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Estudio de proteínas musculares por Western blot y técnicas de
genética aplicadas a las enfermedades neuromusculares: PCR,
RFLP y secuenciación
Cádiz, 21-24 Mayo 2013 - XXVI Congreso Nacional de la SEAP-IAP, XXI Congreso Nacional de la
SEC, II Congreso Nacional de la SEPAF
Dra. IRENE VIÉITEZ GONZÁLEZ
Servicio de Anatomía Patológica y Neuropatología – Hospital Meixoeiro
Complejo Hospitalario Universitario de Vigo (CHUVI)
Instituto de Investigación Biomédica de Vigo
FUNDAMENTO CENTRAL DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR
• La información genética, contenida en el ADN, se mantiene y es trasferida a su descendencia por su
capacidad de REPLICACIÓN
•El ADN transfiere la información al ARN mediante la TRANSCRIPCIÓN en el núcleo.
•El ARN mensajero se desplaza al citoplasma con la información del ADN y, mediante la
TRADUCCIÓN, sintetiza las proteínas
•Las proteínas son las encargadas de desarrollar las diferentes funciones de las células
Transcripción Traducción
ADN ARN Proteína
Replicación
Núcleo Citoplasma
• Excepciones:
- Retrovirus Transcripción inversa (transcriptasa inversa)
- Virus de ARN Duplicación del ARN (ARN polimerasa)
- Ribozimas: ARN con propiedades autocatalíticas, que son capaces de modificarse y replicarse por si mismos.
- Priones: Proteínas que se autoreplican
- NUCLEÓTIDOS de desoxirribosa: Adenina (A), Guanina (G), Citosina (C) y Timina (T)
- ENLACE FOSFODIÉSTER
- Dirección 5’ 3’
- Estructura en DOBLE HÉLICE y ANTIPARALELA
- COMPLEMENTARIEDAD:
A – T (2 puentes de H2) / G – C (3 puentes de H2)
ADN: Ácido didesoxirribonucleico
Nucleótido
- NUCLEÓTIDOS de ribosa: Adenina (A), Guanina (G), Citosina (C) y Uracilo (U)
-De cadena sencilla (5’ 3’) : MONOCATENARIO (excepto reovirus)
- Complementariedad con el ADN molde (la Adenina se combina con Uracilo) TRANSCRIPCIÓN
- Tipos de ARN Distintos papeles en la transmisión de la información
ARN Mensajero: sirve de molde para la síntesis de las proteínas y transporta la información
desde el DNA (núcleo) hasta el centro de producción de la síntesis proteica (ribosoma)
ARN Ribosómico: forma parte de los ribosomas que llevan a cabo la traducción
ARN Transferente: sirve para el transporte de los aminoácidos específicos desde las reservas
citosólicas hasta los ribosomas y aseguran su correcto alineamiento
Otros ARNs se emplean en la elaboración del RNA y en la exportación extracelular de
proteínas
ARN: Ácido ribonucleico
RNA de transferencia
(tRNA)
RNA ribosomal
(rRNA)
RNA mensajero
(mRNA)
- Combinación de AMINOÁCIDOS (20 diferentes)
- Compleja organización estructural: Cadena aminoacídica > Estructura cuaternaria (Complejo proteico)
- Funciones muy diversas: Estructurales, Enzimas, Receptores, Hormonas, Anticuerpos…
LAS PROTEÍNAS
Relación entre la secuencia de nucleótidos del ADN y la secuencia de aminoácidos de la proteína
EL CÓDIGO GENÉTICO
Organizado en tripletes o CODONES: cada
tres nucleótidos corresponden a un
aminoácido.
Los codones TAA, TAG y TGA indican la
parada de la síntesis proteica.
DEGENERADO: existe más de un triplete
que codifica por el mismo aminoácido.
ESPECÍFICO: ningún codón codifica más de
un aminoácido
CONTÍNUO: el cuadro de lectura de los
tripletes se realiza sin espacios en sentido 5’-3’
desde el codón de inicio hasta el de parada.
UNIVERSAL: el mismo triplete en diferentes
especies codifica para el mismo aminoácido.
Unidad física y funcional básica de información contenida en el ADN
¿ Qué es un Gen?
Exón: Región del gen que se mantiene en el ARN mensajero tras su maduración (Splicing). Parte
codificante del gen
Intrón: Región del gen que no se mantiene en el ARN mensajero tras el proceso de Splicing. Parte no
codificante del gen.
GEN
Maduración del
ARNm
En organismos diploides es cada una de las dos copias del gen presente en su genoma
¿ Qué es un Alelo?
ALELO DOMINANTE: Alelo que enmascara la expresión fenotípica del otro alelo del mismo locus.
ALELO RECESIVO: Alelo que para expresarse debe estar en ambos locus.
HOMOCIGOTO: Los dos alelos iguales para un locus.
HETEROCIGOTO: Los dos alelos distintos para un locus.
MUTACIÓN: Tipos de mutaciones
MUTACIONES PUNTUALES: Se produce el cambio de un único nucleótido
“Missense”: Variación de un nucleótido que conlleva el cambio de un aminoácido por otro distinto.
“Nonsense”: Variación de un nucleótido que conlleva el cambio de un aminoácido por un codón de parada
(TAG, TAA o TGA).
Cambio en la información genética que puede ser transmitido a la descendencia
MUTACIONES FRAMESHIFT (Cambio en la pauta de lectura): Se produce un cambio total en el
sentido del mensaje genético a partir del sitio de la mutación. Se sintetiza una proteína inactiva, a menudo
truncada.
Se debe a: DELECIONES, INSERCIONES, INDELS, DUPLICACIONES
MUTACIONES IN-FRAME: Si el cambio afecta a un triplete o varios, la proteína solo pierde los
aminoácidos implicados.
MUTACIONES DE SPLICING (de corte y empalme) : Mutaciones que alteran el proceso de maduración
de los ARNm generando transcriptos alterados que codifican por proteínas truncadas.
5’ ACTGCATTTAGC 3’
T A F S
Secuencia normal
5’ ACTGCATCTAGC 3’
T A S S
Secuencia mutada
5’ AGCTGCAGCAAT 3’
S C S N
Secuencia normal Secuencia mutada
5’ AGCTGAAGCAAT 3’
S X
Patrones de Herencia Genética
Herencia Autosómica Dominante Herencia Autosómica Recesiva
Herencia Ligada a X dominante Herencia ligada a X recesiva
Extracción ADN: Método de extracción por Fenol-Cloroformo
Lisis de la muestra
Protección del ADN y eliminación
de material proteico y lipídico
Precipitación o concentración
Eliminación de inhibidores
de las reacciones sucesivas
Biopsia músculo Sangre en EDTA Otros tejidos
• Tampón de Lisis de Rojos
• Tampón de lisis de Blancos
• Proteinasa K
• SDS
• Lavados con Fenol
• Lavados con Cloroformo
•Isopropanol
•NaCl, EtOH
•Lavados con EtOH 70%
•Secado
Resuspensión
Cuantificación
• H2O o TE
• Espectrofotometría
PCR: Reacción en cadena de la polimerasa
• Consiste en la replicación de un fragmento de ADN de forma sucesiva Crecimiento exponencial
• Tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar y manipular el fragmento de ADN a análisis
• ADN molde (20ng-1μg)
• Cebadores específicos (Primers)
• Nucleótidos (dNTPs 0.8 mM)
• DNA-Polimerasa
• MgCl2 (1.5-4 mM)
• Tampón
• ddH2O
PCR: Reacción en cadena de la polimerasa
• PCR-MULTIPLEX: Amplificación con varios sets de primers de un ADN molde Productos de
distintos tamaños.
- Detección rápida de deleciones en un gen (Distrofina, 1988)
Análisis de una PCR: Electroforesis de Agarosa
• Técnica para separar fragmentos de ADN mediante la aplicación de un campo eléctrico
• El ADN tiene carga negativa por lo que se dirigirá al polo positivo
• Separación de los fragmentos de ADN en función del peso molecular
• Visualización por unión ADN – Bromuro de Etidio
• También permite cuantificar y/o aislar el producto de PCR
1 2 3
PCR SIMPLE PCR MULTIPLEX
RFLP: Restriction fragment length polymorphism
• Estudio de una mutación conocida
• Identificación de mutaciones en el fragmento amplificado utilizando enzimas de restricción (ER)
y analizando los productos en gel de agarosa
• Las ER cortan la cadena de ADN en sitios específicos dando un patrón de bandas característico
• La presencia de una mutación modifica este patrón de bandas
M N HT HM
576 bp
364 bp
212 bp
5’GCGACCTCTTCAACCTCTCGGCGCCCCTGGCCCGGCCGGT
GGGCACCAGCCTCTTTCTGCAGACCGCCCTTCGCGGCTGGGC
GGTGCAGCTGCTGGACTTGACCTTCGCCGCGGCGCGCCAGCC
CCCGCTGGCCACGGCCCACGCGCGCTGGAAGGCTGAGCGCGA
GGGACGCGCTCGGCGGGCGGCGCTGCTCCGCGCGCTGGGCAT
CCGCCTAGTGAGCTGGGAAGGCGGGCGGCTGGAGTGGTTCGG
CTGCAACAAGGAGACCACGCGCTGCTTCGGAACCGTGGTGGG
CGACACGCCCGCCTACCTCTACGAGGAGCGCTGGACGCCCCC
CTGCTGCCTGCGCGCGCTGCGCGAACCGCCCGCTATGTGGTG
GGCGTGCTGGAGGCTGCGGGCGTGCGCTACTGGCTCGAGGGC
GGCTCACTGCTGGGGGCCGCCCGCCACGGGGACATCATCCCA
TGGGACTACGACGTGGACCTGGGCATCTACTTGGAGGACGTG
GGCAACTGCGAGCAGCTGCGGGGGGCAGAGGCCGGCTCGGTG
GTGGATGAGCGCGGCTTCGTATGGGAGAAGGC 3’
Bfa I Fragmento amplificado: 576bp
Sustitución de C > A
212bp
364bp
SECUENCIACIÓN DEL ADN
La secuenciación permite realizar un análisis en profundidad del ADN y desvelar la
información básica presente en el fragmento a estudio
La secuenciación automática:
• Método de Sanger DIDEXOSINUCLEÓTIDOS
• Pasos de la reacción de Secuencia:
I. Purificación del producto PCR Exosap ®
II. Amplificación con un solo primer, ADN
polimerasa, dNTPs + ddNTPs (Big Dye®)
III. Desnaturalización de los fragmentos
IV. Separación por electroforesis capilar
V. Lectura de la secuencia
REACCIÓN DE SECUENCIA
96° 1’
96° 10’’
50° 5’’
60° 4’
4° ∞
25 ciclos
Heterocigoto
CÓDIGO DE COLOR:
ADENINA
TIMINA
GUANINA
CITOSINA
ALELO 1 C
ALELO 2 T
ALELO 1 T
ALELO 2 T
ALELO 1 C
ALELO 2 C
Normal
Homocigoto
SECUENCIACIÓN DEL DNA
WESTERN BLOT
Técnica analítica para detectar proteínas específicas en extractos celulares o de tejido
Obtención y preparación de la muestra
Separación por electroforesis
Trasferencia de proteínas
Immunoblot
Revelado
Análisis de Resultados
Obtención y preparación de la muestra
Etapas:
• Toma de la muestra (músculo – 20µg)
• Lisis (Solución PIK + Inhibidores)
• Homogenización
• Sonicación
• Separación de las fracciones de interés (Centrifugación)
• Desnaturalización para SDS-Page (Adicción del tampón de Leemli
y ebullición)
• Separación de las proteínas aplicando un campo eléctrico
• Gel de Poliacrilamida Rápido y Versátil (Acrilamida/Bisacrilamida)
• Gel Desnaturalizante (SDS- Page): Pérdida de la estructura 3D
• Tampón de Electroforesis Mantener pH constante
• Discontinua
Gel Concentrador: < %Acrilm+Bisacrilm
pH 6.8 (+ácido)
Gel Separador: > %Acrilm+Bisacrilm
pH 8.8
Las proteínas se
separan solamente
en función de su
PESO
MOLECULAR
WESTERN BLOT: Separación por electroforesis
WESTERN BLOT: Transferencia de proteínas
• Gel Poliacrilamida Membrana de Nitrocelulosa o PVDF
• Accesibilidad de las proteínas a su detección con Anticuerpos
• Electrotransferencia:
- Sandwich: Filtro – Gel – Membrana – Filtro
- Tampón de Transferencia
- Corriente eléctrica: Cátodo (+) Ánodo (-)
Gel
Poliacrilamida
Membrana
Nitrocelulosa
Anticuerpo primario
Anticuerpo secundario
Bloqueo
Detección
Leche en polvo o BSA
en tampón TTBS
Monoclonoal o Policlonal
Dilución 1:200-1:2000
Tiempo de incubación
Reconoce la inmunoglobulina de la
especie en el que se ha producido el
primario. Son conjugados con un
sistema de revelación (HRP o AP)
Reacción de un sustrato (ej. luminol)
catalizada por la Horseraddish peroxidase
con emisión de luz.
WESTERN BLOT: Inmunoblot
•Se compara la altura de la banda obtenida con un marcador de pesos moleculares para confirmar que
hemos detectado el producto de interés.
•Cuando es necesario valorar la cantidad de proteína para comparar la expresión en diferentes tejidos o
pacientes es necesario realizar una comparación con una proteína endógena cuya expresión no varia en
las diferentes muestras (GAPDH, IgG, Actina).
WESTERN BLOT: Análisis de Resultados
DIAGNÓSTICO MOLECULAR
Historia clínica
Datos paraclínicos Biopsia muscular
Laboratorio Miopatología
Disección – Orientación
Congelación M/E
Inmunogold
Histoquímica
Inmunohistoquímica
Microscopía Confocal
Extracción de DNA
PCR multiplex
PCR-RFLP
Secuenciación
Otras
Banco de DNA
Cortes criostato
DIAGNÓSTICO Consejo genético
Wb
Bioquímica
+
Sangre
Banco de
Tejidos
DISTROFINOPATÍAS
Distrofina: Nexo de unión entre citoesqueleto y matriz extracelular
1987: Gen DMD localizado en Xp21 => 79 exones
Herencia ligada a X recesiva: Mujeres portadoras y hombres afectos
Estudio de exones de zona caliente del gen
PCR multiplex detecta más del 95% de las
deleciones en DMD
PCR MULTIPLEX
WESTERN BLOT
1 2 3 4 5 6 7 8
427 kDa
Expresión de la Distrofina
Fenotipos:
Distrofia muscular de Duchenne
Distrofia muscular de Becker
PCR I
Exón 45
PCR II
Exón 47
Exón 48
Exón 44
1 2 1 2
DMD DMB DMB
LGMD1C: Caveolinopatía
Caveolina 3 (21kDa): Proteína integral de membrana para la
formación de caveolas en el músculo
Gen CAV3 (3p25) => 2 exones
Herencia AD: Heterocigoto Afecto
A45T (exón 2)
Control Heterocigoto Control Heterocigoto
R26Q (exón 1)
SECUENCIACIÓN
LGMD2C: Gamma-sarcoglicanopatía
Gen SGCG (13q12) => 8 exones
Gamma-sarcoglicano: 35kDa
Etnia Gitana: Elevada prevalencia mutación C283Y (mutación fundacional)
Población Mediterránea: Elevada prevalencia mutación del521T
C283Y → Rsa I
PCR-RFLP SECUENCIACIÓN
del521T (exón 6)
Control
Homocigoto Heterocigoto
GLUCOGENOSIS V: Enfermedad de McArdle
• Glucogenosis más frecuente
• Miofosforilasa: Degradación del glucógeno
• PYGM (11q13) 20 exones
• Herencia AR
• Gran heterogeneidad alélica
3Indels
2Duplicaciones
2Grandes Deleciones
15Pequeñas Deleciones
1Pequeñas Inserciones
9Splicing
69Missense/nonsense
Nº TotalMUTACIÓN
3Indels
2Duplicaciones
2Grandes Deleciones
15Pequeñas Deleciones
1Pequeñas Inserciones
9Splicing
69Missense/nonsense
Nº TotalMUTACIÓN
“ nonsense” R50X ( exón 1)
Arginina > Stop (CGATGA)
Mutación más frecuente
“missense” W798R (exón 20)
Triptófano > Arginina (TGGCGG)
Mutación privada de España
(2ª mutación más frecuente) “ missense” G205S ( exón 5)
Glicina > Serina (GGCAGC)
2ª mutación más frecuente
en la población general
MUTACIONES MÁS FRECUENTES
R50X, W798R y G205S
78% alelos mutantes en pacientes
españoles
1: Marcador peso molecular 4: Caso Homozigoto
2: Producto PCR sin digerir 5: Caso Heterozigoto
3: Caso Normal
PCR-RFLP: Análisis de las mutaciones R50X, W798R y G205S
TGG > CGG
Trp > Arg CGA > TGA
Arg > Stop
GGC > AGC
Gly > Ser
Nonsense R50X
Exón 1
Missense W798R
Exón 20
Missense G205S
Exón 5
GLUCOGENOSIS V: Enfermedad de McArdle
Inserción en el Exón 8
Inserción T entre nucleótidos 892-893
Alteración pauta de lectura
Codón de parada prematuro
35 aminoácidos después
SECUENCIACIÓN
Secuencia normal: 5’ GAGTATTTCGTGGT… 3’
Secuencia mutada: 5’ GAGTTATTTCGTGG… 3’
Tyr Phe Val
Leu Phe Arg
GLUCOGENOSIS II: Enfermedad de Pompe
Maltasa ácida (105kDa): Degradación glucógeno lisosomal
Gen GAA (17q25) 20 exones
Herencia autosómica recesiva
Diagnóstico Prenatal:
CONCLUSIONES
• CONFIRMACIÓN Y EXACTITUD EN EL DIAGNÓSTICO
• MÉTODO DIAGNÓSTICO NO INVASIVO
•DETECCIÓN PRECOZ DE LA ENFERMEDAD
•DETECCIÓN DE HETEROCIGOTOS Y FAMILIARES AFECTOS
•CONSEJO GENÉTICO:
- Prevención de futuros casos
- Diagnóstico prenatal o preimplantacional
•CONOCIMIENTO DEL DEFECTO MOLECULAR:
- PRONÓSTICO (correlación genotipo – fenotipo)
- POSIBLES TERAPIAS GÉNICAS
Muchas Gracias por su atención
Grupo de Neurociencias NC-CHUVI Instituto de Investigación Biomédica de Vigo (IBIV)
Investigadores:
• Saida Ortolano
• Susana Teijeira • Irene Viéitez • Beatriz San Millán • Carlos Spuch
Personal de apoyo:
• Olga Souto
• Soraya Barrera • TaniaVázquez-Santos
Coordinadora: Carmen Navarro
DIAGRAMA GENERAL DE ESTUDIO GENÉTICO
Muestra biológica
DNA
Producto de
PCR
RESULTADO
Reacción Secuencia Digestión (ER)
Extracción DNA
PCR
(Polymerase chain reaction)
Análisis por RFLP
(Restriction fragment length
polymorphism)
Análisis por
Secuenciación
DISTROFIAS DE CINTURAS
ENFERMEDAD LOCUS (OMIM) PROTEÍNA MW (kDa) LOCALIZACIÓN
LGMD1A 5q31 Miotilina 57 Sarcómero
LGMD1B 1q21 Laminina A/C 74/65 Membrana Nuclear
LGMD1C 3p25 Caveolina 3 17 Transmembrana
LGMD1D 7q Desmina 53 Citoplasma
LGMD1E 6q23 DNAJB6 37 Citoplasma/Disco Z
LGMD1F 7q32.1 TPNO-3 104 Membrana Nuclear
LGMD1G 4q21 (Starling et al. Europ J Hum Genet 2004; 12: 1033-1040)
DISTROFIAS DE CINTURAS
ENFERMEDAD LOCUS (OMIM) PROTEÍNA MW (kDa) LOCALIZACIÓN
LGMD2A 15q15 Calpaina 3 94 Citoplasma
LGMD2B 2p13 Disferlina 230 Membrana
LGMD2C 13q12 - sarcoglicano 35 Transmembrana
LGMD2D 17q11-q12 -sarcoglicano 50 Transmembrana
LGMD2E 4q12 -sarcoglicano 43 Transmembrana
LGMD2F 5q33-34 -sarcoglicano 35 Transmembrana
LGMD2G 17q11-q12 Teletonina 19 Sarcomérica
LGMD2H 9q31 TRIM32 72 Citoplasma
LGMD2I 19q13 FKRP 60 Aparato de Golgi
LGMD2J 2q 24-31 Titina 4200 Sarcomérica
LGMD2K 9q34 POMT1 (Balci et al. Neuromusc Disord 2005; 15: 271-275)
LGMD2B: Disferlinopatía
Disferlina (230kDa): Mantiene la integridad del sarcolema
Gen DYSF (2p13) => 55 exones
Cierta correlación Genotipo – Fenotipo:
1 2 3 4
230 kDa
WESTERN BLOT
Fenotipos:
LGMD2B
Miopatía distal de Miyoshi
DMAT
GLUCOGENOSIS V: Enfermedad de McArdle
11 mutaciones
M1V
M1L
L5RfsX20
L5Vfs
V16Ffs
E26Afs
L36R
H37QfsX33
R50X Y53X
A55GfsX21
Q73Hfs
L116P
E125X
L132WfsX163
N134Kfs
G136D
R139W
R194W
G205S G205D
R270X E337R
E349K
L354P
W362X
R428C
G449R
S450L
A452Rfs
G455R
V456M
P454_L464
D511Tfs
D534Vfs
R590H
F599Lfs
R602W
R602Q
K609K
A660D
D662A
Q666E
A670V
N685Y
G686R
G686R
A687P
T692Kfs
A704V
G705Rfs
F710del
R715W
C784X
Q785X
I83F
Y85X
R94Q
R94W
N102Dfs
L153R
L153P
G157V
G159R
R161C
G174D
P230R
V239del
S246P
L292P
Y298Lfsx35
A364V
A365E
W366X
T379M
E383K
A384D
E386Afs
W388Sfs
L397P
G486D
T488N
T488I
R490W
R490Q
R490Afs
R491C
W492X
V494Sfs
E541X
K543T
K543X
R570W
R570Q
Y574X
K575E
R576X
Q577R
L587P
R650EfsX8
R650X
E655K
Y733X
K754Nfs
Q755X
R771Q
E796Vfs
W798R T808P
S809FfsX6
D815A
W826S
c.855 +1G>C c.1092 +1G>A
c.1239 +1G>A
c.1768 +1G>A
c.1970-2177del
c.2380 -1G>A
Hotspots in exons 1, 14 y 17
(32% mutations) 12 mutaciones
14 mutaciones
c.681 -2A>G
c.1000 -1G>T
c.1769 -1G>A
23 nuevas mutaciones
Deleción 5 nucleótidos
Alteración pauta de lectura
Codón de parada prematuro (PTC)
21 aminoácidos después
Deleción T14
Alteración pauta de lectura
Codón de parada prematuro (PTC) 20
aminoácidos después
SECUENCIACIÓN
PYGM
GLUCOGENOSIS IIb: Enfermedad de Danon
• LAMP2 Xq24
• Herencia dominante ligada a X
• 9 exones
• Splicing alternativo exón 9:
- Isoforma LAMP2a
- Isoforma LAMP2b Músculo estriado y cerebro
MUTACIÓN Nº Total
Sustituciones nucleotídicas
(Missense/Nonsense) 10
Pequeñas Inserciones 3
Pequeñas Deleciones 9
Grandes Deleciones 5
Splicing 10
Small Indel 1
Q359PfsX13 (c.1074InsC)
Secuencia Normal Secuencia Mutada
Viéitez I et al. Human Genetics 2008.
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