az rkpm fehérje funkciójának...
Post on 12-Mar-2019
214 Views
Preview:
TRANSCRIPT
Az RkpM fehérje funkciójának elemzése
DIPLOMAMUNKA
Készítette: PÁLVÖLGYI ADRIENN Biológus hallgató
Témavezető: DR. PUTNOKY PÉTER Pécsi Tudományegyetem, Természettudományi Kar
Genetikai és Molekuláris Biológiai Tanszék
PÉCS, 2004
PA_DIP04.doc
2
TARTALOMJEGYZÉK
1. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 3 1.1. Bevezetés 3 1.2. Nitrogénkötő szervezetek 3 1.3. A szimbiózis kialakulása 4
1.3.1 A Nod faktor 5 1.3.2 A nitrogénkötésért felelős gének 5
1.4. Sejtfelszíni poliszacharidok 6 1.4.1. Az exopoliszacharidok 6 1.4.2. A lipopoliszacharidok 7 1.4.3. A kapszuláris poliszacharidok 7
2. A MUNKA ELŐZMÉNYEI 12 2.1. Spontán mutáns baktériumtörzsek izolálása 12 3. CÉLKITŰZÉSEK 14 4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 15
4.1. Baktériumok, bakteriofágok, plazmidok 15 4.2. A baktériumok növesztése 16
4.3. Fágok szaporítása 16 4.4. A baktériumok keresztezése 16 4.5. Fágérzékenységi teszt 16 4.6. Összes DNS izolálás 17 4.7. Plazmid DNS izolálás 17 4.8. Polimeráz láncreakció (PCR) 18 4.9. Fragmentizolálás 18 4.10. DNS szekvenálás 19 4.11. Restrikciós emésztés 19 4.12. Gélelekroforézis 19 4.13. Kompetens sejt készítés 20 4.14. Ligálási reakció 20 4.15. Transzformálás 20 4.16. In vitro transzpozíciós mutagenezis 20
4.17. Bioinformatikai módszerek 21 5. EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK 22
5.1 Az rkp-4046 mutáció helyének meghatározása 22 5.2. A 16-3 bakteriofág receptor kialakításában részt vesz az RkpM fehérje 23 5.3. Az rkpM4046 allélban egy missense mutáció található 23 5.4. Újabb mutánsok vizsgálata 26 5.5. Komplementációs kísérlet a receptorfunkció bizonyítására 26 5.6. Az rkpM klónozása egy erős promoter után 29 5.7 Az rkpM expresszió hatása különböző mutáns törzsekben 31 5.8. Az rkpM gén bioinformatikai analízise 32
5.8.1. PLP kötés a DegT/EryC/DnrJ/StrS aminotranszferáz családnál 33 5.8.2. Az RkpM fehérje DNS-kötő domént tartalmaz? 35 5.8.3 A bioinformatikai elemzések eredményeinek értékelése 37
6. ÖSSZEFOGLALÁS 39 7. IRODALMI HIVATKOZÁSOK 40 8. RÖVIDÍTÉSEK 45 KÖSZÖNETNYÍLVÁNÍTÁS 46
PA_DIP04.doc
3
1. IRODALMI ÁTTEKINTÉS
1.1. Bevezetés
A biológiai nirtogénkötés igen fontos szerepet tölt be az ökoszisztémában, része a
folyamatos nitrogénkörforgásnak. A folyamatban számos baktérium vesz részt. A lebontó
szervezetek által a szerves nitrogén vegyületek ammóniává alakulnak (ammonifikáció), illetve
a légkörből nitrogénfixálás során a nitrogéngáz szintén ammóniává redukálódik. A redukált
ammónia bizonyos arányát nitrifikáló baktériumok nitráttá oxidálják, mely denitrifikáció
segítségével nitrogéngáz formájában újra a légkörbe juthat. A Föld légkörének 78%-át
nitrogéngáz alkotja, ennek nagy részét a diazotróf szervezetek biológiai úton redukálják
(Burns and Hardy, 1975). A növények egyik alapvető tápanyagforrása a talajból, kötött
formában felvett nitrogén (nitrát, nitrit, ammónia). A növényekkel szimbiózist kialakító
diazotróf baktériumok a légköri nitrogéngázt redukálják ammóniává, így az együttélés
lehetőséget biztosít arra, hogy kimeríthetetlen nitrogén utánpótlásként szolgáljon a
gazdanövények számára.
1.2. Nitrogénkötő szervezetek
Nitrogénkötésre a cianobaktériumok mellett még néhány, szintén prokarióta szervezet
képes. Leghatékonyabban a szimbiózisban élő baktériumok alkalmasak a nitrogénkötésre, de
léteznek szabadonélő szervezetek is, mint a Klebsiella, Rhodospirillum, Azotobacter és
Clostridium fajok. A szimbiotikus baktériumok a növénytől kapják meg a nitrogénkötéshez
szükséges energiát. A cianobaktériumok mindenütt előforduló fotoautotróf prokarióták
(Rippka et al., 1979). Ismerünk mind szabadon (Noctoc spp., Chlorogleosis spp.), mind
szimbiózisban élő fajokat (Nostoc spp., Chalotrix spp.) (West and Adams, 1997). Ezen
szervezeteknél a nitrogénfixálás és fotoszintézis együtt zajlik, de külön differenciálódott
sejtekben. A nitrogén fixálása heterociszta sejtekben, a fotoszintézis vegetatív sejtekben
történik (Wolk et al., 1994). A Nostoc fajok számos élőlénnyel képesek a szimbiózis
kialakítására, úgymint az Azolla moha, a nyitvatermő cikász és a zárvatermő Gunnera
növényekkel (Schenk, 1992). A rhizobiumok, a Rhizobiaceae családba tartozó, Gram-negatív,
diazotróf talajbaktériumok (Rhizobium, Azorhizobium, Bradyrhizobium, Sinorhizobium,
Mezorhizobium), szimbiózist tudnak kialakítani a pillangósvirágú (Fabaceae) növényekkel
(Dénairé et al., 1992), illetve a nem pillangósvirágú Parasponia fajokkal (Becking, 1992).
A szimbiózis legfejlettebb formája az endoszimbiózis, melyet a rhizobiumok is
alkalmaznak, partnerspecifikus módon jön létre. Ebben az esetben egy kölcsönösen hasznos
együttélésről van szó (Allen and Allen, 1981). A baktérium megfelelő, redukált
PA_DIP04.doc
4
nitrogénforrással látja el a növényt, míg a gazdanövény tápanyagot biztosít a baktérium
számára. A vizsgálatunk tárgyát képező Sinorhizobium meliloti (régebbi nevén Rhizobium
meliloti), szimbiotikus kapcsolatot képes kialakítani a lucerna (Medicago), lepkeszeg
(Trigonella) és a somkóró (Melilotus) fajokkal. E különleges baktérium-növény kapcsolat
régóta kutatott téma a világon, mind a Sinorhizobium meliloti, mind más rhizobium fajok
esetében (pl. Sinorhizobium fredii).
1.3. A szimbiózis kialakulása
A rhizobium és pillangósvirágúak közötti szimbiózis létrejöttének mechanizmusa
hasonló a patogén baktériumok és az eukarióta sejtek kapcsolódásához (Hentschel et al.,
2000). A szimbiózis kialakulása, igen összetett folyamat, mely komplex molekuláris jelcserén
alapszik. Első lépésként a gazdanövény különféle, flavonoid típusú vegyületeket bocsájt ki a
talajba (Redmond et al., 1986), ami pozitív kemotaxist vált ki (Currier and Strobel, 1974).
Ennek hatására a baktériumok feldúsulnak a növény rhizoszférájában. A flavonoidok, melyek
molekula szerkezete fajspecifikus (Bladergroen and Spaink, 1998), aktiválják a
baktériumsejtekben található un. nodulációs (nod) gének expresszióját, aminek következtében
a baktérium a növény felé kiválaszt egy szignált, a Nod faktort (Schultze et al., 1994), mely
többek között a szimbiótikus gümő kialakulását indukálja. A fertőzés során a baktériumok a
gyökérszőrőkhöz tapadnak (Mills and Bauer, 1985), a tapadást a növény által kiválasztott
lectinek biztosítják (Diaz et al., 1989). Ezután történik a gyökérszőrök meggörbülése. A
fertőzési helyen a sejtfal leépül és egy sejtfalösszetevőkből álló, újonnan lerakódó, belső
csőszerű képlet, az infekciós fonal jön létre, mely folyamatosan növekszik, elágazik
(Robertson and Lyttleton, 1982). Ezáltal jutnak el a baktériumok a gyökérszőrsejtektől a
gümősejtekig, ahol a növényi sejt citoplazmájába endocitózissal lépnek be. A gümősejt
belsejébe került baktériumok peribakteroid membránnal határoltak (Mellor and Werner, 1987).
Mialatt a növény gyökerén kialakul a külön növényi szervként funkcionáló gümő
(Dudley et al., 1987), a baktériumok fiziológiai és morfológiai változásokon mennek
keresztül, egy időleges sejtorganellummá, un. bakteroiddá alakulnak. Miután megtörtént a
baktériumok differenciálódása, megindul a nitrogenáz enzimkomplexet kódoló gének
expressziója, így a szimbiotikus gümő alkalmassá válik a légköri nitrogén redukálására. A
bakteroidok és a növény közötti anyagcseretermékek transzportja a szállítónyalábokon
keresztül történik (Newcomb, 1981).
A gümőfejlődésnek két típusát ismerjük. Az elkülönítés az állandó merisztéma meglétén,
illetve hiányán alapszik (Luyten and Vanderleyden, 2000). Determinált gümő esetében a külső
PA_DIP04.doc
5
kéregsejtekből indul a fejlődés, a merisztematikus aktivitás megszűnik a gümő kifejlődésével.
Determinált gümőt a szója (Glycine max), bab (Phaseolus vulgaris) fajokon kívül más, főleg
trópusi pillangósvirágú (Fabaceae) növény tud létrehozni. Indeterminált gümő esetében pedig
a belső kéregsejtek állandó merisztematikus aktivitása jellemző, folyamatos növekedést
biztosítva ezzel. Az indeterminált gümő, példaként említve a borsó (Pisum sativum), bükköny
(Vicia sp.), lucerna (Medicago sp.) növényeknél fordul elő (Hirsch, 1992). A Sinorhizobium
meliloti indeterminált, a Sinorhizobium fredii determinált gümőképződést indukál.
1.3.1 A Nod faktor
A Nod faktornak fontos szerepe van a szimbiotikus gümő kialakításában, különféle
növényi választ vált ki: a gyökér belső kéregsejtjei között dedifferenciáció és mitózis
inicializálása, mely során egy új osztódószövet alakul ki, a gümőmerisztéma (Dudley et al.,
1987), a növényi gének indukciója, a kálcium oszcilláció (Ehrhardt et al., 1996; Geurts and
Bisseling, 2002), a gyökérszőrök görbülése (Catoira et al., 2000), infekciós fonal növekedése
(Gage and Margolin, 2000). A nod génekben mutáns baktériumok nem képesek a
gümőképződés elindítására (Nod- fenotípus). A nod géneket (pSymA megaplazmidon
találhatóak) két csoportra oszthatjuk, az egyik csoportba (közös nod gének, nodA, nodB,
nodC) azok a gének tartoznak, melyek a Nod faktor alapszerkezetének kialakítását végzik, a
többi gén (nodFEG, nodH, nodPQ) a gazdaspecificitás szempontjából fontos. A növényi
szignált (flavonoidok) a NodD fehérje képes felfogni, ez a fehérje aktiválja a többi nod gént,
kapcsolódik a nod box-ként ismert konzerválódott szekvenciához. Ezzel ellentétes a represszor
hatású, kromoszómán található nolR gén. A két regulátor fehérje (NodD, NolR) biztosítja a
nod gének megfelelő szabályozását. A Nod faktor szerkezete egységesen lipo-kito-
oligoszacharid molekulákból állnak, erre a gazdaspecifitásért felelős gének különböző
oldalláncokat helyeznek (Denarie and Debelle, 1996; Mergaert et al., 1997), így a különböző
szerkezetű molekulák meghatározzák, hogy a baktérium mely növényt képes megfertőzni. A
Nod faktor szekréciójáért a nodIJ gének felelősek.
1.3.2 A nitrogénkötésért felelős gének
A nitrogénkötés megfelelő létrejöttéhez alacsony oxigén tenziójú (mikroaerofil)
környezetre van szükség, ezt a növényi citoszolban lokalizálódó leghemoglobin molekula
biztosítja. A késői bakteriális gének közé tartoznak a nif és bizonyos fix gének. A
nitrogénfixáláshoz szükséges nitrogenáz enzimkomplex egyes részeit a nifHDK gének
kódolják (Fischer, 1994). A nifH gén a homodimer Fe protein (dinitrogenáz reduktáz)
PA_DIP04.doc
6
szintéziséért, a nifD a "2$2 szerkezetű dinitrogenáz " alegység, míg a nifK a $ alegység
kialakításáért felelős (Postgate, 1972). Továbbá a nifE, nifN, nifB gének a FeMo kofaktor
szintézisét végzik (Dean et al., 1993), valamint a nifA génnek, mely egy transzkripciós
aktivátor fehérjét kódol, a nitrogénfixálás szabályozásában van szerepe a fixLJ, fixK génekkel
együtt. Az enzimkomlpex felé történő elektrontranszport biztosítását a fixABCX gének végzik
(Earl et al., 1987). A nagy oxigén affinitású, memránba ágyazott, bakteriod specifikus
citokróm oxidáz komplexet a fixNOQP gének kódolják (Preisig et al., 1993). Alacsony oxigén
koncentráció esetén a szabályozó és szenzor funkciójú fixLJ gének aktiválják a fixK és nifA
regulátor gént, ezáltal megindul a nif operon és több fix gén expressziója (David et al., 1988).
A nif és fix gének regulációját alapvetően a nitrogéngáz és az oxigén koncentrációja határozza
meg.
1.4. Sejtfelszíni poliszacharidok
A rhizobiumok sejtfelszíni poliszacharidjai kulcsszerepet játszanak a szimbiózis
kialakulásának lépéseiben: az infekciós fonal növekedésében, a gümő inváziójában, és a
gazdaspecificitásban (Reuhs et al., 1998), valamint megvédik a baktériumot a környezeti
ártalmakkal szemben. Hasonló szerkezetű sejtfelszíni struktúrákat a patogén baktériumoknál is
találunk, ahol a patogenitást határozzák meg (Reuhs et al., 1993). A S. meliloti sejtfelszíni
poliszacharidjai − sok más Gram-negatív baktériumhoz hasonlóan − az exopoliszacharid
(EPS), lipopoliszacharid (LPS) és a kapszuláris poliszacharid (KPS) (Kannenberg and Brewin,
1994). A poliszacharidok szimbiózisban betöltött szerepére különböző baktérium mutánsok
vizsgálatával derítettek fényt, ilyenek a gümő inváziójára képtelen, infekcióban hibás (Inf-)
baktérium mutánsok, melyek el tudják indítani a gümőfejlődést, de nem képesek bejutni a
belsejébe, “üres” gümők keletkeznek.
1.4.1. Az exopoliszacharidok
A Rhizobium spp. által termelt exopoliszacharidoknak (EPS) két féle típusát ismerjük.
Az egyik típus EPSII néven ismert, glükózt és galaktózt tartalmazó, diszacharid egységekből
felépülő galaktoglükán. A másik típus a S. meliloti által is termelt EPSI (másnéven savas EPS)
(Fraysse et al., 2003), amely egy szukcinoglükán egységekből álló heteropolimer, mely a sejt
felszínén akkumulálódik, és a sejt környezetébe szekretálódik. A szukcinoglükán hét glükóz és
egy galaktóz molekulát tartalmazó, ismétlődő alegységekből épül fel (Reuber and Walker,
1993). Az alegységeken szukcinil, acetil és piruvil módosításokat tartalmaz. Savas jellegét az
uronsav, szukcinát, piruvát elemek jelenlétének köszönheti. A szukcinoglükán poliszacharid
PA_DIP04.doc
7
szintézise négy lépésből áll, melyért a pSymB megaplazmidon elhelyezkedő exo gének
felelősek. Első lépésként, az UDP-glükóz és UDP-galaktóz szintézise történik (pl. exoB,C,N),
majd egy sejtmembránba ágyazott lipid hordozó felszínén zajlik az ismétlődő oktoszacharid
alegység szintézise nukleotid-cukorból (exoF,J,A,L,M,N,O,U). Következő lépésben az
alegységek módosítása (szukcinil – exoH, acetil – exoZ, piruvil – exoV), majd legvégül az
oktoszacharid alegységek polimerizációja, és a sejtfelszínre való transzfere történik
(exoP,T,Q) (Leigh and Walker, 1994). Az exopoliszacharidnak alapvetően a nitrogénfixáló
gümő létrehozásában, az infekciós fonal kialakulásában van meghatározó szerepe (Cheng and
Walker, 1998; Gonzáles et al., 1998). Sok exopoliszacharid termelésében hibás S. meliloti
törzs nem képes a növény inváziójára (Exo-, Inf- fenotípus), mert az infekciós fonalak
abortálódnak a fejlődő gümő sejtjeinél (Müller et al., 1988).
1.4.2. A lipopoliszacharidok
A lipopoliszacharidok (LPS) a Gram-negatív baktériumok sejtfelszínének fontos
alkotóelemei, a külső membránhoz kapcsolódva helyezkednek el. A Rhizobium fajok
konzerválodott szerkezetű LPS-el jellemezhetőek (Reuhs et al., 1998). Szerkezetileg három
egységre bonthatók. A külső foszfolipid membránba egy un. horgonyzó molekulával, a lipidA
egység segítségével rögzülnek. A horgonyzó egység különböző szerkezetű lehet a Rhizobium
fajokban (Reuhs et al., 1995). Ehhez kapcsolódik egy úgynevezett “core” oligoszacharid,
melyhez a törzsspecifikus O-antigén kötődik (Kannenberg and Brewin, 1994). A lipidA és a
„core” oligoszacharid egységeket közösen az LPS „rough” (R-LPS) formájának nevezzük, míg
az O-antigén egységet tartalmazó formát „smooth” LPS-nek (S-LPS) hívjuk. A S. meliloti LPS
mutánsok szimbiózisra képesek a gazdanövénnyel, de a szimbiótikus kapcsolat lassabban
alakul ki, mint a vad típusú baktériumok esetében (Lagares et al., 1992). Léteznek olyan
baktérium törzsek is, mint például a S. meliloti 41 törzs, melyeknél az LPS nem játszik fontos
szerepet a fertőzésben, vagy más struktúra veszi át a szerepét, itt az R-LPS forma hiányozhat.
Más rhizobium fajoknál azonban sok esetben előfordul, hogy csak az LPS bizonyul lényeges
tényezőnek, míg a többi (KPS, EPS) nem (Kannenberg and Brewin, 1994).
1.4.3. A kapszuláris poliszacharidok
Léteznek olyan rhizobiumok, melyek nem termelik egyik formájú exopoliszacharidot
sem, mégis szimbiózist tudnak kialakítani bármely gazdanövénnyel. Ennek oka az, hogy ezek
a baktériumok olyan rhizobiális kapszuláris poliszacharidot (KPS vagy K-antigén) termelnek,
mely átveszi az exopoliszacharid szerepét a szimbiózis kialakításában, ilyen baktérium a S.
PA_DIP04.doc
8
meliloti 41 törzs exoB mutánsa (más néven AK631 - Petrovics et al., 1993; Putnoky et al.,
1990). A KPS, mint egy kapszula veszi körül a baktérium sejtet, hidrát mátrixot alkot, amely
rezisztenciát biztosít egyes bakteriofágokkal szemben, és védi a különféle abiotikus
tényezőktől, mint a kiszáradás. Fontos a szimbiótikus felismerés korai szakaszában (Becquart-
de Kozak et al., 1997) A lipopoliszacharid egy konzerválódott szerkezetű poliszacharid, ezzel
ellentétben a KPS törzsspecifikus, sok variánsa fordul elő (Forsberg and Reuhs, 1997; Reuhs,
1997). A KPS nem rendelkezik horgonyzó molekulával, hanem szorosan kapcsolódik a
baktérium felszínéhez. A K-antigén széleskörben elterjedt a talajbaktériumokban,
rhizobiumokban először a Sinorhizobium fredii USDA205 törzsben izolálták (1.ábra) és
kiderült, hogy strukturálisan analóg az E. coli II-es csoportba tartozó K-antigénjével, ahol a
patogenitásban van szerepe (Reuhs et al., 1993; Rosenow et al., 1995).
1. ábra: A S. fredii USDA205 törzs KR1 antigén ismétlődő egységének (Kdops) elsődleges szerkezete (Reuhs et al., 1993).
A rhizobiumok KPS molekulái (1. táblázat) tartalmaznak megegyező és eltérő
egységeket, közös elemek a hexóz és 1-karboxy-2-keto-3-deoxy cukrokból álló ismétlődő
egységek, mint a sziálsav vagy a 3-deoxy-D-manno-2-oktulozonsav (Kdo), különböznek a
glikozil alegységek elrendezésében, a térszerkezetükben, a kapcsolódó oldalláncok
mintázatában, molekula méretben (Forsberg and Reuhs, 1997). A S. meliloti és S. fredii
baktériumok K-antigénjei, Reuhs és munkatársai által igen jól jellemzett poliszacharidok. A S.
meliloti AK631 törzse KR5 antigén néven ismert kapszuláris poliszacharidot termel. A KR5
antigén diszacharid alegységekből épül fel. Az alegység egy glükuronsavból és egy 5,7-
diamino-3,5,7,9-tetradeoxi nonulozonsavból áll, melyen 7-N-acetil és 5-N-β-hidroxibutiril
módosítások is találhatók (Reuhs et al., 1998; Reuhs és Glushka, nem közölt eredmények).
Az elmúlt évek kutatásai során három régiót azonosítottak az S. meliloti 41 törzsben,
melyek a KPS bioszintéziséért felelősek (rkp-1, rkp-2, rkp-3 régiók).
PA_DIP04.doc
9
1. táblázat: A K-antigén szerkezete néhány Rhizobium fajnál (Reuhs et al., 1998). Pse: pseudaminsav, Ac: acetil csoport, $-OH-But: $-OH-Butiril csoport.
K-antigén Törzs Molekuláris szerkezet Hivatkozás
KR1 S. fredii USDA205 [→3-"-D-Galp-(1→5)-$-D-Kdop-(2→]n Reuhs et al., 1993
KR3 S. fredii USDA257 [→3)-$-D-Manp-(1→5)-$-D-Kdop-(2→]n Forsberg and Reush 1997
KR5 S. meliloti AK631 [−$-GlcA→Pse5N($-OH-But)7NAc−]n Reuhs nem közölt eredm.
KR6 S. meliloti NGR247 [−"-Glc→"-NeuNAc−]n Reuhs et al., 1998
KR7 S. meliloti NGR185 [−$-GlcNAc→$-Kdo−]n Reuhs et al., 1998
Az rkp-1 régióban 10 gén található (rkpA-J). A gének nagy része olyan fehérjéket kódol,
melyek hasonlóak a különböző zsírsavszintézisben részt vevő enzimekkel, ezek a fehérjék a
lipofil molekulák módosításában és szállításában játszanak szerepet (Kiss and Kondorosi,
1997; Petrovics et al., 1993). Az említett gének feladata − a feltételezések szerint − , hogy a K-
antigén bioszintéziséhez szükséges lipid hordozót létrehozzák. Az RkpJ fehérjének a
kapszuláris poliszacharid transzportjában lehet szerepe, mert az E. coli KpsS fehérjéjével
homológ. Ha mutáció történik az említett génekben, akkor a KPS nem jelenik meg a
baktérium felszínén. Az rkp-1 régióban nincsenek olyan gének, melyeknek a cukoralegységek
bioszintézisében vagy a KPS polimerizációjában lenne szerepe.
Az rkp-2 régióban két olyan gén található, melyek a vad típusú LPS kialakításához
szükségesek. Az lpsL gén által kódolt fehérje egy UDP-glükuronsav epimeráz, mely a
lipopoliszacharid bioszintézisében fontos. A másik fehérje, az RkpK egy UDP-glükóz
dehidrogenáz, amely az UDP-glükóz UDP-glükuronsavvá oxidálását katalizálja. Az RkpK
fehérje az LPS és a KPS bioszintézisében is fontos (Kereszt et al., 1998).
A pSymB megaplazmidon található rkp-3 régióban 10 gént (rkpL-Z) azonosítottak (Kiss
et al., 2001), melyek pontos funkciója homológiák alapján feltételezett, még kísérletesen nem
bizonyított (2. táblázat). Az rkp-1 és rkp-2 régió általánosan előfordul a Sinorhizobium
genusban, ezzel szemben az rkp-3 régió csak a S. meliloti 41 törzsben található meg. A KPS
bioszintézisért, és a sejtfelszínre való exportálásáért, valamint a növény infekciójáért felelősek.
Az egy policisztronos operont alkotó rkpL-Q gének között vannak olyan gének, melyek
homológiát mutatnak különféle transzferáz enzimet kódoló génekkel (például: rkpM, rkpO,
rkpP). Feltételezett funkciójuk a cukor prekurzorok bioszintézise a KPS polimer számára.
Transzkripciójuk független a fordított orientációval rendelkező rkpR, rkpT, rkpS génektől. E
három gén feladata valószínű az, hogy a KPS polimert transzportálják a citoplazmából a
sejtfelszínre. Az rkpT és rkpS olyan szekvencia motívummal rendelkeznek, mely specifikus az
PA_DIP04.doc
10
ABC transzporter családban. A régió utolsó génje a polymerizáció szabályozását biztosító
rkpZ, melyet korábban lpsZ génként azonosítottak (Brzoska and Signer, 1991). Az RkpZ
fehérje homológ az E. coli KpsC fehérjéjével, melyről tudjuk, hogy befolyása van a termelt
KPS méretére és exportjára (Reuhs et al., 1995).
2. táblázat: Az rkp-3 régióban található gének feltételezett szerepe. A táblázatban feltüntettük a homológ fehérjék bizonyított vagy feltételezett funkcióját, valamint azokat a szervezeteket, melyekben az adott homológ fehérje található.
rkp-3 gén Feltételezett szerep Homológ fehérje Homológ szervezet Homológ fehérje szerepe
rkpL dNTP-hexóz-dehidratáz / epimeráz
Jhp0778 Cap5E FlmA
Helicobacter pylori Staphylococcus aureus
Aeromonas caviea
Cukor-nukleotid szintézis UDP-glükóz epimeráz O-antigén bioszintézis
rkpM DegT/DnrJ/EryC/StrS aminotranszferáz
FlmB SpsC WlbF
Aeromonas caviae Methanococcus janaschii Bordatella bronchiseptica
O-antigén bioszintézis Poliszacharid szintézis Amino-cukor szintézis
rkpN Pse aktiválás NeuA NeuA KpsU
Aeromonas caviae E. coli E. coli
O-antigén bioszintézis CMP-NeuNAC szintáz
CMP-KDO szintáz
rkpO transzferáz FlmD FlaR
SpsG/H
Aeromonas caviae Caulobacter crescentus
Methanococcus janaschii
O-antigén bioszintézis Flagelláris protein
Poliszacharid szintézis
rkpP acetiltranszferázok FlaG SpeG
Caulobacter crescentus E.coli
Flagelláris protein Acil transzferáz
rkpQ Pse szintézis NeuB NeuB NeuB
Aeromonas caviae Helicobacter pylori
E.coli
O-antigén bioszintézis Sziálsav szintáz
NeuNAC kondenzáció
rkpR KPS export a
periplazmatikus téren keresztül
KpsE BexC CtrB
E.coli Haemophilus influenzae Neisseria meningitidis
KPS export protein
rkpS ABC transzporter
KPS export a sejtmembránon át
KpsT BexA CtrB
E.coli Haemophilus influenzae Neisseria meningitidis
KPS export protein
rkpT ABC-2 típ.transzporter
KPS export a sejtmembránon át
KpsM BexB CtrC
E.coli Haemophilus influenzae Neisseria meningitidis
KPS export protein
rkpZ Lánchosszúság meghatározása
LpsZ KpsC LipA
R. meliloti E. coli
Neisseria meningitidis
LPS modifikáció KPS export protein KPS modifikáció
rkpY Poliszacharid szintézis - Nincs homológja
PA_DIP04.doc
11
Az előzőekben ismertetett poliszacharidok fontos feladatot töltenek be a baktérium-
növény szimbiózis kialakulásában, a baktérium külső környezeti tényezők elleni védelmében.
Az EPS és KPS szerkezete nagymértékben különbözik, mégis azonos szerepet töltenek be a
szimbiózisban, a S. meliloti AK631 törzsnél az EPS feladatát a kapszuláris poliszacharid veszi
át. Ismeretes, hogy a baktérium és a gazdanövény közötti kapcsolat igen specifikus a
poliszacharidok tekintetében is. Az, hogy alapvetően eltérő szerkezetű poliszacharidok
helyettesíteni képesek egymást az invázió folyamatában arra utal, hogy a növény több
független mechanizmussal is felismerheti a baktériumot.
PA_DIP04.doc
12
2. ELŐZMÉNYEK
A szimbiózis kialakulásában különböző növényi, illetve bakteriális gének játszanak
szerepet. Ezen gének egy részet már számos kutatócsoport jellemezte. A növény inváziójához
szükséges bakteriális gének funkciójáról viszonylag még keveset tudunk, ezért az említett
folyamat pontosabb megismerése érdekében, jónéhány infekcióban hibás (Inf-) S. meliloti
mutánst izoláltak, jellemeztek már, melyek nem képesek bejutni a növény belsejébe, így a
szimbiózis kialakulása elakad a gümőfejlődés korai fázisában. Az Inf- fenotípusú mutánsokkal
történő fertőzés során „üres” gümők jönnek létre, segítségükkel sikerült kimutatni, hogy a
szimbiózis kialakulásának ebben a szakaszában a baktérium különböző poliszacharidjainak
fontos szerep jut. Ezen kívül kimutatták, hogy a funkcionális gümő képződéséhez
nélkülözhetetlen az EPS, illetve KPS valamelyikének jelenléte (Walker, 1992). A S. meliloti
AK631 törzs például EPS-t nem termel, mégis képes szimbiózist kialakítani a
gazdanövényeivel, mivel a törzs által termelt KPS helyettesíteni tudja az exopoliszacharidokat
a gümőfejlődés során (Putnoky et al., 1990; Petrovics et al., 1993). Bizonyos vizsgálatok,
melyeket több S. meliloti törzsön végeztek arra utalnak, hogy a KPS-nek akár elsődleges
szerepe is lehet az infekciós folyamatban (B. Reuhs személyes közlés).
Munkánkban szerettük volna jobban megismerni a KPS endoszimbiózisban betöltött
szerepét. Konkrétan arra voltunk kíváncsiak, hogy létezik-e olyan funkcionális
molekularészlet, bioszintézisben bekövetkező utólagos módosítás a KPS-t illetően, melynek
hiányában a szimbiózis az infekciós lépésben elakad. Az EPS esetében már végeztek kísérletet
ennek bizonyítására (Leigh et al., 1985). A kapszuláris poliszacharid szerkezetének
gazdaspecifikus vonatkozásainak megismeréséhez olyan mutáns baktériumtörzsek izolálására
volt szükség, melyek felszínén a KPS kismértékben módosult. Ezen fenotípust okozó genetikai
mutáció(k) helyének pontos behatárolásával a feltételezett gazdaspecifitásért felelős gén(ek)
meghatározhatók.
2.1. Spontán mutáns baktériumtörzsek izolálása
Előzetes információk alapján tudtuk, hogy több Inf- S. meliloti mutáns, mely nem
termelt exopoliszacharidot, rezisztenciát mutatott a 16-3 fággal szemben (Putnoky et al.,
1988). Gyanítani lehetett, hogy az Inf- fenotípusú törzsek (mint az AK631 törzs is), az
invázióra képtelen tulajdonságuk mellett, a fággal szemben mutatott rezisztenciájukat is a KPS
hiányának vagy hibájának köszönhetik. Következésképpen, a poliszacharid bioszintézise és a
PA_DIP04.doc
13
fágreceptor jelenléte, nagy valószínűséggel összefügg. Ezen információkból kiindulva
feltételezték azt, hogy a KPS-molekula egyúttal receptorként szolgálhat a 16-3 fág számára
(Petrovics et al., 1993; Putnoky et al., 1990).
Munkánkban olyan baktérium-mutánsokra volt szükség, melyek felszínén a KPS
módosult formában van jelen. Ennek érdekében csoportunkban olyan mutánsizolálási eljárást
alkalmaztak (Hoffman Gyula munkája), melynek során a S. meliloti 41 törzsre specifikus 16-3
bakteriofágot alkalmazták szelekciós eszközként. Az RM41 törzsből izolált mutációk
azonosítása az un. host-range jelenség segítségével történt. A fág baktériumfelszínt felismerő
fehérjéjét kódoló gén mutációja révén alakul ki a host-range (gazdaspecifitási) mutáció. Ha
egy fágra rezisztenssé vált baktérium-mutánson lehetséges host-range fágmutánst izolálni,
akkor a baktérium mutáns felszínén a fágreceptor jelen van, de feltehetően módosult
formában. Mivel a jelenség lehetővé teszi host-range fágmutánsok adszorbcióját, ezért
valószínű, hogy „finom” szerkezetbeli változás történhetett.
Ezen kísérlet elvégzésével sikerült olyan baktérium mutánst izolálni (GH4046 törzs),
mely rezisztens volt a 16-3 fággal szemben, tehát feltételezhetően a KPS megváltozott
formában van jelen a sejtfelszínen. Ezzel párhozamosan, sikerült izolálni egy feltehetően
módosult farkirosttal rendelkező host-range fágot (16-3 h5), mely fertőzni képes az izolált
baktériumot.
PA_DIP04.doc
14
3. CÉLKITŰZÉSEK
A munkánk célja az volt, hogy komplementációs kísérletekkel azonosítsuk az izolált
mutáció(k) helyét, valamint megállapítsuk a mutáció(k) jellegét bázissorrend meghatározással,
mely megmutatja milyen változás történt DNS, illetve fehérje szekvencia szinten.
Kíváncsiak voltunk, hogy a KPS valóban fágreceptor szerepet is betölthet, vagy
valamilyen más struktúra látja el a feladatot, mely kapcsolatban van a KPS génjeivel. Ez
utóbbi esetben tudni szerettük volna, hogy a fágreceptor milyen módon épül fel és mely
fehérjék alkotják. A fágreceptor szerkezetét meghatározó gén(ek) azonosítható(k) a mutáció(k)
helyének pontos behatárolásával. Amennyiben a fágreceptor valóban a KPS, úgy ezzel a
módszerrel még ismeretlen bioszintézis-gének azonosítására is lehetőség nyílhat.
Ezen kívül, minél többet szerettünk volna megtudni az érintett gén(ek) funkciójáról,
természetéről bioinformatikai analízis segítségével.
A GH4046 törzsön izolált host-range fág (16-3 h5) oldalán is elindult a jelenség
vizsgálata a csoportunkban (Békási Krisztina, illetve Maász Anita diplomadolgozata, 2004.).
PA_DIP04.doc
15
4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
4.1. Baktériumok, bakteriofágok, plazmidok
Munkánk során használt baktérium és bakteriofág törzsek, valamint plazmidok jellemzőit a
3. táblázat tartalmazza.
3. táblázat: Baktériumok, bakteriofágok, plazmidok.
ELNEVEZÉS JELLEMZŐK REFERENCIA
Sinorhizobium meliloti
RM41 S. meliloti vad típusú (Exo+, Nod+, Fix+) Szende K.
AK631 RM41 exoB631 (Nod+ Fix+) Kondorosi Á.
GH4046 RM41 16-3 fágra rezisztens, spontán mutáns Hoffmann Gy.
GH4178 RM41 16-3 fágra rezisztens, spontán mutáns Hoffmann Gy.
GH4180 RM41 16-3 fágra rezisztens, spontán mutáns Hoffman Gy
AT212 AK631 rkpM::Tn5 (212) KmR SmR Kiss et al., 2001
Escherichia coli
JF1754 met leu his hsr- hsm+ Friesen, J
PP219 JF1754 (pRK2013) Putnoky P.
AV4189
AV4190 XL1 Blue pBS::rkpM Kpn-Sal AmpR Ez a munka
AV4191
AV4223 XL1 Blue pSem91::rkpM EcoRV KmR Ez a munka
AV4258 XL1 Blue (pAV4223 Km::Cm(F-778)) KmS CmR Ez a munka
XL1 Blue RecA1,endA1,gyrA96,thi-1, hsdR17,supE44,relA1 Bullock et al., 1987
lacZ∆M15 TcR
JM109 F’ traD36 proA+B+ lacIq ∆(lacZ)M15 / e14- Yanisch-P et al., 1985 (McrA-)∆(lac-proAB) endA1 gyrA96 (Nalr) thi-1 hsdR17(rk
-mk+) glnV44 relA1 recA1
Bakteriofágok 16-3 S.meliloti 41 törzs fágja Orosz and Sik, 1970
16-3 h5 S.meliloti GH4046 törzsre specifikus host-range mutáns Hoffmann Gy.
Plazmidok pBluescript SK II (+/−) AmpR Stratagen, USA
pBBR1 MCS-3 Széles gazdaspecifitású konjugatív plazmid TcR Kovach et al., 1994
pSem91 Expressziós vektor KmR Semsey et al., 1999
pRK2013 Helper plazmid keresztezéshez KmR Ditta et al., 1980
___________________________________________________________________________
PA_DIP04.doc
16
4.2. A baktériumok növesztése
A S. meliloti törzseket TA (Orosz et al., 1973) vagy GTS (minimál) (Kiss et al., 1979)
táptalajokon 32 oC -on, az E. coli törzseket pedig LB (Sambrook et al., 1989) tápközegben 37 oC-on növesztettük. A táptalajok a megfelelő antibiotikumot a 4. táblázatban feltüntetett
végkoncentrációban tartalmazták.
4. táblázat: Az antibiotikumok végkoncentrációja (:g/ml)
Antibiotikum E. coli S. meliloti
Tetraciklin 15 15
Kanamicin 30 200
Kloramfenikol 5 5
Ampicillin 200 --
4.3. Fágok szaporítása
A felszaporítani kívánt fág egy tarfoltját 10 ml TA folyadékba tettük, és 0,2 ml éjszakán
át felnövesztett baktériumtörzs hozzáadása után a lombikot 32 °C-on, 12-24 órán át rázattuk.
A fáglizátumhoz néhány csepp kloroformot adtunk, majd meghatároztuk a fágszámot úgy,
hogy 0,1 ml megfelelően hígított fágot, 0,2 ml éjszakán át felnövesztett baktériumot és 4ml
TA fedőagart összekeverve TA lemez tetejére rétegeztünk. A lemezeket 12-24 órán át 32 °C-
on történő inkubálás után értékeltük ki. A fáglizátumok általában 109 részecskét tartalmaztak
milliliterenként.
4.4. A baktériumok keresztezése
A keresztezni kívánt baktériumokat és a “helper” (PP211) törzset felnövesztettük a
megfelelő antibiotikumokat tartalmazó komplett táptalajon. A keresztezést 0.9%-os NaCl-
oldatban felszuszpendált baktériumokkal végeztük, TA lemezen összecseppentve őket. 16-24
órás 32 oC -on történő inkubálás után a felnőtt baktériumokat felszuszpendáltuk, és a
megfelelő antibiotikumot tartalmazó szelektív lemezre kentük különböző hígításban.
4.5. Fágérzékenységi teszt
A baktériumok fágérzékenységét 16-3 vad típusú, 16-3h5 host-range mutáns
bakteriofágokkal szemben vizsgáltuk. A vizsgálni kívánt baktériumot tartalmazó TA fedőagar
felszínére 1 µl, körülbelül 106 darab fágot tartalmazó lizátumot cseppentettünk, és 24 órás
inkubációs idő után vizsgáltuk, hogy bekövetkezett-e a lízis vagy sem.
PA_DIP04.doc
17
4.6. Összes DNS izolálás
1.5 ml, éjszakán át növesztett, baktériumkultúrából a sejteket centrifugálással ülepítettük
és 300 µl TE oldatban (50 mM TrisHCL, 20 mM EDTA, pH 8,0) szuszpendáltuk. 100 µl 5%
SDS-t tartalmazó TE oldatot és 100 µl pronáz oldatot (2,5 mg/ml pronáz TE oldatban) adtunk
hozzá. 1-3 órás 37oC-os inkubálás után 500 µl fenollal ráztuk össze, majd centrifugálás után a
felülúszót újabb Eppendorf-csőbe pipettáztuk át. 500 µl fenol:kloroform oldattal (25 térfogat
fenol:24 térfogat kloroform:1 térfogat izoamil-alkohol) ráztuk össze. Centrifugálás után a
felülúszóhoz 500 µl kloroform oldatot (24 térfogat kloroform:1 térfogat izoamil-alkohol)
adtunk, összeráztuk és centrifugáltuk. A vizes fázist 1000 µl etanollal kicsaptuk. A kocsonyás
csapadékot új, 500 µl 70%-os etanol tartalmú, eppendorf csőbe tettük át pipettahegy
segítségével. Centrifugálás után a felülúszót leöntve, szárítást követően, a DNS csapadékot
100 µl steril desztillált vízben oldottuk fel (Meade et al., 1982 ).
A pSEM91 plazmid vektorba történő rkpM inszert beépülésének tesztelésére gyors DNS
izolálási technikát használtunk. A vizsgálni kívánt baktériumot felszuszpendáltuk 100µl steril
desztillált vízben, 5 percig 100°C-on forraltuk, majd 5 percig 0°C-on inkubáltuk. Ezután a
mintát 5 percig centrifugáltuk, majd a felülúszót új csőbe pipettáztuk és higítottuk (10x).
4.7. Plazmid DNS izolálás
A plazmid vagy kozmid DNS-t E. coli esetén 3-3 ml LB tápfolyadékban, S. meliloti
esetén pedig TA tápfolyadékban, a megfelelő antibiotikum jelenlétében éjszakán át növesztett
sejtekből Ish-Horowicz és Burke (Ish-Horovicz and Burke, 1981) szerint alkalikus lízissel
preparáltuk. 1.5 ml kultúrát Eppendorf-csőbe tettünk és a sejteket centrifugálással ülepítettük.
A sejteket 100 µl TEG oldatban (25 mM TrisHCL, 10 mM EDTA, 50 mM glükóz pH 8.0)
szuszpendáltuk fel. A feltárást óvatos keverés mellett 200 µl NS oldat (0.2N NaOH, 1% SDS)
hozzáadásával végeztük. A mintákat 5 percig 0°C-on inkubáltuk, majd erős rázással 160 µl
jéghideg Na-acetát oldatot (3M, pH 4.8) adtunk hozzájuk. 5 perces 0°C-os inkubáció után 5
percig centrifugáltuk, és a felülúszóból 400 µl izopropanollal kicsaptuk a plazmid DNS-t. 10
perc -20°C-os inkubáció után a csapadékot lecentrifugáltuk és szárítottuk. A csapadékot 100
µl Tris-pufferben (50 mM TrisHCL, 100 mM Na-acetát, pH 8.0) oldottuk fel, majd 200 µl
etanollal ismét kicsaptuk. 10 perc 0°C-os inkubáció után a csapadékot centrifugáltuk,
szárítottuk, majd 30 µl RNáz-os trideszt vízben (100 µl/ml RNázA) oldottuk fel.
PA_DIP04.doc
18
A szekvenáláshoz és a transzpozíciós in vitro reakcióhoz készített preparátumoknál
további tisztítási lépést iktattunk be. A plazmid DNS izolálálás végén 50 µl RNáz-os desztillált
vízben vettük fel a csapadékot, majd 0.1 térfogat 10% SDS és 1 térfogat 7,5 M NH4-acetát
után 15 percig inkubáltuk jégen. Ezután centrifugáltuk 5 percig és a felülúszót új csőbe
pipettáztuk, ehhez 0,6 térfogat izopropanolt adtunk és -20°C -ra tettük 20 percig. Az inkubálás
után etanolos mosás, és szárítás következett. A csapadékot 40 µl steril desztillált vízbe vettük
fel.
4.8. Polimeráz láncreakció (PCR)
Az rkpM gént magába foglaló, illetve ennek egy részét tartalmazó DNS-szakaszt
sokszoroztuk meg polimeráz láncreakció segítségével. A felhasznált oligonukleotidokat az 5.
táblázat tartalmazza. DNS szekvencia meghatározáshoz az rkpM4046, illetve rkpM4178 allélt
magába foglaló DNS szakaszt az RM-15 és RM-13 primerekkel, valamint az alábbiakban
részletezett RKP-M program alkalmazásával amplifikáltuk (1625 bp). A klónozáshoz használt
rkpM allél felsokszorozásához ugyanezen primereket, és a valószínűsíthetően jobb hatásfokkal
tompa végeket létrehozó Pfu DNS-polimerázt alkalmaztuk (RKP-M1 program). A pSEM91
plazmid vektorba történő rkpM inszert beépülésének tesztelésére két belső primert (RM-23,
RM-25) használtunk fel, melyekkel 1% agaróz gélen is könnyen detektálható (558 bp)
fragmentet kaptunk (RKP-M2 program).
Az alábbi PCR-programokat alkalmaztuk:
RKP-M RKP-M1 RKP-M2
1. 1 min. 94°C 1. 1 min 95°C 1. 1 min. 94°C 2. 30 sec. 94oC 2. 1 min 95°C 2. 30 sec. 94oC 3. 30 sec. 62oC 3. 30 sec. 62oC 3. 30 sec. 59oC 4. 1 min. 72oC 4. 3 min 72oC 4. 1 min. 72oC 5.34× a második lépésre 5. 34× a második lépésre 5.34× a második lépésre 6. 30 sec. 20oC 6. 5 min 72oC 6. 30 sec. 20oC 7. End 7. 1 min 20oC 7. End
8. End
4.9. Fragmentizolálás
A PCR terméket agaróz gélelektroforézis segítségével tisztítottuk. Az izolálni kívánt
fragment elé a gélbe Whatman DE 81 papírt tettünk és 20 perces 60V feszültség melletti
elektroforézis után az izolálandó fragment a papírra került. A papírt eppendorf csőbe tettük, és
a DNS-t 100 µl 1M NaCl oldattal mostuk le, kétszer egymás után. A DNS kicsapása 20 µl 3M
Na-acetát oldattal (pH 7,0) és 120 µl izo-propanollal történt. 20 perces -20oC-os inkubálás
után lecentrifugáltuk, szárítottuk és 20 µl steril desztillált vízben oldottuk fel a csapadékot.
PA_DIP04.doc
19
4.10. DNS-szekvenálás
Az izolált PCR fragmenteket, DNS szekvencia meghatározás céljából a MTA Szegedi
Biológiai Központ DNS Szekvenáló Laboratóriumába küldtük el. A szekvenálási reakcióhoz
felhasznált oligonukleotidok fő jellemzőit az 5. táblázat foglalja össze.
5. táblázat: A szekvenálási reakcióhoz felhasznált oligonukleotidok ___________________________________________________________________________
Oligonukletid neve Nukleotidszekvencia Számított Tm (oC) ___________________________________________________________________________
RM-15 primer 5’- GCATTAGGCCCGGGGAGAAGC -3’ 62,4
RM-13 primer 5’- CAGGCCGAAGGAACGGAACCTC -3’ 62,0
RM-25 primer 5’- CGAGCCAAGGTGGACTTCGTT -3’ 59,4
RM-23 primer 5’- CAGGCCGGAATAGCTGTCAGG -3’ 59,5
RM-35 primer 5’- CTGGCTCGGCGATATGATAAG -3’ 54,9
RM-33 primer 5’- AGCGAAATGCACGAGCACAAC -3’ 59,0
4.11. Restrikciós emésztés, kettős emésztés
A DNS minták restrikciós emésztését Sambrook és mtsai szerint végeztük. (Sambrook et
al., 1989). A kettős emésztés esetén, az első enzimreakció után a minta DNS tartalmát
kicsaptuk 0,1 térfogat 3M Na-acetát (pH=7) és 2 térfogat et-OH (96%) hozzáadásával, és min.
20 percig inkubáltuk -20°C-on, majd 5 perc centrifugálás és 70% et-OH mosás, szárítás után
30µl steril desztillált vízbe vettük fel. Ez után végeztük el a második enzimreakciót.
4.12. Gélelekroforézis
A fragmentek elválasztására 1%-os agaróz gélt használtunk. Az elválasztásra szánt DNS
mintához, az alábbiakban leírt összetételű STOP-oldatot adtunk (5xSTOP-ból a végtérfogat
1/5-ét). A gélelektroforézist minigél esetében 60V-on, fragmentizolálásnál 40V-on végeztük.
Kontrollként, PstI enzimmel emésztett, λ DNS-t alkalmaztunk.
1%-os agaróz gél: 1 g agaróz, 100 ml 1xTBE puffer, 100 µl etidium-bromid (100 µg/ml).
5xSTOP 20 ml-hez: 2 g ficoll, 10 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0), 40 mg brómfenolkék (BFB).
5xTBE törzsoldat: 54 g TRIS, 27,5g bórsav, 20 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0) / 1000 ml.
PA_DIP04.doc
20
4.13. Kompetens sejt készítés
Kompetens sejtek készítéséhez XL1-Blue, valamint JM109 E. coli törzset használtunk.
200 ml SOB táptalajban (2% Bacto trypton, 0.5% Yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl,
pH 7.0) éjszakán át 22°C-on növesztett baktériumkultúrát 10 percre jégre tettünk. A 10 perces
centrifugálással (4000 rpm) összegyűjtött sejteket 80 ml hideg TB pufferben (10 mM PIPES,
15 mM CaCl2, 250 mM KCl, pH 6.7) szuszpendáltuk. 10 percig jégen inkubáltuk, majd
centrifugálással összegyűjtöttük a sejteket, és 20 ml jéghideg TB pufferben szuszpendáltuk. A
szuszpenzióhoz 1.5 ml DMSO-t adtunk, a sejteket Eppendorf-csövekbe szétosztva -80°C-os
hűtőben fagyasztottuk és tároltuk transzformációig (Inoue et al., 1990).
4.14. Ligálás
A ligálási elegyet vektor DNS oldat, fragment DNS oldat, ligáz puffer (5×koncentráció:
200 mM TrisHCL, 50 mM MgCl2, 50 mM dithiotreitol (DTT) 2,5 mM ATP, pH 7.8) és steril
desztillált víz felhasználásával készítettük. A fragment mennyisége tízszeres volt a vektor
mennyiségéhez képest. A reakcióhoz T4 DNS ligázt használtunk, és az elegyet legalább 2
óráig szobahőmérsékleten inkubáltuk.
4.15. Transzformálás
Egy transzformáláshoz 100 µl kompetens sejtet használtunk fel. A sejteket -20°C-ról
jégre tettük, és 15 perc elteltével hozzáadtuk a transzformációhoz használt DNS-t. 30 percig
jégen inkubáltuk, majd 3 perces 37°C-os hősokkot alkalmaztunk. A hősokk után 400 µl SOC
oldatot (2% Bacto trypton, 0.5% Yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 20 mM glükóz, pH
7.0) adtunk a sejtekhez. Egy óra 37°C-os inkubáció után a sejteket szelektív táptalajra tettük.
pBluescript használata esetén a táptalajba 40 µl IPTG (100 mM) és 40 µl Xgal oldatot
(2%,dimetil-formamidban) tettünk, és a transzformánsokat kék-fehér screen segítségével
detektáltuk. (Inoue et al., 1990). A transzpozíciós mutagenezisnél antibiotikumot használtunk
szelekciós eszközként (Km, Cam).
4.16. In vitro transzpozíciós mutagenezis
A pSEM91 plazmid vektor transzpozonos mutagenezisét a TGS II Kit (Template
Generation SystemTM II, TGSTM II, F-702; Haapa et al., 1999) alapján végeztük el. A cél a
vektoron lévő rezisztencia marker megváltoztatása volt. Kloramfenikol rezisztencia gént
juttattunk be a kanamicin génbe. Plazmid DNS tisztítás után megmértük a minta DNS-
koncentrációját. A reakcióhoz szükséges DNS mennyiséget a target DNS hossza (8,4 kb)
PA_DIP04.doc
21
alapján (40 ng DNS/ kb) határoztuk meg. A meghatározott térfogatú DNS mintához, 4 µl 5x
puffert, 1 µl (20 ng/µl) kloramfenikol rezisztenciagént hordozó entranszpozont, 1 µl (0,22
µg/µl) MuA transzpozáz enzimet adtunk, majd az elegyet 20 µl-re egészítettük ki steril
desztillált vízzel. A mintát 1 órán át 30°C -on inkubáltuk, ezután 10 percig 75°C -on
inaktiváltuk, majd transzformáltuk.
4.17. Bioinformatikai módszerek
Az RkpM fehérje homológok keresésére az NCBI honlapon elérhető BLASTP programot
használtuk (Altschul et al., 1990; www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). A homológ funkcionális
doménekről a PROSITE (Falquet et al., 2002; www.expasy.org/prosite) és Pfam
(www.sanger.ac.uk/Software/Pfam) adatbázisokból gyűjtöttünk információkat. Motívum
elemzést a UNIX rendszer alatt működő EMBOSS programcsomag PATMATDB programjával
végeztünk. A fehérje további elemzésére, HTH motívum prediktálásra, többszörös illesztések
elvégzésére az ExPASy Molecular Biology Server honlapon (Gasteiger et al., 2003,
www.expasy.org), és a Lion Bioscience AG, SRS programjában (srs.ebi.ac.uk/Tools) elérhető
eszközöket alkalmaztuk. A feltételezett transzmembrán domének elemzését a TopPred
programmal végeztük (Claros and Heijne, 1994; www.sbc.su.se/~erikw/toppred2).
PA_DIP04.doc
22
5. EREDMÉNYEK
5.1. Az rkp-4046 mutáció helyének meghatározása
Munkánk megkezdésekor rendelkezésünkre állt a GH4046 spontán mutáns S.meliloti
törzs, mely rezisztens a vad típusú 16-3 bakteriofággal szemben, viszont a 16-3 h5 host range
fág fertőzni képes. Az volt a célunk, hogy megtaláljuk a mutációt szenvedett gén pontos
helyét, majd a mutáció jellegét. Mivel sejtettük, hogy a változás valamelyik KPS
bioszintézisért felelős génben van, ezért először azt kellett megállapítanunk, hogy az rkp-4046
mutáció egy már azonosított vagy egy ismeretlen rkp génben történt. Ennek kiderítésére
genetikai komplementációs kísérleteket végeztünk.
2. ábra: Az rkp-3 régió szerkezete (Kiss et al., 2001). fent: Feltüntettük a pAT399 és a pAT401 kozmid klónokban található inszertek által lefedett
részeket. A régión belül néhány restrikciós enzim hasítóhelyét is jelöltük (E: EcoRI; B: BamHI; H: HinDIII).
lent: Nyilakkal az azonosított gének helyét és irányultságát jelöltük.
Az első komplementációs kísérletben azt vizsgáltuk, hogy melyik rkp régióban található
a mutáció. Az rkp-3 régiót két átfedő kozmid klón tartalmazta (pAT399, pAT401; 2.ábra),
ezért ezeket külön kellett vizsgálni. A kísérlet eredményeként megállapítottuk, hogy az rkp-
4046 mutáció az rkp-3 régió bal oldali szakaszán (pAT399) található.
A következő komplementációs kísérlettel a mutáció rkp-3 régióban található helyét
kerestük. A régióban található gének elhelyezkedése és teljes nukleotidszekvenciája már
ismert volt (Kiss et al., 2001). Az eredmények alapján, a régiót számos – a kapszuláris
poliszacharid-bioszintézisben részt vevő – rkp gén alkotja (2. ábra).
PA_DIP04.doc
23
Az előző kísérletből tudtuk, hogy a mutáció a pAT399 kozmid klón szakaszára esik.
Eredményeink szerint az rkp-4046 mutáció az rkpM génben van, tehát a GH4046
baktériumtörzs az rkpM egy mutáns allélját hordozza. Ezt rkpM4046 allélnak neveztük el. (A
komplementációs kísérletek részletes leírása, Deák Veronika diplomadolgozatában található).
5.2. A 16-3 bakteriofág receptor kialakításában részt vesz az RkpM fehérje.
A csoportunkban végzett egyéb kísérletek alapján megállapították, hogy az általunk
vizsgált GH4046 mutáns törzs egyáltalán nem termel kapszuláris poliszacharidot ugyanúgy,
mint az AT212 (rkpM::Tn5) mutáns törzs sem, melyen nem lehet host-range fágot izolálni és
az rkpM génben egy Tn5 transzpozont tartalmaz, így elrontva a gén működését. Ez arra utalt,
hogy a 16-3 fág receptora valószínűleg nem a KPS, mint azt előzőleg feltételeztük. Ezen
információkból kiindulva valószínű, hogy a host-range fágmutánsok esetében az „elsődleges”
receptorként szolgáló KPS hiányában egy másik sejtfelszíni poliszacharid veheti át annak
szerepét. Ha ez így van, akkor minden rkp mutánson, de legalább az rkpM::Tn5(212) mutációt
hordozó baktériumon lehetséges volna a host-range fágmutánsok izolálása. Ezt több független
kísérletben is megpróbáltuk, de minden alkalommal csak a kontrollként alkalmazott GH4046
törzsön kaptunk plakkokat.
Tehát közvetett bizonyíték mutatott arra, hogy a fágreceptor nem a KPS és, hogy az
rkpM4046 allél egy különleges mutációt hordoz, mely egy megváltozott szerkezetű fágreceptort
eredményez. Kézenfekvő volt ezek után a feltételezés, hogy maga az RkpM fehérje szolgál
fágreceptorként, és az rkpM4046 allél valószínűleg csak egyetlen aminosavcserét eredményező
(un. missense) mutációt tartalmaz.
5.3. Az rkpM4046 allélban egy missense mutáció található
A továbbiakban arra kerestünk választ, hogy az rkpM4046 allélban DNS szekvencia
szinten milyen változás történt. A vadtípusú szekvencia (AK631) pontos bázissorrendje már
ismeretes volt (AC: AJ245666; Kiss et al., 2001), ezért megtervezhettük a mutáns gén
megsokszorozásához, illetve szekvencia meghatározásához szükséges oligonukleotidokat.
A GH4046 baktériumtörzs össz-DNS preparátumából polimeráz láncreakció (PCR)
segítségével a kívánt DNS-szakaszt megsokszoroztuk, majd izoláltuk ezt a fragmentet, agaróz
gélelektroforézis alkalmazásával.
Mivel a PCR-fragment 1625 bázispár hosszúságú, míg a benne foglalt rkpM gén 1161
bázispárnyi, ezért a mutáns allél DNS-szekvenciájának meghatározásához – a PCR-
primereken kívül – szükség volt még négy oligonukleotid tervezésére, hogy mindkét szálon
PA_DIP04.doc
24
lehetővé tegyék az egymással átfedő leolvasások a nukleotidsorrend biztonságos
meghatározását (3.ábra).
3. ábra: A PCR és a szekvenálási reakciókhoz felhasznált oligonukletidok elhelyezkedése. A PCR reakcióhoz az Rm-15 és az Rm-13 primereket alkalmaztuk. A DNS-szekvencia meghatározásához – az előbbieken kívül – szükség volt még négy oligonukleotidra (Rm-25; Rm-35; Rm-23; Rm-33; pontos szekvenciájukat az 5. táblázat tartalmazza).
Az izolált PCR-fragment nukleotid szekvenciáját a tervezett oligonukleotidok
segítségével, szubklónozás nélkül, direkt úton határoztuk meg. A részszekvenciák
összeillesztése után megállapítottuk, hogy az rkpM4046 allél, meglepő módon, két missense
mutációt hordoz a gén 3' végének közelében. Ezek alapján nem tudtuk eldönteni, hogy
mindkettő mutáció vagy csak az egyik felelős a megváltozott szerkezetű fágreceptor
kialakulásáért. A probléma oka az, hogy a vadtípusú szekvencia megállapítása az AK631 törzs
alapján történt, míg a GH4046 mutáns az RM41 törzsből lett izolálva. Feltételeztük, hogy csak
az egyik mutáció okozza az RkpM fehérje funkcióvesztését. Ennek kiderítésére az rkpM41
nukleotid sorrendjét is meghatároztuk, így kiderült, hogy az AK631 és RM41 között is létezett
egy eltérés, mely semlegesnek bizonyult a fágreceptor kialakulása és a KPS bioszintézis
szempontjából, mivel mindkettő termel KPS-t és szenzitív a 16-3 fággal szemben. Az rkpM41
vadtípusú és rkpM4046 mutáns allél közötti eltérés egy aminosav cseréjét jelenti az általa kódolt
fehérje C-terminális részén. (Az rkpM41 allél szekvenálása lsd. Deák Veronika
diplomadolgozata, 2004). A vad típusú allél leucint (Leu252) meghatározó kodonjának (TTG)
egyik bázisa megváltozott (TTC), mely fenilalanin (Phe252) beépülését okozza az
aminosavlánc adott pozíciójába (4. ábra).
PA_DIP04.doc
25
4. ábra: A vad típusú rkpM gén nukleotidsorrendjét illetve az általa meghatározott aminosavszekvenciát tartalmazza az ábra. Feltüntettük a GH4046, GH4178 és GH4180 baktériumtörzsek mutáns alléljának felsokszorozásához és DNS-szekvencia meghatározásához alkalmazott oligonukleotidok (Rm-13, Rm-15, Rm-23, Rm-25, Rm-33, Rm-35) elhelyezkedését. A sárgával kiemelt TTG kodon a GH4046 és GH4178 törzsekben azonosított mutáció helyét jelöli, ahol ez TTC kodonra változott. A mutáció eredményeként leucin (L252) helyett fenilalanin (P252) épül be a fehérje adott pozíciójába.
PA_DIP04.doc
26
5.4. Újabb mutánsok vizsgálata
Kíváncsiak voltunk arra, hogy csak az RkpM fehérje alkotja-e a fágreceptort, illetve annak
mely részei vesznek részt a felismerésben. Hogy közelebb kerüljünk a válaszhoz,
tanszékünkön újabb mutánsokat izoláltak, hasonló módszerekkel a már leírtakhoz (2. fejezet).
Ezek az rkp-4178 és az rkp-4180 mutációkat hordozó törzsek.
Mindkét törzsből DNS-t izolálva, megsokszoroztuk az rkpM gént hordozó DNS szakaszt
PCR reakció segítségével, és kimutattuk, hogy az rkp-4178 mutáció teljesen megegyezik az
előzőekben vizsgált rkpM4046 mutációval (4. ábra). Tehát, egy teljesen független
mutánsizolálás és szekvencia meghatározás megerősítette előző eredményeinket.
Az rkp-4180 mutáció vizsgálata azonban más eredményt hozott. Ebben az esetben az rkpM
génben nem találtunk semmilyen mutációt. Az előzetes komplementációs eredmények szerint
(Szabó Csilla munkája), a mutáció ez esetben az rkp-3 régió más génjének területére esik, ami
arra enged következtetni, hogy az RkpM fehérjén kívül más alkotója is van a fágreceptornak.
Végeredményben, az a következtetés vonható le, hogy az RkpM fehérje a fágreceptor
alkotóeleme, C-terminális része a fággal való kapcsolat kialakításában közvetlen szerepet
játszik.
Mindezt alátámasztja a host-range fágok vizsgálata is (Békási Krisztina, illetve Maász
Anita diplomadolgozata 2004.), ahol a h génben történt missense mutáció lehetővé teszi, hogy
az RkpM4046 fehérjét tartalmazó baktériumokon a host-range mutáns fág szaporodhasson.
Tehát, egy baktériumfehérje egyetlen aminosavának megváltozása következtében megszűnt
felismerési folyamatot a fág egy fehérjéjének egyetlen aminosavában bekövetkezett
megváltozása helyre tudta állítani. Ez, a két fehérje közvetlen kölcsönhatására utal.
Hasonló jelenséget már más rendszerekben is kimutattak. Például az Escherichia coli K-12
törzse és a λ fág esetében a fág receptora a maltóz és maltodextrinek transzportjáért felelős
külső membránfehérje, a MalB. Ezzel közvetlen kölcsönhatásban a fág farkirost J fehérjéje áll.
A malB génben történő pontmutációkra, melyek fágrezisztenciát eredményeznek, a host-range
fágok szintén egy-egy missense mutációval „reagálnak”, melyek mind a j génnek a farkirost C
terminálisát kódoló részére estek (Wang et al., 1998; Werts et al., 1994).
5.5. Komplementációs kísérlet a receptorfunkció bizonyítására
A következő kísérletekben tovább szerettük volna erősíteni a feltevésünket, miszerint az
RkpM fehérje a fágreceptor alkotórésze. Ennek bebizonyítására újabb komplementációs
kísérletet terveztünk. A vadtípusú (rkpM), illetve a mutáns gént (rkpM4046), olyan S. meliloti
törzsbe kívántuk bejuttatni konjugáció segítségével, mely egyáltalán nem termel kapszuláris
PA_DIP04.doc
27
poliszacharidot (az rkpM4046 klónozása és az ehhez kapcsolódó komplementációs kísérlet
Deák Veronika diplomadolgozatában, 2004., szerepel). Ilyen törzs a már említett
rkpM::Tn5(212) (AT212) mutáns. Azt reméltük, így helyreáll a fággal való fertőzhetőség a
vadtípus bejuttatása esetén a 16-3, a mutáns allél bejuttatása esetén a 16-3 h5 host-range
bakteriofággal. A vadtípusú génnel történő komplementáció kontrollként is szolgál az
rkpM4046 allél vizsgálatához.
Az első komplementációs kísérletnél (lsd. 5.1 bekezdés), ahol a GH4046 törzsben
történő mutáció pontos helyét határoztuk meg, az rkpL-Q génekben külön-külön Tn5
transzpozont tartalamzó plazmidokat juttattunk be a mutáns baktériumba. Mivel valószínű,
hogy az rkpL-Q gének egy policisztronos egységbe tartoznak, feltételezhető, hogy egy
promóterről íródnak át, ezért a konjugáció során azt reméltük, hogy érvényesül a transzpozon
beépülésének poláris hatása, azaz a tőle „down-stream” elhelyezkedő összes gén átíródásának
blokkolása. A kísérletben kiderült, hogy a poláris hatás nem érvényesül. Ebből arra
következtettünk, hogy a beépült Tn5 transzpozonon van olyan promóter-szerű szekvencia,
mely elegendő az inszerció után elhelyezkedő gének expressziójához, vagy eleve az rkp-3
régió tartalmaz ilyen szekvenciákat. Ezen információkat figyelembe véve, a konjugációs
kísérlet elvégzéséhez olyan plazmidot konstruáltunk, mely az rkp-3 régióból csak az rkpM
gént tartalmazza.
Először a vadtípusú S. meliloti (RM41) törzsből össz-DNS preparátumot készítettünk,
majd az Rm-13 és Rm-15 primerek segítségével, polimeráz láncreakcióval megsokszoroztuk
az rkpM gén megfelelő hosszúságú szakaszát (1161 bp). A DNS-fragment izolálása után
következett a fragment ligálása a pBluescript vektoron lévő KpnI-SalI helyre. Mivel a pBBR1
MCS-3 vektoron lévő KpnI-PstI helyre szerettük volna ligálni az rkpM fragmentet, de az nem
tartalmazott PstI restrikciós hasítóhelyet, ezért alkalmaztuk először a pBluescript vektort (5.
ábra). A pBBR1 MCS-3 vektor KpnI-PstI helyére történő inszert beépülést restrikciós
emésztéssel ellenőriztünk. Az rkpM gént hordozó plazmidszármazékot konjugációval
bejuttattuk az S. meliloti rkpM::Tn5(212) mutánsba, majd a komplementáció sikerét fágteszttel
vizsgáltuk.
A kísérletben nem sikerült komplementálni az rkpM::Tn5(212) mutánst, nem állt vissza
a vad típusú 16-3 bakteriofággal történő fertőzhetőség. A mutáns rkpM4046 alléllal történő
hasonló vizsgálat sem volt eredményes (Deák Veronika diplomadolgozata, 2004).
A klónozásos kísérlet eredményeiből kiindulva valószínű, hogy a vektorba épített rkpM
inszert eleje nem tartalmaz ilyen promoter jellegű szekvenciát, tehát a következőkben olyan
plazmidot kell terveznünk, ahol az inszertet közvetlenül a promóter után építjük be.
PA_DIP04.doc
28
5. ábra: Az rkpM gén klónozása pBBR1 MCS-3 vektorba. Az ábrán a munka egyes lépései láthatók. A gént PCR segítségével amplifikáltuk, majd a fragment izolálása után ligáltuk a pBluescript II SK(+) vektor KpnI-SalI helyére, majd a pBBR1 MCS-3 vektor KpnI-PstI helyre.
PA_DIP04.doc
29
5.6. Az rkpM klónozása egy erős promóter után
Az előző kísérlet nem hozta meg a várt eredményt, ezért, hogy biztosítsuk az rkpM gén
expresszióját, egy újabb klónozási kísérletet végeztünk. A vadtípusú rkpM gént a pSEM91
expressziós vektorba juttattuk be, közvetlenül a Ptac promóter után. Az rkpM4046 mutáns génnel
is elvégeztük a kísérletet (Deák Veronika diplomadolgozata, 2004). Kezdetként, hasonlóan az
előbbi klónozási kísérlethez, polimeráz láncreakciót alkalmaztunk a megfelelő DNS szakasz
megsokszorozására, de ebben nem az általánosan használt Taq polimeráz enzimet használtuk,
hanem a fragment végén nagyobb hatékonysággal tompa véget létrehozó Pfu polimerázt. A
fragment izolálása után szintén pBluescript vektorba ligáltuk az inszertet, de ebben az esetben
a vektoron lévő EcoRV helyre. Mivel itt nem irányított inszertbevitel volt, mint az első
klónozásnál (5.5 pont), meg kellett állapítani, hogy az inszert megfelelő orientációban épült-e
be. Ennek kiderítésére restrikciós emésztést végeztünk.
A megfelelő orientációjú konstrukciót (6. ábra) SmaI enzimmel emésztettük, és
fragmentizolálás után, a pSEM91 vektor EcoRV helyére ligáltuk. Az inszertet tartalmazó
plazmidot XL1Blue sejtbe transzformáltuk, ezután meg kellett állapítanunk az inszert
beépülését és annak orientációját. A transzformánsokból öszes DNS-t izoláltunk „gyors” DNS
preparálással, majd az rkpM inszertet amplifikáltuk PCR segítségével (RM-23, RM-25
primerek). Azokon az izolált plazmidokon, melyeknél a PCR reakció kimutatta az inszert
jelenlétét, restrikciós emésztést végeztünk SalI enzim segítségével. A inszertet megfelelő
orientációban tartalmazó származékot a fragmentek mérete alapján tudtuk kiválasztani
(pAV4223).
A kísérlet során felmerült egy probléma, miszerint a komplementációban recipiensként
használt AT212 (rkpM::Tn5) törzs szintén Km rezisztencia génnel rendelkezik, mint a
pSEM91 vektor. Így nem tudjuk kiszelektálni azokat a S.meliloti, rkpM::Tn5(212) sejteket,
melyekbe a konjugáció során bejutott az rkpM gént tartalmazó pSEM91 plazmid. Ennek
megoldására, in vitro transzpozíciós mutagenezissel a vektor Km rezisztenciagénjébe egy
kloramfenikol (Cam) rezisztenciagént juttattunk be, ezzel elrontva a Km rezisztenciáért felelős
gént. Transzformálás után azokat a sejteket kerestük (pAV4223 Km::Cm(F-778)), melyek Km
szenzitív és Cam rezisztensek voltak. Az entranszpozon beépülését restrikciós emésztéssel is
ellenőriztük (7. ábra). A klónozásos és transzpozíciós kísérletek végére egy olyan
plazmidszármazékkal (pAV4258) rendelkeztünk, mely tartalmazta a pSEM91 expressziós
vektoron a Ptac promoter után építve az rkpM vadtípusú gént, és a kanamicin rezisztencia gént
inaktiváló kloramfenikol rezisztenciát hordozó entranszpozont.
PA_DIP04.doc
30
6. ábra: Az rkpM gén klónozása pSEM91 expressziós vektorba A klónozási folyamat egyes lépéseit szemlélteti az ábra. PCR segítségével megsokszoroztuk a vizsgált gént, a fragment izolálását követően a pBluescript II SK(+) vektor EcoRV helyére ligáltuk, majd a pSEM91 vektor szintén EcoRV helyére. Végül in vitro transzpozíciós mutagenezissel Cam rezisztenciagént juttattunk a plazmid Km génjébe.
PA_DIP04.doc
31
7. ábra: Az in vitro mutagenezis ellenőrzése restrikciós emésztéssel. (A) A bal oldali fotón látható a SalI enzimmel emésztett pAV4223 plazmid, három fragment keletkezik (5,2kb; 1,7kb; 1,2kb). (B) A jobb oldali fotón az 1,3kb-os entranszpozon beépülését követő restrikciós emésztés (SalI) eredménye látható. Az 1,2kb-os fragmentből a beépülés hatására 2,5kb-os fragment keletkezett. λ: PstI enzimmel emésztett lambda DNS
5.7. Az rkpM expresszió hatása különböző mutáns törzsekben
A kísérletben továbbra is azt szerettük volna megtudni, hogy az RkpM fehérje részt
vesz-e a fágreceptor kialakításában. A klónozás során létrehozott pAV4258 plazmidot juttatuk
be konjugáció segítségével az AT212 (rkpM::Tn5), a receptor mutáns GH4046 (rkpM4046),
illetve kontrollként a vad típusú AK631 törzsekbe.
A komplementáció sikerét, vagyis a transzkonjugáns baktériumok fenotípusát fágteszttel
ellenőriztük. Az AK631 törzset mind a 16-3, mind a 16-3 h5, ezzel ellentétben a GH4046
törzset csak a 16-3 h5 bakteriofág képes fertőzni, viszont az AT212 törzset egyik sem. A
kísérletben azt figyeltük, hogy az említett fenotípusok hogyan változnak meg a Ptac::rkpM
konstrukció jelenlétében. Eredményként azt vártuk, hogy az AT212 (rkpM::Tn5) törzsbe,
plazmidon bejuttatott vadtípusú rkpM gén képes helyreállítani mindkét fággal történő
fertőzhetőséget. Ez nem sikerült, a mutáns rkpM4046 génnel történő konjugáció sem hozott
eredményt, ebben az esetben azt reméltük, hogy az AT212 törzs 16-3 h5 fággal szembeni
fertőzhetősége áll helyre (Deák Veronika diplomadolgozat, 2004). A kísérlet pozitív
eredménye, hogy a bejutatott vadtípusú rkpM az AK631 esetén nem csökkentette a fágokkal
való fertőzhetőséget, a GH4046 törzset pedig fertőzhetővé tette a vadtípusú 16-3 fággal
szemben (6. táblázat).
PA_DIP04.doc
32
6. táblázat: A komplementációs kísérlet eredménye. Donor törzs: AV4258. Feltüntettük a recipiensek fágfertőzhetőségét konjugáció előtt és után.
Fenotípus (Fágfertőzés)
Transzkonjugáns fenotípus (Fágfertőzés) Recipiens törzsek
16-3 h5 16-3 h5
AK631 (vad típus) + + + +
4046 − + + +
AT212 (rkpM::Tn5) − − − −
Az AT212 (rkpM::Tn5) törzsel történő konjugáció során valószínű, hogy a Tn5
transzpozon poláris hatása valahogyan mégis megnyílvánul, vagy a kialakításban résztvevő
gének nem tudják létre hozni a fágreceptort. A mutáns rkpM4046 gén bevitelével csökken az
AK631 törzs mindkét fággal történő fertőzhetősége (Deák Veronika diplomadolgozat, 2004).
Ezek alapján azt is feltételezhetjük, hogy az RkpM fehérje önmagában represszor hatású lehet,
ha nem tudja kialakítani a fágreceptort és a KPS bioszintézisben sem vesz részt. A jelenség
következetesebb körüljárásához további kísérletek szükségesek, mivel bonyolultabb
folyamatról lehet szó, mint azt gondoltuk. Azt is meg kell állapítani, hogy a külön bejuttatott
RkpM fehérje mennyire befolyásolja a KPS termelést.
5.8. Az rkpM gén bioinformatikai analízise
Ahhoz, hogy minél többet megtudjunk egy ismeretlen génről, illetve az általa kódolt
fehérjéről, további információkat bioinformatikai eszközök segítségével nyerhetünk. Ezen
ismeretek felhasználásával olyan biológiai kísérleteket tervezhetünk, melyekkel
megállapítható a fehérje természete, funkciója.
Az S. meliloti baktérium KPS bioszintézisben szerepet játszó rkpM génjének nukleotid
és fehérjeszkvenciája már rendelkezésre állt (AC: AJ245666). Ismert volt, hogy a BLASTP
homológia keresés alapján az RkpM szekvenciája nagyban hasonlít a DegT/EryC/DnrJ/StrS
piridoxál-foszfát (PLP) függő aminotranszferáz családba tartozó fehérjékkel (Kiss et al.,
2001). Az említett családba tartozó fehérjék főként poliszacharid és antibiotikum
bioszintézisért felelősek. Már a bevezetőben említettük, hogy az rkp-3 régió a KR5 antigén
szintézisének törzsspecifikus génjeit tartalmazza és csak a S. meliloti 41 törzs rendelkezik ezen
génekkel. A GC-tartalom és a kodonhasználat elemzésével kiderült, hogy az rkp-3 régió génjei
valószínűleg horizontális transzfer segítségével, újonnan szerzett gének. Az egyes kódoló
szekvenciák különböző kodonhasználattal rendelkeznek, valamint a régió génjeinek GC-
PA_DIP04.doc
33
tartalma alacsonyabb, mint az alap „háztartási” géneké (Kiss et al., 2001). Hasonlót már más,
főleg patogén baktériumok K-antigén specifikus génjeinél is feltételeztek. Ezen
információkból kiindulva részletesebb elemzéseket végeztünk a fehérjén. Konzerválódott
domén homológia (Marchler-Bauer et al., 2003) alapján az RkpM fehérje legnagyobb
hasonlóságot a WecE fehérjével mutatott, mely prediktált PLP kötő, sejtfal bioszintézis
regulációjában résztvevő fehérje (COG0399.1) A szekvencia szintű homológia vizsgálatnál
feltűnt, hogy az RkpM fehérje magasfokú hasonlóságot mutat a Pseudomonas aeruginosa
egyik O9 szerotípusba tartozó fehérjéjével (ORF_7, AC: AAM27873.1). A K-antigéneket
alkotó pszeudaminsavat (Pse) először a Pseudomonas törzsekben fedezték fel. Az RkpL-Q
fehérjék BLASTP elemzéséből kitűnt, hogy mindegyik fehérje homológ valamelyik O-antigén
biosztinézisben résztvevő P. aeruginosa fehérjével, melyek pontosan abban a sorrendben
helyezkednek el (O9 szerotípus, AC: AF498420), mint az rkp-3 régióban lévő homológ
fehérjék. Ezekből az adatokból gondolhattunk volna arra is, hogy a S. meliloti ettől a O9
szerotípusba tartozó P.aeruginosa törzstől kapta az rkpL-Q géneket, de Raymond és
munkatársai kimutatták, hogy ezen O-antigén bioszintézisben résztvevő gének GC-tartalma
alacsonyabb a Pseudomonas alap „háztartási” génjeinek GC-tartalmától (Raymond et al.,
2002; www.genome.washington.edu/uwgc/O-Antigen). Ebben az esetben is horizontális
transzferrel magyarázzák a jelenséget ugyanúgy, mint a szintén RkpM homológ P.aeruginosa
WbpE fehérje, alapgénektől eltérő GC-tartalmát. (AC: AAG06543.1, [Pseudomonas
aeruginosa PAO1]; Burrows et al., 1996).
A kísérleti eredményeinkből következtetve az RkpM fehérje a fágreceptor alkotóeleme,
tehát valószínű, hogy a sejtmembránban helyezkedik el, és transzmembrán doménekkel
rendelkezik. Számítógépes elemzés szerint az RkpM fehérje három transzmembrán domént
tartalmaz (50-70, 73-93, 123-143 aminosavak), tehát a belső membránba ágyazódva található.
A domének lehetséges elhelyezkedését a 10. ábra (5.8.3. bekezdés) szemlélteti. A 243
aminosavból álló C terminális rész a periplazmatikus tér felé néz, az általunk meghatározott
rkpM4046 mutáció ezen a szakaszon található.
5.8.1 PLP kötés a DegT/EryC/DnrJ/StrS aminotranszferáz családnál
A következőben a DegT/EryC/DnrJ/StrS piridoxál-foszfát függő amintranszferáz
családról (a továbbiakban DegT család) gyűjtöttünk információkat. Léteznek más PLP függő
aminotranszferáz fehérjék, melyeket már részletesebben elemeztek (aminotranszferáz I.-V.
osztály). Ezekről tudjuk, hogy meghatározott PLP kötőhellyel rendelkeznek, melyek
konzerválódott fehérje szekvencia motívumai ismertek (Pfam adatbázis, I. és II. osztály:
PA_DIP04.doc
34
PF00155, III. osztály: PF00202, IV. osztály: PF01063, V. osztály: PF00266). A PLP kötőhely
szerkezetileg 2 " hélixből és a közöttük lévő $ lemezből áll. A kötőhelyet kialakító molekulák
két rétegből álló struktúrát alkotnak. Az első réteg kapcsolódik a foszfát-csoport 3 oxigén
atomjához. A fehérje és a kofaktor közötti kötésben kiemelt szerepe van a lizin aminosavnak,
mely Schiff bázist képez a PLP molekulával (Denesyuk et al., 2002; Denesyuk et al., 2003). A
DegT család, egy újonnan leírt osztályba tartozik, tagjai főleg pyridoxál/pyridoxamin-foszfát
függő aminotranszferázok, melyek szintén rendelkeznek erősen konzerválódott
fehérjeszekvencia motívummal, de ez eltér az öt aminotranszferáz osztálynál leírt
motívumoktól. A motívum képlete a következő:
G-(D,V,T)-(E,V,Q)-x 76-84-(E,Q,R)-D-x10-12-(G,D,Q)-x3-5-G-x8-10-S-x4-K-x4-5-(G,A,L,F)-(E,D,Q)-G-G.
Itt feltételezhetően szintén a lizin (K) képez Schiff bázist a kofaktorral, emellett az
aszparaginsav (D) hidrogénkötést alakít ki a PLP N1 atomjával (Ahlert et al., 1997; Pascarella
and Bossa, 1994).
8. ábra: A DegT/EryC/DnrJ/StrS aminotranszferáz családba tartozó fehérjék PLP-kötő motívumjainak többszörös illesztése (www.expasy.org). DegT (P15263), WbpE (AAG06543.1), DnrJ (P25048), MosB (AAA91313.1), ORF_7 (AAM27873), RkpM (AJ245666). Az RkpM és az ORF_7 fehérjék motívumtól való eltérését nyíllal jelöltük. A megengedett glutaminsav (E), valin (V) vagy glutamin (Q) helyett triptofán (W) áll.
Miután megvizsgáltuk az RkpM fehérjeszekvenciáját motívum kereső programmal,
kiderült, hogy nem rendelkezik az említett motívummal, ugyanúgy ahogy a P.aeruginosa
ORF_7 fehérje sem, ezzel ellentétben a P. aeruginosa WbpE fehérjéje igen. Ezután, hogy
PA_DIP04.doc
35
kiderítsük pontosan milyen eltérés lehet az RkpM fehérje szekvenciája és a motívum között,
többszörös illesztéseket végeztünk. Az RkpM fehérje és az előbb említett P.aeruginosa
ORF_7 (AAM27873.1) fehérje szekvenciája egyetlen egy aminosavban különbözött a PLP
kötő motívum képletében megadott konzerválódott aminosavakhoz képest, és mindkét
fehérjénél ugyanaz az eltérő aminosav állt, ugyanabban a pozícióban (8. ábra). Más DegT
családdal homológ fehérjénél is találkoztunk ugyanezzel a jelenséggel, de ott más eltérő
aminosav állt az adott pozícióban. Az utóbbi fehérjék PLP kötését még nem bizonyították. Az
eredmények alapján valószínűsíthető, hogy az RkpM fehérje a DegT aminotranszferáz
családba tartozik és piridoxál-foszfát kötésre képes, hogy tényleges bizonyságot nyerjünk
erről, biológiai kísérletekkel kell bizonyítanunk a funkciót.
5.8.2. Az RkpM fehérje DNS-kötő domént tartalmaz?
Léteznek olyan DegT/EryC/DnrJ/StrS aminotranszferáz családba tartozó fehérjék,
melyeknél bizonyították, hogy regulátor szereppel rendelkeznek. Többek között ilyenek a
DegT (Takagi et al., 1990), a DnrJ (Stutzman-Engwall et al., 1992) és a MosB (Murphy et al.,
1993) fehérjék. Az eddigi eredmények alapján elképzelhető, hogy az RkpM fehérje is
rendelkezhet regulátor szereppel (lsd. 5.7 bekezdés). Az aminotranszferáz családba tartozó
fehérjéknél feltételeznek egy hélix-turn-hélix DNS kötő motívumot (Lacalle et al., 1992). Az
előbb leírt, bizonyítottan regulátor funkcióval rendelkező feherjéknél ez a motívum
megtalálható. Többszörös illesztéseket végeztek és az adott helyen fehérje szekvencia
hasonlóság alapján feltételezik a kötőhelyet. Ezzel a módszerrel már más fehérjéknél is
állapítottak meg valószínűsíthető hélix-turn-hélix (HTH) motívumot (Brennan and Matthews,
1989). Mivel a létező hélix-turn-hélix motívumot prediktáló számítógépes programokkal nem
sikerült DNS-kötő helyet találnunk az RkpM fehérjén (a DegT, DnrJ, MosB fehérjéknél sem),
ezért mi is ezt a homológián alapuló módszert használtuk fel a motívum keresésére.
A DegT család fehérjéi meghatározott helyen rendelkeznek a kötőhellyel. A DNS kötő
motívum 20 aminosavból álló fehérje részlet. A regulátor szereppel bíró fehérjék és más, nem
ebbe a családból származó, hasonló kötőhellyel rendelkező fehérjék szekvenciáinak illesztése
alapján megállapítható, hogy a motívum tartalmaz erősen és kevésbé erősen konzerválódott
aminosavakat (Brennan and Matthews, 1989; Murphy et al., 1993). Ezek alapján készítettünk
egy olyan szabályos kifejezésekből álló képletet, amelyet felhasználhattunk számítógépes
motívum keresésre. Mivel a kötőhely igen rövid hosszúságú és csak néhány konzerválódott
aminosavat tartalmaz, ezért egy fehérje szekvencián belül is több helyen előfordulhat.
Szerencsénkre a DNS kötőhelyet pont a PLP kötő motívum által lefedett szekvencia részre
PA_DIP04.doc
36
valószínűsítik, ezért a PLP kötő motívum bizonyos elemeit is felhasználva, olyan DNS kötő
motívumot prediktáló képletet készítettünk, melyet adott helyre pozícionálhattunk ([GA]-x(4)-
G-x(5)-[LI]-x(6)-S-x(4)-K-x(4,5)-[GALF]-[DQE]-G-G). Az általunk létrehozott képletet
felhasználva végeztünk számítógépes keresést az RkpM fehérjén. A képlet túl szigorúnak
bizonyult, mert nem illeszthető a fehérjére. Mivel a motívum tartalmazott kevésbé
konzerválódott aminosavat is, ezért bizonyos változtatásokkal sikerült olyan motívumot
szerkeszteni, mely már illett az RkpM és annak homológ fehérjéire is (9. ábra).
HHHHHHHHtttHHHHHHHHH EryC1 QAVGARHRGHRVGAGSNAAA DegT QAIGAKYNGKCVGELGTAAT MosB QAHGALYKGQHVGLLSDIGC DNRJ QAHGARRHGRLVGTQGHAAA G-x(4)-G-x(5)-[LI] STRS QATGTEIGGRPIGGFGDLAC PRG1 HAHGSRYKGKPVGTFGDAAV ΛCro QTKTAKDLGVYQSAINKAIH 434REP QAELAQKVGTTQQSIEQLEN
ORF_7 HAIGGRYLGEYIGNCRYSDITIFSFHPVKIITTAEGG RkpM HAVGGRYRGEPIGNCRYSDVTVFSFHPVKIVTTAEGG
1. [GA]-x(4)-G-x(12,14)-S-x(4)-K-x(4,5)-[GALF]-[DQE]-G-G
2. [HQ]-x(2)-[GA]-x(4)-G-x(12,14)-S-x(4)-K-x(4,5)-[GALF]-[DQE]-G-G
9. ábra: Feltételezett DNS kötő motívumok a DegT családba tartozó és egyéb, már bizonyítottan DNS kötő, valamint az RkpM és ORF_7 (P. aeruginosa) fehérjéknél. Pirossal a konzerválódott, kékkel a PLP motívum konzerválódott aminosavait jelöltük. Az 1. számmal jelölt képlet illik az RkpM és ORF_7 fehérjékre. Az adatbázis keresés (7. táblázat) során újabb aminosavval bővítettük a képletet (2. motívum képlet), zölddel jelölve.
A következőkben arra voltunk kíváncsiak, hogy az általunk készített képlet mennyire
jellemző a DegT aminotranszferáz családra. Ennek megállapítására, a képlet segítségével
keresést végeztünk fehérje szekvencia adatbázisokban. A vizsgálatok alapján a motívumot
olyan fehérjék is tartalmazzák, melyek nem az aminotranszferáz, hanem főleg B típusú
karboxilészteráz/lipáz családba tartozó fehérjék. A képlet újabb módosításával (9. ábra, 2.
motívum) sikerült csak azokat a fehérjéket megtalálnuk, melyek mind a DegT családba
tartoznak. A keresés eredménye tartalmazta mind az RkpM, WbpE, ORF_7 mind a DegT,
EryC, StsC, DnrJ fehérjéket is (7. táblázat). Az első képlet alkalmazásával 66, DegT családdal
homológ fehérjét találtunk a trembl adatbázisban, míg a bővített képlettel csak 52-t, ezen
fehérjék többségénél még nem írtak le DNS kötő domént. A számokból következik, hogy 14
PA_DIP04.doc
37
fehérje adott szekvencia részlete nem hisztidin (H) vagy glutamin (Q) aminosavval kezdődik.
Az utóbbi fehérjék nagy része perozamin szintáz enzim (RfbE, WbhD).
Természetesen nem mondhatjuk, hogy ez a képlet konkrétan HTH motívumot prediktál,
mivel nagyobb szekvenciarészletet fed le, mint maga a DNS kötő hely. Inkább lehetőséget ad
arra, hogy egy DegT családdal homológiát mutató fehérjében megtaláljuk azokat a
konzerválódott aminosavakat, melyek jellemzőek a már bizonyítottan regulátor szereppel
rendelkező fehérjék DNS kötő motívumjaira.
7. táblázat: Fehérje szekvenciák keresése a kétféle képlet alapján (db).
Motívum: [GA]-x(4)-G-x(12,14)-S-x(4)-K-x(4,5)-[GALF]-[DQE]-G-G
Adatbázis DegT/EryC/DnrJ/StrS családba tartozó fehérje
Nem DegT/EryC/DnrJ/StrS családba tartozó fehérje
Swissprot 5 1
trembl 66 18
Motívum: [HQ]-x(2)-[GA]-x(4)-G-x(12,14)-S-x(4)-K-x(4,5)-[GALF]-[DQE]-G-G
Swissprot 5 --
trembl 52 --
5.8.3 A bioinformatikai elemzések eredményeinek értékelése
A számítógépes elemzések alapján az RkpM a DegT/EryC/DnrJ/StrS fehérje családba
tartozik, és valószínű, mint piridoxál-foszfát függő aminotranszferáz funkcionál. A fehérje kis
eltéréssel, tartalmazza a fehérje családra jellemző PLP kötő motívumot, és ami fontos,
rendelkezik a PLP molekulával kötést kialakító aszparagin és lizin aminosavakkal a megfelelő
pozíciókban. Az RkpM fehérje homológ számos poliszacharid és sejtfal bioszintézisében
szereplő regulátor fehérjével. Vizsgálataink alapján feltételezhető, hogy van egy DNS kötő
HTH motívum a fehérjén, viszont érdekes, hogy mind az RkpM, mind a DegT család regulátor
fehérjéinél a PLP kötésben fontos szerepet betöltő lizin és a DNS kötő hely igen közel
találhatók egymáshoz. Ebből arra következtethetünk, hogy a két funkció nem működhet
egyszerre. Mivel a KPS kialakításáért felelős az RkpM, tehát ez esetben az aminotranszferáz
funkció érvényesül, de bizonyos esetekben előfordulhat, hogy szabályozó DNS-régió(k)hoz
kötődhet, és a hasonló HTH motívummal rendelkező fehérjék (λcro, 434Rep, λRep)
PA_DIP04.doc
38
természetéből kiindulva valószínű, hogy represszáló hatású. Az elemzések alapján a fehérje a
belső membránban helyezkedik el, három transzmembrán doménnel rendelkezik (10. ábra). A
mutáció a periplazmatikus tér felé néz, a PLP kötésért felelős aszparginsav (D157) és lizin
(K188) aminosavak, valamint a prediktált DNS kötő motívum is a periplazmatikus tér felé néző
szekvenciarészre esik. Hasonló tulajdonságokkal rendelkezik a Xanthomonas campestris pv.
campestris LPS bioszintézisben résztvevő WxcK fehérjéje, mely szintén a DegT családdal
homológ és tartalmaz egy transzmembrán domént (Vorhölter et al., 2001).
10. ábra: Az RkpM fehérje feltételezett transzmembrán doménjeinek elhelyezkedése Az ábrán kékkel jelöltük a PLP motívum által lefedett szekvenciarészt, valamint nyillal az rkpM4046 mutációt.
A következőkben a különböző funkciók bizonyítására, biológiai kísérletek elvégzésére
van szükség, legfőképpen azt kell tisztázni, hogy az említett lehetséges funkciók milyen
feltételek esetén érvényesülnek.
PA_DIP04.doc
39
6. ÖSSZEFOGLALÁS
Munkánk kezdetekor rendelkezésünkre állt egy olyan Sinorhizobium meliloti baktérium
mutáns (GH4046), melyet a host-range jelenség segítségével izoláltak, rezisztens a vadtípusú
16-3 bakteriofággal szemben, emellett gyanítottuk, hogy módosult szerkezetű KPS-el
rendelkezik. Feltételeztük, hogy a KPS receptorként szolgál a 16-3 bakteriofág számára, mivel
a KPS hiánya befolyásolja a fágrezisztenciát. Bizonyítani szerettük volna, hogy a KPS valóban
fágreceptor szerepet is tölthet be, vagy más struktúra felelős ezért, valamint a poliszacharid
bioszintézisben résztvevő gének természetének megismerését tűztük ki célul.
Komplementációs kísérlettel megállapítottuk, hogy a GH4046 törzs mutációja az rkpM
génben található és a gén bázissorrendjének meghatározásával kiderült, a változást egy
missens mutáció okozta a fehérje C-terminális részén. A vad típusú allél leucint (Leu252)
meghatározó kodonjának (TTG) egyik bázisa megváltozott (TTC), mely fenilalanin (Phe252)
beépülését okozza az aminosavlánc adott pozíciójába. Ugyanezt az eredményt találtuk a
függetlenül izolált GH4178 törzs vizsgálatánál is. Megtudtuk, hogy a GH4046 baktérium törzs
egyáltalán nem termel KPS-t. Ezek alapján arra következtettünk, hogy a feltételezéseinkkel
ellentétben a fágreceptor nem ez, hanem egy olyan sejtfelszíni struktúra, melynek
kialakításában az RkpM fehérje, ezen kívül a GH4180 tözs előzetes vizsgálata szerint más
fehérje is részt vesz. A továbbiakban klónozási és újabb komplementációs kísérleteket
végeztünk a fágreceptor felépülésének pontosabb megismerése érdekében. A kísérletekben
nem sikerült igazán tisztázni a folyamatot, de rávilágítottak arra, hogy az RkpM több
funkcióval rendelkező fehérje, a receptor kialakulásában több tényező is szerepet játszhat,
mint azt gondoltuk.
A számítógépes elemzések szerint, az RkpM fehérje feltételezhetően a
DegT/EryC/DnrJ/StrS piridoxál-foszfát kötő aminotranszferázok családjába tartozik, hasonló
több poliszacharid és sejtfal bioszintézisében résztvevő regulátor fehérjével. Valószínűleg a
belső sejtmembránban helyezkedik el és három transzmembrán doménnel rendelkezik.
Homológia alapján DNS kötő helix-turn-helix (HTH) motívum prediktálható a fehérjén, illetve
tartalmazza azokat a konzerválódott aminosavakat, melyek jellemzőek a bizonyítottan
regulátor funkcióval rendelkező fehérjék DNS kötő motívumjaira.
A biológia kísérletekből és a bioinformatikai analízisből kitűnik, hogy az RkpM fehérje
több funkcióval is rendelkezhet, melyek különböző feltételek mellett érvényesülhetnek. A
különböző fehérje funkciók bizonyítására és azok összefüggéseinek tisztázására további, főleg
biológiai kísérleteket kell elvégezni a jövőben.
PA_DIP04.doc
40
7. IRODALMI HIVATKOZÁSOK
Ahlert, J., J. Distler, K. Mansouri, and W. Piepersberg. 1997. Identification of stsC, the gene encoding the L- glutamine:scyllo-inosose Streptomycetes. Arch Microbiol. 168:102-113.
Allen, O.N., and E.K. Allen. 1981. The Leguminosae: A source book of characteristics, uses, and nodulation The University of Wisconsin Press, Madison.
Altschul, S.F., W. Gish, W. Miller, E.W. Myers, and D.J. Lipman. 1990. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215:403-410. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/.
Becking, T.H. 1992. The Rhizobium symbiosis of the nonlegume Parasponia. Chapman & Hall, New York.
Becquart-de Kozak, I., B.L. Reuhs, D. Buffard, C. Breda, J.S. Kim, R. Esnault, and A. Kondorosi. 1997. Role of the K-antigen subgrup of capsular polysaccharides in the early recognition process between Rhizobium meliloti and alfalfa leaves. Mol. Plant-Microbe Interact. 10:114-123.
Bladergroen, M.R., and H.P. Spaink. 1998. Genes and signal molecules involved in the rhizobia-Leguminosae symbiosis. Current Opinion Plant Bio. 1:353-359.
Brennan, R.G., and B.W. Matthews. 1989. The Helix-Turn-Helix DNA Binding Motif. J Biological Chemistry. 264:1903-1906.
Brzoska, P.M., and E.R. Signer. 1991. lpsZ, a lipopolysaccharide gene involved in symbiosis of Rhizobium meliloti. J. Bacteriol. 173:3235-3237.
Bullock, W.O., J.M. Fernandez, and J.M. Short. 1987. Xl1-blue: A High Efficiency Plasmid Transforming RecA Es. Biotechniques. 5:376-379.
Burns, R.C., and R.W.F. Hardy. 1975. Nitrogen fixation in bacteria and higher plants. Springer Verlag, New York.
Burrows, L.L., D.F. Charter, and L.J. S. 1996. Molecular characterization of the Pseudomonas aeruginosa serotype O5 (PA01) B-band lipopolysaccharide gene cluster. Mol Biol. 22:481-495.
Catoira, R., C. Galera, F. de Billy, R. Penmetsa, E. Journet, F. Maillet, C. Rosenberg, D. Cook, C. Gough, and J. Denarie. 2000. Four genes of Medicago truncatula controlling components of a nod factor transduction pathway. Plant Cell. 12:1647-1666.
Cheng, H.P., and G.C. Walker. 1998. Succinoglycan is required for initiation and elongation of infection threads during nodulation of alfalfa by Rhizobium meliloti. J Bacteriol. 180:5183-5191.
Claros, M.G., and G.v. Heijne. 1994. TopPred II: an improved software for membrane protein structure predictions. Comput. Applic. Biosci. 10:685-686.
Currier, W.M., and G.A. Strobel. 1974. Chemotaxis of a Rhizobium spp to a glucoprotein produced by birdsfoot trefoil roots. Science. 196: 434-436.
David, M., M.-L. Daveran, J. Batut, A. Dedien, O. Domergue, J. Ghai, C. Hertig, P. Boistard, and D. Kahn. 1988. Cascade regulation of nif gene expression in Rhizobium meliloti. Cell. 54:671-683.
Dean, D.R., J.T. Bolin, and L. Zheng. 1993. Nitrogenase metalloclusters : structures, organisation and synthesis. J. Bacteriol. 175:6737-6744.
Dénairé, J., F. Dabellé, and C. Rosenberg. 1992. Signaling and host range variation in nodulation. Annu Rev Microbiol. 46:497-531.
Denarie, J., and F. Debelle. 1996. Rhizobium lipo-chitooligosaccharide nodulation factors: Signaling molecules mediating recognition and morphogenesis. Annu. Rev. Biochem. 65:503-535.
PA_DIP04.doc
41
Denesyuk, A.I., K.A. Denessiouk, T. Korpela, and M.S. Johnson. 2002. Functional Attributes of the Phosphate Group Binding Cup of Pyridoxal Phosphate-dependent Enzymes. J Mol Biol. 316:155-172.
Denesyuk, A.I., K.A. Denessiouk, T. Korpela, and M.S. Johnson. 2003. Phosphate group binding "cup" of PLP-dependent and non-PLP-dependent enzymes: leitmotif and variations. Biochimica et Biophysica Acta. 1647:234-238.
Diaz, C.L., L.S. Melchers, P.J.J. Hooykaas, B.J.J. Lugtenberg, and J.W. Kijne. 1989. Root lectin as a determinant of host-plant specificity in the Rhizobium legume symbiosis. Nature. 338:579-581.
Ditta, G., S. Stanfield, D. Corbin, and D.R. Helinski. 1980. Broad host- range DNA cloning system for Gram-negative bacteria: construction of a gene bank of Rhizobium meliloti. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77: 7347-7351.
Dudley, M.E., T.W. Jacobs, and S.R. Long. 1987. Microscopic studies of cell divisions induced in alfalfa roots by Rhizobium meliloti. Planta. 171:289-301.
Earl, C.D., C.W. Ronson, and F.M. Ausubel. 1987. Genetic and structural analysis of the Rhizobium meliloti fixA fixB fixC and fixX genes. J. Bacteriol. 169:1127-1136.
Ehrhardt, D.W., R. Wais, and S.R. Long. 1996. Calcium spiking in plant root hairs responding to Rhizobium nodulaton signals. Cell. 85:673-681.
Falquet, L., M. Pagni, P. Bucher, N. Hulo, C.J.A. Sigrist, K. Hofmann, and A. Bairoch. 2002. The PROSITE database, its status in 2002. Nucleic Acids Research. 30:235-238.
Fischer, H.-M. 1994. Genetic regulation of nitrogen fixation in rhizobia. Microbiol Rev. 58:352-386.
Forsberg, L.S., and B.L. Reuhs. 1997. Structural characterization of the K antigens from Rhizobium fredii USDA257: evidence for a common srtuctural motif, with strain-specific variation, in the capsular polysaccharides of Rhizobium spp. J. Bacteriol. 179:5366-5371.
Fraysse, N., F. Couderc, and V. Poinsot. 2003. Surface polysaccharide involvement in establishing the rhizobium-legume symbiosis. Eur. J. Biochem. 270:1365-1380.
Gage, D.J., and W. Margolin. 2000. Hanging by thread: invasion of legume plants by rhizobia. Current Opinion Microbio. 3:613-617.
Gasteiger, E., A. Gattiker, C. Hoogland, I. Ivanyi, R.D. Appel, and A. Bairoch. 2003. ExPASy: the proteomics server for indepht protein knowledge and analysis. Nucleic Acid Research. 31:3784-3788.
Geurts, R., and T. Bisseling. 2002. Rhizobium Nod factor perception and signalling. Plant Cell:s239-s249.
Gonzáles, J.E., C.E. Semino, L.X. Wang, L.E. Castellano-Torres, and G.C. Walker. 1998. Biosynthetic control of molecular weigth in the polymerization of the octasaccharide subunits of succinoglycan, a symbiotically important exopolysaccharide of Rhizobium meliloti. Proc Natl Acad Sci USA. 95:13377-13482.
Haapa, S., S. Suomalainen, S. Eerikäinen, M. Airaksinen, L. Paulin, and H. Savilahti. 1999. An efficient DNA sequencing strategy based on the bacteriophage Mu in vitro DNA transposition reaction. Genome Res. 9:308-315.
Hentschel, U., M. Steinert, and J. Hacker. 2000. Common molecular mechanism of symbiosis and pathogenesis. Trends Microbiol. 8:226-231.
Hirsch, A.M. 1992. Developmental biology of legume nodulation. New Phytol. 122:211-237. Inoue, H., H. Nojima, and H. Okayama. 1990. High efficiency transformation of Escherichia
coli with plasmids. Gene. 96:23-28. Ish-Horovicz, D., and J.F. Burke. 1981. Rapid and efficient cosmid cloning. Nucl. Acids Res.
9:2989-2998. Kannenberg, E.L., and N.J. Brewin. 1994. Host-plant invasion by Rhizobium : the role of cell-
surface components. Trends Microbiol. 2:277-283.
PA_DIP04.doc
42
Kereszt, A., E. Kiss, B. Reuhs, R.W. Carlson, A. Kondorosi, and P. Putnoky. 1998. Novel rkp gene clusters of Sinorhizobium meliloti involved in capsular polysaccharide production and the invasion of the symbiotic nodule: rkpK gene encodes for a UDP-glucose dehydrogenase. J. Bacteriol. 180:5426-5431.
Kiss, E., A. Kereszt, F. Barta, S. Stephens, B. Reuhs, L., A. Kondorosi, and P. Putnoky. 2001. The rkp-3 gene region of Sinorhizobium meliloti Rm41 contains strain-specific genes that determine K antigen structure. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14:1395-1403.
Kiss, E., and A. Kondorosi. 1997. Complete sequence of a Rhizobium plasmid carrying genes necessary for symbiotic association with the plant host. BioEssays. 19:843-846.
Kiss, G.B., E. Vincze, Z. Kalman, T. Forrai, and A. Kondorosi. 1979. Genetic and biochemical analysis of mutants affected in nitrate reduction in Rhizobium meliloti. J. Gen. Microbiol. 113:105-118.
Kovach, M.E., R.W. Phillips, P.H. Elzer, R.M. Roop, and K.M. Peterson. 1994. pBBR1MCS: A broad-host-range cloning vector. BioTechniques. 16:800-802.
Lacalle, R.A., J.A. Tercero, and A. Jiménez. 1992. Cloning of the complete biosynthetic gene cluster for an aminonucleoside antibiotic, puromycin, and its regulated expression in heterologous hosts. EMBO J. 11:785-792.
Lagares, A., G. Caetano-Anolles, K. Niehaus, J. Lorenzen, H.D. Ljunggren, A. Puhler, and G. Favelukes. 1992. A Rhizobium meliloti lipopolysaccharide mutant altered in competitiveness for nodulation in alfalfa. J Bacteriol. 174:5941-5952.
Leigh, J.A., E.R. Signer, and G.C. Walker. 1985. Exopolysaccharide deficient mutants of Rhizobium meliloti that form inefficient nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82:6231-6235.
Leigh, J.A., and G.C. Walker. 1994. Exopolysaccharides of Rhizobium: Synthesis, regulation and symbiotic function. Trends Genet. 10:63-67.
Luyten, E., and J. Vanderleyden. 2000. Survey of identified in Shinorhizobium meliloti spp., necessary for the development of an efficient symbiosis. Eur. J Soil Biol. 36:1-26.
Marchler-Bauer, A., J.B. Anderson, C. DeWeese-Scott, N.D. Federova, L.Y. Geer, S. He, D.I. Hurwitz, J.D. Jackson, A.R. Jacobs, C.H. Lanczycki, C.A. Leibert, C. Liu, T. Madej, G.H. Marchler, R. Mazumder, A.N. Nikolskaya, A.R. Panchenko, B.S. Rao, B.A. Shoemaker, V. Simonyan, J.S. Song, P.A. Thiessen, S. Vasudevan, Y. Wang, R.A. Yamashita, J.J. Yin, and S.H. Bryant. 2003. CDD: a curated Entrez database of conserved domain alignments. Nucleic Acids Research. 31:383-387.
Meade, H.M., S.K. Long, G.B. Ruvkun, S.E. Brown, and F.M. Ausubel. 1982 Physical and genetic characterization of symbiotic and auxotrophic mutants of Rhizobium meliloti induced by transposon Tn5 mutagenesis. J. Bacteriol. 149:114-122
Mellor, R., and D. Werner. 1987 Peribacteroid membrane biogenesis in mature legume root nodules. Symbiosis. 3:75-100
Mergaert, P., M. Van Montagu, and M. Holsters. 1997. Molecular mechanism of Nod factor diversity. Mol Microbiol. 25:811-817.
Mills, K.K., and W.D. Bauer. 1985. Rhizobium attachment to clover roots. J Cell Sci Suppl. 2:333-345.
Murphy, P.J., S.P. Trenz, W. Grzemski, F.J. De Bruijn, and J. Schell. 1993. The Rhizobium meliloti Rhizopine mos Locus Is a Mosaic Structure Facilitating Its Symbiotic Regulation. J Bacteriol. 175:5193-5204.
Müller, P., M. Hynes, D. Kapp, K. Niehaus, and A. Puhler. 1988. Two classes of Rhizobium meliloti inf ection mutants differ in exopolysaccharide production and in coinoculation properties with nodulation mutants. Mol. Gen. Genet. 211:17-26.
PA_DIP04.doc
43
Newcomb, W. 1981 Nodule morphogenesis and differentiation. In Biology of the Rhizobiaceae. Vol. 13. K.L. Giles and A.G. Atherly, editors. Academic Press, New York. 247-298.
Orosz, L., and T. Sik. 1970. Genetic mapping of rhizobiophage 16-3. Acta Microbiol. Acad. Sci. Hung. 17:185-194.
Orosz, L., Z. Svab, A. Kondorosi, and T. Sik. 1973. Genetic studies on Rhizobio- phage 16-3. Genes and functions on the chromosome. Mol. Gen. Genet. 125:341- 350.
Pascarella, S., and F. Bossa. 1994. Similarity between pyridoxal/pyridoxamine phosphate-dependent enzymes involved in dideoxy and deoxyaminosugar biosynthesis ang other pyridoxal enzymes. Prot Science. 3:701-705.
Petrovics, G., P. Putnoky, B. Reuhs, J. Kim, T.A. Thorp, K.D. Noel, R.W. Carlson, and A. Kondorosi. 1993. The presence of a novel type of surface polysaccharide in Rhizobium meliloti requires a new fatty acid synthase-like gene cluster involved in symbiotic nodule development. Mol. Microbiol. 8:1083-1094.
Postgate, J.R. 1972. The Chemistry and Biochemistry of Nitrogen Fixation. Plenum Press, London.
Preisig, O., D. Anthamatten, and H. Hennecke. 1993. Genes for a microaerobically induced oxidase complex in Bradyrhizobium japonicum are essential for a nitrogen-fixing endosymbiosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90:3309-3313.
Putnoky, P., E. Grosskopf, D.T.C. Ha, G.B. Kiss, and A. Kondorosi. 1988. Rhizobium fix genes mediate at least two communication steps in symbiotic nodule development. J. Cell Biol. 106:597-607.
Putnoky, P., G. Petrovics, A. Kereszt, E. Grosskopf, D.T.C. Ha, Z. Banfalvi, and A. Kondorosi. 1990. Rhizobium meliloti lipopolysaccharide and exopolysaccharide can have the same function in the plant-bacterium interaction. J. Bacteriol. 172:5450-5458.
Raymond, C.K., E.H. Sims, A. Kas, D.H. Spencer, T.V. Kutyavin, R.G. Ivey, Y. Zhou, R. Kaul, J.B. Clendenning, and M.V. Olson. 2002. Genetic variation at the O-antigen biosynthetic locus in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 184:3614-3622.
Redmond, J.W., M. Batley, M.A. Djordjevic, R.W. Innes, P.L. Kuempell, and B.G. Rolfe. 1986. Flavons induce expression of nodulation genes in Rhizobium. Nature. 323:632-635.
Reuber, T.L., and G.C. Walker. 1993. The acetyl substituent of succinoglycan is not necessary for alfalfa nodule invasion by Rhizobium meliloti Rm1021. J. Bacteriol. 175:3653-3655.
Reuhs, B.L. 1997. Acidic capsular polysaccharides (K antigens) of Rhizobium. In Biology of Plant-Microbe Interactions. G. Stacey, B. Mullin, and P.M. Gresshoff, editors. International Society for Molecular Plant-Microbe Interactions, St. Paul. 331-336.
Reuhs, B.L., R.W. Carlson, and J.S. Kim. 1993. Rhizobium fredii and Rhizobium meliloti produce 3-deoxy-D-manno-2- octulosonic acid-containing polysaccharides that are structurally analogous to group II K antigens (capsular polysaccharides) found in Escherichia coli. J. Bacteriol. 175:3570-3580.
Reuhs, B.L., D.P. Geller, J.S. Kim, J.E. Fox, and S.G. Pueppke. 1998. Sinorhizobium fredii, and Sinorhizobium meliloti produce structurally conserved lipopolysaccharides and strain-specific K antigens. Appl. Environ. Microbiol. 64:4930-4938.
Reuhs, B.L., M.N. Williams, J.S. Kim, R.W. Carlson, and F. Cote. 1995. Suppression of the Fix- phenotype of Rhizobium meliloti exoB mutants by lpsZ is correlated to a modified expression of the K polysaccharide. J. Bacteriol. 177:4289-4296.
Rippka, R., J. Deruelles, J.B. Watersbury, M. Herdman, and R.Y. Starnier. 1979. Generic assingments, strain histories and properties of pure cultures of cyanobacteria. J Gen Microbiol. 111:1-61.
PA_DIP04.doc
44
Robertson, J.G., and P. Lyttleton. 1982. Coated and smooth vesicles in the biogenesis of cell walls, plasma membranes, infection threads and peribacteroid membrane in root hairs and nodules of white clover. J Cell Sci. 58:63-78.
Rosenow, C., F. Esumch, I.S. Roberts, and K. Jann. 1995. Characterization and Localization of the KpsE Protein of Escherichia coli K5, Which Is Involved in Polysaccharide Export. J Bacteriol. 177:1137-1143.
Sambrook, J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual - 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
Schenk, H.E.A. 1992. Cyanobacterial symbioses. Springer-Verlog, New York. Schultze, M., E. Kondorosi, P. Ratet, M. Buire, and A. Kondorosi. 1994. Cell and molecular
biology of Rhizobium-plant interactions. Int. Rev. of Cytol. 156:1-75. Semsey, S., I. Papp, Z. Buzas, A. Patthy, L. Orosz, and P. Papp. 1999. Identification of site-
specific recombination genes int and xis of the Rhizobium temperate phage 16-3. J Bacteriol. 181:4185-4192.
Stutzman-Engwall, K.J., S.L. Otten, and C.R. Hutchinson. 1992. Regulation of secondary metabolism in Streptomyces spp. and overproduction of daunorubicin in Streptomyces peucetius. J.Bacteriol. 174:144-154.
Takagi, M., H. Takada, and T. Imanaka. 1990. Nucleotide sequence and cloning in Bacillus subtilis of the Bacillus stearothermophilus pleiotropic regulatory gene degT. J Bacteriol. 172:411-418.
Vorhölter, F.-J., K. Niehaus, and A. Pühler. 2001. Lipopolisaccharide biosynthesis in Xanthomonas campestris pv. campestris: a cluster of 15 genes is involved in the biosynthesis of the LPS O-antogene and the LPS core. Mol Genet Genomics. 266:79-95.
Walker, G.C. 1992. Role of exopolysaccharides in nodulation. In Nodulation and Nitrogen Fixation in Rice. G.S. Khush and J. E-Bennett, editors. Int Rice Research Inst, Manila. 55-60.
Wang, J., V. Michel, M. Hofnung, and A. Charbit. 1998. Cloning of the J gene of bacteriophage lambda, expression and solubilization of the J protein: first in vitro studies on the interactions between J and LamB, its cell surface receptor. Res Microbiol. 149:611-624.
Werts, C., V. Michel, M. Hofnung, and A. Charbit. 1994. Adsorption of bacteriophage lambda on the LamB protein of Escherichia coli K-12: point mutations in gene J of lambda responsible for extended host range. J. Bacteriol. 176:941-947.
West, N.J., and D.G. Adams. 1997. Phenotypic and Genotypic Comparison of Symbiotic and Free-Living Cyanobacteria from a Single Field Site. Applied Environ Microbiol. 63:4479-4484.
Wolk, C.P., A. Erust, and J. Elhai. 1994. Heterocyst and metabolism and development. Kluwer Academic Publisher, Boston.
Yanisch-Perron, C., J. Viera, and J. Messing. 1985. Improved M13 phage cloning vectors and host strains : nucleotid sequence of the M13mp18 and pUC19 vectors. Gene. 33:103-119.
PA_DIP04.doc
45
8. RÖVIDÍTÉSEK
KPS kapszuláris poliszacharid EPS exopoliszacharid LPS lipopoliszacharid Amp ampicillin Tc tetraciklin Km kanamicin Cam kloramfenikol EDTA etilén-diamino-tetra-acetát SDS nátrium-lauril-szulfát Tris tris-(hidroxi-metil)-amino-metán DTT dithiotreitol DNS dezoxi-ribonukleinsav PCR polimeráz láncreakció kb kilobázis PLP piridoxál-foszfát HTH hélix-turn-hélix
PA_DIP04.doc
46
KÖSZÖNETNYÍLVÁNÍTÁS
Munkámat a PTE Természettudományi Kar, Genetikai és Molekuláris Biológiai
Tanszékén végeztem. Hálás vagyok a tanszék összes dolgozójának, hogy megfelelő hátteret
biztosítottak terveim megvalósításához.
Köszönettel tartozom témavezetőmnek, Dr. Putnoky Péternek munkám irányításáért
önzetlen segítségéért, tanácsaiért.
Köszönöm Deák Veronikának, − akivel a közös témánk kísérleteit együtt végeztem −
kitartását és ötleteit, Hoffman Gyulának, hogy rendelkezésünkre bocsájtotta az izolált
baktérium mutánsokat, valamint Nagy Tibornak a bioinformatikai elemzésekben adott hasznos
segítségét.
PA_DIP04.doc
top related