )) ，液体浑浊，管底有细菌沉淀物，，液体浑浊，管底有细菌沉淀物，形成边缘整齐、光滑的小圆块，轻轻摇动试管，形成边缘整齐、光滑的小圆块，轻轻摇动试管，圆块便分散成均匀浑浊的悬液。圆块便分散成均匀浑浊的悬液。

从第从第 ll 号至第号至第 77 号管依次观察。Ｏ菌液阳性管可号管依次观察。Ｏ菌液阳性管可见管底边缘不整齐的凝集物，如轻微振摇试管颗见管底边缘不整齐的凝集物，如轻微振摇试管颗粒状凝块可悬浮起来，不易摇碎。粒状凝块可悬浮起来，不易摇碎。 (H(H 菌液，则菌液，则为絮状沉淀物，轻摇易碎为絮状沉淀物，轻摇易碎 )) 。阴性管则与对照管。阴性管则与对照管(( 第第 88 管管 )) 相同。相同。

　　　结果记录方法；　　　结果记录方法； ++++++++ ：完全凝集，细菌全部凝集，凝集块完全沉：完全凝集，细菌全部凝集，凝集块完全沉

于管底，液体澄清。于管底，液体澄清。 ++++++ ：绝大部分细菌凝集，凝集块沉于管底，液：绝大部分细菌凝集，凝集块沉于管底，液

体稍浑浊。体稍浑浊。 ++++ ：细菌部分凝集，管底凝集物较前者少，但仍：细菌部分凝集，管底凝集物较前者少，但仍

明显，液体半澄清。明显，液体半澄清。 ++ ：凝集物极少，需仔细观察才能发现，液体浑浊。：凝集物极少，需仔细观察才能发现，液体浑浊。 一：无凝集，液体的浑浊度与阴性对照管相同。一：无凝集，液体的浑浊度与阴性对照管相同。 取取 ++++ 的的最高稀释度最高稀释度为该免疫血清的凝集效价。为该免疫血清的凝集效价。

双向琼脂扩散试验实验结果及判定实验结果及判定 在两孔之间出现一清晰致密白色沉淀线与在两孔之间出现一清晰致密白色沉淀线与

已知阳性对照的沉淀线发生融合者为阳性已知阳性对照的沉淀线发生融合者为阳性反应。若反应。若 7272 小时后仍未出现沉淀线则为阴小时后仍未出现沉淀线则为阴性反应。如图。性反应。如图。

加入定量的抗体在中间孔，按一定距离在四周打数个小孔，分别加入不同稀释度的抗原可见粗细不等的沉淀线，从而可判定抗原的效价。

定性实验 常用于检测两种抗原的相关性

三孔型双向免疫扩散三孔型双向免疫扩散可能的结果可能的结果

三孔型双向免疫扩散三孔型双向免疫扩散可能的结果可能的结果

EE 花环形成试验（花环形成试验（ EACEAC ）） 实验目的实验目的 11 ．掌握．掌握 EE 花环形成实验的原理及操作方花环形成实验的原理及操作方

法。法。 22 ．了解．了解 EE 花环形成实验的临床意义。花环形成实验的临床意义。

实验原理实验原理 EE 花环形成试验是根据人的花环形成试验是根据人的 TT 细胞表面有细胞表面有

绵羊红细胞受体－－绵羊红细胞受体－－ EE 受体受体 (E(E 即红细胞即红细胞rythrocyte)rythrocyte) ，在一定条件下能与绵羊红细，在一定条件下能与绵羊红细胞胞 (SRBC)(SRBC) 结合，绵羊红细胞吸附于结合，绵羊红细胞吸附于 TT 细细胞周围，形如玫瑰花环胞周围，形如玫瑰花环 ,, 因而得名。因而得名。

此试验既能计数此试验既能计数 TT 细胞，又能反映细胞，又能反映 TT 淋巴淋巴细胞活性细胞活性 ,, 从而可以判定机体细胞免疫水平。从而可以判定机体细胞免疫水平。

实验材料实验材料 11 ．试管．试管 (( 含肝素含肝素 )) 。。 22 ．淋巴细胞分层液。．淋巴细胞分层液。 33 ． ． Hank'sHank's 液。液。 44 ．． 11 ％压积％压积 SRBCSRBC 。。 55 ．小牛血清．小牛血清 (56(56℃℃3030 分钟灭活并经分钟灭活并经 SRBCSRBC

吸收吸收 )) 。。 66 ．无菌试管，注射器。．无菌试管，注射器。 77 ．． Wright—GiemsaWright—Giemsa 染液。染液。 88 ．离心管、吸管、毛细管、载物玻片、盖玻．离心管、吸管、毛细管、载物玻片、盖玻

片、离心机、显微镜等。片、离心机、显微镜等。

实验方法实验方法 11 ．无菌采集静脉血．无菌采集静脉血 lmllml 注入盛有肝素的试管中。立即注入盛有肝素的试管中。立即

摇匀使血液抗凝。摇匀使血液抗凝。22 ．将肝素抗凝血沿管壁徐徐加入已装有．将肝素抗凝血沿管壁徐徐加入已装有 2ml2ml 淋巴细胞淋巴细胞

分层液的试管中，使稀释血液重叠分层液的试管中，使稀释血液重叠于分层液之上，保持界面清晰于分层液之上，保持界面清晰（勿使两液相混 ）。（勿使两液相混 ）。33 ．离心：．离心： 2000r2000r ／／ minmin 离心离心 2020 分钟。分钟。44 ．洗涤：用毛细管轻轻吸出淋巴．洗涤：用毛细管轻轻吸出淋巴细胞层（位于分层液及血浆交界处细胞层（位于分层液及血浆交界处的灰白层）到另一试管中，加的灰白层）到另一试管中，加 55 倍倍体积的体积的 HanksHanks 液洗涤，液洗涤， 2500r2500r ／／ minmin离心离心 55 分钟，共分钟，共 33 次。次。

5 5 ．活化：去掉上清，留取管底沉淀．活化：去掉上清，留取管底沉淀 (( 即即PBMC)0.2PBMC)0.2 ～～ 0.3ml0.3ml混匀后，吸取混匀后，吸取 0.1ml0.1ml 注入已注入已放有放有 0.1ml0.1ml 小牛血清的小试管内，置小牛血清的小试管内，置 3737℃℃ 水浴五水浴五分钟分钟 (( 小牛血清可提高小牛血清可提高 EE 花环形成率花环形成率 ,,且使反应稳且使反应稳定定 )) 。。

66 ．结合：取．结合：取 11 ％ ％ SRBCSRBC 0.1ml0.1ml加入上述小试管加入上述小试管内，轻轻摇匀，再以内，轻轻摇匀，再以 1000r1000r ／／ minmin 离心一分钟，离心一分钟，然后放然后放 4℃4℃冰箱二小时。冰箱二小时。

7.7.涂片：弃掉少量上清，取沉淀细胞涂片，自然干涂片：弃掉少量上清，取沉淀细胞涂片，自然干燥。燥。

8.8. 染色：用染色：用Wright—GiemsaWright—Giemsa 染液覆盖涂膜，滴染液覆盖涂膜，滴加等量的蒸馏水，轻轻晃动混合。经加等量的蒸馏水，轻轻晃动混合。经 55 分钟后，用分钟后，用蒸馏水洗净。蒸馏水洗净。

9.9. 干燥后用油观察。干燥后用油观察。

实验结果实验结果 在显微镜下，淋巴细胞呈蓝色，在显微镜下，淋巴细胞呈蓝色， SRBCSRBC

红色红色 (( 或五色或五色 )) ，一个淋巴细胞周围凡吸附，一个淋巴细胞周围凡吸附三个或三个以上三个或三个以上 SRBCSRBC 即为即为 EE 花环形成，计花环形成，计数数 200200 个淋巴细胞，求出花环形成百分率。个淋巴细胞，求出花环形成百分率。

注意事项注意事项 11 ．分离淋巴细胞时，离心机启动应缓慢．分离淋巴细胞时，离心机启动应缓慢加速。加速。

22 ．吸取淋巴细胞时，不宜将灰白层下的．吸取淋巴细胞时，不宜将灰白层下的液体取出过多。液体取出过多。

免疫荧光试验免疫荧光试验（示教）（示教）

直接法直接法———— BB 淋巴细胞淋巴细胞 SmlgSmlg荧光抗体检测法荧光抗体检测法

实验目的实验目的 l.l. 熟悉熟悉 BB 淋巴细胞荧光抗体检测法的原理。淋巴细胞荧光抗体检测法的原理。 2.2. 观察免疫荧光染色的细胞的形态、类型。观察免疫荧光染色的细胞的形态、类型。 3.3. 掌握掌握 SmlgSmlg 阳性的细胞在荧光显微镜下阳性的细胞在荧光显微镜下

的形态特征。的形态特征。 4.4. 学习使用荧光显微镜。学习使用荧光显微镜。

实验原理实验原理 利用荧光素标记的抗利用荧光素标记的抗 IgMIgM抗体在一定条件下与抗体在一定条件下与 BB 细胞细胞表面表面 SmIgMSmIgM特异结合，结合于细胞表面的荧光素，特异结合，结合于细胞表面的荧光素，在一定波长光激发照射下，发出一定波长的荧光，借此在一定波长光激发照射下，发出一定波长的荧光，借此可用荧光显微镜或流式细胞仪检测到与荧光抗体特异性可用荧光显微镜或流式细胞仪检测到与荧光抗体特异性结合的结合的 BB 细胞表面标志。细胞表面标志。

由于每一个由于每一个 BB 淋巴细胞表面可携带不同类的淋巴细胞表面可携带不同类的 SmlgSmlg ，，如 如 SmlgMSmlgM 、、 SmlgASmlgA 等，若分别用单价荧光抗等，若分别用单价荧光抗 IgIg 血血清染色，则可鉴别出带不同清染色，则可鉴别出带不同 SmlgSmlg 的的 BB 淋巴细胞。淋巴细胞。

凡与荧光标记抗体结合的细胞，在荧光显微镜下，细凡与荧光标记抗体结合的细胞，在荧光显微镜下，细胞膜呈现荧光，即为胞膜呈现荧光，即为 SmlgSmlg 阳性细胞阳性细胞 (B(B 淋巴细胞淋巴细胞 )) 。。如同时用普通光源照明，记数该视野中的淋巴细胞总数，如同时用普通光源照明，记数该视野中的淋巴细胞总数，便可算出便可算出 SmlgSmlg 阳性细胞或带各类阳性细胞或带各类 SmIgSmIg 细胞的百分数。细胞的百分数。

实验材料实验材料

1.1. 用异硫氰酸荧光素标记的兔或羊抗人用异硫氰酸荧光素标记的兔或羊抗人 IgIg血清血清 ..

2.2. 待检者肝素抗凝静脉血待检者肝素抗凝静脉血 .. 3.3. 含含 55 ％胎牛血清的％胎牛血清的 HanK'sHanK's 液液 .. 4.4. 比重为比重为 1.077+-0.0011.077+-0.001 的淋巴细胞分的淋巴细胞分

离液离液 . . 55 ．载玻片：；盖玻片、毛细滴管、试管、．载玻片：；盖玻片、毛细滴管、试管、荧光显微镜、离心机、计数器等荧光显微镜、离心机、计数器等 ..

1 ．小白鼠颈椎脱臼处死，取脾、制备脾细胞悬液 1× 106/ml。2 ．将 1ml脾细胞悬液加入 EP管内， 2000rpm 3min离心，弃上清，加入 FITC-IgG 100μL, 置于4 ,30min℃ 。3 ．洗涤 2 次，去除游离的抗体，最后一次离心留少许回流液，混匀滴片镜检。

实验方法实验方法

[[ 实验结果及判定实验结果及判定 ]] 在荧光显微镜下观察时所见到的发出明显荧光的在荧光显微镜下观察时所见到的发出明显荧光的细胞应为细胞应为 BB 淋巴细胞淋巴细胞

凡呈现微弱、均匀一致的暗淡荧光者为荧光阴凡呈现微弱、均匀一致的暗淡荧光者为荧光阴性细胞，即非性细胞，即非 BB 淋巴细胞。凡细胞呈现较强荧淋巴细胞。凡细胞呈现较强荧光，有明显细胞轮廓，细胞荧光可光，有明显细胞轮廓，细胞荧光可呈点状、环状呈点状、环状和帽和帽状三种类型即为状三种类型即为 SmlgSmlg 阳性细胞即阳性细胞即 BB 淋巴淋巴细胞。细胞。