der alterungsprozess roter blutzellen und die auftrennung der zellen nach alter seminar 1 benjamin...

1

Der Alterungsprozess roter Blutzellen und die Auftrennung der Zellen nach Alter

Seminar 1Benjamin Hanf

09.05.2012

2

- Regulationsmechanismen - O2 Transport; sehr flexibel erhöhte Abnutzung

Funktion:

Unterschiedliche Formen der RBCs Modifiziert nach Williams, 2008

3

Motivierung:

- Mögliche Beteiligung von roten Blutkörperchen (RBCs) an Thrombusbildung

- Ideales Modell für Alterungsprozesse (da keine DNA/RNA mehr)

Der Alterungsprozess roter Blutzellen und die Auftrennung der Zellen nach Alter

4

Thrombusbildung:

Thrombozyten heften sich an Kollagen-Fasern erster Verschluss

Thrombusbildung Modifiziert nach HI (High Impact)

5

Thrombusbildung:

Gerinnungskaskade: Prothrombin aktive Form Thrombin Thrombin katalysiert Umwandlung Fibrinogen Fibrin

Thrombusbildung Modifiziert nach HI (High Impact)

6

Thrombusbildung:

Fibrin: Gewebe aus maschenartigen Fäden, die RBCs einfangen

Thrombusbildung Modifiziert nach HI (High Impact)

7

Thrombusbildung:

Passive Beteiligung der RBCs?

Thrombusbildung Modifiziert nach HI (High Impact)

8

Motivierung:

- Mögliche Beteiligung von RBCs an Thrombusbildung- Erhöhter Hämatokrit

Endogenous Thrombin Potential Modifiziert nach McDonald et al., 2006

9

Motivierung:

- Mögliche Beteiligung von RBCs an Thrombenbildung- Erhöhter Hämatokrit- Durch Phosphatidylserin (PS) Fähigkeit zur Aggregation

PS-Exposition und Aggregation von RBCs Modifiziert nach Steffen et al., 2011

10

Motivierung:

- Mögliche Beteiligung von RBCs an Thrombenbildung- Erhöhter Hämatokrit- Durch Phosphatidylserin (PS) Fähigkeit zur Aggregation

PS-Exposition und Aggregation von RBCs Modifiziert nach Wagner et al., 2011

11

Kationen-Kanal

(2-wertige Kationen; Ca2+)

PGE2, LPA Ca2+

Gardos-Kanal

H 2O, K

+ , Cl-

H2O, K+, Cl-

Scra

mbl

ase

induziert

PKC

Ca2+

PS PS

Signalkaskade von RBCs Modifiziert nach Kaestner et al., 2004

12

Gardos-Kanal

Scramblase

A23187

Schrumpfen

PS-Exposition

Aggregation

Einfluss Gardos-Kanal / Scramblase auf Aggregation Modifiziert nach Kaestner et al., 2004

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Motivierung:

- Mögliche Beteiligung von roten Blutkörperchen (RBCs) an Thrombenbildung

- Ideales Modell für Alterungsprozesse (da keine DNA/RNA mehr)

Lebenszyklus RBCs Modifiziert nach Silbernagel und Despoupolos et al., 2004

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Retikulozyt(RNA / DNA Reste)

(Hämoglobin)

Phagozytose

Max. 120 Tage

Lebenszyklus RBCs Modifiziert nach Silbernagel und Despoupolos et al., 2004

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-Dichtegradientenseparation (in vitro)

- Percoll (s.u.)- Stractan (stark verzweigtes Arabinogalaktan aus Lärchenholz)- Dextran (Polymere aus Glucose) - Serum Albumin (Protein, im Blut vorkommender Reservestoff)

-Isotopenmarkierung (in vivo)

- 14C, 51Cr…

Auftrennung nach Alter (Methoden):

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Ein Gemisch verschieden alter Zellen (bis zu 120 Tage max. Lebensdauer, Durchschnittsalter: ca. 40 Tage), die unterschiedlich Verhaltensweisen zeigen.

Separation nach Dichte Modifiziert nach Piomelli et al., 2007

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Schema / Dichtegradientenseparation

Percoll

- Beschichtete Silica-Partikel- Wasserlöslich- biologisch inert

Fraktion 1

Fraktion 2Fraktion 3

Fraktion 4

Fraktion 5

Dichtegradientenseparation von RBCs Modifiziert nach Wagner, 2009

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Isotopenmarkierung

Hypertransfusion Schema Modifiziert nach Mueller et al., 1987

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Überleben der Zellen wurde mit Isotopen-markiertem 51Cr getestet.

Künstlich gealterte Zellen: 1 Tag (7%)Normale Zellen: 15 Tage (100%)

Überlebensrate der RBCs Modifiziert nach Mueller et al., 1987

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Effekte

Bekannt: - Redox-System - Protein 4.1 a/b- Größe

Neu: - PMA- LPA

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Aktivität des Plasmamembran-Redoxsystems bei Erythrozytenunterschiedlichen Alters:

Effekte

RedOx-System

Ferrocyanid-Assay

Gehalt an Ferrocyanid der aufgetrennten Zellen nach Alter Wagner, 2009

22

Von Anfangs (C) ca. 70:30(b:a) zu ca. 50:50 (b:a) bei alten (H) Zellen.

Effekte

Protein 4.1 a/b

Unterschied nach Alter Bande 4.1a und 4.1b Modifiziert nach Mueller et al., 1987

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Effekte

Größe

Häufigkeit in Größe der Zellen nach Alter Wagner, 2009

24

Effekte

Bekannt: - Redox-System - Protein 4.1 a/b- Größe

Neu: - PMA- LPA

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Kationen-Kanal

(2-wertige Kationen; Ca2+)

PGE2, LPA Ca2+

Gardos-Kanal

H 2O, K

+ , Cl-

H2O, K+, Cl-

Scra

mbl

ase

induziert

PKC

Ca2+

A23187

Ca2+

PS PSPMA

aktiviert

Signalkaskade von RBCs Modifiziert nach Kaestner et al., 2004

0 200 400 600 800 1000FSC-H

F4PMA_tube5.014

0 200 400 600 800 1000FSC-H

F4PMA_tube5.014

Histogram Statistics

Marker Left, Right Events % Gated % Total Mean Geo Mean CV Median Peak Ch

All 1, 9910 30000 100.00 100.00 366.69 257.88 89.38 276.32 577

M1 1, 143 9181 30.60 30.60 97.65 90.28 31.30 101.82 124

M2 143, 9910 20938 69.79 69.79 483.39 407.22 68.12 441.09 577

M3 1, 255 14550 48.50 48.50 130.39 117.40 40.39 125.21 124

M4 255, 9910 15498 51.66 51.66 588.19 539.82 54.79 532.80 577

File: F4PMA_tube5.014 Log Data Units: Linear Values

Sample ID: Patient ID:

Tube: Untitled Panel: Untitled Acquisition Tube List

Acquisition Date: 01-Feb-12 Gate: No Gate

Gated Events: 30000 Total Events: 30000

X Parameter: FL1-H (Log)

Region Statistics

File: F4PMA_tube5.014 Log Data Units: Linear Values

Sample ID: Patient ID:

Tube: Untitled Panel: Untitled Acquisition Tube List

Acquisition Date: 01-Feb-12 Gate: No Gate

Gated Events: 30000 Total Events: 30000

X Parameter: FSC-H (Linear) Y Parameter: FL1-H (Log)

Region Events % Gated % Total X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean Px,Py

R1 29993 99.98 99.98 399.94 382.75 364.46 257.66 1, 3

100 101 102 103 104

FL1-H

F4PMA_tube5.014

0 200 400 600 800 1000FSC-H

F4PMA_tube1.001

0 200 400 600 800 1000FSC-H

F4PMA_tube1.001

Histogram Statistics

Marker Left, Right Events % Gated % Total Mean Geo Mean CV Median Peak Ch

All 1, 9910 30000 100.00 100.00 19.31 16.40 651.77 16.40 17

M1 1, 143 29956 99.85 99.85 17.27 16.32 35.89 16.40 17

M2 143, 9910 44 0.15 0.15 1407.59 428.12 213.73 249.16 9910

M3 1, 316 29985 99.95 99.95 17.47 16.36 51.53 16.40 17

M4 316, 9910 15 0.05 0.05 3697.01 1556.64 118.75 913.98 9910

File: F4PMA_tube1.001 Log Data Units: Linear Values

Sample ID: Patient ID:

Tube: Untitled Panel: Untitled Acquisition Tube List

Acquisition Date: 01-Feb-12 Gate: No Gate

Gated Events: 30000 Total Events: 30000

X Parameter: FL1-H (Log)

Region Statistics

File: F4PMA_tube1.001 Log Data Units: Linear Values

Sample ID: Patient ID:

Tube: Untitled Panel: Untitled Acquisition Tube List

Acquisition Date: 01-Feb-12 Gate: No Gate

Gated Events: 30000 Total Events: 30000

X Parameter: FSC-H (Linear) Y Parameter: FL1-H (Log)

Region Events % Gated % Total X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean Px,Py

R1 29996 99.99 99.99 405.63 373.13 17.99 16.38 1, 3

100 101 102 103 104

FL1-H

F4PMA_tube1.001

0 200 400 600 800 1000FSC-H

F4PMA_tube2.004

0 200 400 600 800 1000FSC-H

F4PMA_tube2.004

Histogram Statistics

Marker Left, Right Events % Gated % Total Mean Geo Mean CV Median Peak Ch

All 1, 9910 30000 100.00 100.00 296.07 256.80 56.65 294.27 291

M1 1, 143 2879 9.60 9.60 59.88 49.01 60.98 49.58 46

M2 143, 9910 27140 90.47 90.47 321.02 306.00 48.69 305.05 291

M3 1, 119 2586 8.62 8.62 51.69 43.80 55.35 44.51 46

M4 119, 9910 27427 91.42 91.42 319.03 303.29 49.11 302.32 291

File: F4PMA_tube2.004 Log Data Units: Linear Values

Sample ID: Patient ID:

Tube: Untitled Panel: Untitled Acquisition Tube List

Acquisition Date: 01-Feb-12 Gate: No Gate

Gated Events: 30000 Total Events: 30000

X Parameter: FL1-H (Log)

Region Statistics

File: F4PMA_tube2.004 Log Data Units: Linear Values

Sample ID: Patient ID:

Tube: Untitled Panel: Untitled Acquisition Tube List

Acquisition Date: 01-Feb-12 Gate: No Gate

Gated Events: 30000 Total Events: 30000

X Parameter: FSC-H (Linear) Y Parameter: FL1-H (Log)

Region Events % Gated % Total X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean Px,Py

R1 29997 99.99 99.99 424.46 402.88 295.11 256.71 1, 3

100 101 102 103 104

FL1-H

F4PMA_tube2.004

Standard nach 30 Minuten bei 33 a.u. -63 a.u. ggü. ~1500 a.u. bei angeregten Zellen

0‘

5‘

30‘

27

Effekte

PS-Exposition Kontrolle stark

Kontrolle: Nach alter getrennte Zellen mit starker PS-Exposition Wagner, 2009

28

Effekte

PS-Exposition Kontrolle schwach

Kontrolle: Nach alter getrennte Zellen mit schwacherPS-Exposition Wagner, 2009

29

Effekte

PS-Exposition PMA stark

PMA: Nach alter getrennte Zellen mit starker PS-Exposition Wagner, 2009

30

Effekte

PS-Exposition PMA schwach

PMA: Nach alter getrennte Zellen mit schwacher PS-Exposition Wagner, 2009

31

Effekte

PS-Exposition LPA stark

LPA: Nach alter getrennte Zellen mit starker PS-Exposition Wagner, 2009

32

Effekte

PS-Exposition LPA schwach

LPA: Nach alter getrennte Zellen mit schwacher PS-Exposition Wagner, 2009

33

Effekte

PS-Exposition Hämolyse (LPA stark)

Generelles Problem: Hämolyserate + Reaktion des Blutes auf LPA (Spenderabhängig)

Hämolyserate LPA: Nach alter getrennte Zellen mit starker PS-Exposition Wagner, 2009

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Kationen-Kanal

(2-wertige Kationen; Ca2+)

PGE2, LPA Ca2+

Gardos-Kanal

H 2O, K

+ , Cl-

H2O, K+, Cl-

Scra

mbl

ase

induziert

PKC

Ca2+

A23187

Ca2+

PS PSPMA

aktiviert

Signalkaskade von RBCs Modifiziert nach Kaestner et al., 2004

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Fazit / Ausblick

- Effektive Methode zur Separation der Zellen nach Alter- Redoxsystem- Zellgröße- Bande 4.1 a / b

- Kein Trend in den verschiedenen Altersklassen mit PMA / LPA

- Doppelbestimmung von intrazellulären Ca2+– Gehalt und PS Exposition

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Referenzen•L. Wagner, D.B. Nguyen, A. Jung, P. Steffen, C. Wagner, L. Kaestner, T. Mueller, I. Bernhardt „Phosphatidylserine Exposure and Aggregation of Red Blood Cells“ (2011) Red Cell Club, Philadelphia •M. Osanai, H. Rembold „Entwicklungsabhängige Mitochondriale Enzymaktivitäten bei den Kasten der Honigbiene“ (1968) Max-Planck-Institut für Biochemie•S. K. Jain, „Evidence for membrane lipid peroxidation during the in vivo aging of human erythrocytes” (1988) Biochimica et Biophysica•T. Tiffert, N. Daw, Z. Etzion, R. M. Bookchin, V. L. Lew “Age Decline in the Activity of the Ca2+-sensitive K+ Channel of HumanRed Blood Cells” (2007) The Journal of General Physiology•M. K. Horne III, A. M. Cullinane, P. K. Merryman, E. K. Hoddeson “The effect of red blood cells on thrombin generation” (2006), bjh•V. Peyrou, J. C Lormeau, J. P. Hérault, C. Gaich, A. M. Pfliegger, J. M. Herbert „Contribution of Erythrocytes to Thrombin Generation in Whole Blood“ (1999) Thromb Haemost•T. J. Mueller, C. W. Jackson, M. E. Dockter, M. Morrison “Membrane Skeletal Alterations During In Vivo Mouse Red Cell Aging” (1986)J. Clin. Invest.•S. Berndl „Fluoreszente H-Aggregate von Thiazol Orange in DNA und RNA, sowie postsynthetische Klick-Ligation an DNA (2010) Dissertation Uni Regensburg•S. Piomelli, C. Seaman “Mechanism Red Blood Density Cell Aging: Relationship of Cell and Cell Age” (1993) American Journal of Hematology•H. U. Lutz, P. Stammler, S. Fasler, M. Ingold, J. Fehr „Density separation of human red blood cells on self forming Percoll R gradients: correlation with cell age” (1992) Biochimica et Biophysica•V. L. Lew, N. Daw, Z. Etzion, T. Tiffert, A. Muoma, L. Vanagas , R. M. Bookchin “Effects of age-dependent membrane transport changes on the homeostasis of senescent human red blood cells” (2012) blood•N. Mohandas, W. Groner „Cell Membrane and Volume Changes during Red Cell Development and Aging” University of California, San Francisco•L. Wagner “Untersuchung dynamischer Prozesse an der Membran humaner Erythrozyten in Abhängigkeit vom Zellalter“ (2009) Diplomarbeit Universität des Saarlandes•W. Williams, “Hem I Erythrocytes” (2008) Morphology and Physiology, www.clt.astate.edu/wwilliam/hem_i_erythrocytes_morphology_and_physiologyhtm•High Impact http://www.highimpact.com/animations/medical-animations/MED01296/ •L. Kaestner, W. Tabellion, P. Lipp, I. Bernhardt “Prostaglandin E2 activates channel-mediated calcium entry in human erythrocytes: an indication for a blood clot formation supporting process” (2004) Thromb Haemost. 2004 Dec;92(6):1269-72.•S. Silbernagel, A. Despopoulus „Taschenatlas der Physiologie“ (2007) 7. Auflage, Thieme, Stuttgart, S. 89•I. Bernhardt „Die rote Blutzelle als Modell zur Untersuchung biophysikalischer Regulationsmechanismen an biologischen Membranen “ (2003) Magazin Forschung Universität des Saarlandes

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Vielen Dank für Eure Aufmerksamkeit.

Gibt es Fragen?

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Nachweis einer gelungenen Separation Dichtegradientenseparation

Nachweis der RNA / DNA mittels Reagenz Retic-COUNT (Thiazol-Orange oder Polymethin)

Polymethin (ungrade Anzahl an Methin-Gruppen, Bsp. Cyanin)

- In Lösung kaum Fluoreszenz- In Kontakt mit DNA / RNA Fluoreszenzanstieg, da eingeschränkten Rotation der aromatischen Systeme um die Methingruppe

Verschiedene Enzym-Aktivitäten messbar:

Aktivität der

- Glutamic-oxalacetic transaminase (GOT)

- Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD)

Alte Zellen besitzen nurnoch ca.60% Aktivität gegenüber normalen Zellen

Isotopenmarkierung Nachweis