badania genetyczne w dystrofiach miotonicznych · miopatia zróżnicowanie mięśni zaćma inne...
Post on 12-Mar-2020
2 Views
Preview:
TRANSCRIPT
BADANIA GENETYCZNE
W DYSTROFIACH MIOTONICZNYCH
Anna Sułek
Pracownia Molekularnych Podstaw
Chorób Neurodegeneracyjnych
Zakład Genetyki, IPiN
Kurs Neurogenetyki
DYSTROPHIES NON-DYSTROPHIC
MYOTONIA MYOTONIC
DYSTROPHY
OBRAZ KLINICZNY DYSTROFII MIOTONICZNEJ – WIELE TWARZY
Choroba wieloukładowa, klinicznie heterogenna, miopatia miotoniczna
DM1 – 4 podtypy: łagodny, klasyczny, młodzieńczy i wrodzony
Typ 1: zaćma, łysienie, w późnym wieku może rozwinąć się miotonia
Typ 2: 2-3 dekada życia, osłabienie siły mięśni dystalnych, zaburzenia przewodzenia,
miotonia, objawy ze strony układu pokarmowego, apatia
Typ3: przypomina typ 2, zaburzenia poznawcze, zaburzenia zachowania
Typ4: słabe ruchy płodu, wielowodzie, dziecko wiotkie, zaburzenia oddychania
Antycypacja w dziedziczeniu
dystrofii miotonicznej
zjawisko obserwowane w dziedziczeniu niektórych chorób genetycznie
uwarunkowanych, charakteryzujące się wcześniejszym występowaniem
objawów choroby i cięższym (ostrzejszym) jej przebiegiem w kolejnych
pokoleniach.
ANTYCYPACJA
PATOGENEZA MOLEKULARNA
Poziom DNA – niestabilność powtórzeń mikrosatelitarnych Poziom RNA – toxic gain of function Poziom białka – czy bierze udział w patomechanizmie?
DYSTROFIA MIOTONICZNA TYPU 1
mutacja dynamiczna w genie DMPK (19q13)
ekspansja powtórzeń CTG w regionie nie ulegającym
translacji genu DMPK
5 - 37 CTG norma
38 - 49 CTG premutacja
> 50 CTG pełna mutacja
Produktem genu jest serynowo-treoninowa kinaza białkowa
związana z przewodnictwem i przekazywaniem sygnału wewnątrz
komórki. Aktywna w komórkach mięśnia sercowego i mięśni
szkieletowych
Sąsiedztwo genu DMPK i lokalizacja powtórzeń
SIX5 – czynnik transkrypcyjny zawierający homeodomenę,
pełniący funkcję w organogenezie
DMWD – dystrophia miotonica-containing WD repeat motif
Patogeneza na poziomie DNA
CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG
CTG CTG CTG CTG CTG CTG
CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTG
mutacja dynamiczna de novo
CTG CTG CTG CTG CTG CTG
CAG mutacja dynamiczna –
zwielokrotnienie powtórzeń
mutacja dynamiczna
przypadek sporadyczny - 1%
choroba dziedziczna
Antycypacja
forma młodzieńcza – 10%
Niestabilność powtórzeń CTG/CCTG
Tworzenie struktur: pętle, potrójne helisy, kwadrupleksy i in.
Niestabilność somatyczna (większa w DM2)
DM1 (płód) – największe ekspansje w sercu a najmniejsze w wątrobie (40-400)
DM1 (dorosły) – największe ekspansje w sercu i korze mózgowej, najmniejsze
w móżdżku (5770 CTG)
Białka zaangażowane w procesy naprawcze DNA
Patogeneza na poziomie DNA
Frequency of DMPK alleles (DM1)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
5 8 10 11 12 13 14 15 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 28 29 30 31
allele (CTGn)
freq
ue
ncy %
Prawidłowy zakres liczby CTG a częstość występowania DM1
Proponowany mechanizm patologiczny w DM1 (gain of function)
• im więcej powtórzeń, tym bardziej zaburzony splicing
• poziom białka CUG BP jest podwyższony w mięśniach pacjentów z DM1
• CIC - białko kanału chlorkowego, specyficznego dla komórek
mięśniowych
CUG
mRNA białka CUG
BP
wzrost
alternatywnego
splicingu
różnych białek
IR (insulinooporność)
CIC-1 (miotonia)
DYSTROFIA MIOTONICZNA TYPU 1
Patogeneza DM
Mbnl1 CUG BP Mbnl1
CUG BP
Prawidłowy stan DM1
Elementy trans (spliceopathy)
W obecności mutRNA białko CUG-BP wiąże się z kompleksem
rybonukleinowym, co opóźnia jego szybki katabolizm i prowadzi do
akumulacji i „nadaktywności” w jądrze
Dwa czynniki splicingowe: białko Mbnl1 i CUG BP
Patogeneza DM – poziom RNA
Dwa czynniki splicingowe: białko Mbnl1 i CUG BP
Elementy cis
Transkrypty z ekspansją powtórzeń zostają w jądrze komórkowym
Tworzą struktury drugo-, trzecio- i czwartorzędowe
Brak białka DMPK – haploinsufficiency
Zaburzenia transkrypcji genów flankujących – SIX5 i DMAHP
Alternatywne składanie genów w DM1
Patogeneza – DM – poziom białka
Geny:
ClC1
IR
Troponina T (TNNT2,3)
Białko tau (MAPT), APP,
NMDAR1
Miotubularyna,
MTMR1 – myotubularin related 1 gene
SERCA1, 2, RγR,
Dystrofina (ex 71, 78)
?
?
Objawy:
Miotonia
Cukrzyca
Zaburzenia kardiologiczne
CNS
Miopatia
Zróżnicowanie mięśni
Zaćma
Inne
Geny, których alternatywny splicing może powodować objawy kliniczne DM
(CTG)n
(CCTG)n
Cytoplazma
zaburzona regulacja
alternatywnego splicingu genów:
TNNT2, TNNT3, CLCN1, IR, MAPT, MTMR1
NMDAR1, APP, SERCA1, SERCA2, RγR,
-dystrobrevin
Jądro komórkowe
zaburzona regulacja
transkrypcji genów:
NKX2-5, Sp1, CLCN1,
Connexin 40, 43
toksyczne RNA
Patogeneza DM – poziom białka
DMPK – kinaza białkowa serynowo/treoninowa związana z dynamiką aktyny
i homeostazą jonową
Ulega alternatywnemu splicingowi
Lokalizacja: DMPK A, B, C, D – białka błonowe ER i mitochondrium
DMPK E – białko w cytozolu
ZNF9 – „palce cynkowe” wiążące się do DNA
Prawidłowy poziom białka u pacjentów ?
DYSTROFIA MIOTONICZNA TYPU 1
Diagnostyka molekularna w DM1
badania diagnostyczne
badania przedobjawowe
badania prenatalne
DYSTROFIA MIOTONICZNA TYPU 1
Diagnostyka molekularna
wg Best Practice Guidelines for Molecular Analysis
of Myotonic Dystrophy EMQN
1. PCR
• dwa allele o prawidłowej liczbie CTG - jednoznaczne
wykluczenie DM1
• jeden allel - wynik nieinformatywny
hybrydyzacja, XL PCR
2. Southern blot (hybrydyzacja)
dokładne ustalenie liczby powtórzeń nie jest możliwe
powtórzenia CTG są niestabilne podczas mitoz
DYSTROFIA MIOTONICZNA TYPU 1
PCR z użyciem starterów znakowanych fluorescencyjnie
Diagnostyka dystrofii miotonicznej typu 1 z wykorzystaniem TP-PCR
NP
NP
NP
NP
DYSTROFIA MIOTONICZNA TYPU 2 (Richer syndrome,
PROMM)
• choroba wieloukładowa,
• autosomalny dominujący sposób dziedziczenia
• częstość występowania: głównie Europa
• antycypacja ? brak wyraźnej korelacji pomiędzy zakresem
mutacji a ciężkością objawów
DYSTROFIA MIOTONICZNA TYPU 2
mutacja dynamiczna w intronie 1 genu ZNF9 (3q13.3-q24)
ekspansja powtórzeń CCTG w niekodującym regionie
• 71 - 11.000 CCTG - mutacja
(TG)n(TCTG)n(CCTG)n
• motyw + sekwencje przerywające
• patologia na poziomie RNA
DYSTROFIA MIOTONICZNA TYPU 2
Diagnostyka molekularna
• rodzaje badań
• metody molekularne
• interpretacja wyników
DYSTROFIA MIOTONICZNA TYPU 1 i 2
epidemiologia
wiek zachorowania
antycypacja
forma wrodzona
sposób dziedziczenia
lokalizacja genu
gen
typ mutacji
rodzaj powtórzeń
liczba powtórzeń
rozpowszechniona
0 do wieku dorosłego
+
+
autosomalny dominujący
19q13.3
DMPK
dynamiczna
CTG
100 - 4.000
Europa
8 - 60 l.
nieznaczna
brak
autosomalny dominujący
3q21
ZNF9
dynamiczna
CCTG
średnio 5.000
DM1 DM2
Perspektywy terapeutyczne
STRATEGIE:
• redukcja aktywności białka Msh1 – zapobieganie ekspansji powtórzeń
• zwiększenie stężenia białka Mbnl1
• spowodowanie poprawności alternatywnego splicingu poszczególnych
transkryptów
• usuwanie toksycznych transkryptów zawierających powtórzenia - siRNA
top related