dna ricombinante: due molecole di dna vengono unite in provetta sfruttando le proprieta’ di
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DNA RICOMBINANTE: DUE MOLECOLE DI DNA VENGONOUNITE IN PROVETTA SFRUTTANDO LE PROPRIETA’ DI ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE DI TIPO II E DELLA DNALIGASI
CLONAGGIO-IN BIOLOGIA CLONARE UN ORGANISMO SIGNIFICA OTTENERE UN INDIVIDUO UNA POPOLAZIONE DI ORGANISMI CHE SONO GENETICAMENTE IDENTICI
-IN BIOLOGIA MOLECOLARE CLONARE UN TRATTO DI DNA SIGNIFICAOTTENERE UNA POPOLAZIONE DI DNA IDENTICHE ALLA MOLECOLA DI PARTENZA
Il clonaggio del DNA
• Clonaggio: viene generata una molecola di DNA ricombinante, cioe’ isolata dal suo contesto e introdotta in un replicone (una unita’ di DNA capace di replicarsi detto vettore).
• Questa molecola di DNA ricombinante viene introdotta in un sistema cellulare appropriato (in genere batteri derivati dall’ Escherichia coli).
• Tutti i discendenti di questa singola cellula, detta clone, conterranno la medesima molecola di DNA ricombinante originariamente isolata, permettendo di produrne quantita’ praticamente illimitate
Plasmidi
• Molecole extracromosomiali di DNA circolare, capaci di replicarsi e di segregare autonomamente rispetto al DNA cromosomale dei batteri. • Di solito sono portatori di geni che conferiscono ai batteri un vantaggio selettivo in particolari condizioni ambientali (resistenza agli antibiotici, ad es.)
• Possono ospitare DNA estraneo (a condizione che non sia troppo grande)
• Possono essere facilmente purificati dal DNA cromosomale in grande quantità.
Plasmidi
Plasmidi: Superavvolgimento
M
1
2
3
4
5
6
789
10
Non
dig
erit
o
Dig
erit
o
Enzimi di restrizioneEnzimi di restrizioneIl DNA digerito con gli enzimi di restrizione può essere analizzato mediante elettroforesi
Plasmide (P)
DNA genomico (G) 3x 109 basi
Eco RI (E)
Eco RI
M
1
2
3
4
5
6
789
10
Bam HI (B)
P P+B P+E G+E
10 kb
+
-
MAPPATURA ENZIMATICA DI UN TRATTO DI DNA
6.6 bp
PstI PstIHindIII HindIII
1.1 kb 0.6 kb 2.3 kb 1.2 kb 1.4 kb
PstI HindIIIM
1
2
3
4
+0,5
PstI+HindIII
1.1
1.4
4.1 -
1.7
2.32.6
1.1
0.6
2.3
1.41.2
Le DNA ligasi sono enzimi capaci di legare covalentemente due molecole di DNA adiacenti
con estremità libere
DNA RICOMBINANTE: due tratti di DNA che in natura non sonoadiacenti, vengono uniti in provetta.
Le proprietà degli enzimi di restrizione sono state essenziali per la tecnica del DNA ricombinante.
I due tratti da unire vengono tagliati con uno stesso enzima di restrizione.
GAATTCCTTAAG
GAATTCCTTAAG
EcoRI
G AATTCCTTAA G
G AATTCCTTAA G
G CTTAA
AATTC G
GAATTCCTTAAG
Le estremità coesive prodotte da uno stesso enzima possono appaiarsi.
GAATTCCTTAAG
5’
3’ 5’3’
DNA LIGASI ATP
5’
3’
GCTTAA
OH
P
AATTC G
OH
P
5’3’
G AATTCCTTAA G
5’
3’
OH P
OHP
G AATTCCTTAA G
OH
OH
P
P
5’
3’ 5’3’
Infine la DNA ligasi viene utilizzata per legare covalentemente le due molecole di DNA
Solo estremità compatibili possono essere legate efficientemente
INSERIMENTO DI UN TRATTO DI DNA ESOGENO IN UN VETTORE DI CLONAGGIO
CLONAGGIO:
- LIGASI
- TRASFORMAZIONE
- SELEZIONE
- CRESCITA COLONIE
IDENTIFICAZIONE DELLA COLONIA
BATTERICA DI INTERESSE
Cosa può succedere in una reazione ligasica ?
1. Il vettore si richiude su se stesso senza legarsi con l’inserto
2. Il vettore si lega con l’inserto
L’enzima beta-galattosidasi può essere utilizzato per discriminare le colonie che contengono un plasmide con inserto
da quelle che contengono un plasmide senza inserto
ALCUNI ENZIMI PRODUCONO ESTREMITA’ TRONCHE (BLUNT)
ESTREMITA’ BLUNT POSSONO ESSERE LEGATE A ESTREMITA’ BLUNT PRODOTTEDA QUALSIASI ALTRO ENZIMA, NON CI SONO LE LIMITAZIONI IMPOSTE DALLACOMPLEMENTARIETA’ DELLE BASI DELLE CODINE APPICCICOSE.
SVANTAGGIO: LIGASI DI ESTREMITA’ BLUNT E’ MENO EFFICIENTE PECHE’ NONSI HA APPAIAMENTO TRA CODINE A SINGOLO FILAMENTO.
CCC/GGGGGG/CCC
GAT/ATCCTA/TAG
SmaI EcoRV
CCCGGG
ATCTAG
LA SEQUENZA IBRIDA CHE SI FORMA NON E’ RICONOSCIUTA DA NESSUNO DEIDUE ENZIMI.
QUANDO E’ NECESSARIO UNIRE DUE ESTREMITA’ INCOMPATIBILI????
E’ POSSIBILE CONVERTIRE LE ESTREMITA’ STICKY IN ESTREMITA’ BLUNT
Estremita’ 5’ protruding:
5’3’5’
3’
L’estremità 3’ del filamento viene utilizzata come innesco dalla DNA POLIMERASI.Si utilizza il frammento Klenow della DNA polimerasi I di E. coli (DNA POLIMERERASI intera ha azione 5’esonucleasica).
Estremità 5’ o 3’ protruding:
5’3’5’
3’
Si utilizza la nucleasi S1: nucleasi che funziona su singolo filamento.
Il fago lambda come vettore di clonaggio
Il ciclo vitale del fago lambda
Placche di lisi
Lisogenia
Lisogenia
Ricombinazione sito-specifica
Ricombinazione omologa
INFEZIONE
Produzione di enzimiPer la sintesi del DNA
Inizia la replicazione
Produzione di testee code del fago
packaging
lisi
FASE PRECOCE
FASE TARDIVA
Ciclo litico
Un interruttore complesso
Replicazione ‘rolling circle’
COS Genoma COS Genoma COS Genoma COS
Packaging
Il fago lambda come vettore
• VETTORI PLASMIDICI -> 0-10 kb
• VETTORI di inserzione -> 0-10 kb• VETTORI di sostituzione -> 9-23 kb• VETTORI COSMIDICI -> 30-44 kb
• VETTORI PAC (crom. artif. P1) -> 130-150 kb• VETTORI BAC (crom. artif. batt.)-> fino a 300 kb
• VETTORI YAC (crom. artif.lievito)-> 0.2-2 Mb
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Cosmidi
P1
YAC
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