biochemie i aminokyseliny a peptidy
Post on 21-Jan-2016
121 Views
Preview:
DESCRIPTION
TRANSCRIPT
Biochemie I
Aminokyseliny a peptidy
Aminokyseliny a peptidy
(vlastnosti, stanovení a reakce)
( -COOH, -NH2 nebo -NH-)
prostorový vztah aminoskupiny a karboxylové skupiny:
- (=2-), -(=3-)..... -(= poslední)
-alanin: +H3N-CH2-CH2-COO-
-aminobutyrát (GABA): +H3N-CH2-CH2-CH2-COO-
AMINOKYSELINY
Když se řekne AK
-aminokyseliny: konfigurace (podle Fischera)
COO- COO-
D: H CNH3
+ L: NH3+ CH
R R
Kódované aminokyseliny (20): -aminokyseliny (kromě prolinu – NH2 skupina zabudována do cyklu)). Alfa = aminoskupina na uhlíku, který
nese karboxylovou skupinu.
AMINOKYSELINY
L--aminokyseliny:
kódované (= proteinogenní, viz dále)
nekódované:
- odvozené od kódovaných aminokyselin
-Tyrkatecholaminy (dopamin, adrenalin, tyroxin...)
-vzniklé modifikacemi bílkovin (posttranslační modifikace)
- metabolické meziprodukty (ornithin, citrulin)
AMINOKYSELINY
Kódované aminokyseliny:
Polarita: N (nepolární), P (neutrální polární), K (kyselá) a Z (zásaditá). Esenciální: pro člověka
OO-
C
C
H H
NH3
+
OO-
C
C
H CH3
NH3
+
OO-
C
C
H CH
NH3
+ CH3
CH3
OO-
CHCH3
CH3C
C
H
NH3
+
CH2
Název / zkratka Vzorec Polarita Esenciální
GlycinGly
N
N
AlaninAla
N
N
ValinVal
N
E
LeucinLeu
N
E
Polarita: N (nepolární), P (neutrální polární), K (kyselá) a Z (zásaditá). Esenciální: pro člověka
Kódované aminokyseliny:
OO-
C
C
H CH
NH3
+ CH3
CH2 CH3
OO-
C
C
H CH2
NH2
+ CH2
CH2
OO-
C
C
H CH2
NH3
+
OO-
OHC
C
H CH2
NH3
+
OO-
C
C
H CH2
NH3
+
NH
IsoleucinIle
N
E
ProlinPro
N
N
FenylalaninPhe
N
E
TyrosinTyr
P
N
TryptofanTrp
N
E
Název / zkratka Vzorec Polarita Esenciální
Polarita: N (nepolární), P (neutrální polární), K (kyselá) a Z (zásaditá). Esenciální: pro člověka
Kódované aminokyseliny:
OO-
C
C
NH3
+
H CH2 NH+
CHNH
C
CH
OO-
OHC
C
H CH2
NH3
+
OO-
C
C
H CH
NH3
+ OH
CH3
OO-
SHC
C
H CH2
NH3
+
OO-
C
C
H CH2
NH3
+
S CH3CH2
HistidinHis
Z
N
SerinSer
P
N
ThreoninThr
P
E
CysteinCys
P
N
MethioninMet
N
E
Název / zkratka Vzorec Polarita Esenciální
Polarita: N (nepolární), P (neutrální polární), K (kyselá) a Z (zásaditá). Esenciální: pro člověka
Kódované aminokyseliny:
Název / zkratka Vzorec Polarita Esenciální
OO-
C
C
H CH2
NH3
+
CH2 CH2 CH2 NH3
+
OO-
C
C
NH3
+
H CH2 CH2 CH2NH C
NH2
NH2
+
OO-
OO-C
C
H CH2
NH3
+
C
OO-
OO-C
C
H CH2
NH3
+
CH2 C
OO-
ONH2C
C
H CH2
NH3
+
C
OO-
ONH2C
C
H CH2
NH3
+
CH2 C
LysinLys
Z
E
ArgininArg
Z
N
Asparagová kyselinaAsp
K
N
Glutamová kyselinaGlu
K
N
AsparaginAsn
P
N
GlutaminGln
P
N
Naučit se AK včetně označeníhmotnosti v Tab jsou uváděny o 18 nižší, tedy takové jaké jsou v bílkovinném řetězci
Rozdělení podle chemické povahy postranních řetězců
Funkční skupiny:
Alifatické Aromatické Hydroxylové Sulfhydrylové Kyselé Basické Polární Nepolární
Hydrofobní aminokyseliny
Polární aminokyseliny
Kyselé aminokyseliny
Bazické aminokyseliny
Větvené aminokyseliny
• leucin, valin, izoleucin• energetické substráty• nezbytné v těžkých stavech (sepse, polytraumata)• součástí specializovaných roztoků aminokyselin
Kódované aminokyseliny:
Jednopísmenkové zkratky
Proč jsou v tabulce vzorce s náboji? obojetné ionty = amfionty
celkový náboj amfiontu: součet všech nábojů (pro Gly v pH 7 = 2)
volný náboj amfiontu: algebraický součet nábojů (pro Gly v pH 7 = 0)
OO-
C
C
H H
NH3
+
kyselina: HA H+ + A-
např. CH3-COOH H+ + CH3-COO-
termodynamická disociační konstanta
zdánlivá
Ka a
aa
H A
HA
.
KH A
HAA
+ -
přičemž K Ka A
H A
HA
.
Úvod do teorie elektrolytické disociace:
báze: B + H2O BH+ + OH-
např: CH3-NH2 + H2O CH3-NH3+ + OH-
bazická zdánlivá disociační konstanta:
ale: Kw = [H+] . [OH-] a tedy:
po spojení:
[H2O] zahrnu do konstanty a vypočtu 1/KB:
KBH OH
B H OB
+ -
.[ ]2
[ ][ ]
OHK
H
w
KBH K
B H H OB
w
+
.[ ].[ ]2
1K
B H
BH KB w
][
.[ ]
+
Kyselá disociační konstanta KA ionisované formy báze B (např. CH3-NH3+)
je tedy rovna:
KK
KA
W
B
Úvod do teorie elektrolytické disociace:
-COOH ,-COOH imidazolium -SH -NH3+ fenol -NH3
+ guanidinium
2,5 4,0 6,0 8,3 9,5 10,1 10,5 12,5
KYSELÉ DISOCIAČNÍ KONSTANTY pKA SKUPIN
VYSKYTUJÍCÍCH SE V BÍLKOVINÁCH
-karboxylová C-koncová 1,7 - 2,6 1,8 - 3,6
imidazolová His 6,0 5,6 - 7,0
-aminová Lys 10,53 9,4 - 11,0
sulfhydrylová Cys 8,33 8,3 - 8,6
Funkční skupina
Aminokyselina
Hodnoty pKA nalezené
ve volných aminokyselinách
Hodnoty pKA
nalezené v bílkovinách
,-karboxylová
Asp, Glu 3,86; 4,25 3,0 - 4,7
-aminová N-koncová 8,8 - 10,7 7,9 - 10,6
fenolová Tyr 10,07 9,8 - 10,8
guanidylová Arg 12,48 11,6 - 12,6
Hodnoty pKA disociovatelných skupin v aminokyselinách a bílkovinách (25 oC)
Mám roztok slabé kyseliny. Jak se bude měnit pH, když budu přidávat NaOH?
Na začátku: jen HA, množství A- odpovídá množství přidaného louhu.
převedeme na pH: (Hendersonova - Hasselbalchova rovnice)
KH A
HAA
+ -
H KHA
AA
+
-
pH pKA
HAA
log
TITRAČNÍ KŘIVKY SLABÝCH KYSELIN
TITRAČNÍ KŘIVKY SLABÝCH KYSELIN
Titrační křivka glycinu
OO-
OO-C
C
H CH2
NH3
+
CH2 C
OO-
C
C
H CH2
NH3
+
CH2 CH2 CH2 NH3
+
OO-
C
C
NH3
+
H CH2 NH+
CHNH
C
CH
Cystin = cystinylcystein
Titrační křivka cystindihydrochloridu
DEFINICE: pH, při němž se amfiont nepohybuje ve stejnosměrném
elektrickém poli (interakce s dalšími ionty, závisí na prostředí - pufr);
označujeme pI
Isoionický bod: pH, při němž je v destilované vodě volný náboj iontu nulový.
ISOELEKTRICKÝ BOD
př.: Gly (titruji Gly.HCl) KA1 KA2
Z = +1 (Gly1+) 0 (Gly) -1 (Gly-1)
Ale v pH = pI platí: [Gly1+] = [Gly-1]
takže:
OOH
C
C
H H
NH3
+
OO-
C
C
H H
NH3
+
OO-
C
C
H H
NH2
pH pKGlyA
1log
[ ]Gly
pH pKGly
A
2log
[ ]
Gly
21 2
pH pK pKGly
A A
log
[ ]
Gly
pI pK pKA A
( ) /1 2
2
ISOELEKTRICKÝ BOD
Více disociovatelných skupin: rozhodují ty, které "sousedí" s pI (nutno načrtnout titrační křivku)
Pro polyionty (např. bílkoviny) tuto rovnici nelze použít (příliš mnoho pKA v
okolí pI)
Isoelektrické body kódovaných aminokyselin
AK pI AK pI AK pI AK pI
Gly 6,0 Ser 5,7 Phe 5,5 His 7,6
Ala 6,0 Thr 5,6 Tyr 5,7 Lys 9,6
Val 6,0 Cys 5,0 Trp 5,9 Arg 10,8
Leu 6,0 Met 5,7 Asn 5,4 Asp 3,0
Ile 6,0 Pro 6,4 Gln 5,6 Glu 3,2
Absorpce UV záření: aromatické (především Tyr a Trp) u 280 nm Absorpční spektra 1: hovězího sérového albuminu (1 mg/ml), 2: lidského imunoglobulinu (1
mg/ml) a 3: DNA (0,1 mg/ml), optická délka kyvety 1 cm.
Optická aktivita: konfigurace (nesouvisí přímo se smyslem rotace)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
210 230 250 270 290 310 330
vlnová délka [nm]
abso
rbance
1
23
OPTICKÉ VLASTNOSTI
Chemické reakce AK
Stanovení AK (reakce
aminoskupin): ninhydrin,
Sangerovo činidlo, dansylchlorid
Reakce postranních řetězců: modifikační reakce - různá specifita
např.
značení bílkovin radioaktivním jodem
blokování SH skupin (proti oxidaci a vzniku disulfidových můstků)
O
+ I2OHC
C
H CH2
NH
R2
R1
O
OHC
C
H CH2
NH
R2
R1I
O
+ ICH2-CONH2C
C
H CH2
NH
R2
R1
SH
O
C
C
H CH2
NH
R2
R1
SCH2-CONH2 + HI
Chemické reakce AK
Nejdůležitější reakce (hypothetická): vznik peptidové vazby
CH CNH3
+
R1
OO- CH CNH3
+
R2
OO- OO-+ CHNH3
+C
R1 O
NH CH
R2
C
Chemické reakce AK
Chemické reakce AK
Chemické reakce AK
N- konec (začátek), C-konec (konec) acylaminokyseliny, např. Gly.Ala.His = glycylalanylhistidin
Pozor: Ala.Tyr Tyr.Ala
OO- OO-CH
CH3
C
O
NH CH C
CH2
NH3
+CH
CH2
C
O
NH CH C
CH3
NH3
+
OH OH
Nomenklatura peptidů
PŘIROZENÉ PEPTIDY
Zvláštnosti struktury:
nekódované aminokyseliny (ornithin, -alanin ...)
často i D-aminokyseliny
někdy i tzv. -peptidové vazby (Glu)
cyklické struktury (laktamy, disulfidové vazby)
větvené struktury
blokování konců (pyroglutamát, glycinamid)
• meziprodukty odbourávání bílkovinných prekursorů
• synthesa pomocí speciálních enzymových reakcí
(ne na ribosomech cestou protheosynthesy)
Biosynthesa
di a tripeptidy (glutathation, umělý aspartám...)
peptidové hormony (oxytocin, vasopresin....přechod k proteohormonům)
neuromodulátory: enkefaliny (pentapeptidy), endorfiny (15 - 32 AK)
peptidová antibiotika (mnoho nekódovaných AK)
peptidové zoo- a fytotoxiny (hadi, štíři, apamin, falloidiny a amanitiny: Amanita
phalloides)
protaminy (malé bazické lineární peptidy, mlíčí ryb)
polyaminokyseliny (buněčné stěny bakterií: poly--L-Glu, poly--D-Glu)
Skupiny přirozených peptidů
Skupiny přirozených
peptidů
URČOVÁNÍ CELKOVÉHO AMINOKYSELINOVÉHO SLOŽENÍ
AK1-AK2-AK3 ....AKn kyselá nebo bazická hydrolysa AK1 + AK2 + AK3 +....+ AKn
(určit kvalitativní i kvantitativní jednotlivé aminokyseliny -
chromatografické dělení)
URČOVÁNÍ SEKVENCE AMINOKYSELIN V ŘETĚZCI
Edmanovo odbourávání
Sangerova reakce
URČOVÁNÍ N-KONCOVÉ
AMINOKYSELINY
URČOVÁNÍ N-KONCOVÉ
AMINOKYSELINY
Edmanovo odbourávání
a) aktivace (aktivní estery, anhydridy, azidy,
karbodiimidová synthesa)
b) blokování skupin, které nemají reagovat
c) synthesa peptidové vazby
d) odblokování
O-X OO- OO-+CH CNH
R1
" CH CNH3
+
R2
" CHNH3
+C
R1
"
O
NH CH
R2
" C
Q
R10 R10 R10 R10 + HX
SYNTHESA PEPTIDŮ in vitro
Chromatografické metody pro separaci proteinů
• Gelová chromatografie
• Ionexová chromatografie
• Chromatografie s hydrofóbní interakcí
• Afinitní chromatografie
Ionexová chromatografie
• Určena pro separaci látek nesoucích kladný nebo záporný náboj
• Afinita iontů k ionexu závisí na velikosti náboje
• V případě proteinů hraje zásadní roli pH !
• Celulosové a dextranové ionexy
Ionexy
• Katexy – záporný náboj vazba kationtů
silné – sulfo (S), sulfopropyl(SP) OSO3-
slabé – karboxy (C), karboxymethyl (CM) COO-
• Anexy – kladný náboj vazba aniontůslabé – diethylaminoethyl (DEAE)silné – triethylaminoethyl (TEAE)
Ionexová chromatografie proteinů
• Náboj bílkoviny závisí na pH prostředí a isoelektrickém bodu bílkoviny
• pH < pI bílkovina nese kladný náboj separace na katexu
• pH > pI bílkovina nese záporný náboj separace na anexu
• pH = pI celkový náboj bílkoviny je nulový nelze provést ionexovou chromatografii
Ionexová chromatografie
• Nanášení vzorku – nízká iontová síla
• Eluce – gradientová• Zvyšováním iontové síly • Změnou pH
Použití – purifikace a zakoncentrování proteinu, výměna pufru
Typická ionexová chromatografie
Loading starts
Loading ends,Low salt wash begins
Protein absorbance
Peak of unbound protein
Salt gradient
0
1M
Salt gradient begins
Salt gradient ends
Eluted peaks of weakly bound (I), moderately bound (II)
and tightly bound (III) proteins
IIIII
I
Roztok obsahující kyselinu asparagovou (pI = 2,98), glycin (pI = 5,97), threonin (pI = 6,53) a lysin (pI = 9,74) v citrátovém pufru pH 3,0 byl nanesen na sloupec Dowex-50 (katex). V jakém pořadí tyto aminokyseliny ze sloupce vytekly?
Příklad 1
OO-
C
C
H H
NH3
+
OO-
OO-C
C
H CH2
NH3
+
C
OO-
C
C
H CH
NH3
+ OH
CH3OO-
C
C
H CH2
NH3
+
CH2 CH2 CH2 NH3
+
Na sloupec DEAE-celulosy (anex) byl nanesen vzorek
obsahující sérový albumin, ureasu a chymotrypsinogen
(isoelektrické body pI jsou 4,9; 5,4 a 9,5) v pufru pH 7,0.
V jakém pořadí tyto aminokyseliny ze sloupce vytekly?
Příklad 2
top related