a polimeráz láncreakció

A polimeráz láncreakcióA polimeráz láncreakció

Gurbi BiankaGurbi Bianka

2013. március 4. 2013. március 4.

Emelt Biotechnológiai Számítások

Polimeráz láncreakció = PCR

Célja: DNS molekulák felszaporítása in Célja: DNS molekulák felszaporítása in vitrovitro

Előnye: gyors, egyszerűElőnye: gyors, egyszerű

Hátránya: minta előkészítése nehéz, Hátránya: minta előkészítése nehéz, időigényes lehetidőigényes lehet

A PCR reakcióelegy A PCR reakcióelegy összetevőiösszetevői

1. 1. DNS templátDNS templát: bárhonnan izolálható, : bárhonnan izolálható, lehet a teljes genom, vagy annak egy lehet a teljes genom, vagy annak egy részleterészlete

A PCR reakcióelegy A PCR reakcióelegy összetevőiösszetevői

2. 2. DNS polimerázDNS polimeráz: leggyakoribb a Taq : leggyakoribb a Taq polimeráz, illetve a Vent polimerázpolimeráz, illetve a Vent polimeráz

•hőstabilhőstabil•gyorsgyors•pontospontos

A PCR reakcióelegy A PCR reakcióelegy összetevőiösszetevői

3. 3. PrimerekPrimerek: rövid egyszálú DNS : rövid egyszálú DNS darabok, amelyek specifikusan darabok, amelyek specifikusan kötnek a felszaporítani kívánt DNS kötnek a felszaporítani kívánt DNS két végéhezkét végéhez

•Forward primerForward primer•Reverz primerReverz primer

A PCR reakcióelegy A PCR reakcióelegy összetevőiösszetevői

4. 4. NukleotidokNukleotidok: dATP, dTTP, dGTP, : dATP, dTTP, dGTP, dCTPdCTP

5. 5. PufferPuffer: pH beállítás, : pH beállítás,

megfelelő enzimműködésmegfelelő enzimműködés

biztosítása, DNS védelmebiztosítása, DNS védelme

A PCR folyamataiA PCR folyamatai

0. Elődenaturáció (95°C, 10 perc)0. Elődenaturáció (95°C, 10 perc)

1. Denaturáció (95°C, 30-60s)1. Denaturáció (95°C, 30-60s)

2. Annealing / összekapcsolás (10-20s) 2. Annealing / összekapcsolás (10-20s)

3. DNS szintézis (72°C)3. DNS szintézis (72°C)

4. Ismétlés4. Ismétlés

5. Hűtés (4°C)5. Hűtés (4°C)

http://www.youtube.com/watch?v=2KoLnIwohttp://www.youtube.com/watch?v=2KoLnIwoZKUZKU

A PCR folyamataiA PCR folyamatai

A PCR matematikai leírásaA PCR matematikai leírása

Teljes DNS-lánc felszaporítási egyenlete: Teljes DNS-lánc felszaporítási egyenlete:

N=NN=N00*2*2nn

Egy DNS szakasz felszaporítási egyenlete:Egy DNS szakasz felszaporítási egyenlete:

N=NN=N00*2*2nn-2n-2n

1. Példa1. Példa

Tekintsünk egyetlen DNS molekulát, Tekintsünk egyetlen DNS molekulát, amit felszaporítani kívánunk. Egy amit felszaporítani kívánunk. Egy PCR során az általánosan alkalmazott PCR során az általánosan alkalmazott ciklus szám 30. Hány molekulát ciklus szám 30. Hány molekulát kapunk, ha teljes DNS-t szaporítunk kapunk, ha teljes DNS-t szaporítunk fel, és hányat, ha egy adott DNS fel, és hányat, ha egy adott DNS szakaszt?szakaszt?

1. Példa megoldás1. Példa megoldás

NN00=1, =1, n=30n=30

Teljes DNS-lánc felszaporítás esetén: Teljes DNS-lánc felszaporítás esetén:

N=NN=N00*2*2nn=1*2=1*23030==1.073.741.8241.073.741.824

Egy DNS szakasz felszaporítása esetén:Egy DNS szakasz felszaporítása esetén:

N=NN=N00*2*2nn-2n=1*2-2n=1*23030-2*30=-2*30=1.073.741.7641.073.741.764

A PCR matematikai leírásaA PCR matematikai leírása

A reakció működése nem tökéletes, A reakció működése nem tökéletes, eltérések vannak az ideális esettől.eltérések vannak az ideális esettől.

Teljes DNS-lánc felszaporítási egyenlete: Teljes DNS-lánc felszaporítási egyenlete:

N=NN=N00*E*Enn

Egy DNS szakasz felszaporítási egyenlete:Egy DNS szakasz felszaporítási egyenlete:

N=NN=N00*E*Enn-Kn-Kn

2. Példa2. Példa

Tekintsük az első példa adatait, de Tekintsük az első példa adatait, de vegyük figyelembe a PCR hibáit, vegyük figyelembe a PCR hibáit, vagyis a hatványalap legyen 1,8; a vagyis a hatványalap legyen 1,8; a hozzátartozó lineáris szorzó pedig hozzátartozó lineáris szorzó pedig 1,9. Ekkor mennyi DNS keletkezik a 1,9. Ekkor mennyi DNS keletkezik a két esetben? Hány százalékkal két esetben? Hány százalékkal kevesebb DNS keletkezik ezekben az kevesebb DNS keletkezik ezekben az esetekben?esetekben?

2. Példa megoldása2. Példa megoldása

NN00=1, =1, n=30, n=30, E=1,8E=1,8 K=1,9K=1,9

Teljes DNS-lánc felszaporítás esetén: Teljes DNS-lánc felszaporítás esetén:

N=NN=N00*E*Enn=1*1,8=1*1,83030==45.517.16045.517.160

Egy DNS szakasz felszaporítása esetén:Egy DNS szakasz felszaporítása esetén:

N=NN=N00*E*Enn-Kn=1*1,8-Kn=1*1,83030-1,9*30=-1,9*30=45.517.10345.517.103

2. Példa megoldása2. Példa megoldása

Teljes DNS-lánc felszaporítása esetén:Teljes DNS-lánc felszaporítása esetén:

(45.517.160/1.073.741.824)*100=(45.517.160/1.073.741.824)*100=4,24%4,24%

Egy DNS szakasz felszaporítása esetén:Egy DNS szakasz felszaporítása esetén:

(45.517.103/1.073.741.764)*100=(45.517.103/1.073.741.764)*100=4,24%4,24%

Már egy DNS felszaporítása esetén is Már egy DNS felszaporítása esetén is jelentős mennyiségű DNS keletkezik, jelentős mennyiségű DNS keletkezik, még akkor is, ha a hatványalap eltér még akkor is, ha a hatványalap eltér az ideálistól.az ideálistól.

A gyakorlatban eltekintünk ezektől a A gyakorlatban eltekintünk ezektől a hibáktól. Elfogadjuk, hogy 30 ciklus hibáktól. Elfogadjuk, hogy 30 ciklus alatt elegendő DNS keletkezik. A DNS alatt elegendő DNS keletkezik. A DNS pontos mennyiségét később pontos mennyiségét később határozzuk meg.határozzuk meg.

Agaróz gélelektroforézisAgaróz gélelektroforézis

Alapja az ionok elektromos térbeli Alapja az ionok elektromos térbeli mozgékonysága. Elektromos térbe mozgékonysága. Elektromos térbe helyezve a töltéssel rendelkező helyezve a töltéssel rendelkező részecskék az ellenkező töltésű részecskék az ellenkező töltésű pólusok felé haladnak. pólusok felé haladnak.

Az ionok vándorlási sebessége, Az ionok vándorlási sebessége, elmozdulása különböző, ezért elmozdulása különböző, ezért lehetséges az elválasztásuk. lehetséges az elválasztásuk.

A futtató közeg gél, amely poli-A futtató közeg gél, amely poli-akrilamid vagy agaróz.akrilamid vagy agaróz.

Agaróz gélelektroforézisAgaróz gélelektroforézis

Agaróz: a D-galaktóz és a 3,6-anhidro-L-Agaróz: a D-galaktóz és a 3,6-anhidro-L-galaktóz lineáris polimere.galaktóz lineáris polimere.

Egy lineáris DNS molekula vándorlási Egy lineáris DNS molekula vándorlási sebessége fordítottan arányos a molekula sebessége fordítottan arányos a molekula tömegének logaritmusával.tömegének logaritmusával.

A DNS pH 7 érték körül negatív töltésekkel A DNS pH 7 érték körül negatív töltésekkel rendelkezik, így az elektromos erőtérben a rendelkezik, így az elektromos erőtérben a (+) pólus felé vándorol.(+) pólus felé vándorol.

Etídium-bromiddal festhető, UV-fénnyel Etídium-bromiddal festhető, UV-fénnyel detektálható.detektálható.

3. Példa3. Példa

Adott agaróz gélelektroforézis Adott agaróz gélelektroforézis

gélfotója alapján határozzuk gélfotója alapján határozzuk

meg az ismeretlen DNS fragment meg az ismeretlen DNS fragment nagyságát! nagyságát!

3. Példa megoldása3. Példa megoldása

Első lépésként szükségünk van az Első lépésként szükségünk van az alkalmazott marker adataira, alkalmazott marker adataira, amelynek segítségével az adott gélre amelynek segítségével az adott gélre megadhatjuk a futási távolság – megadhatjuk a futási távolság – bázispár szám összefüggést, bázispár szám összefüggést, végeredményben a kalibrációs végeredményben a kalibrációs egyenest.egyenest.

3. Példa megoldása3. Példa megoldása

Az alkalmazott DNS

létra adatai:

Ez alapján a marker vonalai beazonosíthatóak. Következő lépésben meg kell határozni a futási távolságot (vonalzó).

3. Példa megoldása3. Példa megoldása

Az adatokat Excelben rögzítjük, Az adatokat Excelben rögzítjük, diagramban ábrázoljuk.diagramban ábrázoljuk.

A kapott pontokra egyenest illesztünk, A kapott pontokra egyenest illesztünk, feltüntetjük az egyenes egyenletét, feltüntetjük az egyenes egyenletét, valamint a varianciát.valamint a varianciát.

3. Példa megoldása3. Példa megoldása

A kapott kalibrációs egyenes:A kapott kalibrációs egyenes:

y = -0,1385x + 4,1411y = -0,1385x + 4,1411

Kalibrációs egyenes y = -0,1385x + 4,1411

R2 = 0,9027

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

0 2 4 6 8 10 12

Futási távolság (cm)

lg(b

ázis

pár

szám

)

3. Példa megoldás3. Példa megoldás

Végül meghatározzuk a minta futási Végül meghatározzuk a minta futási távolságát: x=7,1 cm.távolságát: x=7,1 cm.

A kalibrációs egyenes egyenletébe A kalibrációs egyenes egyenletébe behelyettesítve kiszámítjuk a lg(bp) behelyettesítve kiszámítjuk a lg(bp) értéket, abból pedig a bázispárszámot:értéket, abból pedig a bázispárszámot:

y=-0,1385x+4,1411=-y=-0,1385x+4,1411=-0,1385*7,1+4,14110,1385*7,1+4,1411

y=3,16=lg(bp)y=3,16=lg(bp)

bp=bp=14381438

Real-time PCRReal-time PCR

A PCR folyamatának valós idejű A PCR folyamatának valós idejű nyomon követése.nyomon követése.

Leggyakoribb detektálási technikák:Leggyakoribb detektálási technikák:

•SYBR Green I. festék SYBR Green I. festék (duplaszálú DNS-hez kötődik, (duplaszálú DNS-hez kötődik, fluoreszcens jelet detektálnak)fluoreszcens jelet detektálnak)

•FRET (hibridizációs próbák)FRET (hibridizációs próbák)

Real-time PCR - FRETReal-time PCR - FRET

Fluorescence Resonance Eneregy Fluorescence Resonance Eneregy TransferTransfer

A real-time PCR A real-time PCR hatékonyságahatékonysága

Különböző kiindulási koncentrációkbanKülönböző kiindulási koncentrációkban

vesznek DNS-oldatokat, és legalább annyivesznek DNS-oldatokat, és legalább annyi

cikluson keresztül futtatják a PCR-t, amíg cikluson keresztül futtatják a PCR-t, amíg elel

nem érik a kimutatási nem érik a kimutatási

határt, ahol ahatárt, ahol a

fluoreszcens jel márfluoreszcens jel már

detektálható. detektálható.

A real-time PCR A real-time PCR hatékonyságahatékonysága

N=NN=N00*E*Enn

lgN=lgNlgN=lgN00+n*lgE+n*lgE

-n*lgE=lgN-n*lgE=lgN00-lgN-lgN

n=-(1/lgE)*lgNn=-(1/lgE)*lgN00+lgN/lgE +lgN/lgE

A real-time PCR A real-time PCR hatékonyságahatékonysága

Tehát ha lgNTehát ha lgN00 függvényében ábrázoljuk függvényében ábrázoljuk az n értékeket (az a ciklusszám, ahol az n értékeket (az a ciklusszám, ahol elérték a kimutatási határt), akkor egy elérték a kimutatási határt), akkor egy egyenest kapunk, aminek a egyenest kapunk, aminek a meredeksége -1/lgE, a meredeksége -1/lgE, a tengelymetszete lgN/lgE.tengelymetszete lgN/lgE.

Tehát megkapjuk a PCR amplifikációs Tehát megkapjuk a PCR amplifikációs hatékonyságát (E), valamint a végső hatékonyságát (E), valamint a végső DNS mennyiségét (N).DNS mennyiségét (N).

A real-time PCR A real-time PCR hatékonyságahatékonysága

Áttö

rési ciklu

sszám

Kiindulási DNS mennyisége (lgN0)

4. Példa4. Példa

Real-time PCR hatékonyságát Real-time PCR hatékonyságát vizsgálták. Ehhez 10vizsgálták. Ehhez 1033, 5*10, 5*1033, 10, 1044, , 5*105*1044 és 10 és 1055 kezdeti DNS kezdeti DNS koncentrációkból indultak ki. koncentrációkból indultak ki. Fluoreszcens jelüket vizsgálva sorban Fluoreszcens jelüket vizsgálva sorban a következő ciklusszámokat kapták: a következő ciklusszámokat kapták: 35, 33, 32, 30 és 28. Határozzuk meg 35, 33, 32, 30 és 28. Határozzuk meg a végső DNS koncentrációt és a a végső DNS koncentrációt és a hatékonyságot!hatékonyságot!

4. Példa megoldása4. Példa megoldása

Először írjuk fel az Először írjuk fel az adatokat Excelben.adatokat Excelben.

Vegyük a kezdeti DNS Vegyük a kezdeti DNS koncentráció koncentráció logaritmusát.logaritmusát.

Ábrázoljuk az Ábrázoljuk az adatokat egy adatokat egy diagramban, majd a diagramban, majd a pontokra illesszünk pontokra illesszünk egyenest.egyenest.

PCR hatékonysága y = -3,3522x + 45,276R2 = 0,9804

0

5

10

15

20

25

30

35

40

2,80 3,30 3,80 4,30 4,80

Kezdeti DNS koncentráció logaritmusa

Átt

öré

si c

iklu

sszá

m

4. Példa megoldása4. Példa megoldása

Az egyenes egyenlete: Az egyenes egyenlete: y = -3,3522x + 45,276y = -3,3522x + 45,276

Itt y=n az áttörési ciklusszám, x=NItt y=n az áttörési ciklusszám, x=N00. . A meredekség: -3,3522=-1/lgEA meredekség: -3,3522=-1/lgE

E=10E=10(-1/-3,3522)(-1/-3,3522)==1,991,99A tengelymetszet: 45,276=lgN/lgE=lgN/1,99A tengelymetszet: 45,276=lgN/lgE=lgN/1,99

N=10N=10(45,276*lg1,99)(45,276*lg1,99)==3,4*103,4*101313

A kapott értékek jellemzőek egy adott PCR A kapott értékek jellemzőek egy adott PCR lefutására.lefutására.

PCR alkalmazásaiPCR alkalmazásai

• Molekuláris klónozás alternatívájaMolekuláris klónozás alternatívája• Genetikai betegségek felderítésére, Genetikai betegségek felderítésére,

fertőző betegségek diagnosztizálására, fertőző betegségek diagnosztizálására, bűnözők azonosítására, apasági bűnözők azonosítására, apasági vizsgálatok vizsgálatok

• Detektálhatóak a kapcsolt gének Detektálhatóak a kapcsolt gének csoportjaicsoportjai

• Összekapcsolható reverz transzkriptáz Összekapcsolható reverz transzkriptáz reakcióval: mRNS-ek ezen keresztül reakcióval: mRNS-ek ezen keresztül mikroorganizmusok aktivitásának mérése mikroorganizmusok aktivitásának mérése

PCR alkalmazásaiPCR alkalmazásai

• Környezeti minták vizsgálataKörnyezeti minták vizsgálata• Speciális enzimek termelődésének Speciális enzimek termelődésének

vizsgálatavizsgálata• Újabban fehérje PCR!Újabban fehérje PCR!

Köszönöm a figyelmet!Köszönöm a figyelmet!