chromatographie sur phase inverse - université de...
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Chromatographie sur phase inverse
267CHM 3102
Principe de séparation
Phase stationnaire greffée avec ligand C4, C8 ou C18
Peptide injecté dans la phase mobile et entrainevers la colonne
Peptide adsorbé sur la phase stationnaire
Peptide désorbé de la phase stationnaire avec le gradient d’acetonitrile
• Le peptide est d’abord adsorbé sur la phase stationnaire en présence d’une phase mobile aqueuse.
• La désoption du peptide est effectuée en augmentant le % solvant organique(e.g. acetonitrile) en utilisant un gradiant d’élution.
• La colonne est par la suite ré-équilibrée avec le solvant aqueux.
• Phénomène d’adsorption ou la séparation survient par un mécanisme de partition entrela phase mobile et la phase stationnaire.
• La distribution du peptide entre les deux phases depend des affinités hydrophobiqueset de la composition de la phase mobile
Chromatographie sur phase inverse
268CHM 3102
Facteurs affectant la chromatographie surphase inverse
Phase stationnaireType de ligandComposition de la phase mobile Diametre des poresTaille des particulesDimension de la colonneTempératureAdditifs
Chromatographie sur phase inverse
269CHM 3102
ColonneAcier inoxydable (pression)Diamètre des particules : 3 à 10 µmTaille des pores : 70 à 300 ÅAire : 50 à 250 m2/g
Chromatographie sur phase inverse
270CHM 3102
Phase stationnaire
[W.R.Melander, C.Horvath, Reversed-Phase Chromatography, in HPLC Advances and Perspectives, V2, Academic Press, 1980]
[K.K.Unger, Porous silica, Elsevier, 1979]
Chromatographie sur phase inverse
271CHM 3102
Phase stationnaire
Comprend des groupessilanol libres pouvantdonner lieu a d’autrestypes d’interactions
Chromatographie sur phase inverse
272CHM 3102
Phase stationnaire
Solubilité de la silice en fonction du pH
Limitations de la silicepH
<2 (hydrolyse Si-O-Si-R)>8 (dissolution)
Tamponphosphate (inorganique) vsTris (organique)Molarité
Température
Supports polymériques (PS-DVB) également utilisé
Chromatographie sur phase inverse
274CHM 3102
Type de ligand et diamètres des pores
300 Å50-100 Å
Transfert de masserestreint
Transfert de masseplus efficace
Diamètres des pores
Phase greffée
Silanol libre résiduel
Ether; source de silanol
n: 17, C187, C83, C4
Greffon
Groupe terminal (Capping group)
Chromatographie sur phase inverse
275CHM 3102
Composition de la phase mobile (solvants)Acetonitrile (ACN)• Volatile • Faible viscosité• Peu d’absorption UV adsorption à basse longueur d’onde• Couramment utilisé pour la séparation des peptides
Isopropanol• Utilisé pour les protéines de masse élevée ou tres hydrophobe• Viscosité élevée• Peut etre dilué avec ACN 1:1• 1-3% IPA dans ACN peut améliorer le rendement dans certain cas (Synthetic
Peptide Purification by Application of Linear Solvent Strength Gradient Theory, J.C. Ford and J.A. Smith, J. Chrom. 483, 131–143 (1989))
Ethanol• Utilisé pour purification a grande échelle• Bon solvant pour la chromato. phase inverse• Utilisé pour l’élution de protéines hydrophobes
Methanol et autres solvantsOffre tres peu davantage comparativement aux solvants plus couramment utilisés
Chromatographie sur phase inverse
277CHM 3102
Viscosité des mélanges de solvants
La viscosité des mélanges eau-alcoolaugmente de façonsignificative jusqu’àune proportion 1:1.double
50%
Chromatographie sur phase inverse
278CHM 3102
Composition de la phase mobileGradient d’élution
Elution trop rapide
Elution trop lente
Elution trop rapide
Elution trop lente
Chromatographie sur phase inverse
279CHM 3102
Gradient d’élution et solvant organique
N. C. Robinson, M.D. Dale, L.H. Talbert, “Subunit Analysis of Bovine Cytochrome c Oxidase by Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography”, Arch. of Biochem. and Biophys. 281(2), 239–244 (1990)
Colonne: Vydac 218TP104Echantillon: Sous-unités cytochrome C oxidaseGradient: 25-50% acetonitrile (0.1%TFA)Détection: A214nm
Une meilleure résolution peutêtre obtenue avec un gradient plus lent
Il est recommandé d’avoir unecomposition initiale de 3-5% ACN pour réduire le temps de re-équilibration et la difficultéa rehydrater la phase stationnaire. On peut utiliserune pente d’élution de 0.5-1.0%/min
Chromatographie sur phase inverse
280CHM 3102
Composition de la phase mobileL’ionisation de differents acidesaminés peut influencer l’adsorption et l’ordre d’élution
1 Bradykinin2 Oxytocin3 Angiotensine II4 Neurotensine5 Angiotensine III
Effect du pH
Chromatographie sur phase inverse
281CHM 3102
Composition de la phase mobileFormation de paire d’ions
Acide trifluoroacetique (TFA)
• Courramment utilisé pour les séparations de peptides
• Volatil• Peu d’absorption UV a basse
longueur d’onde• Concentration typique: 0.1% dans
eau et ACN• Peu etre utilise pour solubiliser
protéines hydrophobiques
0.1% TFA
0.3% TFA
Digest trypsiqued’apotransferrin surcolonne Vydac218TP54
0.1% TFA
20 mM phosphate pH:2
5 mM HCl pH:2
Separation de peptides surcolonne Vydac218TP54
1. oxytocin2. bradykinin3. angiotensin II 4. neurotensin5. angiotensin I
Autres
Acide heptafluorobutyrique (HFBA)Triethylamine phosphate (TEAP)Acide formique – LC/MS
Variation de sélectivité
Chromatographie sur phase inverse
282CHM 3102
Taille des particules
Avantage: N ↑
Inconvénient : P ↑
3500
pdLN ≈
L : longueur de la colonne (cm)dp : diamètre des particules (µm)
Chromatographie sur phase inverse
283CHM 3102
Taille des particules
Perte de charge (∆P) : pression qu’il faut appliquer pour faire passer la phase mobile dans la colonne chromatographique
15022cpddFLP η
≈∆L : longueur de la colonne (cm)dp : diamètre des particules (µm)dc : diamètre de la colonne (cm)F : débit (mL/min)η: viscosité (cP)∆P : perte de charge (atm)
Horvath, C., in Chromatography, partie A, Heftmann (Ed.), Chap. 3, 1983
Chromatographie sur phase inverse
284CHM 3102
Taille des particules
Separation de peptide standards surune colonne Vydac 214TP avec particules de differentes dimensions Gradient: 24–95 % ACN (0.1% TFA) en 30 min debit: 1.5 mL/min.
5 µm
10 µm
15-20 µm
The Handbook of Analysis and Purification of Peptides and Proteins by Reversed-Phase HPLC Grace Vydac, 3rd Edition, 2002
Largeur de pic selon la variation de la taille des particules et de la quantité chargéeConditions: VYDAC® 214TP, 5 µm, 10 µm, 15–20 µm, 20–30 µm Gradient: 24–95 % ACN (0.1% TFA) en 30 min debit: 1.5 mL/min; echantillon: ribonuclease.
Les difference de performance analytique entre les tailles de particulesdeviennent moins grande avec la quantite chargee.
Chromatographie sur phase inverse
285CHM 3102
Dimension de la colonne et considérationspratiquesDébit actuel peut varier d’un facteur 2 plus haut ou plus bas dependant de la méthode
Capacité de charge optimalecorrespond a la quantité de peptide pouvant être chargé sur la colonne sans compromettre la résolution
Quantité maximale de charge correspond à la quantité maximaled’échantillon pouvant être purifiésur la colonne avec un rendementet une pureté raisonable
The Handbook of Analysis and Purification of Peptides and Proteins by Reversed-Phase HPLC Grace Vydac, 3rd Edition, 2002
Pression pour une colonne de 25 cm (1:1 eau:ACN) est typiquement de 1000-1800 PSI
Chromatographie sur phase inverse
286CHM 3102
Température
La température de la colonne peutaffecter la viscosité du solvant, la pression (perte de charge), le temps de rétention et la sélectivité. Unetempérature < 60°C estrecommandée afin de limiter la dégradation de la phase stationnaireet l’élévation accrue de la pression(<5000 PSI).
Separation de digest trypsique de l’hormone de croissance humaineConditions: C18, 4.6 x 150 mm. Debit: 1 mL/min. Gradient de 0–60% ACN (0.1% TFA) en 60 min. Hancock et al.
Temperature as a variable in reversed-phase high-performance liquid chromatographic separations of peptide and protein samples. I. Optimizing the separation of a growth hormone tryptic digest, W.S. Hancock, R.C. Chloupek, J.J. Kirkland and L.R. Snyder, J. Chrom. 686, 31–43 (1994)
Chromatographie sur phase inverse
287CHM 3102
Exemple de séparation
Identification de variant génétique lors de l’apparitionde globule rouge anémiquede type faucille
Conditions: VYDAC® 218TP51 (C18, 5 µm 1.0 x 250 mm) Gradient: 0–40% ACN en 50 min (0.1% TFA) debit 50 µL/min.
Automated Analytical System fo the Examination of Protein Primary Structure,Y.L.F. Hsieh, et.al., Anal. Chem. 68, 455–462 (1996)
Le phénotype est caracterisé par une substitution de l’acideglutamique par une valine en position 6 de l’hémoglobine A. Cechangement se distingue par l’apparition d’un peptide plus hydrophobe
Chromatographie sur phase inverse
288CHM 3102
Exemple de séparationLa déamidation des peptides est un phénomene courant et possiblementnaturel. La déamidation non-enzymatique de l’asparagine (et a un moindre degré la glutamine) peut se produire naturellement par l’isomérisation et la racémisation de l’aspartate et l’asparagine en condition de pH neutre ou basique. Certaineséquence comprenant les acides aminésGN et SN sont plus susceptibles à la déamidation et peuvent accélérer ceprocessus.
Wright, H. T. CRC Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1991, 26, 1-52.Bischoff, R.; Kolbe, H. V. J. J. Chromatogr., A 1994, 662, 261-278.
Séparation de peptides trypsiques de la somatotropin de boeuf(BST) montrant la déamidation de Asn99. Conditions: VYDAC®218TP54 (C18, 5 µm, 4.6 x 250 mm) gradient: 0–15% ACN en 20 min, 15–21% ACN (0.1%TFA) en 12 min, 21–48% ACN en 27 min, 48-75% ACN en 4 min debit: 2.0 mL/min.
Purification and Characterization of Recombinant BovineSomatotropin Containing an Isoaspartyl Residue, M.R. Schlittler,P.C. Toren, N.R. Siegel and B.N. Violand, Ninth ISPPP, 1989, Abstract 621
289CHM 3102
Détecteurs
Détecteurs (3 classes) :
Universel : Basé sur une propriété fondamentale des moléculesEx. : réfractométrie
Sélectif : Basé sur une propriété particulière d’une famille de composés, par exemple la présence d’un élément ou d’un group. fonctionnelEx. : UV, fluorescence, électrochimie
Spécifique : Basé sur une propriété unique à un composéEx. : spectrométrie de masse (MS)
290CHM 3102
Détecteurs
RéfractométrieMesure continue de la différence d’indice de réfraction entre la phase mobile et l’effluent de la colonne
Réfractomètre à
déviation
291CHM 3102
Détecteurs
AvantagesUniverselFacteur de réponse semblable pour des produits de même classe
Réfractométrie
InconvénientsManque de sensibilité(général)
dépend de ∆nD entre soluté et éluant
Affecté par T, qui doit être contrôlée à 0.001, et par le débit de la phase mobileGradient d’élution possible seulement si les deux solvants ont des indices de réfraction semblables
294CHM 3102
Détecteurs
Détecteur UV :
InconvénientsSubstances : chromophoreFacteur de réponse : différent pour chaque composéDAD : emploi plus difficileLimité par le « cut-off »de la phase mobile
Avantages Sélectif : choix de la longueur d’ondeDAD : mesurer àplusieurs λ (puretéd’un pic)Peu sensible à T et débitFacile à utiliser et àentretenirPeut être utilisé en mode gradientNon destructif
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