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2018-4-20

1

東レ株式会社先端材料研究所

新ｴﾈﾙｷﾞｰ材料研究室長・ﾘｻｰﾁﾌｪﾛｰ

菅谷博之

ナノスケールの分離材料

大阪大学・吹田キャンパス・工学研究科Ｕ３棟３階３１１講義室（筑波大学、和歌山大学、滋賀県立大学、兵庫県立大学）

ナノテクキャリアアップ特論

（人工腎臓などに用いるナノ多孔体分離膜、血液成分吸着材料）

2

人工腎臓の原理

１．抗血栓性人工腎臓

２.生体との特殊な親和性を利用した表面設計

内容

（１）敗血症治療血液浄化器

（１） コンピューター化学を活用した材料設計と人工腎臓（２）吸着・非吸着の両機能を有する人工腎臓

（２）酸化LDL除去膜（３）白血球除去カラム

３.病態解析・診断

４.先端材料とイノベーション

3

血液透析治療と人工腎臓

ポンプ

エアートラップ

シャント

血液 尿素β２-ﾐｸﾛｸﾞﾛﾌﾞﾘﾝ

除去物質

など

血液

透析液透析液

中空糸膜

５μｍ

人工腎臓

血液透析治療

50nm

最内表面

多孔質膜構造

（約1万本内蔵）

透析液

透析液

（内径：200μm、膜厚：40μm）

4

血管内に医療材料を挿入

（カテーテル治療など）

飛散した血栓により、脳梗塞・心筋梗塞を誘発

血液は医療材料（異物）を排除しようとする

血栓

血液凝固

血栓により、循環不能

カテーテルなど

血液を体外に循環

（透析治療など）

人工腎臓など

医療材料と血液凝固

5

透析液

ポンプ

人工腎臓

血液 中空糸膜（約1万本）

内側：血液

外側：透析液

血液

透析液

中空糸膜(多孔質)

血小板（約2μm）

赤血球

白血球

慢性腎不全患者は人工腎臓を用いた血液透析治療を週３回、１回約４時間行う。

水

尿素

β2ﾐｸﾛｸﾞﾛﾌﾞﾘﾝ(Mw1.2万）

（尿毒ﾀﾝﾊﾟｸ質）アルブミン(約7nm)（有用ﾀﾝﾊﾟｸ質：Mw6.6万）

拡散・濾過で除去

尿毒物質(～5nm)

人工腎臓の概要

尿素やβ2ﾐｸﾛｸﾞﾛﾌﾞﾘﾝ等の尿毒物質を拡散・濾過で除去

6

海水淡水化用RO(逆浸透)膜

燃料電池用電解質膜

水の構造・運動性を捉えるには、ナノメートル、ナノ秒オーダーの解像度が必要（ナノ＝10億分の1）

http://www.toyota.co.jp/jpn/tech/environment/fcv/

医療材料 人工腎臓中空糸型透析器

物質の分離が求められる製品～水の基礎科学をベースにした開発～

ｺﾝﾋﾟｭｰﾀｰｼﾐｭﾚｰｼｮﾝと実験の相補活用によって材料を解析

7

均一系触媒設計(オレフィン重合)ポリマー解析

非均一系触媒設計

共重合ポリマータンパク質ナノテクポリマーアロイ

NAREGI・ナノ統合

勃興期 縮小期 普及期

企業の計算化学開始

土井プロジェクト

1970 1980 1990 2000 20051995

企業計算化学の歴史

グループ縮小傾向

参考:WTEC Panel Report on Applications of Molecular and Materials ModelingInternational Technology Research Institute (2002).

2010 2015

HPCI戦略PG

新エネルギー(FC, OPV)

企業における高分子計算化学の歴史

高分子と水

膜分離

8

量子化学

空間スケール

時間スケールns μs ms

CAE(Computer Aided Engineering)

製品・プラント設計

分子動力学

s h

nm

μm

mm

m

粗視化分子動力学

絡み合い動力学

平均場理論

粗視化シミュレーション高次構造

高次構造に依存した物性

有限要素法

量子化学・分子シミュレーション材料設計，医薬設計

「京」が得意

やりたい計算の方向性→ 超並列スパコンには不向き

高分子材料の計算手法の位置づけ

ps

9

有限要素法

製品設計

プラント設計

ＣＡＥ

Computer Aided Engineering

コンピューターエンジニアリング

材料設計

分子設計

ＣＡＣComputer Aided Chemistry

コンピューターケミストリー

量子化学 分子動力学

製品・プラント（マクロ）

原子・分子（ミクロ）

適用分野 適用分野

主な計算手法 主な計算手法

境界要素法

コンピューターシミュレーション技術分野

10

伸縮振動 変角振動

原子に働く力（水分子の例）

＋－

原子・分子の位置が時間とともに動いていく様子を、コマ送りのように解析できるLiイオン電池

電解液中のイオン伝導

シミュレーション実行例

分子間

Li+

C

P (PF6-)

O

分子内力：バネで近似バネ定数はIRや量子化学計算から決定

分子間力：密度や蒸発熱から決定

①原子に働く力を計算

②ニュートンの運動方程式から

加速度、速度、位置を求める

ニュートンの運動法的式

F = m × a(力) (重さ) (加速度)

分子動力学(MD: Molecular Dynamics)法の原理

11

50nm

0.1mm

50nm

細孔

ポリビニルピロリドン(PVP)

親水性ポリマーであり抗血栓性発現に寄与

ポリスルホン (PSf)

膜の骨格ナノレベルの精密な構造制御

膜内表面の構造（３次元 透過型電子顕微鏡像）

膜内表面の構造（３次元 透過型電子顕微鏡像）

膜内表面の組成（ＰＶＰ染色 透過型電子顕微鏡像）

膜内表面の組成（ＰＶＰ染色 透過型電子顕微鏡像）

2μm

密（内側）

疎（外側）

ポリスルホン中空糸膜の細孔構造

ナノレベルで構造制御、表面にPVPを集積

12

ＰＶＰが血小板・タンパク質付着を抑制するが、完全には抑制できない→ ＰＶＰに変わる新しいポリマーの探索を開始

血小板・タンパク質

尿毒物質

ＰＳｆ中空糸膜断面イメージ図

血液

透析液

ＰＶＰの親水化効果で血小板・ﾀﾝﾊﾟｸ質付着抑制不可逆的付着

ＰＶＰ

ＰＳｆ

一部血小板・ﾀﾝﾊﾟｸ質は不可逆的に付着⇒凝固系活性化

PSfフィルム PSf／ＰＶＰフィルム

血小板凝集塊

血小板

血液

モデルフィルム

PVPの効果検証（フィルムを用いた抗血栓性モデル試験）

従来ポリスルホン中空糸膜の抗血栓性

13

なぜＰＶＰで覆われた表面で血小板が付着するのか？なぜＰＶＰで覆われた表面で血小板が付着するのか？

血小板

PVP

自由水 血小板の吸着水（血小板の構造を安定化）

PVPの吸着水

PSf

⇒ 血小板の吸着水（血小板周囲に存在する水）は血小板の構造を安定化している。血小板がＰＶＰと接触する前に、両者の吸着水が接触する。

PVPの吸着水が血小板の吸着水の変化を誘発

血小板構造が変化し不可逆的に付着

仮説ポリマーの吸着水の状態（運動性）が

血小板付着に影響を及ぼしているのでは？

付着仮説と新規ポリマーアプローチ

吸着水の運動性に着目した新規ポリマー探索を実施

14

N O

CHH 2C

ポリビニルピロリドン（PVP)

ポリマーのどの部分が吸着水の運動性に関与しているのか

水分子が強く束縛 自由に熱運動

注目する水

水 ポリマー鎖

炭素 酸素 窒素

ピロリドン環ピロリドン環

PVPのシミュレーション結果

ポリマー構造と吸着水運動性の関係を明確化、分子設計

15

0

20

40

60

80

1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

親水性ポリマーへの血小板付着数

親水性ポリマーの吸着水の緩和時間(10-8s,-40℃）

PVP

（個

/10

3μm

2）

膜表面

ＰＶＰ吸着水

新規親水性ポリマー

膜表面

吸着水

運動性高 低

計算科学による水の挙動解析をポリマー設計に活用し、新規抗血栓性中空糸膜を創出

分子動力学シミュレーションによる水の運動性と血小板付着性の関係解明

ポリビニルピロリドン(PVP)（親水性ポリマーの一種）

ポリスルホン中空糸

0.1mm

血小板付着性評価（in vitro 評価）ポリスルホン ポリスルホン／PVP

血小板凝集塊

血小板

抗血栓性は重要な要件（目詰まりの原因） PVPは抗血栓性効果が不十分新しいポリマーが必要

抗血栓性（モデル試験）

血小板付着性（モデル試験）

タンパク質付着性（ポリスルホン：１００）

ポリスルホン単独

ポリスルホン/PVP

ポリスルホン/新規ポリマー

100 58 3

血小板の塊

血小板

血栓の付着なし

約20分の1

新規中空糸膜の蛋白質付着性と抗血栓性

（実測；東海大共同）

抗血栓性評価結果

16

0

20

40

60

80

100

0 6 12 18 24

従来品[PVP]

新規ポリマー適用品

タン

パク

質透

過能

の維

持率

(%)

ウシ血液の循環時間（ｈｒ）

膜

ﾀﾝﾊﾟｸ質(非吸着)

血液

透析液

血小板

高透過性能

老廃物

抗血栓性不十分

性能低下透析液

膜

血液ﾀﾝﾊﾟｸ質

血小板

抗血栓性高い

老廃物

新規ポリマー適用ポリスルホン膜人工腎臓

膜目詰まりがほとんど起きない抗血栓性新規人工腎臓の創出に成功

17

透析 濾過 吸着

高濃度側 低濃度側

透過による除去 吸着による除去

溶質は濃度差によって拡散で移動する。

濾過は圧力差によって移動する。

吸着は膜素材と溶質の相互作用による。

ＰＳｆ膜

ＰＭＭＡ膜

人工腎臓における吸着膜

（血液側）血液側 血液側膜 膜 膜

18

タンパク質の吸着パターン（電気泳動像, in vitro）

血小板の付着性（in vitro）

205

116976655

45

302114

(kDa)

分子量マーカー

PSf膜 PMMA膜

20μm

血小板

透過除去できない

分子量領域

ＰＭＭＡ膜の吸着特性

ＰＭＭＡ膜は透過で除去できない大分子量のタンパク質まで吸着するが、血小板も付着する

19

付着タンパク質が構造変化しフィブリノーゲンや血小板付着を誘起

付着タンパク質が構造変化しなければ、血小板付着を抑制できるのでは？

血液側

透析液側

血小板ﾌｨﾌﾞﾘﾉｰｹﾞﾝ

PMMA膜

ｱﾙﾌﾞﾐﾝ

低分子量タンパク質

血小板

ﾌｨﾌﾞﾘﾉｰｹﾞﾝ

PMMA膜

ｱﾙﾌﾞﾐﾝ

低分子量タンパク質

従来ＰＭＭＡ膜の仮説 抗血栓性PMMA膜コンセプト

タンパク質吸着と血小板付着抑制の両立

20

水素結合強水素結合弱

天然状態

タンパク質の構造変化

変性状態

構造変化

イメージ図

O

C

CN

N

H

O

C

CN

N

H

ウシ血清アルブミンの熱変性（８５℃×１ｈ）による赤外分光スペクトル変化

S.J. McClellan, etal, Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects, 260,(2005), 265を改変

吸光

度(-)

波数（cm-1)

1550 1500

熱変性前 熱変性後

低波数側へシフト

赤外分光法によるタンパク質構造変化分析

変性により低波数側へシフト

21

波数（ｃｍ－１）

従来PMMA膜中のアルブミン

新規PMMA膜中のアルブミン

水溶液中のアルブミン

実験新規ＰＭＭＡ膜と従来ＰＭＭＡ膜をそれぞれアルブミン水溶液に浸漬

膜に吸着したアルブミンについて赤外分光法で測定

吸着アルブミンの吸収ピーク（赤外分光法測定）

アルブミンの高次構造に変化があれば吸収ピーク位置がシフト

吸収

強度

膜表面の設計指針

新規ＰＭＭＡ膜中のアルブミンのピークは、水溶液のものに近く、吸着による構造変化が少ないことを示唆

22

血小板付着性

従来膜（BG） 新規膜（NF)

（ヒト新鮮血を用いたin vitro試験）

５μm

１００

1/100以下

５μm

膜表面電顕写真

ﾌｨﾌﾞﾘﾉｰｹﾞﾝ相対付着

１００ ７２ 分子量ﾏｰｶｰ

新規膜（ＮＦ）

従来膜（BG）

（膜吸着タンパク質の電気泳動像＊）

タンパク質吸着性

血小板相対付着

205

116976655

45

302114

(kDa)

PSf膜

（従来膜（ＢＧ）を１００としたときの相対値）

０．７

＊中空糸膜モジュールにヒト血漿を４時間循環後、膜吸着タンパク質を酢酸により溶脱し、電気泳動

β2-MG相対吸着 １００ １００

抗血栓性ＰＭＭＡ膜のコンセプト確認

血小板付着抑制とタンパク質吸着特性維持の両立に成功

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人工腎臓の原理

１．抗血栓性人工腎臓

２.生体との特殊な親和性を利用した表面設計

内容

（１）敗血症治療血液浄化器

（１） コンピューター化学を活用した材料設計と人工腎臓（２）吸着・非吸着の両機能を有する人工腎臓

（２）酸化LDL除去膜（３）白血球除去カラム

３.病態解析・診断

４.先端材料とイノベーション

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マイクロポア繊維

-(CH2-CH)n-

CH2NHCOCH2NH

NH2

NH2NH2NH2

ポリミキシンＢ

ポリスチレン繊維

10μm

患者

カラム

1mm

合成プロセス

ポリスチレン系複合繊維

N-ﾒﾁﾛｰﾙ-α- ｸﾛﾛｱｾﾄｱﾐﾄﾞ化反応

ﾎﾟﾘﾐｷｼﾝＢ固定化繊維

固定化担体繊維（末端ｸﾛﾙ基）

ポリミキシンＢ固定化

１級アミノ基有する物質と容易に反応可能

ｴﾝﾄﾞﾄｷｼﾝ吸着性を有する抗生物質

血液の体外循環を行うことにより、敗血症の治療（エンドトキシンの吸着除去）を行う。

“トレミキシン”

エンドトキシンとは細菌毒素であり、血中に入ると全身に炎症性の症状（敗血症）を引き起こす

敗血症治療血液浄化器（トレミキシン）

マイクロレベルの多孔質ポア繊維を作製し、表面を機能化

25

リガンド（酸化ＬＤＬと選択的に相互作用）

中空糸膜（細孔径によって除去物質を選択）

血液

尿素 β２ミクログロブリン

アルブミン（有用物質） 酸化ＬＤＬ

（有害物質）

有害物質

現在の透析膜では酸化ＬＤＬを除去できない

酸化ＬＤＬ除去膜

リガンドを膜表面に固定化し、吸着による除去を目指した

26

ＬＤＬ

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 10 20 30 40 50

吸着

除去

率（％

）

酸化ＬＤＬ

ＨＤＬ

リガンド（TRX-7068）の固定化密度 (nmol/cm2)酸化LDL測定:DLH3抗体を用いたサンドイッチELISA法

酸化ＬＤＬ除去性能

酸化ＬＤＬ

ＨＤＬ

ＬＤＬ

リガンド（TRX-7068）は酸化LDLの選択的吸着能を有する

27

顆粒球・単球

異物（細菌etc.）異物認識

貪食

繊維を異物として認識・貪食

顆粒球・単球を選択的に除去する

設計コンセプト

：ＰＳｔ/ＰＰ芯鞘繊維

：ＰＰ繊維

：PET繊維

単球

顆粒球

リンパ球

繊維径(mm)0 5 10 15 20 250

20

40

60

80

100

吸着

率(%

)

白血球バッチ吸着試験の結果

顆粒球・単球の貪食能に注目

繊維

粒子

仮説：置きかえ可能？

極細繊維フェルトをカラムに充填

白血球除去カラム

繊維径：数μｍで顆粒球・単球を選択的に吸着

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人工腎臓の原理

１．抗血栓性人工腎臓

２.生体との特殊な親和性を利用した表面設計

内容

（１）敗血症治療血液浄化器

（１） コンピューター化学を活用した材料設計と人工腎臓（２）吸着・非吸着の両機能を有する人工腎臓

（２）酸化LDL除去膜（３）白血球除去カラム

３.病態解析・診断

４.先端材料とイノベーション

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遺伝子（ゲノム）

変化しない

大きく変化する

全く異なる

タンパク質（ﾌﾟﾛﾃｵｰﾑ）

表現型

プロテオームは“タンパク質の顔ぶれ”であり、表現型を反映

プロテオームとは

30

発現量や活性が健康状態を反映

遺伝子 hnRNA 蛋白質

選択的ｽﾌﾟﾗｲｼﾝｸﾞ転写

翻訳後修飾（ﾘﾝ酸化、糖化etc）

・・・

・・・

翻訳

総蛋白数：20～200万

・・・

mRNA

健常者

患者

差異総遺伝子数：3～4万

タンパク質の差異を見出し、バイオマーカーを見つける

新しい診断・治療、予防医療、ﾃｲﾗｰﾒｰﾄﾞ医療

患者（副作用）

差異

臨床プロテオーム解析

31

臨床検体（血清）

前処理

分画(2次元電気泳動/2次元液体ｸﾛﾏﾄｸﾞﾗﾌｨｰ)

質量分析(ﾀﾝﾊﾟｸ質/ﾍﾟﾌﾟﾁﾄﾞ)

データ解析

(DB照合/統計解析)

検体の前処理技術が未熟なために臨床プロテオーム解析の実用化が進んでいない

目的タンパク質画分の抽出

Pro te in name mass sco re pepti des An notati onFIBA_HUMAN 94914 567 77 (P02671) Fibrinogen alpha/alpha-E chain precursor [Contains: Fibrinopeptide A]SZ07_HUMAN 13885 472 130 (P02775) Platelet basic protein precursor (PBP) (Small inducible cytokine B7) (CXCL7) (Leukocyte-deTHRB_HUMAN 69992 471 70 (P00734) Prothrombin precursor (EC 3.4.21 .5) (Coagulation factor II)CO4_HUMAN 192650 401 53 (P01028) Complement C4 precursor [Contains: C4a anaphylatoxin]RETB_HUMAN 23029 366 30 (P02753) Plasma retinol-binding protein precursor (PRBP) (RBP) (PRO2222)CFAD_HUMAN 26987 245 13 (P00746) Complement factor D precursor (EC 3.4.21.46) (C3 convertase activator) (Properdin factor DB2MG_HUMAN 13706 191 19 (P61769) Beta-2-microglobulin precursor (HDCMA22P)CALD_HUMAN 93194 175 11 (Q05682) Caldesmon (CDM)ZYX_HUMAN 61238 169 12 (Q15942) Zyxin (Zyxin 2)TYB4_HUMAN 4918 142 16 (P01253) Thymosin beta-4 (FX) [Contains: Hematopoietic system regulatory peptide; Seraspenide]MAC4_HUMAN 669735 122 26 (Q96PK2) Microtubule-actin crosslinking factor 1, isoform 4CO3_HUMAN 187046 120 10 (P01024) Complement C3 precursor [Contains: C3a anaphylatoxin]RNP_HUMAN 17633 118 6 (P07998) Ribonuclease pancreatic precursor (EC 3.1.27 .5) (RNase 1) (RNase A) (RNase UpI-1) (RIB-1)CAH1_HUMAN 28721 117 8 (P00915) Carbonic anhydrase I (EC 4.2.1.1) (Carbonate dehydratase I ) (CA-I) (Carbonic anhydrase B )F13A_HUMAN 83084 112 5 (P00488) Coagulation factor XI II A chain precursor (EC 2.3.2.13) (Protein-glutamine gamma-glutamyltSH3N_HUMAN 10431 110 4 (Q9H299) SH3 domain-binding glutamic acid-rich-like protein 3 (SH3 domain-binding protein SH3BP-1)FIBB_HUMAN 55892 106 4 (P02675) Fibrinogen beta chain precursor [Contains: Fibrinopeptide B]ALBU_HUMAN 69321 103 8 (P02768) Serum albumin precursorK2C1_HUMAN 65847 96 3 (P04264) Keratin , type II cytoskeletal 1 (Cytokeratin 1) (K1) (CK 1) (67 kDa cytokeratin) (Hair alpACTB_HUMAN 41710 94 5 (P60709) Actin, cytoplasmic 1 (Beta-actin)MYH9_HUMAN 226392 91 9 (P35579) Myosin heavy chain, nonmuscle type A (Cellular myosin heavy chain , type A) (Nonmuscle myosRBP2_HUMAN 357993 91 16 (P49792) Ran-binding protein 2 (RanBP2) (Nuclear pore complex protein Nup358) (Nucleoporin Nup358)MACF_HUMAN 619975 87 23 (Q9UPN3) Microtubule-actin crosslinking factor 1, isoforms 1/2/3 (Actin cross-linking family proteiSETX_HUMAN 302761 82 21 (Q7Z333) Probable helicase senataxin (EC 3.6.1 .-) (SEN1 homolog)COA2_HUMAN 279516 80 13 (O00763) Acetyl-CoA carboxylase 2 (EC 6.4.1.2) (ACC-beta) [Includes: Biotin carboxylase (EC 6.3 .4.1MLL2_HUMAN 563831 80 15 (O14686) Myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia protein 2 (ALL1-related protein)VASP_HUMAN 39674 78 3 (P50552) Vasodilator-stimulated phosphoprotein (VASP)KAC_HUMAN 11602 76 6 (P01834) Ig kappa chain C regionDOC1_HUMAN 215239 76 20 (Q14185) Dedicator of cytokinesis protein 1 (180 kDa protein downstream of CRK) (DOCK180)FBN2_HUMAN 314131 75 19 (P35556) Fibrillin 2 precursorFLNA_HUMAN 280586 74 13 (P21333) Filamin A (Alpha-filamin) (Filamin 1) (Endothelial actin-binding protein) (ABP-280) (NonmuMLH3_HUMAN 163608 72 5 (Q9UHC1) DNA mismatch repair protein Mlh3 (MutL protein homolog 3)CYTC_HUMAN 15789 71 2 (P01034) Cystatin C precursor (Neuroendocrine basic polypeptide) (Gamma-trace) (Post-gamma-globulinDPOZ_HUMAN 352566 71 16 (O60673) DNA polymerase zeta catalytic subunit (EC 2.7.7.7) (hREV3)PCN2_HUMAN 0 71 15 (O95613) Pericentrin 2 (Kendrin)NEUG_HUMAN 7614 70 1 (Q92686) Neurogranin (Ng) (RC3)DESP_HUMAN 331571 69 12 (P15924) Desmoplakin (DP) (250/210 kDa paraneoplastic pemphigus antigen)EPPL_HUMAN 552754 68 35 (P58107) Epiplakin (450 kDa epidermal antigen)LYST_HUMAN 428852 66 10 (Q99698) Lysosomal trafficking regulator (Beige homolog)PI4K_HUMAN 231143 66 10 (P42356) Phosphatidylinositol 4-kinase alpha (EC 2.7.1.67) (PI4-kinase) (PtdIns-4-kinase) (PI4K-alpTRAP_HUMAN 437304 64 15 (Q9Y4A5) Transformation/transcription domain-associated protein (350/400 kDa PCAF-associated factorKE04_HUMAN 0 64 14 (Q9P2E3) Protein KIAA1404RA18_HUMAN 56159 62 6 (Q9NS91) Postreplication repair prote in RAD18 (hRAD18) (hHR18)PPIB_HUMAN 22728 62 4 (P23284) Peptidyl-prolyl c is-trans isomerase B precursor (EC 5.2.1 .8) (PPIase) (Rotamase) (CyclophiMLL3_HUMAN 540965 62 21 (Q8NEZ4) Myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia protein 3 homolog (Histone-lysine N-methyltransTLN2_HUMAN 271385 62 11 (Q9Y4G6) Talin 2RIM1_HUMAN 188956 61 9 (Q86UR5) Regulating synaptic membrane exocytosis prote in 1 (Rab3-interacting molecule 1) (RIM 1)RSG3_HUMAN 95852 61 8 (Q14644) Ras GTPase-activating protein 3 (GAP1(IP4BP)) (Ins P4-binding prote in)ACIN_HUMAN 151797 60 8 (Q9UKV3) Apoptotic chromatin condensation inducer in the nucleus (Acinus)CSKP_HUMAN 104998 60 9 (O14936) Peripheral plasma membrane protein CASK (EC 2.7.1 .-) (hCASK) (Calcium/calmodulin-dependent

Protein name mass sco re pe ptides An notationFIBA_HUMAN 94914 567 7 7 (P02671) Fibrinogen alpha/alpha-E chain precursor [Contains: Fibrinopeptide A]SZ07_HUMAN 13885 472 13 0 (P02775) Platelet basic protein precursor (PBP) (Small inducible cytokine B7) (CXCL7) (Leukocyte-deTHRB_HUMAN 69992 471 7 0 (P00734) Prothrombin precursor (EC 3.4.21 .5) (Coagulation factor II)CO4_HUMAN 192650 401 5 3 (P01028) Complement C4 precursor [Contains: C4a anaphylatoxin]RETB_HUMAN 23029 366 30 (P02753) Plasma retinol-binding protein pre cursor (PRBP) (RBP) (PRO2222)CFAD_HUMAN 26987 245 13 (P00746) Complement factor D precursor (EC 3.4.21.46) (C3 convertase activator) (Properdin factor DB2MG_HUMAN 13706 191 19 (P61769) Beta-2-microglobulin precursor (HDCMA22P)CALD_HUMAN 93194 175 11 (Q05682) Caldesmon (CDM)ZYX_HUMAN 61238 169 1 2 (Q15942) Zyxin (Zyxin 2)TYB4_HUMAN 4918 142 16 (P01253) Thymos in beta-4 (FX) [Contains: Hematopoietic system regulatory peptide; Seraspenide]MAC4_HUMAN 669735 122 2 6 (Q96PK2) Microtubule-actin crosslinking factor 1, isoform 4CO3_HUMAN 187046 120 1 0 (P01024) Complement C3 precursor [Contains: C3a anaphylatoxin]RNP_HUMAN 17633 118 6 (P07998) Ribonuclease pancreatic precursor (EC 3.1 .27.5) (RNase 1) (RNase A) (RNase UpI-1) (RIB-1)CAH1_HUMAN 28721 117 8 (P00915) Carbonic anhydrase I (EC 4.2.1.1) (Carbonate dehydratase I) (CA-I) (Carbonic anhydrase B)F13A_HUMAN 83084 112 5 (P00488) Coagulation factor XIII A chain precursor (EC 2.3.2.13) (Protein -glutamine gamma-glutamyltSH3N_HUMAN 10431 110 4 (Q9H299) SH3 domain-binding glutamic acid-rich-like protein 3 (SH3 domain-binding protein SH3BP-1)FIBB_HUMAN 55892 106 4 (P02675) Fibrinogen beta chain precursor [Contains: Fibrinopeptide B]ALBU_HUMAN 69321 103 8 (P02768) Serum albumin precursorK2 C1_HUMAN 65847 96 3 (P04264) Keratin, type II cytoskeletal 1 (Cytokeratin 1) (K1) (CK 1) (67 kDa cytokeratin) (Hair alpACTB_HUMAN 41710 94 5 (P60709) Actin, cytoplasmic 1 (Beta-actin)MYH9_HUMAN 226392 91 9 (P35579) Myosin heavy cha in, nonmuscle type A (Cellular myosin heavy chain, type A) (Nonmuscle myosRBP2_HUMAN 357993 91 16 (P49792) Ran-binding protein 2 (RanBP2) (Nuclear pore complex protein Nup358) (Nucleoporin Nup358)MACF_HUMAN 619975 87 2 3 (Q9UPN3) Microtu bule-actin crosslinking factor 1, isoforms 1/2/3 (Actin cross-linking family proteiSETX_HUMAN 302761 82 21 (Q7Z333) Probable helicase senataxin (EC 3.6.1.-) (SEN1 homolog)COA2_HUMAN 279516 80 13 (O00763) Acetyl-CoA carboxylase 2 (EC 6.4.1.2) (ACC-beta) [Includes: B iotin carboxylase (EC 6.3.4.1MLL2_HUMAN 563831 80 15 (O14686) Myeloid/lymphoid or mixed-lineage leu kemia protein 2 (ALL1-related protein)VASP_HUMAN 39674 78 3 (P50552) Vasodilator-stimulated phosphoprotein (VASP)KAC_HUMAN 11602 76 6 (P01834) Ig kappa chain C regionDOC1_HUMAN 215239 76 2 0 (Q14185) Dedicator of cyto kinesis protein 1 (180 kDa protein downstream of CRK) (DOCK180)FBN2_HUMAN 314131 75 19 (P35556) Fibrillin 2 precursorFLNA_HUMAN 280586 74 13 (P21333) Filamin A (Alpha-f ilamin) (Filamin 1) (Endothelial actin-binding protein) (ABP-280) (NonmuMLH3_HUMAN 163608 72 5 (Q9UHC1) DNA mismatch repair protein Mlh3 (MutL protein homolog 3)CYTC_HUMAN 15789 71 2 (P01034) Cystatin C precursor (Neuroendocrine basic polypeptide) (Gamma-trace) (Post-gamma-globulinDPOZ_HUMAN 352566 71 1 6 (O60673) DNA polymerase zeta catalytic subunit (EC 2.7.7.7) (hREV3)PCN2_HUMAN 0 71 1 5 (O95613) Pericentrin 2 (Kendrin)NEUG_HUMAN 7614 70 1 (Q92686) Neurogranin (Ng) (RC3)DESP_HUMAN 331571 69 1 2 (P15924) Desmoplakin (DP) (250/210 kDa paraneoplastic pemphigus antigen)EPPL_HUMAN 552754 68 3 5 (P58107) Epiplakin (450 kDa epidermal antigen)LYST_HUMAN 428852 66 10 (Q99698) Lysosomal traffick ing regulator (Beige homolog)PI4K_HUMAN 231143 66 10 (P42356) Phosphatidyli nositol 4-kinase alpha (EC 2.7.1.67) (PI4-kinase) (PtdIns-4-kinase) (PI4K-alpTRAP_HUMAN 437304 64 15 (Q9Y4A5) Transformation/transcription domain-associated protein (350/400 kDa PCAF-associate d fac torKE04_HUMAN 0 64 1 4 (Q9P2E3) Protein KIAA1404RA18_HUMAN 56159 62 6 (Q9NS91) Postreplication repair protein RAD18 (hRAD18) (hHR18)PPIB_HUMAN 22728 62 4 (P23284) Peptidyl-proly l cis-trans isomerase B precursor (EC 5.2.1.8) (PPIase) (Rotamase) (Cyclo phiMLL3_HUMAN 540965 62 21 (Q8NEZ4) Myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia protein 3 homolog (Histone-lysine N-methyltransTLN2_HUMAN 271385 62 11 (Q9Y4G6) Talin 2RIM1_HUMAN 188956 61 9 (Q86UR5) Regulating synaptic membrane exocytosis protein 1 (Rab3 -inte racting molecule 1) (RIM 1)RSG3_HUMAN 95852 61 8 (Q14644) Ras GTPase-activating protein 3 (GAP1(IP4BP)) (Ins P4-binding protein)ACIN_HUMAN 151797 60 8 (Q9UKV3) Apoptotic ch romatin condensation inducer in the nucleus (Acinus)CSKP_HUMAN 104998 60 9 (O14936) Peripheral plasma membrane protein CASK (EC 2.7.1.-) (hCASK) (Calcium/calmodulin-dependent

Toray Sample 4-1-2

Time20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 80.00 90.00

%

0

100

250405_009 1: TOF MS ES+ BPI

6.71e3421.66

518.17

448.68

535.13

524.16

421.67

626.70

435.70

512.68 917.82

508.24

572.17

971.34

933.01

747.29

794.25

741.31

773.76

807.351032.79

ﾏｰｶｰ候補の特定

臨床プロテオーム解析の実用化に向けて革新的な前処理デバイスを提供する

臨床プロテオーム解析作業の流れ

32

含有量の多いタンパク質が高分子であることに着目し、分子ふるいの原理でこれを除去するシステムを構築。

血液プロテオーム解析において、微量成分を検出することが望まれている

効率的検出のためには、含有量の多いタンパク質を除去する事が必要

東レタンパク質分画デバイス

Albumin

IgG Total

Transferrin

Fibrinogen IgA Total

α2-MacroglobulinIgM Total

C3 complementα1-Antitrypsin

Haptogｌobin

10％

Apolipoprotein A1Apolipoprotein B

α1-acid Glycoprotein

Lp(a)

Factor H

Ceruloplasmin

C4 complement Complement FactorB

Prealbumin

C9 complement

C1q complement

C8 complement

1％

：Multiple Affinity Removal System(Agilent社)で除去可能な蛋白質赤字 ：東レデバイスで除去可能なタンパク質（高分子量）

（www.plasmaproteome.orgより引用）

Major Plasma Proteins

東レデバイスの回収対象

タンパク質分画デバイスとは

血清成分組成 分画処理コンセプト

血漿／血清 分画処理後の血漿／血清

高含有成分(アルブミンなど)

タン

パク

質濃

度［

Fm

ol / μ

g］

除去

高い ← 分子量 → 低い

質量分析機の検出限界

検出

高い ← 分子量 → 低い

微量成分の濃縮

33

分画装置および実証例

・・・・

回収液

低分子量タンパク質高分子量タンパク質

タンパク質濃縮

緩衝溶液

分離膜１

濃縮膜

分離膜Ｎ

分離膜２

タンパク質分離

循環

次段へ

血清注入

循環

１段目へ

タンパク質の分離・濃縮図

2.5

6.0

31.0

1 2 3

3.5

14.4

21.5

36.5

55.4

66.3

(kDa)

97.4116.3

200

4

ｱﾙﾌﾞﾐﾝ

レーン１： 分子量マーカーレーン２：原血清,レーン３：抗体除去カラム,レーン４：分画処理後の血清

（試作機）

分画結果

34

(Size: W47 x H31 x D40 cm)

検体量： １ｍＬ処理時間：１時間操作：自動

大量の検体を短時間で処理

タンパク質分画デバイス

35

***

*

*******

*** **

**

*

*

**

*

Disease “X”

Disease “X”

Normal

Normal

デバイス処理なしで比較

デバイス処理して比較

血漿をﾄﾘﾌﾟｼﾝ消化したﾍﾟﾌﾟﾁﾄﾞ混合物の逆相RP-HPLCﾌﾟﾛﾌｧｲﾙ

16

7

* 新たに検出* 消失

より多くの疾患ﾏｰｶｰ候補の検出が可能

疾患マーカー探索への展開

36

透析患者に多いタンパク質のリスト

透析患者に多く検出されるタンパク質リスト

protein Mw Reported infomation

Beta-2-microglobulin 13829 High level

Plasma retinol-binding protein(PRBP)(RBP) 23386 Detected in urin

Complement factor D 27517normal：1.02±0.11 ug/ml、ESRD：12.12±2.38 ug/ml

Myoglobin. 17110

Macrophage colony stimulatingfactor-1 (CSF-1) (MCSF) (M-CSF).

60804

ESRD;preHD：1287±（2.4times by normal)、ESRD;postHD：1644±456 U/ml

Guanylin (Guanylate cyclase activator2A) (Guanylate cyclase activatingprotein 1) (Gap-I

12848

Thioredoxin (ATL-derived factor)(ADF) (Surface associated sulphydrylprotein) (SASP).

11892

normal：28.0±5.4ng/ml、ESRD;HCV+：

112.3±3.7 ng/ml、ESRD;HCV-：

69.7±3.3ng/ml

Osteopontin(Bone sialoprotein 1)(Urinary stone protein) (Secretedphosphoprotein 1) (SP

35594normal：315.1±117.4ng/mlESRD：837.3±443.2 ng/ml

既報物質

380 U/ml

High level

High level

健常者と異なるタンパク質が一度に判明する（２０００種以上のタンパク質の検出が可能）

37

人工腎臓の原理

１．抗血栓性人工腎臓

２.生体との特殊な親和性を利用した表面設計

内容

（１）敗血症治療血液浄化器

（１） コンピューター化学を活用した材料設計と人工腎臓（２）吸着・非吸着の両機能を有する人工腎臓

（２）酸化LDL除去膜（３）白血球除去カラム

３.病態解析・診断

４.先端材料とイノベーション

（当日紹介します）