aula de engenharia genética sobre enzimas de restrição

Enzimas de Restrição

Profª Drª Marta F. Bastos

• São proteínas que aumentam a velocidade das reações químicas

• Na ausência destas, diversas reações químicas do metabolismo celular não ocorreriam

Enzimas

Enzimas de Restrição- Histórico

AL

GA

RIS

MO

Enzimas de Restrição- Histórico

Enzimas de Restrição- Histórico

Enzimas de Restrição- Histórico

Enzimas de Restrição- Histórico

Enzimas de Restrição- Histórico

• Avery, MacLeod, McCarty (1944) demonstraram a transformação de uma cepa avirulenta de Streptococcus

penumoniae;

• DNA como elemento transformante

Enzimas de Restrição - Histórico

• Watson & Crick (1953):propõem o modelo da dupla

hélice de DNA, baseados nos

resultados de difração de raioX de Franklin & Wilkins.

Procurar um gene dentro de um genoma humano é

comparável a procurar uma pessoa sem sobrenome

em uma casa sem endereço em uma rua

desconhecida em uma cidade não identificada de um

país estrangeiro.

Solange Farah

Enzimas de Restrição- Histórico

• Estudos em Microbiologia sugeriam que bactériasapresentavam mecanismos de defesa para proteção

contra infecções virais.

Enzimas de Restrição- HISTÓRICO

Enzimas de Restrição- HISTÓRICO

Enzimas de Restrição- HISTÓRICO

• Arber (1962): microscopia eletrônica de bactérias E. coli

e bacteriófagos Lambda fornecem a primeira evidência daexistência de enzimas que restringem o crescimento viral

devido ao reconhecimento e a quebra do DNA estranho.Arber & Linn. DNA modification and restriction. Ann Rev Biochem, 1969 .

• Smith & Wilcox (1970): enzimas que cortam DNA em

Haemophilus influenzae.

Por que o DNA bacteriano também não é clivado?

Enzimas de Restrição

• Metilação do DNA bacteriano

Enzimas de Restrição- HISTÓRICO

• Nathans & Smith (1975): purificação das enzimas por métodos de cromatografia e digestão do DNA de SV40.

Eletroforese

Enzimas de Restrição- DEFINIÇÃO

• São enzimas que atuam como tesouras químicas

cortando DNA em seqüências específicas.

• Tipo I: reconhece específicas sequências de DNA

porém cortam em locais que podem estar a 1000 pb

de distância do sítio de reconhecimento da enzima;

Ex: EcoAI GAGNNNNNNNGTCA

EcoKI AACNNNNNNGTGC

StySPI AACNNNNNNGTRC

Enzimas de Restrição - TIPOS

• Tipo II: que reconhece e corta diretamente dentro do

sítio de reconhecimento;

Ex: EcoRI G/AATTC

BalI TGG/CCA

PstI CTGCA/G

Enzimas de Restrição - TIPOS

• Tipo III: Corte a 24-26 pb a jusante da sequência de

reconhecimento que é assimétrica e de 5 a 7 pb

Ex: EcoP151 CAGCAG

EcoPI AGACC

HinfIII CGAAT

Enzimas de Restrição - TIPOS

Enzimas de Restrição tipo II

• Estrutura heterodimérica

Enzimas de Restrição

Importância do íon Magnésio para o reconhecimento específico

Enzimas de Restrição

Produtos comercializados

Produtos comercializados

Enzimas de Restrição

Enzimas de Restrição

• Reconhecem e cortam o DNA em pontos específicos,

geralmente em seqüências de 4 a 8 pares de bases,

chamados palíndromos.

Enzimas de Restrição- DEFINIÇÃO

RADAR ARARA ANA

5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’

Enzimas de Restrição- NOMENCLATURA

• Nome da enzima é a abreviação do nome da espécie

bacteriana do qual foi isolada.

- 1ª letra: Maiúscula e representa o gênero

- Duas outras letras: representam a espécie

- Outras letras indicam a linhagem ou cepa bacteriana

- Algarismos romanos indicam a ordem da descoberta

Enzimas de Restrição- NOMENCLATURA

Microorganismo EnzimaSítio de

reconhecimento

Enzimas de Restrição

• Tipos de extremidades formadas após digestão

Extremidades cegas

Enzimas de Restrição

• Tipos de extremidades formadas após digestão

Extremidades coesivas

Microorganismo EnzimaSítio de

reconhecimentoExtremidades

Enzimas de Restrição

Enzimas de Restrição

Enzimas de Restrição- Aplicações

• Clonagem Molecular

- Mutações dentro de sítios de restrição altera o

tamanho dos fragmentos gerados e assim a posição

das bandas na eletroforese .

- A existência de diversidade genética em uma

população é denominada polimorfismo, porém

mutações podem causar doenças e algumas podem

ser detectadas por RFLP.

Enzimas de Restrição- Aplicações

• RFLP (Restriction fragment length polymorphism)

• RFLP- Detecção de Mutações

Enzimas de Restrição- Aplicações

• RFLP- Genotipagem

Enzimas de Restrição- Aplicações

• RFLP- Genotipagem

Enzimas de Restrição- Aplicações

Fig. 1. Restriction fragments obtained by digestion with Hinf I and Hae III of PCR’s amplicom using

primers PM2 lower and PM2 upper and template DNA of reference strains ATCC 33270, HG 1467

and HG1259 and some clinical isolates (26, 36, 243 and 583). (MM – molecular marker 100bp –

Fermentas).(a) profiles not expected and observed during the tests.

Enzimas de Restrição- Mapas de Restrição

Enzimas de Restrição- Mapas de Restrição

ATIVIDADE

O tratamento de uma molécula de DNA com tamanho de 8

kb com a endonuclease de restrição EcoRI resulta em dois

fragmentos: de 3 e 5 Kb. A digestão da mesma molécula com

Hin DIII gera os fragmentos de 1,5 e 6,5 Kb. Finalmente, a digestão

com as duas enzimas resulta em fragmentos de 1,5, 3 e 3,5.

Desenhe o mapa de restrição, indicando os sítios de clivagem de

EcoRI e HinDIII.