analisis toksikologi forensik dan klinik
Post on 02-Jun-2018
276 Views
Preview:
TRANSCRIPT
-
8/10/2019 Analisis Toksikologi Forensik Dan Klinik
1/34
ANALISIS TOKSIKOLOGI
FORENSIK DAN KLINIK
Determination of Chronic Abuse of The Anaesthetic Agents
Midazolam and Propofol as Demonstrated by Hair Analysis
-
8/10/2019 Analisis Toksikologi Forensik Dan Klinik
2/34
Kelompok 3
Putu Wida Kawistari 1008505006
Putu Hediarta Widiana Putra 1008505080Putu Yudha Ugrasena 1008505082
-
8/10/2019 Analisis Toksikologi Forensik Dan Klinik
3/34
Kasus
Seorang perawat wanita di departemen anestesiologi berumur 44
tahun ditemukan tewas di rumahnya. Pada kasus ini, ditemukan sebuah
botol kosong Hypnovel (midazolam 5 mg/5 mL) dan jarum suntik di
dekat mayat. Pada tubuh korban tidak menunjukkan adanya tanda-
tanda kekerasan, tetapi terdapat beberapa bekas jarum pada lengandan kongesti paru pada saat otopsi. Darah femoral dan berbagai jenis
rambut dikumpulkan untuk investigasi toksikologi. Helaian rambut di
kepala (panjang 6 cm) dipotong sedekat mungkin dengan kulit
menggunakan gunting kecil pada bagian posterior vertex dan disimpan
dalam tabung plastik kering pada suhu kamar. Tidak ada penggunaankosmetik yang diaplikasikan ke rambut (misalnya pengeritingan,bleaching, dying hair, dll). Sampel rambut ketiak dan kemaluan juga
dipotong sedekat mungkin dengan kulit menggunakan gunting kecil dan
disimpan dalam tabung kering pada suhu kamar. Warna untuk semua
spesimen rambut adalah coklat (Cirimeleet al., 2002).
-
8/10/2019 Analisis Toksikologi Forensik Dan Klinik
4/34
Tujuan
Tujuan Analisis
Untuk analisis agen anestesi dalam sampel rambut yaitu
midazolam dengan metode GC-MS mode ionisasi kimia negatif
(NCI) dan propofol dengan metode HS-GC/MS yang sensitifdan spesifik dalam menyelesaikan kasus forensik.
Tujuan Aspek Forensik
Untuk membuktikan adanya penyalahgunaan senyawamidazolam dan propofol yang terdapat pada sampel rambut
perawat wanita yang tewas di rumahnya.
-
8/10/2019 Analisis Toksikologi Forensik Dan Klinik
5/34
Aspek Forensik
Dalam kasus ini, peran ilmu forensik digunakan untuk mengetahui
apakah kasus ini termasuk tindak kriminal sebagai masalah hukum
atau termasuk tindak kriminal masalah teknis.
Konsentrasi senyawa midazolam dan propofol dalam darah
korban tidak memenuhi untuk menimbulkan efek toksisitas.
Sehingga dicurigai bahwa korban telah menyalahgunakan agen
anestesi tersebut dalam jangka panjang. Untuk mengetahui
riwayat penggunaan obat yang kronis, sampel biologi yang
dapat digunakan adalah rambut. Dengan bantuan ilmu forensik, dapat disimpulkan penyebabnya
adalah bunuh diri. Oleh sebab itu penyidik tidak perlu melakukan
penyidikan selanjutnya guna mencari siapa pelaku dari peristiwa
tersebut, karena kematian diakibatkan oleh perbuatannya sendiri.
-
8/10/2019 Analisis Toksikologi Forensik Dan Klinik
6/34
Uraian Masalah
Masalah Analisis
Sampel biologis yang paling banyak digunakan dalam analisis
toksikologi adalah berupa urin dan plasma. Namun, eliminasi
obat dalam sampel tersebut terjadi dalam beberapa hari saja,sehingga untuk mengetahui tepatnya tingkat toksisitas pasien,
biasanya diperlukan analisis toksikan yang berulang baik dari
darah maupun urin, sehingga dalam kasus ini digunakan sampel
rambut.
Diperlukan suatu metode analisis yang cepat, sensitif, dan
spesifik dalam penentuan midazolam dan propofol pada
sampel rambut.
-
8/10/2019 Analisis Toksikologi Forensik Dan Klinik
7/34
Uraian Masalah
Masalah Forensik
Ditemukan sebuah botol kosong Hypnovel (midazolam 5 mg/5
mL) dan jarum suntik di dekat mayat, serta tidak ditemukannya
tanda-tanda kekerasan pada tubuh korban, sehingga didugaperawat tersebut meninggal akibat penyalahgunaan
midazolam dan propofol.
Apakah kasus tersebut termasuk tindak kriminal sebagai
masalah hukum atau tindak kriminal sebagai masalah teknis?
-
8/10/2019 Analisis Toksikologi Forensik Dan Klinik
8/34
Tinjauan Pustaka
Midazolam
Midazolam, yang juga dikenal sebagai Hypnovel, merupakan
water soluble benzodiazepine yang terikat dalam albumin
plasma. Midazolam termasuk psikotropika golongan IV yang pertama
kali dibuat tahun 1976 oleh Fryer dan Walser. Tujuan
pemberian utamanya adalah sebagai obat penenang atau
hipnotis serta digunakan dalam prosedur medis dan bedah. Paparan midazolam terhadap pH darah juga mengubah
strukturnya dariwater-solublemenjadilipid-solubleyang mampu
melewati sawar darah otak untuk meningkatkan akses menuju
sistem saraf pusat.
-
8/10/2019 Analisis Toksikologi Forensik Dan Klinik
9/34
Tinjauan Pustaka
Midazolam
Rumus molekul : C18H13ClFN3
Berat molekul : 325,8 g/mol
Pemerian : Kristal tidak berwarna Kelarutan : Larut dalam air
Titik leleh : 158-1600C
pKa : 6,2
Koefisien partisi : Log P (oktanol/air) 4,3
-
8/10/2019 Analisis Toksikologi Forensik Dan Klinik
10/34
Tinjauan Pustaka
Propofol
Propofol merupakan derivat fenol yang banyak digunakan
sebagai anastesia intravena dan lebih dikenal dengan nama
dagang Diprivan. Propofol digunakan untuk induksi dan pemeliharaan dalam
anastesia umum dengan pemakaian propofol, maka
didapatkan kesadaran yang lebih cepat kembali dengan
efek residul yang minimum pada sistem saraf pusat jikadibandingkan dengan obat induksi lainnya.
-
8/10/2019 Analisis Toksikologi Forensik Dan Klinik
11/34
Tinjauan Pustaka
Propofol
Rumus molekul : C12H18O
Berat molekul : 178,3 g/mol
Kelarutan : Sangat sukar larut dalam air Titik leleh : 190C
pKa : 11,1
Koefisien partisi : Log P (oktanol/air) 3,79
-
8/10/2019 Analisis Toksikologi Forensik Dan Klinik
12/34
Tinjauan Pustaka
Preparasi Sampel Biologis (Rambut)
Keuntungan tes rambut dibandingkan dengan urine atau darah
adalah mempunyai jendela pengamatan yang besar (mingguke bulan, tergantung dari panjang batang rambut, 2-4 hari
untuk obat dalam urine dan darah) serta mampu membedakan
antara chronic use atau single exposure. Biasanya analisis
rambut disertai juga dengan analisis urin atau darah. Analisisrambut digunakan untuk mengetahui data jangka panjang
sedangkan analisis urin atau darah untuk informasi jangka
pendek.
Prosedur pengambilan rambut untuk analisis belum terstandarisasi.
-
8/10/2019 Analisis Toksikologi Forensik Dan Klinik
13/34
Tinjauan Pustaka
GC-MS
Pemisahan pada kromatografi gas didasarkan pada titik didih suatu
senyawa dikurangi dengan semua interaksi yang mungkin terjadi
antara solut dengan fase diam. Fase gerak yang berupa gas
akan mengelusi solut dari ujung kolom lalu menghantarkannya ke
detektor. Spektrometri massa didasarkan pada pergerakan
partikel yang bermuatan (ion) dalam bidang listrik atau magnetik
berdasarkan rasiom/zdari ion tersebut
Pengoperasian GC/MS dalam mode SIM memungkinkan untukmendeteksi analit tertentu dengan meningkatnya kepekaan relatif
terhadap mode full scan. Dalam mode SIM, MS mengumpulkan
data massa lebihinterestdaripada mencari semua massa dalam
semua rentang.
-
8/10/2019 Analisis Toksikologi Forensik Dan Klinik
14/34
Metode Analisis
GC/MS denganNCI deteksi
chromatograph (LC sistem
Alliance)
Tabung kaca head space
Kolom kapiler HP wax (30 m
0.25 mm I. D. 0.25 mm tebal
film)
Detektor selected ion monitoringDan beberapa peralatan lain
sesuai keperluan analisis.
Methylene klorida
Tetrahydofuran (THF)
Soerensen buffer pH 7,6 Diazepam deuerated
Diethyl eter / kloroform
N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide
1% trimethylchlorosilane. Rambut Perawat (dari ketiak,
kepala, pubis) dengan panjangberbeda
Rambut selain perawat (Blank)
Alat Bahan
-
8/10/2019 Analisis Toksikologi Forensik Dan Klinik
15/34
A. Preparasi Larutan Stok Standar
Larutan Stok Midazolam, 1-OH-midazolam, dan Propofol
Larutan stok disiapkan dalam metanol pada konsentrasi 400 g/ml dan
disimpan pada suhu -20OC. Dibuat larutan kerja 400 ng/mL
Larutan Internal Standar (Diazepam terdeuterasi) untuk Midazolam dan 1-
OH-midazolam Larutan stok Diazepam dibuat pada konsentrasi 100 g/mL. Dibuat
Larutan baku kerja internal sebesar 5 ng/mL
Larutan Internal Standar (THF) untuk Propofol
Disiapkan stok tetrahidrofuran (THF) pada konsentrasi 100 g/mL. Dibuatlarutan kerja baku internal sebesar 5 ng/mL
Pembuatan Buffer
KH2PO4(38,8 mL) (9,07 g/ml) dicampur dengan 61,2 ml (11.87 g/ml)
Na2HPO4dan diatur pH nya menjadi 7,6 dengan 1M NaOH. Bufferdisimpan selama 1 bulan pada temperatur hangat dalam termos gelap.
-
8/10/2019 Analisis Toksikologi Forensik Dan Klinik
16/34
C. Penanganan Sampel Rambut (Prosedur Ekstraksi)
untuk Analisis Midazolam, 1-OH-midazolam
Untuk melakukan validasi metode, rambut kepala tanpa obat digunakan sebagaispesimen kosong (blanko). Rambut perawat yang telah dilakukan pencucian
berturut-turut dalam metilen klorida dipotong-potong menjadi 3 bagian.
Dari akar 2 cm, 2-4 cm, dan 4-6 cm. Rambut dari ketiak dan pubis jugadikumpulkan dan dicuci dengan metilen klorida.
Rambut kemudian dihaluskan dalam ball mill dan 50 mg bubuk rambut
diinkubasi dalam 1 ml larutan penyangga pH 7,6 semalaman pada suhu 40Cdengan diazepam deuterateddigunakan sebagai standar internal sebesar 50 ng.
Setelah ekstraksi dengan 5 ml dietileter : kloroform (80:20 v/v), fase organik
diuapkan dan ekstrak kering diderivatisasi dengan 35 ml N,O-bis (trimetilsilil)
trifluoroacetamide dan 1 % trimetilklorosilan.
-
8/10/2019 Analisis Toksikologi Forensik Dan Klinik
17/34
D. Penanganan Sampel Rambut (Prosedur Ekstraksi)
untuk Analisis Propofol
Setelah dicuci berturut-turut dalam metilen klorida, rambut dipotongmenjadi segmen kecil 1 mm dengan gunting.
Sebanyak 50 mg ditambahkan ke tabung 20 ml kaca head-spacedengan tetrahidrofuran (THF) sebagai standar internal danditambahkan 1 ml larutan penyangga pH 7,6.
Tabung disegel dan diinkubasi semalaman pada suhu 40C.
-
8/10/2019 Analisis Toksikologi Forensik Dan Klinik
18/34
E. Analisis Midazolam, 1-OH-midazolam dengan GC-
MS
Analisis dilakukan dengan menggunakan metode GC/MS dalam
mode NCI. Alikuot 1,5 l dari derivatisasi ekstrak diinjeksikan
dengan suhu injektor 250C ke kolom kapiler HP-5MS (30 m
0,25 mm ID 0,25 pM ketebalan Film).
Pemisahan dicapai dengan kecepatan alir konstan dari 1,0
ml/menit dari gas pembawa helium menggunakan suhu oven awal
60C dipertahankan selama 1 menit, kemudian naik 30C/menit
sampai 295C dan suhu akhir dipertahankan selama 6 menit.
Metana digunakan sebagai gas reaktan pada tekanan 1,3 Torr
dalam sumber ion. Spektrum massa yang direkam dalam mode fullscan 250-450 Amu.
-
8/10/2019 Analisis Toksikologi Forensik Dan Klinik
19/34
Analit diidentifikasi berdasarkan waktu retensi
relatif mereka dan spektrum massa tertentu,
yaitu midazolam dengan waktu retensi 10,08
menit, m/z 325-327; 1 - OH - midazolamdengan waktu retensi 10,64 menit, m/z 325-
413-415; diazepam-d5dengan waktu retensi
9,55 menit, m/z 289. Kuantifikasi dilakukansetelah penentuan faktor respon terhadap
diazepam-d5.
Cont...
-
8/10/2019 Analisis Toksikologi Forensik Dan Klinik
20/34
F. Analisis Propofol dengan GC-MS
Campuran yang telah homogen dianalisis secara langsung dengan sistem
operasi HS-GC/MS mode tumbukan elektron (electronic impact).
Untuk proses volatilisasi, tabung yang diberi tekanan selama 15 menit pada
80C dalam HS 40 (Perkin Elmer) dan aliquot dipindahkan ke kromatografigas (Hewlett Packard 5890) di bawah tekanan helium 100 kPa.
Kromatografi dioperasikan pada kolom lilin kapiler HP (30 m 0,25 mm ID
0,25 mm ketebalan film) menggunakan suhu oven berikut: 45C selama 3menit, 10C/menit sampai 180C dan 30C/menit sampai 240C.
Deteksi dilakukan dengan detektor massa selektif Hewlett Packard 5971menggunakan modeSelected ion monitoring(SIM).
-
8/10/2019 Analisis Toksikologi Forensik Dan Klinik
21/34
Propofol diidentifikasi berdasarkan waktu
retensi dan kelimpahan relatif tiga ion
mengkonfirmasikan: propofol dengan waktu
retensi 18,34 menit, m/z 117-163-178; THFdengan waktu retensi 2,13 menit, m/z 72.
Kuantifikasi Propofol dibuat setelah penentuan
faktor respon terhadap THF.
Cont...
-
8/10/2019 Analisis Toksikologi Forensik Dan Klinik
22/34
-
8/10/2019 Analisis Toksikologi Forensik Dan Klinik
23/34
Presisi
Presisi ditentukan dengan simpangan baku dan simpangan
baku relatif dari larutan sampel yang ditetapkan. Simpangan
baku ditentukan menggunakan rumus berikut:
Nilai presisi midazolam dan 1-OH-midazolam padakonsentrasi 0.5 ng/mg masing-masing sebesar 6.3% dan
8.1%. Nilai presisi propofol pada konsentrasi 0,5 ng/mg
adalah 6,0%.
-
8/10/2019 Analisis Toksikologi Forensik Dan Klinik
24/34
Akurasi
Data AUC dari pengukuran rentang linearitas digunakan kembali
untuk menentukan akurasi metode ini. Caranya adalah dengan
menghitung perolehan kembali Midazolam, 1-OH-midazolam dan
propofol yaitu mensubstitusikan nilai masing-masing AUCpengukuran pada persamaan regresi y = bx + a. Jadi, perolehan
kembali dihitung dengan rumus :
Pada analisis Midazolam dan 1-OH-midazolam, nilai akurasi
adalah rata-rata persen perolehan kembali untuk konsentrasi 0,5
ng/mg sebesar 93,8% dan 90,2%. Persen perolehan kembali untuk
propofol konsentrasi 0,5 ng/mg sebesar 27%.
%100sebenarnyakadar
pengukuranhasildarikadarkembaliPerolehan
-
8/10/2019 Analisis Toksikologi Forensik Dan Klinik
25/34
LOD dan LOQ
Batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ) ditentukan denganmenghitung simpang baku residual yang membandingkan hasil pengukurandengan hasil perhitungan. Rumus yang digunakan adalah:
Q = LOD (batas deteksi) atau LOQ (batas kuantitasi)
Sb = simpangan baku residual
k = konstanta yaitu 3 untuk LOD atau 10 untuk LOQ
Sl = arah garis linear (kepekaan arah) dari kurva antara responterhadap konsentrasi = slope (b pada persamaan garis y = a + bx)
Nilai LOQ Midazolam, 1-OH-midazolam, propofol pada kasus ini adalah1,05 ng/mg.
-
8/10/2019 Analisis Toksikologi Forensik Dan Klinik
26/34
-
8/10/2019 Analisis Toksikologi Forensik Dan Klinik
27/34
Cont..
Pencucian dengan metilen klorida untuk
menghilangkan pengotor-pengotor selain
analit pada sampel.
Pemotongan rambut menjadi beberapa bagian
dari akar untuk mengetahui deposisi analit
ada pada bagian rambut yang mana yang
ditunjukkan dengan kadar tertinggi analitpada bagian rambut tertentu.
-
8/10/2019 Analisis Toksikologi Forensik Dan Klinik
28/34
Cont..
Analisis Midazolam dan 1-OH-midazolam derivatisasi GC/MS negative chemical ionization(NCI) menghilangkan gangguan bahan kimiasehingga menyediakan kemampuan untuk mengukur
dalam matriks yang kompleks.Headspace (HS) GC/MS analisis dengan kuat,
teknik sepenuhnya otomatis untuk penentuan melacaksenyawa organik volatil dengan jumlah sedikit
menghindari kesalahan karena kontaminasi silangdengan gelas dan hilangnya komponen volatil selamatransfer sampel.
-
8/10/2019 Analisis Toksikologi Forensik Dan Klinik
29/34
Cont..
Linearitas: untuk midazolam konsentrasi mulai0,05 - 5,00 ng/mg (r = 0,97 dan 0,96) danpropofol konsentrasi mulai 0,1 - 10,00 ng/mg (r= 1,00).
Presisi & perolehan kembali: midazolam 6,3 dan93,8%; 1-OH-midazolam 8,1 dan 90,2%;propofol 6,0 dan 27% (untuk konsentrasi 0,5ng/mg).
Rasio signal-to-noise: midazolam 35 pada titikkalibrasi terendah 0,05 ng/mg; propofol padatitik kalibrasi terendah 0,01 ng/mg.
-
8/10/2019 Analisis Toksikologi Forensik Dan Klinik
30/34
Tabel 1. Hasil analisis dari midazolam, 1-OH midazolam (1-OH-
M) and propofol pada tipe rambut yang berbeda
-
8/10/2019 Analisis Toksikologi Forensik Dan Klinik
31/34
-
8/10/2019 Analisis Toksikologi Forensik Dan Klinik
32/34
Cont..
Hasil kromatogram ion mode deteksi NCI: identifikasimidazolam waktu retensi 10,08 menit, m/z 325-327, 1-OH-midazolam dengan waktu retensi 10,64 menit, m/z325-413-415, diazepam-d5dengan waktu retensi 9,55
menit, m/z 289. Kuantifikasi dilakukan setelah penentuan faktor respon
terhadap diazepamd5.
berdasarkan waktu retensi dan kelimpahan relatif tiga ion
dengan hasil waktu retensi propofol 18,34 menit, m/z 117-163-178, THF dengan waktu retensi 2,13 menit, m/z 72.
Kuantifikasi Propofol dibuat setelah penentuan faktorrespon terhadap THF.
-
8/10/2019 Analisis Toksikologi Forensik Dan Klinik
33/34
Kesimpulan
Penyalahgunaan agen oleh staf medis untuk tujuanhiburan sudah banyak diketahui tetapi bukti analisissering kurang. Etanol yang ditemukan dalam darahjuga dapat menjadi pemicu kematian dalam kasus ini.
Dalam situasi ini, analisis rambut dapat menjadipengatasannya. Hasil analisis yang dilakukanmenunjukkan GC / MS-NCI dapat digunakan untukmendeteksi agen anastesi dalam rambut manusia. Sifatfisiko-kimia propofol mendukung untuk dilakukannya
headspace preparation dari spesimen rambut dandilakukan pengembangan metode asli yang tidakmemerlukan prosedur ekstraksi yang lama.
-
8/10/2019 Analisis Toksikologi Forensik Dan Klinik
34/34
top related