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Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.
Práctica 6
Extracción de los pigmentos en tejido vegetal y su separación cromatográfica
http://publicacionescbs.izt.uam.mx/DOCS/estfunii.pdf
Cromatografía
Clorofila
Ficobilinas
Ficoeritrinas
b- Carotenos
Ficocianinas
+ 6 H2O6 CO2 + 6 O2C6H12O6
Luz solar
Clorofila
Muestra
A B CMuestra
Fase Móvil (Eluyente)
Fase
Estacionaria
(Sílica)
Cromatografía en Columna
Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.
Disolventes Polares
Agua
Metanol
Etanol
N-Propanol
Isopropanol
N-Butanol
Acido acético
Disolventes Polares
Dimetil sulfoxido (DMSO)
Acetonitrílo
Acetona
Cloroformo
Disolventes NO Polares
Éter dietílico
Tolueno
Benceno
Hexano
CromatografíaColumna
https://ecovi.tripod.com/id19.html
De Intercambio
Iónico
HPLC
Placa
Eluyente
Eluyente
Eluyente
Mezcla de aaProteína
Hidrólisis
Sol. de HCL 3N
autoclave 2 h
Cromatografía
1) Mezcla de aa
2) Ala
3) Phe
4) Ser
5) Ac. Asp
6) Lis
Eluyente:
Ciclohexano, éter dietílico (50:50)
Dejar estabilizar la cámara de
electroforesis
Eluyentes en orden creciente de polaridad:
Ácido acéticoAguaMetanolEtanolBenceno†Diclorometano†Cloroformo†Piridina†Acetato de etiloTetracloruro de carbono†CiclohexanoÉter dietílicoÉter de petróleo
Polaridad † compuestos cancerígenos
AA Clasific. en base a la polaridad del grupo R.
Apolares o hidrofóbs:Ala, Val; Leu, Isoleu, Prol, Met, Phe, Tript.
Polares sin carga:Gly, Ser, Treon, cist,, Tiros, Asp, Glutam.
Polares con carga -:Ac. Asp., Ac. Glutam.
Polares con carga +:Lis, Arg Hist
Ninhidrina
Calor
Distancia
Recorrida (cm)
10
9.5
8
7
5
2
1
Fase Estacionaria: Papel
Fase Móvil: Eluyente
Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.
LECHE
Caseina
Distancia
Recorrida (cm)
10
9.5
8
7
5
2
1
RF =Distancia recorrida de la muestra (cm)
Distancia recorrida del eluyente (cm)
Mezcla Ala Phe Ser Ac. Asp. Lis
9.5/10= 0.95 9.5/10= 0.95 Ala
8/10= 0.80 ???
7/10= 0.70 No tiene
Ser
5/10= 0.50 5/10= 0.50 Phe
2/10= 0.20 2/10= 0.20 Ac. Asp.
1/10= 0.10 1/10= 0.10 Lis
1) Mezcla de aa
2) Ala
3) Phe
4) Ser
5) Ac. Asp
6) Lis
Valores de RF de c/ muestra
Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.
1 2 3 4 5 6
• Separar
• Identificar
• Purificar
Cromatografía
FOTOSÍNTESIS
Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.
+ 6 H2O6 CO2+ 6 O2C6H12O6
Luz solar
Clorofila
H2O O2Luz solar
Clorofila
NADP H
ATP
1. La excitación fotoquímica de la clorofila.
2. Fotolisis del agua. Fotolisis
3. Síntesis de NADPH. Fotorreducción.
4. Síntesis de ATP. Fotofosforilación.
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CO2
Reacciones de la Fase Luminosa
Reacciones de
la Fase Obscura
3
4
5
Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.
Objetivos particulares
• Extraer los pigmentos de diferentes vegetales (hojas verdes como espinaca, perejil).
• Separar los cromóforos obtenidos de las hojas verdes por cromatografía en papel.
Objetivo general
• Obtener los diferentes pigmentos presentes en los vegetales verdes
Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.
Soluciones
• Disolución de éter dietílico-metanol-hexano (45:15:5)
• Etanol al 70%.
*Nota: Se deben manejar bajo las medidas de seguridad adecuadas.
Material y equipo
Material por grupo
1 Balanza de dos platos.
2 Vasos de precipitados de 50 mL.
1 Balanza granataria.
Material por equipo
1 Mortero con pistilo.
1 Embudo de vidrio.
1 Embudo de separación.
1 Soporte universal con anillo.
3 Vasos de precipitados de 100 mL.
2 Vasos de precipitados de 50 mL.
2 Pipetas graduadas de 5 mL.
2 Pipetas graduadas de 10 mL.
2 Pipetas Pasteur con bulbo.
1 Parrilla eléctrica.
1 Palangana con hielo.
1 Piceta con agua destilada.
Capilares adelgazados.
Papel filtro Whatman #1 para cromatografía.
Material proporcionado por el alumno
20 g de tejido vegetal limpio y seco (hojas verdes de espinaca, perejil, cilantro).
(cada equipo una muestra diferente).
4 Gasas de algodón.
1 Frasco con tapa (por equipo).
1 Par de guantes desechables (por equipo).
Reactivos
• Etanol.
• Éter dietílico.
• Éter de petróleo.
• Hexano.
• Sulfato de sodio.
• Metanol.
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45: 15 : 5 = 65 mL
90: 30 :10 = 130 mL180:60 :20 = 260 mL
1. Colocar el mortero en un baño de hielo, la extracción de los pigmentos se lleva a cabo en frio.
2. Pesar 10 g del tejido vegetal sin los peciolos, ni las venas grandes.
3. Trocear las hojas y macerar en 10 mL de etanol hasta que se forme una masa espesa.
4. Adicionar 5 mL de etanol y 10 mL de éter de petróleo.
5. Filtrar el macerado a través de las 2 gasas colocadas en el embudo de vidrio, recibiendo el
filtrado en un embudo de separación.
6. Adicionar al embudo de separación 15 mL de disolución éter dietílico-metanol-hexano y 25 mL de
agua destilada, lenta y suavemente resbalando por las paredes del embudo.
7. Agitar suavemente y dejar que se separen las dos fases. Desechar la fase acuosa y colectar la
fase orgánica que se encuentra en la parte superior, en un vaso de precipitados de 50 mL.
8. Adicionar unos cristales de sulfato de sodio para eliminar los restos de agua.
9. Calentar levemente sobre una parrilla eléctrica para concentrar el extracto a un volumen de 2 mL.
Procedimiento experimental A.
Extracción de los pigmentos
10 g del tejido vegetal
Filtrar a través 2 capas de gasa
gasa
Temp Agit.
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éter dietílico-metanol-hexano (45:15:5)
1. Colocar 20 mL de etanol al 70% en un frasco con tapa.
2. Ponerse guantes y cortar un fragmento de 6 x 8 cm de una hoja de papel Whatman # 1, el cual se debe colocar
en una cartulina nueva. Marcar el sentido en que correrá la muestra, que se indica en la caja del papel Whatman.
3. Trazar con lápiz una línea tenue a 1.5 cm, con un punto marcar divisiones cada 1 cm. Se debe tener en cuanta,
el sentido en que correrá la muestra.
4. Aplicar la muestra obtenida por usted, con un capilar que tenga la punta adelgazada. Poner una microgota entre
los puntos marcados sobre el papel Whatman, dejar secar y repetir 5 veces la aplicación en el mismo punto,
dejando secar en cada ocasión. Realizar el mismo procedimiento para otras dos o tres muestras obtenidas por
otros equipos.
B. Separación de los pigmentos obtenidos, por cromatografía en papel
5. Colocar el papel Whatman de forma vertical dentro del frasco con los 20 mL de etanol al 70%, sin que las
muestras toquen este eluyente y tapar el frasco.
6. Dejar correr la cromatografía durante 1.5 h. Sacar el papel del frasco y dejar secar por 10 min.
etanol al 70%
1.5 cm
6 X 8 cm
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Se obtuvieron los 4 tipos de clorofilas
existentes en gran cantidad: 4 tubos
de xantofilas, 2 tubos de clorofila , 3
tubos de clorofila b y 1 tubo completo
de carotenos.
Las primeras clorofilas formadas
fueron de xantofilas:
La primer capa formada fue de color
amarillo transparente, después la
siguiente capa fue de color amarillo
verdoso, seguida de un verde militar y por último un color verde olivo
Las segundas clorofilas extraídas
fueron las clorofilas
El primer y segundo tubo se
observaron de un color verde agua;
esta fue la clorofila que se presentó
en mayor cantidad y en la misma
tonalidad.
Las terceras clorofilas
extraídas fueron las
clorofilas b de las que se
obtuvieron 3 tubos: el
primero verde claro, el
segundo verde amarillento y
el último verde amarilloso.
Por último, se obtuvo un tubo
completamente lleno de
carotenos en color amarillo.
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7. Marcar con un lápiz los límites de las manchas y tomar la distancia desde el punto de aplicación. A partir de estos
datos y la distancia a la que llegó el eluyente determinar el Rf de cada una de las muestras que se aplicaron al
papel, empleando la fórmula:
Rf= Distancia recorrida por cada muestra (cm)
Distancia recorrida por el eluyente (cm)
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Resultados Cromatograma.
Figura 4.” Comienzo de la Cromatografía “10:12 am
Espinaca 1 Perejil Espinaca 2
Espinaca 2PerejilEspinaca 1
Clorofila b
Clorofila a
Xantofila.
Cromatografía de la muestra de espinaca
.
Clorofila b
Clorofila a
Xantofila.
Figura 6 . Cromatografía de la
muestra de perejil.
Nota: Recordar que los puntos que se dan a continuación son una base para realizar el análisis.
Explicar el patrón de separación de los componentes de la mezcla de cada una de las muestras analizadas.
• Diferencia en el corrimiento de los pigmentos obtenidos en los vegetales.
Y ¿A qué se debe?
• Cuántos pigmentos se obtuvieron en cada extracto y cuál es su afinidad con el eluyente
• Comparar la cromatografía de los pigmentos con lo que se tiene reportado en la literatura
Análisis de resultados
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