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FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA
PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
AVALIAÇÃO DE UM PRÉ-TRATAMENTO BIOLÓGICO COM CEPAS DE
PANUS TIGRINUS NO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR QUE ANTECEDE A
POLPAÇÃO Q~ÍMICA
Sirlene Maria da Costa
Tranferido da Biblioteca do DEBIQ para a Bilblioteca
Universitária em Junho/2004 Proc. nº 202/04
Lorena -SP- Brasil 1999
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FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA
PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
AVALIAÇÃO DE UM PRÉ-TRATAMENTO BIOLÓGICO COM CEPAS DE
.PANUS TIGRINUS NO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR QUE ANTECEDE A
POLPAÇÃO QUÍMICA
Dissertação de mestrado apresentada como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Biotecnologia Industrial
Banca examinadora: Dr. Adilson Roberto Gonçalves (presidente) Ora Elisa Esposito Ora Angela Elena Machuca Herrera
Estudante: Sirlene Maria da Costa
Lorena -SP- Brasil 1999
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FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA
PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
AVALIAÇÃO DE UM PRÉ-TRATAMENTO BIOLÓGICO COM CEPAS
DE PANUS TIGRINUS NO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR QUE
ANTECEDE A POLPAÇÃO QUÍMICA
Este exemplar corresponde à versão final da dissertação de mestrado aprovada pela banca examinadora.
Dr. Adilson Robe cfonçalves Orientador e Presidente da banca examinadora
Lorena -SP- Brasil 1999
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Dedico este trabalho aos meus pais, José Carlos da Costa in memoriam, Maria de Lourdes Costa e irmãos (Silgia, Jeane, Renato, Vilson, Celso e Anilson)
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AGRADECIMENTOS
Ao Dr. Adilson Roberto Gonçalves pelo apoio, incentivo, dedicação e
. orientação desde a iniciação cientifica até a realização desta tese.
À Ora. Elisa Esposito , pelo incentivo, pelas sugestões e orientação durante a
etapa biológica do trabalho.
Ao Dr. Pedro Edson Fardim e a empresa Suzano, pela realização dos testes
físicos das polpas Acetosolv.
À Ora Anqela Machuca e Priscila Bernar pelas sugestões durante este trabalho.
Aos amigos Andersen e Régis pela paciência e sugestões e principalmente
pela _atenção.
À todos os professores da Pós-Graduação do DEBIQ (Departamento de
Biotecnologia) da Faculdade de Engenharia Química de Lorena.
Aos colegas de curso Carla, Luciane, Water , Luciano, Hellen, Mareia e Luane
e companheiros do laboratório José Moreira,. José Carlos e Jussara, pela
amizade e alegria do convívio diário.
Aos demais funcionários e colegas do DEBIQ que não foram citados, mas que
de alguma forma contribuíram para realização deste trabalho.
Aos meus familiares, pelo carinho e grande incentivo.
À CAPES e FAPESP, pelo apoio financeiro.
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CONTEÚDO Páginas
· Lista de tabelas vi
Lista de figuras vii
Resumo xi
Astract. xii
Lista de abreviações, acrônimos e símbolos utilizados xiii
1- INTRODUÇÃ0 , 1
1.1 Composição química 1 1.2 Bagaço de cana-de-açúcar 3 1.3 Estrutura e Ultraestrutura da parede da célula vegetal 5 1.4 Processos de separação dos constituintes do bagaço 7
1.4.1 Processo de polpação Kraft 7 1.4.1.1 Terminologias empreqadas no processo de polpação kraft. 9
1.4.2 Polpação Acetosolv 11 1.4.3 Separação alternativa 11
1.5 Aplicação da biotecnologia na indústria de polpa 12 1.6 Fungos de decomposição branca. 13 1.7 Enzimas Ligninolíticas e Hidrolíticas 14 1.8 Utilização de PGA na seleção de cepas com capacidade ligninolítica e
hidrolítica : 20
2. OBJETIVOS ; 21
3. PARTE EXPERIMENTAL 22 3.1 Fungos 22 3.2 Bagaço de cana-de-açúcar 22 3.3 Condições de cultura 22 3.4 lnóculo 25 3.5 Avaliação das atividades enzimáticas 25
3.5.1 Lacase (Lac) 26 3.5.2 Lignina peroxidase (LiP) 26
3.5.3 Manganês-peroxidase (MnP) 26
iv
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3.5.4 Xilanase (Xyl) 27
3.6 Diálise 27
3.7 Análise química da composição do bagaço 28 3.8 Análise do bagaço autoclavado 30 3.9 Microscopia eletrônica de varredura (MEV) 31 3.1 O Espectros no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) e
análise por componentes principais (PCA) 31 3.11 Determinação da composição do licor de polpação kraft pelo teste
ABC 32 3.11.1 Polpação kraft 33
3.12 Polpação Acetosolv do bagaço 33 3.13 Determinação do número kappa ." 35 3.14 Viscosidade 36 3.15 Propriedades óptico-mecânicas das folhas obtidas a partir das polpas
Acetosolv 37
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO .40 4.1 Crescimento fúngico ~ .40 4.2 Atividades enzimáticas : .42
4.3 Composição Química do bagaço original e pré-tratado 46 4.4 Morfologia das floras 56 4.5 FTIR- PCA 58 4.6 Polpação 63
4.6.1 Polpação kraft 63 4.6.2 Polpação Acetosolv 69
4.6.2.1 Propriedades óptico-mecânicas das folhas obtidas das polpas Acetosolv feitas em escala ampliada , 73
4. 7 FTIR das polpas kraft e Acetosolv 75
5. CONCLUSÕES 80
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 81
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LISTA DE TABELAS Páginas
Tabela 1. Atividades enzimáticas produzidas pelo P. tigrinus no bagaço de
cana-de-açúcar, determinadas após 1 O dias de incubação .43
Tabela 2.Atividades enzimáticas para as três cepas do Panus tigrinus
(FTPT-4741, FTPT-4742 e FTPT-4745) produzida durante a
degradação do bagaço de cana-de-açúcar nas bolsas, determinadas
antes e após diálise ." 45
Tabela 3. Comparação dos resultados encontrados na análise química do
bagaço in natura com os da literatura .47
Tabela 4. Composicão química do bagaço degradado e não degradado
(controle) em dez dias de incubação com agitação (série 1) 48
Tabela 5. Composição química do bagaço tratado e controle durante dez dias
sob agitação (série 2) 50
Tabela 6. Composicão química do bagaço tratado e controle durante dez dias
em regime estacionário (frascos), série 2 51
Tabela 7. Composição química do bagaço tratado e controle durante trinta dias
em bolsas em regime estacionário 52
Tabela 8. Perda de massa e de componentes do bagaço biodegradado durante
1 O dias por Panus tigrinus nos frascos sob agitação ( série 2) 53
Tabela 9. Perda de massa e de componentes do bagaço biodegradado durante
1 O dias por Panus tigrinus nos frascos em regime estacionário 54
vi
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Tabela 10. Perda de massa e de componentes do bagaço biodegradado
durante 30 dias por Panus tigrinus em bolsas 55
Tabela 11. Resultados da polpação kraft com o bagaço in natura em vários
tempos de reação 64
Tabela 12. Resultados da polpação kraft do bagaço tratado e controle utilizando
bolsas, em vários tempos de reação 66
Tabela 13. Resultados da polpação kraft obtidas a partir do bagaço tratado e
controle nos frascos Erlenmeyer com e sem agitação, com 20 min
de reação 68
Tabela 14. Resultados da polpação Acetosolv do bagaço de cana-de-açúcar
in natura degradado pelas três cepas do Panus tigrinus
(FTPT-4741, FTPT-4742 e FTPT-4745) e do controle nos sistemas
com agitação, estacionário e bolsas 70
Tabela 15. Resultados da polpação Acetosolv com a ampliação de escala para
o bagaço de cana-de-açúcar in natura., controle e inoculado nas
bolsas pelas três cepas do Panus tigrinus (FTPT-4741, FTPT-4742
e FTPT-4745) 72
Tabela 16. Propriedades óptico-mecânicas das folhas obtidas das polpas
Acetosolv 7 4
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LISTA DE FIGURAS Páginas
Figura 1- Estrutura de um fragmento de celulose de madeira 1
Figura 2- Modelo de uma estrutura de lignina de faia (Fagus sylvatica) proposta
por Nimz (1974) 3
Figura 3- Estrututa da parede celular vegetal em célula do tipo traqueídeos (Ft).
A- Componente da parede celular, P1: parede primária; P2: parede
8- secundária e as camadas S1, S2 e S3, ML: lamela média. 8
Disposição dos componentes químicos· da parede celular, Cm:
microfibrilas de celulose, Hc: hemicelulose (polioses), MLHc: matriz de
lignina e polioses. Os elementos fibrilares das microfibrilas estão
formadas de celulose que apresentam regiões cristalinas: ZC e
amorfas: ZA. Adaptado de Cowling e Kirk, (1976) e Goring, (1975) ..... 6
Figura 4- Representação de uma reação típica catalisada por lacase
R1 = cadeia propànica R2 e R3 = H ou OCH3 15
Figura 5- Ciclo Catalítico da Enzima Lignina Peroxidase. A• substrato na
forma radicalar; AH representa um substrato aromático; o qual age
como doador de elétrons para o grupamento heme; O(P.+) enzima
com átomo de oxigênio na forma de radical cátion 16
Figura 6- Ciclo Catalítico da Enzima Manganês-Peroxidase. AH substrato
doador de elétrons; A• radical do substrato; O(P.+) enzima com
átomo de oxigênio na forma de radical cátion 17
Figura 7- (A) enzimas xilanolíticas envolvidas na degradação da xilana.
(8) Hidrólise de xilooligossacarídeos pela f3-xilosidase. Ac: grupo
acetil; a-4-0-Me-GlcA: Ácido a-4-0 metil glucurônico e a-araf:
arabinofuranose 19
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Figura 8- Fluxograma de todo procedimento experimental (série 1 ) 23
Figura 9- Fluxograma de todo procedimento experimental (série 2) 24
Figura1 O- Cultivo de Panus tigrinus no bagaço de cana-de-açúcar em
Erlenmeyer sob agitação após 1 O dias de tratamento 40
Figura 11- Cultivo do Panus tigrinus no bagaço de cana-de-açúcar em bolsas
plásticas após 30 dias de tratamento .41
Figura 12- MEV do bagaço de cana-de-acúcar, após 1 O dias de tratamento com
Panus tigrinus sob agitação (série 1 ). (a) controle, (b) P. tigrinus
FTPT-4741, (c) P. tigrinus FTPT-4742, (d) P. tigrinus FTPT-4745 (1
mm= 3,6 um). 57
Figura 13- Espectros FTIR das amostras do bagaço degradado e não
degradado (controle) 58
Figura 14- Correlação entre os scores de CP1 e CP2 dos espectros FTIR das
amostras de bagaço de cana-de-açúcar degradado pelas diferentes
cepas de P. tigrinus e controle sob condições agitadas ( série 1)
durante 1 O dias 60
Figura 15- Correlação entre os scores de CP1 e CP2 dos espectros FTIR das
amostras de bagaço de cana-de-açúcar degradado pelas diferentes
cepas de P. tigrinus e controle sob condições agitadas ( série 2)
durante 1 O dias 60
Figura 16- Correlação entre os scores de CP1 e CP2 dos espectros FTIR das
amostras de bagaço de cana-de-açúcar degradado pelas diferentes
cepas de P. tigrinus e controle em regime estacionário ( série 2)
durante 1 O dias , 61
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Figura 17- Correlação entre os scores de CP1 e CP2 dos espectros FTIR das
amostras de bagaço de cana-de-açúcar degradado pelas diferentes
cepas de P. tigrinus e controle em regime estacionário em bolsas
durante 30 dias 62
Figura 18- Gráfico dos resultados da polpação kraft do bagaço in natura,
obtidos da tabela 11 [rendimento (r), número kappa (k), lignina
residual (Ir), viscosidade(v)] 64
Figura 19- Correlação entre os scores de CP1 e CP2 dos espectros FTIR das
polpas Acetosolv obtidas a partir das amostras de bagaço de
cana- de-açúcar degradado e não degradado para os três sistemas .. 75
Figura 20- Correlação entre os scores de CP1 e CP2 dos espectros FTIR das
amostras de polpas kraft obtidas a partir do bagaço de cana-de-
açúcar degradado e não degradado para os três sistemas com 20
min de reação 77
Figura 21- Loadings CP1 e CP2 referente a região 1400 a 1800 cml.a)
Gráficos dos loadings dos dois primeiros componentes principais das
amostras kraft. b) Gráficos dos loadings dos dois primeiros
componentes principais das amostras Acetosolv 79
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RESUMO
Avaliação de um pré-tratamento biológico com cepas de Panus tigrinus no bagaço de cana-de-açúcar que antecede a polpação química. Sirlene M. Costa. Dissertação de Mestrado. Programa de Pós-graduação em Biotecnologia Industrial, Departamento de Biotecnologia, Faculdade de Engenharia Química de Lorena. Orientador: Dr. Adilson Roberto Gonçalves (departamento de Biotecnologia, FAENQUIL, CP 116, 12600-000, Lorena, SP, Brasil). Banca examinadora: Ora. Elisa Esposito e Ora. Angela Machuca Herrera, Setembro de 1999.
Foi realizado um pré-tratamento do bagaço de cana com três cepas do fungo de decomposição branca Panus tigrinus (FTPT-4741, FTPT-4742, FTPT- 4745). A fermentação semi-sólida foi realizada a 28ºC, sem adição de fonte de carbono, em frascos Erlenmeyer com e sem agitação por 1 O dias, utilizando-se 6 g de bagaço, e em bolsas plásticas por 30 dias, utilizando 100 g de bagaço. A ação fúngica foi investigada por medidas de atividade enzimática, análise química, perdas de componentes, microscopia eletrônica de varredura e espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR). Após a fermentação, o extrato líquido foi filtrado em membrana e foram medidas as atividades enzimáticas de lignina peroxidase (LiP}, manganês-peroxidase (MnP), lacase (Lac) e xilanase (Xyl). Para a fermentação conduzida em bolsas foram feitas medidas de atividade enzimática com os extratos com 1 O e 30 dias antes e após dialise. Foram realizadas palpações kraft e Acetosolv com o bagaço in natura, biodegradado e com os controles nos três sistemas. Das polpas kraft e Acetosolv foram determinados o rendimento, número kappa e a viscosidade e obtidos espectros por FTI R. As propriedades óptico-mecânicas, índice de tração, rasgo e estouro, comprimento de auto-ruptura e alvura foram determinadas para as polpas Acetosolv. O uso de bolsas plásticas para inoculação do bagaço com Panus tigrinus aumentou a atividade para a MnP e Xyl. A LiP não foi encontrada em nenhum dos três sistemas. A análise por microscopia eletrônica mostrou um crescimento satisfatório para as três cepas, sendo que a cepa FTPT-4745 ocasionou maior rupturanas fibras. Os espectros de FTIR foram obtidos diretamente das amostras de bagaço e tratados por PCA (Análise por Componentes Principais). Uma clara separação foi observada entre a cepa FTPT-4742 e o controle. A análise química foi realizada e foi calculada a seletividade, sendo que a cepa FJPT.,.47: 45 foi a mais seletiva para degradar lignina. Os rendimentos para as polpas kraft foram baixos: de 20 a 45% para as bolsas e de 12 a 38% para os frascos. O valor de número kappa foi de 1 a 18 e os valores de viscosidade variaram de 2,3 a 6,8 cP. Para as polpas Acetosolv o rendimento foi na faixa de 43,5 a66~º2%,-· número kappa de 16,8 a 44,6 e viscosidade de 4 a 13 cf=> .. As propriedades óptico-mecânicas das polpas Acetosolv foram muito semelhantes entre as diferentes cepas. A cepa FTPT-4745 foi a que menos sobreu infuência do sistema utilizado. Os resultados mostraram que o Panus tigrinus é adequado para o pré-tratamento do bagaço de cana e que as três cepas são muito semelhantes entre si. O uso de bolsas plásticas aumentou as atividades MnP e Xyl ao mesmo tempo que representa numa vantagem e/ou facilidade numa eventual aplicação industrial em larga escala.
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ABSTRACT
Evaluation of a biological pre-tretament with Panus tigrinus strains on Surgacane bagasse applied before chemical pulping. Sirlene M. Costa. Dissertação de Mestrado. Programa de Pós-graduação em Biotecnologia
. Industrial, Departamento de Biotecnologia, Faculdade de Engenharia Química de Lorena. Orientador: Dr. Adilson Roberto Gonçalves ( departamento de Biotecnologia, FAENQUIL, CP 116, 12600-000, Lorena, SP, Brasil). Banca examinadora: Ora. Elisa Esposito e Ora. Angela Machuca Herrera, Setembro de 1999.
Biological pre-treatment of sugarcane bagasse with three strains of the white-rot fungus Panus tigrinus (FTPT-4741, FTPT-4742 and FTPT-4745) was performed. The semi-solid fermentation was carried out at 28°C with no additional carbon source in Erlenmeyer flasks with and without shaking for 1 O days (using 6 g of bagasse) or in plastic bags for 30 days (using 100 g of bagasse). The action of P. tigrinus was evaluated by enzymatic activities, chemical analysis and component lasses, scanning electronic microscopy (SEM) and Fourier-transformed infrared spectroscopy (FTIR) of the decayed and non-decayed (contrai) bagasse samples. After fermentation the liquid extract was filtered in membrane and measured the enzymatic activity, before and after dialysis, of lignin-peroxidase (LiP), manganese-peroxidase (MnP), laccase (Lac) an the hydrolytic enzyme xylanase (Xyl). Kraft and Acetosolv pulping experiments were carried out using in natura bagasse, decayed and contrai samples. Pulp yields, kappa number and viscosity of ali pulps were determined and FTIR spectra from the samples were recorded. Tear, burst and tensile indices and brightness were determined for Acetosolv pulps. The growth of Panus tigrinus strains in plastic bags increased the MnP and Xyl activities. LiP was not detected in the three systems (shaked and non-shaked flasks and plastic bags ). SEM analysis showed a satisfactory growth of the three strains over the bagasse fibers and the FTPT-47 45 was most effective with rupture of the fibers. FTIR spectra was reduced to their Principal Components anda clear separation between FTPT-47 42 and the contrai was observed. The selectivity was calculated from the chemical analysis data of the decayed and contrai bagasse samples. FTPT -47 45 strain was more selective to decay lignin, in the three systems utilized. Yields of kraft pulping were low, ranging from 20 to 45% for the plastic bags samples and from 12 to 38% for the flasks samples. Kappa numbers were 1-18 and viscosity varied from 2.3 to 6.8 cP. For Acetosolv pulps these results were: pulp yield 43.5-66.2%, kappa number 16.8-44.6 and viscosity 4-13 cP. Mechanical properties and brightness of the Acetosolv pulps showed no difference between the samples. The results show that the three strains of P. tigrinus are very similar and the action of FTPT-4 7 45 strain was not modified within the different systems. Thpp use of plastic bags to grow P. tigrinus strains increases the MnP and Xyl activities at sarne time that represents an advantage/easiness in the industrial process. Enzymatic activities related to chemical composition after action of P. tigrinus shows the efficiency of this fungus as a pre-treatment of sugarcane bagasse.
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LISTA DE ABREVIAÇÕES, ACRÔNIMOS E SÍMBOLOS UTILIZADOS
AA ABTS AE ASTM AT CAA ·cAE CAR CLAE COPERSUCAR Cv DNS FTIR
FTPT ISO Lac LiP LR K MEV MnP PCA TAPPI uv V Xyl
: Álcali ativo : 2,2 azino-(3 etil benzenotiazolina-6-sulfonato) : Álcali efetivo : Americam Standard T est Methods : Álcali total titulável : Carga de álcali ativo : Carga de álcali efetivo : Comprimento de auto-ruptura : Cromatografia líquida de alta eficiência : Cooperativa de Produtores de Açúcar e Álcool : Constante do viscosímetro · : Ácido 3,5-dinitrossalicílico : Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier
: Fundação Tropical de Pesquisa e Tecnologia : lnternational Standard Office : Lacase : Lignina peroxidase : Lignina residual : Número kappa : Microscopia eletrônica de varredura : Manganês-peroxidase : Análise por componentes principais : Technical Association of the Pulp and Paper lndustry : Ultravioleta : Viscosidade : Xilanase
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1. INTRODUÇÃO 1.1 Composição química
Atualmente existe um grande interesse da indústria e da sociedade em
geral em relação ao uso de recursos . renováveis, principalmente para a
obtenção de combustíveis e de produtos químicos de base, incluindo-se aí a
polpa celulósica. Desta forma, o uso da biomassa vegetal (materiais
lignocelulósicos) é estimulado. Juntamente com o aumento do interesse na
utilização completa e racional de todos os constituintes dos materiais
lignocelulósicos, principalmente daqueles obtidos como resíduos.
O bagaço de cana é um desses resíduos agrícolas abundante em várias
regiões. do Brasil como por exemplo nos estados· de São Paulo, Pernambuco,
Rio de Janeiro, Alagoas, Minas Gerais e Paraíba ( Orlando Filho e Zambello, .
1983).
Os materiais lignocelulósicos são constituídos por três principais
componentes macromoleculares: celulose, polioses e lignina.
Celulose: é um polímero linear (parte amorfo e parte cristalino) formado
por moléculas de anidro-glicose unidas através de ligações ~-1,4 glicosídicas,
de fórmula geral (CsH100s). A celulose é composta unicamente por unidades
moméricas de celobiose que se repetem apresentando sempre o oxigênio que
liga os anéis glicosídicos na posição equatorial (Ferraz, 1999), conforme
mostrado na figura 1 .
me ·Aff ~e O #?'OH 'o o o/ o o/ °'20! o K) . °'20! o Figura 1. Estrutura de um fragmento de celulose de madeira.
No bagaço de cana, a celulose é intimamente ligada com ligninas,
pentasanas, gomas, gordura, material colorido e taminos. As diferenças nas
propriedades da celulose são devidas basicamente aos diferentes graus de
polimerização. A celulose de bagaço é um polímero com cadeias com cerca de
2000 a 3000 unidades de glicose (Paturau, 1969).
1
-
Polioses: (ou hemiceluloses) são compostas pelos açúcares glicose,
manose e galactose (hexoses) e xilose e arabinose (pentases), podendo ainda
apresentar quantidades variáveis de ácidos urônicos e desoxiexoses em alguns
tipos de vegetais. As polioses apresentam-se na forma de polímeros
ramificados de menor massa molar que a celulose e podem ser homopolímeros
(exemplo: xilana, formado por xilose) ou heteropolímeros (exemplo:
glicomanana formado por glicose e manose ). O teor de polioses em diferentes
tipos de vegetal é bastante variável, com um valor médio de 20% (Fengel e
Wegener, 1989).
As pentasanas de bagaço de cana submetidas a hidrólise resultam em
xilose, arabinose e ácido urânico. Com a ação de HCI fervente, as pentasanas
resultam em furfural (Paturau, 1969).
Lignina: depois da celulose, a lignina é o composto orgânico mais
abundante dentre os materiais lignocelulósicos. Ela é composta basicamente
de unidades fenilpropano formando uma macromolécula tridimensional e
amorfa, representando cerca de 20 a 30% do total da madeira. O acoplamento
das unidades fenilpropano não ocorre de forma regular e repetitiva, o que é
atribuído ao mecanismo da biossíntese da lignina, que se processa via
radicalar a partir da reação de três diferentes álcoois cinamílicos precursores.
Os diferentes tipos de acoplamentos entre os precursores dão origem a vários
tipos de ligações entre as unidades fenilpropano. A mais abundantes são: p-0-4
e p-0-4, P-1 e p-5, 5-5 e p-p. A figura 2 mostra um modelo de estrutura de lignina. A lignina possui uma função estrutural no complexo celular da parede
de plantas superiores, agindo como uma cola que confere coesão ao conjunto
de células. A quantidade de lignina varia entre as diferentes espécies de
plantas superiores e também entre plantas da mesma espécie (Fengel e
Wegener, 1989). A lignina de bagaço de cana é do tipo HGS, típica de
gramíneas, segundo a classificação de Faix (1991 ).
2
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Figura 2. Modelo de uma estrutura de lignina de faia (Fagus sy/vatica) proposta
por Nimz (1974)
1.2 Bagaço de cana-de-açúcar A cana-de-açúcar, · uma gramínea perene . pertencente ao gênero
Saccharum, é originária da Índia e, com o decorrer do tempo, sua cultura
expandiu-se por várias regiões do mundo, e foi introduzida no Brasil logo após
seu descobrimento (Paiva, 1980).
A cana-de-açúcar (Saccharum officinarum) cresce na maioria dos países
tropicais e subtropicais e seu uso principal é na obtenção de açúcar e álcool.
Após moagem, o principal subproduto é o bagaço. Em muitas áreas do mundo
tem aumentado o valor econômico do bagaço, notadamente na produção de
polpa celulósica, papel e papelão. O bagaço parece satisfazer também os
requerimentos necessários para a obtenção de papel de impressão já que o
material cru é até melhor que outras fibras (Atchison, 1993).
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As características, composição e disponibilidade do bagaço de cana têm
impulsionado diferentes grupos de pesquisas a desenvolver tecnologias
alternativas que viabilizem seu aproveitamento. A composição típica do bagaço
de cana in natura, determinada por um trabalho realizado na África do Sul é a
seguinte: celulose 45,3%, pentasanas 24, 1 %, lignina 22, 1 % e cinzas 1,6%
(Paturau, 1969). Como comparação a composição determinada no nosso
laboratório é a seguinte: glucana 43%, xilana 25%, grupos acetil 2%, lignina
Klason 20%, lignina solúvel em H2S04 1 %, extrativos 8%, cinzas totais 1 %
(Urbano e Gonçalves, 1996).
Os custos dos processos de colheita e lavagem do bagaço já são
incluídos ao processo de extração do açúcar, tornando assim as condições
econômicas excelentes para o processamento do bagaço como polpa moída.
As fibras do bagaço são finas, flexíveis e fortes e, portanto, úteis para a
manufatura do papel; no entanto, cerca de 30% da massa do bagaço consiste
de medula e células de parênquimas e cerca de 5% de material epidérmico
denso. Nenhum desses componentes é fibroso in natura e, se levado à
polpação, têm efeito negativo na qualidade do papel. Aproximadamente 50%
da massa do caule consiste de alta quantidade de feixe de fibras concentradas,
uma estrutura compacta que protege os reservatórios de açúcar. As fibras do
anel são camadas mais largas do que os elementos fibrosos no interior do
caule e mais resistentes a ação química, em comparação com a medula interior
da fibra; 15% da massa do caule consiste de feixe de fibras curtas de baixa
resistência e células de vasos.
As características dimensionais das fibras do bagaço são similares às de
madeiras de fibras curtas (folhosas ), porém são mais curtas do que madeiras
de fibras longas (coníferas). As características químicas do bagaço variam de
um país para o outro dependendo do solo e duração da estação de
crescimento (Atchison, 1993).
O Brasil possui uma vasta área de plantação de cana de açúcar e os
produtos principais são açúcar e etanol usado como combustível. A produção
de cana-de-açúcar foi relatada como sendo de 287x106 ton em 1998
(Matioli et ai., 1998) e, segundo cálculos de Lora et ai. (1997), a quantidade de
bagaço produzida é cerca de 15 % do total de cana colhida. Assim, o bagaço é
4
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produzido em quantidades acima de 40x106 ton/ano, mas a maior parte é
queimada para obtenção de energia para as destilarias de álcool (Armas e
Bianchi, 1990). No entanto, calcula-se que há ainda cerca de 1x106 ton/ano
de excesso (2,5% do total de bagaço) que causa sérios problemas de
estocagem e impacto ao meio ambiente e que pode ser aproveitado para fins
mais nobres. Esses valores podem ser ainda maiores como mostram os dados
da Copersucar: além do bagaço consumido nas próprias usinas de açúcar e
destilarias de álcool com fins energéticos para geração de vapor e energia
elétrica, ainda há um excedente médio de bagaço de 7 % em relação à
produção total do subproduto (Fornai, 1991 ). A possibilidade do uso da polpa
de bagaço para a produção de papel de jornal vem sendo estudada desde
1950 (Johnsrud et ai., 1987), mas muitos projetos fracassaram, mostrando que
o bagaço não é uma matéria-prima de fácil uso, em função do baixo
rendimento e da qualidade da polpa.
1.3 Estrutura e Ultraestrutura da parede da célula vegetal
Estruturalmente, a parede celular do vegetal é composta pela parede
primária e secundária e a lamela média (Essau, 1984). A parede primária
representa 15% do volume total da parede celular. As microfibrilas de celulose
são o principal componente da parede primária e estão organizadas em
lâminas formando uma armação cristalina que rodeia a célula (figura 38)
(Cowling e Kirk, 1976; Kollman e Côte, 1984).
5
-
e
MLHc
Figura 3. Estrututa da parede celular vegetal em célula do tipo traqueídeos (Ft).
A- Componente da parede celular, P1: parede prlmárla; P2: parede secundária
e as camadas 81, 82 e 83, ML: lamela média. 8- Disposição dos
componentes químicos da parede celular, Cm: microfibrilas de celulose, Hc:
hemicelulose (polioses), MLHc: matriz de lignina e polioses. Os elementos
fibrilares das microfibrilas estão formadas de celulose que apresentam regiões
cristalinas: ZC e amorfas: ZA. Adaptado de Cowling e Kirk, (1976) e Goring,
(1977).
As xiloglicanas formam parte da parede primária na mesma proporção que
a celulose. A parede secundária é o componente espesso formado por 60% de
celulose e 27% do seu volume é de lignina (Kollman e Côte, 1984);
ultraestruturalmente ela é composta de três camadas 81, 82 e 83 com
dilerentes orientação e espessura das microfibrilas de celulose (figura 3 8). A
82 é a camada de maior espessura, concentração e grau de polimerização da
celulose na parede celular ( Fujita e Harda, 1991, Saka, 1991 ).
A lamela média é uma camada fina que une as células vizinhas entre si,
composta por 60% de lignina, 14% de celulose, e taninos fortemente unidos a
proteínas estruturais (figura 3 A) (Fengel e Wegener, 1989; Kollman e Côte,
1984). 6
-
Em geral, a porcentagem de lignina na parede celular reduz-se
gradualmente em direção ao lúmen (Speranza, 1998).
1.4 Processos de separação dos constituintes do bagaço
Para a utilização dos diferentes componentes dos materiais
lignocelulósicos, uma separação seletiva é requerida. Isso implica na ruptura
do complexo lignina-carboidrato e na remoção de cada fração por técnicas de
pré-tratamento e deslignificação.
Os processos de separação dos componentes de materiais
lignocelulósicos podem ser térmicos, químicos, físicos, biológicos ou uma
combinação de todos esses, o que dependerá do grau de separação requerido .
e do fim proposto (Clark et ai., 1989; Cápek-Mênard et ai., 1992; Kokta e
Ahmed, 1992; Heitner et ai., 1993; Ferraz et ai., 1994, Silva, 1995; Reni e Silva,
1999 a e b; Maciel e Silva, 1999; Gravitis et ai, 1999; Consentino e Silva, 1999).
A separação química é feita em larga escala através da polpação. A
celulose e parte das polioses constituem o produto principal (polpa) sendo a
lignina um subproduto. A produção em larga escala de lignina é restrita à
indústria de polpa. Várias possibilidades de uso têm sido propostas para a
lignina, tais como a obtenção de fenóis, surfactantes e estabilizantes para
borracha (Chum eta/.,1985), quelantes (Oviedo, 1998, Gonçalves et ai., 1999)
e como matriz polimérica, tanto na forma in natura como em formas
modificadas, para obtenção de sistemas de liberação controlada de defensivos
agrícolas, como por exemplo herbicidas e pesticidas (Silva e Wilkins, 1992,
Ferraz et ai. 1997).
1.4.1 Processo de polpação Kraft O processo sulfato ou kraft teve grande desenvolvimento a partir de
1940 e hoje domina totalmente os processos de polpação. A principal
vantagem desse processo é a possibilidade de um sistema de recuperação dos
produtos químicos utilizados. Outro fator favorável é que o processo sulfato
pode ser utilizado tanto para madeiras de fibras longas (coníferas) como para
madeiras de fibras curtas (folhosas) e plantas anuais como bagaço de cana e
7
-
bambu. Os ciclos de cozimentos são mais curtos que os dos processos sulfito
ácidos e a pasta obtida pode ser branqueada a altos níveis de alvura. O
processo sulfato também apresenta vantagens como a produção de pastas de
alta resistência e a produção de valiosos subprodutos, como resina da polpa e
terebentina, no caso da utilização de madeiras resinosas. O processo também
apresenta algumas desvantagens como alto custo de investimento na
construção da fábrica, problemas de odor dos gases produzidos, baixa alvura
da polpa não-branqueada quando comparada com polpas sulfito, baixo
rendimento de polpação e alto custo de branqueamento (Assumpção et ai.,
1988; Biermann, 1993). A principal crítica quanto a esse processo está
relacionado com a contaminação do meio ambiente (Mendonça, 1997). O
processo sulfato é denominado também processo' kraft, devido às excelentes
características de resistência mecânica da celulose obtida (kraft provém do
alemão e significa "forte"). O kraft é um processo alcalino que tem como
agentes deslignificantes o hidróxido de sódio (NaOH) e o sulfeto de sódio
(Na2S), sendo que a adição deste último, produz íons hidrogenossulfeto (HS-)
que aceleram a remoção da lignina (aumento na velocidade de polpação)
resultando em uma polpa de melhor qualidade. Outros sais de sódio também
são encontrados no licor de polpação em menor quantidade, como carbonato
de sódio, tiossulfato de sódio, sulfito de sódio e silicato de sódio. Pequenas
quantidades de íons polissulfeto também estão presentes quando o enxofre
elementar é adicionado ao licor branco para manter a sulfidez alta (Assumpção
et ai., 1988; Biermann, 1993; Mimms et ai., 1993).
No processo kraft a deslignificação ocorre em 3 etapas bem definidas:
inicial, principal e residual (MacDonald e Franklin, 1969; Biermann, 1993;
Mimms et ai., 1993). Na etapa inicial a solubilização de lignina é pequena, da
ordem de 15 a 25% do total, dependendo da espécie de madeira e das
condições de cozimento. Nessa etapa, parte dos carboidratos é dissolvida e
cerca da metade da carga de álcali efetivo é consumida, neutralizando os
ácidos formados na dissolução de extrativos e na degradação de carboidratos.
Na etapa principal, ocorre a remoção da maior parte da lignina, havendo uma
ligeira diminuição da quantidade de carboidratos e da concentração de álcali no
licor. Na etapa residual, a quantidade de carboidratos decresce
8
- ·-
-
significativamente, acompanhada por um aumento no consumo de álcali,
enquanto a velocidade de deslignificação diminui. Portanto, um cozimento
alcalino ideal não deve atingir o estágio de deslignificação residual, pois
haveria prejuízo quanto ao rendimento. Com coníferas, a etapa final inicia-se
geralmente com teores de lignina residual entre 2,5 e 3%. Na prática industrial
para a produção de polpas branqueáveis de madeira moles (coníferas),
evita-se atingir teores de lignina inferiores a 4 ou 5% ( 45 a 50% de rendimento)
correspondentes a números kappa entre 26 e 33. A deslignificação de
madeiras duras (folhosas) é mais rápida que coníferas, e a etapa de
deslignificàção residual é atingida em níveis mais baixos de lignina, permitindo,
na maioria dos casos, cozimentos até teores de lignina de 2% sem efeitos
danosos ao rendimento da qualidade da polpa (Assurnpção et ai., 1988).
Na polpação kraft do bagaço de cana é prevista uma redução na
porcentagem de lignina de 20% a cerca de 3% no final do processo. Essa
lignina residual ou recalcitrante não é desejável pois escurece o papel e exige
um processo de branqueamento mais drástico, com o uso de oxidantes fortes
(Cl2, CI02, 02, 03, H202, etc). A lignina residual em polpa kraft não branqueada
é altamente modificada por reações de condensação alcalina. As polpas
branqueadas são obtidas removendo-se a lignina residual por uma série de
tratamentos baseados principalmente em compostos de cloro e os efluentes
desses processos de branqueamento contêm numerosas substâncias
orgânicas cloradas que têm mostrado uma atividade mutagênica (Fujita et ai.,
1993).
1.4.1.1 Terminologias empregadas no processo de polpação kraft
Na polpação alcalina, segundo a norma TAPPI, empregam-se as
definições relacionadas a seguir. De um modo geral, na América do Norte
(Estados Unidos e Canadá), os compostos são expressos em base de Na20
equivalente, enquanto que na Europa, principalmente países escandinavos, os
compostos são reportados em base da quantidade de NaOH equivalente. No
Brasil o padrão empregado varia de uma fábrica para outra, podendo ser
empregada tanto uma relação quanto outra (Assumpção et ai., 1988).
9
-
Álcali total titulável (AT): soma de todas as bases no licor branco que podem
ser tituladas com ácido forte.
Álcali ativo (AA): soma dos ingredientes ativos no licor de polpação kraft.
AA = NaOH + Na2S
Álcali efetivo (AE): soma dos ingredientes que produzem OH nas condições
de polpação.
AE = NaOH + % Na2S
Freqüentemente têm-se AA e AE e para calcular as concentrações individuais
usa-se a relação:
Na2S = 2(AA-AE)
sulfidez: a razão ( em % ) entre o teor de Na2S e o teor de álcali ativo.
SULFIDEZ = Na2S X100% NaOH+Na2S
Causticidade: a razão (em%) entre o teor de NaOH e o teor de álcali ativo.
CAUSTICIDADE= NaOH X100% NaOH+Na2S
Sulfidez + Causticidade = 100%.
álcali ativo Carga de ãlcali ativo : CAA = X100% massa bagaço seco
10
-
álcali efetivo Carga de álcali efetivo: CAE = X100% massa bagaço seco
1.4.2 Polpação Acetosolv Como processo alternativo, os processos organosolv de polpação têm
recebido uma atenção significativa nos últimos 20 anos (Aziz e Sarkanen,
1989; Vázquez et ai., 1995; Benar, 1992; Curvelo e Pereira, 1995; Baeza
et a/.,1999 a e b). Dentro da polpação Organosolv destaca-se o processo
Acetosolv, que consiste no cozimento com ácido acético de madeiras e outros
materiais lignocelulósicos, cujas polpas são semelhantes às obtidas nos
processos convencionais (Benar e Schuchardt, 1991; Nimz e Casten, 1986). O
processo Acetosolv foi adaptado para a polpação do bagaço de cana com
excelentes resultados (Benar, 1992). O objetivo é utilizar solventes orgânicos
(ou misturas de solventes) como nucleófilo para a remoção da lignina. Uma
grande vantagem desse tipo de processo é a reutilização do solvente e a
obtenção da lignina com alta pureza que pode ser utilizada de forma mais
nobre.
O desenvolvimento de processos conhecidos como Organosolv pode em
grande parte colaborar com a diminuição do impacto ambiental causado por
processos de deslignificação convencionais, além de possibilitarem um uso
integral dos componentes dos materiais lignocelulósicos e apresentarem
vantagens quanto ao baixo capital de investimento e a possibilidade de
instalação de plantas para produção em pequena escala (Aziz e Sarkenen,
!989, Mac Donald e Franklin, 1969, Bendzala e Kokta, 1995).
1.4.3 Separação alternativa Uma possibilidade promissora na separação dos constituintes dos
materiais lignocelulósicos é a combinação de processos, por exemplo,
utilizando um pré-tratamento biológico seguido da polpação química. O
processo biológico é baseado na utilização de microrganismos (fungos e
bactérias) capazes de produzir enzimas envolvidas principalmente na
degradação da lignina. Tais microrganismos podem promover uma
deslignificação parcial dos materiais lignocelulósicos, com concomitante perda
11
-
de outras frações em diferentes intensidades, dependendo do microrganismo
empregado.
Os desafios principais a serem vencidos para utilização desse tipo de
processo são relacionados com o aumento .da seletividade dos microrganismos
para degradar preferencialmente ou exclusivamente a lignina, reduzindo, desta
forma, as perdas das frações desejáveis, com o aumento da atividade
ligninolítica.
1.5 Aplicação da biotecnologia na indústria de polpa Uma revisão recente da literatura mostra diversas possibilidades de
aplicação da biotecnologia na indústria de polpa e papel (Ferraz, 1999, Ferraz
et ai., 1998), desde o uso da engenharia genética para a obtenção de mudas de
árvores mais resistentes e de melhor produção, até o uso de microrganismos
degradadores de lignina na polpação e no branqueamento. As indústrias
continuam a desenvolver novas tecnologias de biobranqueamento com o intuito
de eliminar o uso do cloro, investigando processos de branqueamento da polpa
kraft com fungos de decomposição branca (Bourbonnais e Paice, 1996). As
propriedades ópticas e mecânicas e o rendimento das polpas biobranqueadas
são comparáveis com as polpas convencionalmente branqueadas, resultando
em um consumo significativamente menor de cloro (Fujita et ai., 1993).
Outra aplicação da biotecnologia na indústria papeleira envolve o uso de
celulases e hemicelulases na reciclagem de papel. As enzimas atuam
hidrolisando parcialmente a celulose e as polioses, o que facilita
consideravelmente a flotação dos pigmentos na etapa de destintamento. Uma
das mais antigas aplicações da biotecnologia na indústria papeleira é o
tratamento de efluentes em lagoas aeróbias (Ferraz, 1999). Esses efluentes
contêm principalmente produtos originados da lignina, o que levou a uma
grande expansão da pesquisa relacionada à biodegradação da lignina. O bagaço de cana-de-açúcar é um substrato complexo mas que também
pode ser eficientemente biodegradado, especialmente por fungos de
decomposicão branca (Zadrazil e Puniya, 1995, Esposito et ai., 1995,
Esposito et el., 1996, Gao et et., 1996, Breccia et el., 1997).
12
-
1.6 Fungos de decomposição branca
A maioria dos fungos de decomposição branca pertence à classe dos basidiomicetos. Os fungos dessa classe degradam a celulose, polioses e
lignina, sendo alguns deles degradadores seletivos de lignina.
Os fungos de decomposição branca têm a habilidade para deslignificar
os materiais lignocelulósicos ou degradar as ligações lignina-carboidrato; a
porcentagem de lignina removida neste pré-tratamento pode ser pequena ( da
ordem de 2% ), mas o resíduo é menos recalcitrante o que pode facilitar o
processo de branqueamento, sendo menos prejudicial ao meio ambiente.
Vários fungos têm sido propostos para a deslignificação de bagaço de
cana-de-açúcar. Breccia et ai. (1997) fizeram um estudo sistemático com 42
fungos de decomposição branca. Nesse trabalho foram determinadas as
composições do bagaço antes e após a degradação com 30 e 60 dias e foi
calculada a razão de lignina residual por celulose residual (RURC) para as
amostras do bagaço tratado e não tratado. Os fungos que apresentaram os
melhores resultados na degradação da lignina foram Phanerochaete
chrysosporium, Punctularia artropurpurascens, Trametes versicolor, Athelia sp,
Phebia sp, Ganoderma applanatum, Spongypellis pachyodon, Hyphodontia sp
e Panus tigrinus. Os fungos desse tipo de decomposição colonizam o material pelas vias
anatômicas de mais fácil acesso e menor resistência e movem-se por áreas
com nutrientes mais facilmente assimiláveis. As células parenquimais de raio
são normalmente as primeiras a serem atingidas e, a partir delas, as hifas
movimentam-se pelo lúmen em direção à parede celular e lamela média
(Fengel e Wegener, 1989; Blanchete et al.,1992; Messner e Srebotnik, 1994;
Shimada, 1996). A biodegradação da lignina por esse tipo de fungo tem início e
é mais intensiva na parede celular secundária das células e é progressiva até
atingir a lamela média. Os mecanismos de colonização e invasão do lúmen das
células da madeira são conhecidos devido aos estudos por microscopia
eletrônica (Daniel, 1994; Evans et ai., 1994; Blanchette et a/., 1997; Speranza,
1998).
13
-
Uma propriedade comum aos fungos de decomposição branca é a
capacidade de oxidação de compostos fenólicos e não-fenólicos relacionados
com a lignina, devido à atividade de suas enzimas ligninolíticas extracelulares (Blanchette, 1991; Blanchette et ai., 1997, Ortega et ai., 1993). A produção e as
características de enzimas ligninolíticas e. hemicelulolíticas têm sido bastante
estudadas nos útimos tempos (Prasad et ai., 1996 a e b; Pessoa et ai., 1997;
Abd EI-Nasser et el., 1997, Cazemier et ai., 1999; Bium et ai., 1999; Kang et ai.,
1999).
1. 7 Enzimas Ligninolíticas e Hidrolíticas Dentre o vasto arsenal de enzimas extracelulares degradadoras de
lignina, particularmente o grupo das fenoloxidasés é tido como o de maior
importância (Hatakka, 1994; Peláez et ai., 1995; Tuor et el., 1995; Pai
et ai., 1995). Fazem parte desse grupo as enzimas lignina peroxidase (LiP),
rnanqanês-peroxidase (MnP) e lacase (Lac) que estão diretamente envolvidas
na degradação da lignina. Dada sua baixa especificidade as enzimas oxidativas
como as peroxidases atuam sobre uma ampla gama de substratos de difícil
degradação.
A lacase (EC 1.10.3.2, benzenodiol: oxigênio oxi-redutase) representa
um grupo de enzimas encontradas principalmente em fungos e plantas
superiores, onde são abundantes. A maioria das diferentes lacases conhecidas
(provenientes de diferentes fontes) apresentam massa molar (MM) de 60 a
70 kDa, sendo conhecidas lacases no intervalo de 60 a 100 kDa (Thurston,
1994). Possuem uma estrutura de glicoproteína com conteúdo relativo de
carboidrato variando de 15 a 20 % (Thurston, 1994). Todas as lacases
conhecidas contêm cobre no seu sítio ativo, sendo em geral 4 átomos de cobre
por molécula, os quais apresentam número de oxidação +2. Tais átomos de
cobre estão diferentemente coordenados, podendo assim ser distinguidos três
tipos ou estados de coordenação denominados 1, li, Ili, sendo esse último constituído por um par de átomos de cobre (Messerschmidt e Hubert, 1990;
Reinhammar, 1984; Thurston, 1994).
A lacase é tipicamente uma oxidase que catalisa reações de oxidação, na ausência de H202, utilizando 02 como oxidante, o qual é reduzido a H20
14
-
num processo de oxidação envolvendo no total quatro elétrons (Kirk e Farrel,
1987; Thurston, 1994). Essa enzima não apresenta uma especificidade muito
estrita quanto à estrutura do substrato, podendo catalisar a oxidação de uma
grande variedade de estruturas aromáticas, especialmente estruturas fenólicas,
como mono-, dl-, poli- e metoxifenóis. Estudos mais recentes demonstraram
que a lacase também foi capaz de degradar estruturas não fenólicas na
presença de mediadores específicos (Bourbonnais e Paice, 1990; Johannes et
ai., 1996). O mecanismo de oxidação do substrato é pela retirada de um elétron
com formação inicial de um radical cátion, o qual, subseqüentemente, pode
reagir através de mecanismo não enzimático (figura 4) (Bourbonnais e Paice,
1990, Kersten et ai., 1990, Thurston, 1994, Tuor et ai., 1995).
Neste caso são freqüentes as reações de acoplamento radical-radical,
desproporcionamento, retirada de próton e ataque nucleofílico pela molécula de
H20, resultando em polimerização, clivagem de ligações tipo alquil-aril,
oxidação no carbono a e desmetoxilação das estruturas fenólicas (Hatakka,
1994; Kirk e Farrel, 1987).
R,
O, +46 == fü~R,-
OH
~. ~~rno
o
! R'
Reações. não.en~ticas* pollrrlenzaçao
R2 R., o.
> /~. À R2~R,
o
Figura 4- Representação de uma reação típica catalisada por lacase.
R1 = cadeia propânica, R2 e ~ = H ou OCH3
Diversos estudos com substâncias modelos de subestruturas de lignina
mostram que as lacases podem catalisar a clivagem de ligações tipo Ca-Cí3
das cadeias laterais. de estruturas ditnéricas tipo (3-1 e (3-0-4 15
-
(Kawai et ai., 1988), bem como catalisar a clivagem de anéis aromáticos de
estruturas como 4,6-di(tert-butil)guaiacol (Kawai et ai., 1988). Esses resultados
demonstraram que as lacases podem degradar e despolimerizar a lignina.
A lignina peroxidase (LiP) constitui um grupo de glicoproteínas contendo
um grupamento heme [Fe(lll)-protoporfirina IX] como grupo prostático por
molécula. Requer H202 para sua atividade catalítica e apresenta massa molar
em torno de 38-43 kDa (Kirk e Farrel, 1987; Kuwahara et ai., 1984; Tuor et ai., 1995).
Durante o ciclo catalítico, o ferro contido no grupamento heme da LiP
passa por etapas de reações de oxi-redução (figura 5). A oxidação do Fe(III) da
enzima nativa para Fe(IV) se dá através da ação do peróxido de hidrogênio,
formando o composto 1. A redução do composto I via transferência de um
elétron forma o composto li. O agente redutor pode ser álcool veratrílico ou
peróxido de hidrogênio. A redução via um elétron retorna a enzima a seu
estado nativo, completando o ciclo catalítico. Na ausência do substrato redutor,
o composto li é oxidado pelo peróxido de hidrogênio, formando o composto Ili
(uma forma de LiP com capacidade catalítica limitada), que com excesso de
peróxido de hidrogênio é rapidamente inativado (Cai e Tien, 1993; Schoemaker
et ai., 1994; Barr e Aust, 1994; De-Jong et ai., 1994 ).
H20 H202 ~ composto I
Fe~~~ ~ ~:: O(P~.)
AH FeIV =O A.•
comf:; (excesso) Fe III 02 .:!.
composto Ill
Figura 5- Ciclo Catalítico da Enzima Lignina Peroxidase. A• substrato· na
forma radicalar; AH representa um substrato aromático; o qual age como
doador de elétrons para o grupamento heme; O(P:) enzima com átomo de
oxigênio na forma de radical cátion.
16
-
A enzima lignina peroxidase catalisa reações de uma variedade de
compostos modelo de lignina não fenólicos (Kirk e Farrel, 1987; Buswell e
Odier, 1987; Gold et ai., 1989; Higuchi, 1990; Schoemaker, 1990; Valli e Gold,
1991; Valli et ai., 1992) bem como lignina sintética (Hammel e Moen 1991 ).
Essas reações incluem oxidações de álcool benzílico, clivagem de cadeia
lateral, reações de abertura do anel, desmetoxilações e desclorinação
oxidativa. Todas essas reações são relacionadas com mecanismo envolvendo
a retirada inicial de um elétron do núcleo aromático, formando um radical cátion
arila, e esse pode sofrer várias reações não enzimáticas, formando outros
produtos (Reneganathan et ai., 1985; Marquez et ai., 1988; Schoemaker,
1990).
A MnP (peroxidase-manganês dependente, EC.1.11.1. 7) é uma heme-
enzima e a maioria de suas propriedades estruturais são semelhantes às da
LiP. É uma glicoproteína de massa molar em torno de 45-47 kDa contendo
também um grupamento prostético tipo Fe(lll)-protoporfirina IX. A diferença é
que, além de H202, essa peroxidase requer Mn +2 como cofator e sua atividade
é potencializada ou estabilizada por um derivado de a.-acetoácido, como
lactato, malonato e outros (Mester et ai., 1995; Moilanen et ai., 1996; Perez e
Jeffries, 1992).
H20 }L(h .L composto l
Felll~ k, ~:::o(P+~AH A,~ Mnll FeIV -o Mnlll X.A.
) composto II
AH -~ H,O, (excesso)
t'-1-120 Fe III 02 s
composto III
Figura 6-. Ciclo Catalítico da Enzima Manganês-Peroxidase. AH substrato
doador de elétrons; A• radical do substrato; O(P.+) enzima com átomo de
oxigênio na forma de radical cátion. 17
-
Seu ciclo catalítico é semelhante ao da LiP (figura 6), com formação de
composto 1, li, Ili (Wariishi et ai., 1988). Porém nesse caso, ocorre a oxidação
de Mn(II) para Mn(III), que atua como espécie ativa nos processos de oxidação
catalisados por MnP (Kuwahara et ai., 1984). Devido a alta reatividade de
Mn(III), a disponibilidade para oxidar os substratos de MnP depende da
presença de ácidos orgânicos que atuam como quelantes de Mn(III), formando
um complexo mais estável de alto potencial de oxi-redução (Moilanen et ai.,
1996; Perez e Jeffries, 1992). Como consequência, o potencial de oxi-redução
do sistema oxidante é diferente do apresentado pela LiP, determinando
diferenças na especificidade entre as duas enzimas, com relação às estruturas
aromáticas dos substratos. Assim por exemplo, MnP oxida apenas estruturas
fenólicas, mas, por outro lado, a inativação de MnP por H202, via formação do
composto Ili, parece requerer concentrações mais altas de peróxido, indicando
uma maior estabilidade dessa enzima (Wariishi et ai., 1988). O fato de que
essa enzima oxida apenas estruturas fenólicas impõe uma limitação a sua
capacidade de degradar integralmente lígninas de alta massa molar (Kirk e
Farrel, 1987; Owens, 1991 ).
Devido a heterogeneidade das xilanas, sua hidrólise requer um conjunto
de isoenzimas para a sua degradação que pode ser visto na figura 7
(Coughnlan e Hazzewood, 1993, sunna e Antranikian 1997).
As endo-!3-1,4-D-xilanases são enzimas que atuam sobre a xilana
produzindo grandes quantidades de xilo-oligossacarídeos substituídos e não
substituídos de diversos tamanhos (figura 7). As exo-13-1,4-D-xilanases atuam
removendo somente unidades de xilose a partir das extremidades da cadeia de
xilana. As !3-xilosidase hidrolisam dissacarídeos como xilobiose e
xilo-olígossacarídeos maiores até xilose. Algumas xilanases produzidas pelo
fungo Penicillium janthinellum por exemplo apresentam massa molar de
20 kDa e 50 kDa ( Milagres e Lacis, 1991, Milagres et ai., 1993, Rodrigues,
1997).
18
-
o;-4-0-Me-GlcA
IACETIL(XILAN.\IES'IERASE I
-
que visam a produção e recuperação de enzima em larga escala são de
grande relevância (Milagres e Duran, 1992).
1.8 Utilização de PCA na seleção de cepas com capacidade ligninolítica e
hidrolítica
Em estudo recente, Gonçalves et ai. (1998) propuseram o uso da
espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) como
técnica auxiliar para seleção de cepas de Panus tigrinus que atuam no bagaço
de cana-de-açúcar, em conjunto com determinações das atividades
enzimáticas de MnP, t.ac e LiP e o monitoramento da ação fúngica sobre o
bagaço, utilizando microscopia eletrônica de varredura. A espectroscopia no
infravermelho é uma técnica muito utilizada na identificação de compostos
orgânicos (Silverstein et ai., 1979); a porção de mais utilidade para os químicos
orgânicos está situada entre 4000 e 666 cm" (2,5 a 15,0 µm), mas até
moléculas simples podem produzir espectros extremamente complexos. Os
espectros de compostos desconhecidos são comparados ao de uma amostra
conhecida, e a correlação pico a pico constitui boa· identidade, \Visto ser pouco l.-
provável que dois compostos diferentes tenham o mesmo espectro no
infravermelho, à exceção de pares enancioméricos. É a presença de bandas características de grupos que permite a obtenção, através de simples exame
do espectro e consulta a tabelas, de informações estruturais úteis.
Já no caso de moléculas mais complexas, como é o caso dos
constituintes dos materiais lignocelulósicos, a simples comparação de
espectros não resulta necessariamente em identificação. Isso mesmo quando
os espectros são obtidos com alta resolução, em equipamento interferométrico
e tratados com transformadas matemáticas (FTIR).
Os conjuntos de espectros FTIR de materiais lignocelulósicos são
melhor avaliadas pela Análise por Componentes Principais (PGA), cujo
fundamento é reduzir as várias informações contidas nos espectros
(absorbância X número de onda) em um número pequeno de vetores
(componentes principais) que expliquem a maioria dessas informações. Esse
tipo de análise foi empregada recentemente para a classificação de ligninas de
20
-
diferentes origens (Cotrim et ai., 1999) e no acompanhamento da
hidroximetilação de ligninas (Benar et ai., 1999).
Nesse estudo de seleção de cepas do Panus tigrinus (Gonçalves et ai.,
1996, Gonçalves et ai., 1998) foi também utilizada a análise química das
amostras de bagaço antes e após tratamento, bem como das polpas obtidas
dessas amostras. A análise química baseia-se na hidrólise das amostras e
quantificação dos componentes macromoleculares. A maior parte da lignina
não é hidrolisada e é quantificada por gravimetria. Na fração líquida
(hidrolisado) quantifica-se a lignina solúvel por espectroscopia na região de
UV-visível (Goldschimd, 1977) e os carboidratos derivados da celulose e
hemicelulose por cromatografia líquida de alta eficiência.
No estudo citado (Gonçalves et ai., 1998) foram utilizadas sete cepas de
P. tigrinus e selecionadas três (FTPT-4741, FTPT-4742 e FTPT-4745) como as
mais promissoras para a deslignificação do bagaço de cana como um
pré-tratamento para uma posterior polpação química.
2. OBJETIVOS O objetivo principal desse trabalho é a avaliação de um pré-tratamento
biológico do bagaço de cana-de-açúcar com o fungo ligninolítico Panus tigrinus,
que antecede a polpação convencional kraft e a polpação alternativa
Acetosolv.
Para atingir este objetivo foram propostas as seguintes etapas: - Avaliação do pré-tratamento fúngico em relação ao regime estacionário e
agitado.
- Estudo das atividades enzimáticas e sua correlação com a eficiência da
biodeslignificação do bagaço de cana por P. tigrinus.
- Estudo da polpação química do bagaço pré-tratado e determinação das
propriedades da polpa.
- Monitoramento da ação fúngica sobre as fibras do bagaço por microscopia
eletrônica de varredura e FTI R.
21
-
3. PARTE EXPERIMENTAL
3.1 Fungos: Foram utilizadas três cepas de Panus tigrinus FTPT -47 41,
FTPT-4742 e FTPT-4745 cedidas gentilmente. pela professora Mariela
Speranza (Faculdade de Ciências Biológicas, Universidade de La República-
Uruguai) e preservadas na Fundação Tropical de Pesquisa e Tecnologia André
Tosello (Campinas, SP, Brasil). Essas linhagens foram mantidas em ágar
extrato de malte 4% a 28ºC durante 5 dias. Elas foram selecionadas a partir de
resultados obtidos previamente ( Gonçalves et ai., 1998).
3.2 Bagaço de cana-de-açúcar: Foi utilizado o bagaço de cana-de-açúcar
desmedulado e previamente caracterizado, contendo 51 % de glucana, 23% de
polioses, 2% de grupos acetil, 21 % de lignina Klason, 1 % de lignina solúvel em
H2S04 e 3% de cinzas. O tamanho médio das partículas do bagaço utilizado
foi de 2, 1 cm de comprimento e O, 12 cm de largura.
3.3 Condições de cultura: As culturas de fermentação em meio semi-sólido
foram realizadas em duas séries.
Série 1: Nesta primeira série os experimentos foram realizados em triplicatas
utilizando-se Erlenmeyer de 250 ml sob agitação a 150 rpm por 1 O dias a
30ºC. O bagaço de cana-de-açúcar foi 'suplementado a uma concentração de
6% (m/v) somente com 1 ml de solução de sais [NaN03 (2 g/L), K2HP04
(1 g/L), MgS04 (0,5 g/L). KCI (0,5 g/L) , CaCb (0,3 g/L), CuS04.5H20 (O, 10
mg/L), FeS04.7H20 (0,20 mg/L), MnS04 (0,02 mg/L), z-ci, (O, 15 mg/L)] e 49 ml de água destilada. Nenhuma outra fonte adicional de carbono foi utilizada.
O meio foi esterilizado por autoclavagem a 121 ºC durante 20 min.
Série 2: As fermentações foram realizadas em duplicatas e conduzidas em
sistemas sob agitação e estacionário. Foram realizados experimentos sob
agitação constante utilizando-se 6 g de bagaço em frascos Erlenmeyer de 250
ml. Em sistema estacionário foram realizados experimentos utilizando-se 6 g
de bagaço em frascos Erlenmeyer de 250 ml e também experimentos
utilizando quantidades maiores de bagaço (100 g) em bolsas de polipropileno.
Nas bolsas foram adicionados 17 ml da solução de sais e 816 ml de água
destilada. A solução de sais adicionada aos experimentos da série 2 foi uma
22
-
solução com um número reduiid,b de sais (CaCb (0,3 g/L), (NH4)2HP04 (2g/L),
FeCI (0,2 mg/L), KH2P04, MgS04( 0,5 g/L). O bagaço nas bolsas foi incubado
por 30 dias. O meio foi esterilizado por autoclavagem durante 30 min a 121 ºC.
Nessa série 2 o bagaço de cana-de-açúcar foi suplementado a uma concentração de 5% (m/v).
O procedimento experimental do cultivo do Panus tígrínus no bagaço de
cana-de-açúcar e análise do bagaço biodegradado e do controle foi
esquematizado nas figuras 8 e 9.
r- 49 ml de água destilada f 1 ml de solução de sais (NaN03, MEIO DE CULTURA~ K2HP04, MgS04, KCI, CaCl2,
CuS04.5H20, FeS04.7H20, MnS04, ZnCl2)
,.~;: ~ ~~:- 6 g de bagaço
Autoclave por 20 min.121°C
+ 50 ml do caldoô
contendo as cepas . FTPT 4741 FTPT 4742 ..... FTPT 4745 - ...
...
INÓCULO
Bagaço pré-tratado
+ t gAnálise química FTIR MEV . Caldo filtrado Ri Atividade LJI enzimática Figura 8. Fluxograma de todo procedimento experimental (série 1 ).
23
-
49 mL H20 + 1 mL de solução
(CaCl2, (NH4)2HP04, FeCI, KH2P04, MgS04)
6 g de bagaço
Agitação (série 2)
Autoclave por 20 min, 121ºC
ontrole
10 dias
13 placas contendo fungo 1866 mL H20
+ + bagaço i
+ Caldo filtrado
Atividade Análise química enzimática FTIR
17mL de solução de sais+ 816 mL de H20
i 100 g de bagaço
Polpação Rendimento kraft Número Kappa
Viscosidade FTIR
Controle
30 dias
1
o Caldo filtrado
Atividade enzimática com 10 dias e com
30 dias (antes e após a diálise)
OBS: Para as bolsas a polpação Acetosolv foi realizada em escala ampliada e foi feita a medida das propriedades óptico-mecânicas
da polpa
Pigura 9~ Fluxograma de todo procedimento experimem~(§érie 2).
24
-
3.4 lnóculo: Para a primeira série de experimentos sob agitação, o inóculo foi
preparado retirando-se o micélio submerso . de duas placas contendo
Panus tigrinus, e triturando-o em 50 ml de água destilada esterilizada. Uma
alíquota de 50 ml desse caldo obtido foi adicionado aos frascos Erlenmeyer
contendo o bagaço de cana, que foram mantidos nas condições descritas no
item 3.3. Para os experimentos da série 2, 13 placas contendo
Panus tigrinus foram trituradas em 1866 ml de água destilada e esterilizada;
do caldo obtido foram adicionados 833 ml em cada bolsa e 50 ml em cada
Erlenmeyer. As bolsas e frascos Erlenmeyer foram mantidas nas condições
descritas no item 3.3. Para as duas séries, os bagaços autoclavados (item
3.3) nos frascos e bolsas sem inóculo serviram de controle do processo.
3.5 Avaliação das Atividades Enzimáticas: Após fermentação, o extrato líquido foi separado do bagaço, filtrado a vácuo em membrana Millipore
(OA7µm) para determinação das enzimas presentes, recuperando-se cerca de
50 ml de caldo nos frascos Erlenmeyer de 100 ml e cerca de 500 ml nas
bolsas de 1666 ml. O pH do extrato líquido foi ·medido em um potênciometro
Metrohm 632 pH Meter com eletrodo de vidro e foi cerca de 4,2. As atividades
da lignina peroxidase (LiP) (Tien e Kírk, 1984), manganês-peroxidase (MnP)
(Kuwahara et ai., 1984), lacase (Lac) (Szklarz et ai., 1989) e xilanase (Xyl)
(Bailey et ai., 1992) foram determinadas por métodos publicados. Foram
medidas as atividade enzimáticas dos extratos obtidos das duas séries após
1 O dias e para as bolsas, o sistema de fermentação foi mantido até 30 dias,
uma vez que o crescimento fúngico foi demorado. Com o extrato líquido das
bolsas após 30 dias de incubação foram feitas as medidas de atividades
enzimáticas antes e após diálise, nas condições descritas no item 3.6. Foram
medidas as atividades enzimáticas nos controles e descontados os valores.
25
-
3.5.1 Lacase (Lac): A atividade de lacase foi determinada segundo
metodologia descrita por- Szklarz e/ ai. (1989). A 600 µL do caldo enzimático
foram adicionados 300 µL de tampão citrato-fosfato 50 mM pH=5,0, 100 µL de
o-dianisidina 1 mM e a absorbância foi lida a 11,=460 nm (s=29400 M-1cm-1),
durante 1 O min em um espectrofotômetro UV/visível GBS-Cintra 20. Uma
unidade de atividade enzimática de Lac foi definida como a quantidade de
µmoles de o-dianisidina oxidado L-1 min".
3.5.2 Lignina peroxidase (LiP): Para determinação da enzima lignina
peroxidase foi utilizado o método modificado de Tien e Kirk (1984), baseado na
oxidação do álcool veratrílico a aldeído veratrílico na presença de peróxido de
hidrogênio. A reação foi acompanhada durante 5 min a 310 nm
(s=9300 M-1cm-1) em um espectrofotômetro UV/visível GBS-Cintra 20. A 250 µL
do caldo enzimático foram adicionados 125 µL de álcool veratrílico 4,0 mM,
50 µL de H202 0,4 mM, 375 µL de tampão tartarato de sódio 0,33 mM a pH=3,0
e 450 µL de água destilada. Uma unidade de atividade enzimática de LiP foi
definida como sendo a quantidade de enzima necessária para oxidar 1,0 µmal
de substrato L-1min-1.
3.5.3 Manganês-peroxidase (MnP): A atividade manganês-peroxidase foi
determinada pelo método de Kuwahara et ai. (1984) e baseia-se na oxidação
do vermelho de fenol em presença de Mn(II) e peróxido de hidrogênio. A
absorção foi medida a 610 nm (s= 4460 M-1cm"1) em um espectrofotômetro
UV/visível GBS-Cintra 20. A 500 µL do caldo filtrado foram adicionados 100 µL
de solução de vermelho de fenol O, 1 %, 100 µL de lactato de sódio 250 mM,
200 µL de albumina bovina 0,5%, 50 µL de sulfato de manganês(II) 2 mM,
50 µL de tampão succinato de sódio/ H202 20 mM a pH = 4,5. O volume final
foi 1 ml. A mistura de reação foi incubada por 5 min a 30ºC e a reação foi
interrompida pela adição de 40 µL de NaOH 2 N. Uma unidade de atividade
enzimática de MnP foi definida como a quantidade de enzima que oxida 1,0 µmal de vermelho de fenol L''rnin".
26
-
3.5.4 Xilanase: A atividade de xilanase extracelular foi determinada pela medida da quantidade de açúcares redutores liberados a partir de xilana, de
acordo com o método de Bailey et ai. (1992). Os açúcares redutores foram
dosados pelo método do ácido 3,5-dinitrossalicílico (DNS) (Miller, 1959). Uma
unidade de atividade enzimática foi definida como a quantidade de enzima
necessária para produzir 1 µmol de xilose por minuto a 50ºC. A solução de
xilana foi preparada a partir de 1 g de xilana ("Birchwood"- Sigma) adicionada
em 80 ml de tampão acetato de sódio 50 mM pH 5,5. A solução foi aquecida
sob agitação e o volume completado para 100 ml com o mesmo tampão.
Um volume de 900 µL de xilana 1 % foi colocado em tubos de ensaio que
foram incubados em banho termostatizado, à temperatura de 50°C por 5 min.
Em seguida, acrescentaram-se 100 µL das amostras contendo enzima. Após
5 min, adicionou-se 1,5 ml de DNS para dosagem dos açúcares liberados,
sendo a mistura aquecida em banho de água fervente por 5 min. A reação foi
interrompida em banho de água à temperatura ambiente e as leituras foram feitas a 540 nm em um espectrofotômetro Shimadzu modelo UV-150-02. As
leituras de cada amostra foram feitas utilizando-se tampão acetato de sódio
50 mM a pH 5,5 e DNS como referência.
Para detectar as unidades redutoras provenientes da hidrólise
enzimática da xilana, foram utilizados dois controles. O primeiro, denominado
controle do substrato, continha a xilana sem a ação da enzima. O segundo,
denominado controle da enzima, foi constituído de tampão acetato, meio
fermentado contendo a enzima e o DNS, para detectar a presença de açúcares
redutores do próprio meio fermentado. Das leituras obtidas com as amostras,
foram descontadas as absorbâncias verificadas nos controles ( enzima e
substrato). A curva padrão foi estabelecida a partir de xilose (Merck) nas
concentrações entre 2 e 1 O µmol/ml.
3.6 Diálise: 20 ml do extrato provenientes da fermentação em bolsas por 30 dias foram dialisados utilizando membrana celulósica de corte 12 kDa, com
diâmetro de 21 mm e capacidade de 11 O ml contra solução tampão de
acetato de sódio de concentração 50 mM pH= 5,5 durante 12 h a 4ºC.
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-
Dos extratos dialisados foram medidas as atividades enzimáticas pelos
métodos descritos no item 3.5.
3. 7 Análise química da composição do bagaço: A fração principal de lignina
foi determinada por gravimetria pelo método Klason (ASTM, 1956) após
hidrólise com H2S04 72%. O bagaço foi seco a 60ºC por 40 min e moído a
40 mesh (0,42 mm). Amostras de 1 g de bagaço foram secas, pesadas com
precisão de O, 1 mg e transferidas para béqueres de 100 ml e tratadas com
5 ml de H2S04 72 %, sobre vigorosa agitação, em banho termostatizado a
45 ± 0,5ºC por 7 min. As reações foram interrompidas com adição de 25 ml de água destilada. As amostras foram transferidas para frascos Erlenmeyer de
250 ml, elevando-se o volume de água a 137,5 ml.
Para a completa hidrólise dos oligômeros restantes, os frascos
Erlenmeyer foram fechados com papel alumínio e autoclavados por 30 min a
1,05 bar. Após a descompressão da autoclave, os frascos foram retirados e
resfriados à temperatura ambiente, sendo a mistura reacional filtrada e os hidrolisados transferidos e avolumados com água destilada em balões
volumétricos de 250 ml.
Os materiais retidos no papel de filtro previamente tarado (lignina
Klason) foram lavados com aproximadamente 900 ml de água destilada e
secos em estufa a 105±3ºC até massas constantes.
As quantidades de lignina solubilizadas em meio ácido foram
determinadas segundo a metodologia desenvolvida por Rocha et a~. (1993). Alíquotas de 5 ml de hidrolisado foram diluídas com água destilada em
balões de 100 ml, após alcalinização com NaOH 6,5 mo1L·1 até pH 12,5.
As frações de ligninas solúveis foram determinadas pela absorbância a
280 nm em um equipamento UN visível GBS-Cintra 20, usando como
referência NaOH 6,5 mo1L·1. A determinação da lignina solúvel foi calculada
pela equação 1 .
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-
C u9= [(0,04187 X A1ig2so - Apol 200) - 0,32790] X 10-3 (equação 1)
onde:
Cli9 ... concentração de lignina em g/L
Ali92so absorbância da solução de lignina, em 280 nm.
Apd2so c1s1 + c2s2 = absorbância, em 280 nm dos produtos de
decomposição dos açúcares (furfural e hidroximetilfurfural) cujas concentrações
(e, e c2) e absortividade (s1 e s2) foram determinadas previamente por
cromatografia líquida de alta eficiência e por UV (Rocha et ai., 1993)
As cinzas foram determinadas utilizando cerca de 1 g das amostras de
bagaço de cana ou 1 g de lignina. As amostras com umidade conhecida foram
pesadas com precisão de O, 1 mg em um cadinho de porcelana previamente
calcinado e tarado. Em seguida, o material foi calcinado inicialmente a 300ºC e
depois por mais de 2 h a 800ºC. Após a calcinação, o cadinho foi resfriado em
dessecador e o teor de cinzas calculado pela equação 2.
%czy= (M2 -M1) I M3x 100 (equação 2)
onde:
%czy ... porcentagem em massa de cinzas
M1 massa do cadinho calcinado vazio, em g
M2 massa do cadinho com cinzas, em g
M3 massa de bagaço ou lignina seca, em g
Para os experimentos do sistema sob agitação ( série 1 ) não foram
calculadas as porcentagens de cinzas do bagaço e somente para os sistemas
sob agitação (série 2), estacionária e em bolsas.
A celulose e as hemiceluloses foram determinadas por cromatografia
líquida de alta eficiência (CLAE) segundo metodologia de Rocha et ai. (1997).
Foi realizada a quantificação dos açúcares produzidos presentes nos
hidrolisados ácidos, que foram filtrados em Sep-Pak C18 (Waters), para a
remoção de partículas em suspensão e de compostos aromáticos e então,
injetados diretamente (alça de injeção de 20 µL) em uma coluna Aminex
HPX-87H (300 X 7,8 mm) de troca iônica, utilizando H2S04 0,005 M como fase
móvel com fluxo de 0,6 mtrnin", a 45 ºC e detector de índice de refração. A
quantificação dos açúcares foi realizada por comparação com padrões.
29
-
O furfural e hidroximetilfurfural foram determinados por CLAE em coluna
(RP-18 1 O µL) utilizando-se acetonitrila I água 1 :8 (v/v) com 1 % de ácido
acético como fase móvel, com fluxo de 0,8 rnl.min' a 25ºC. O hidrolisado foi
filtrado em membrana RC 25 de 45 µm e injetado diretamente na coluna
através de uma alça de injeção de 20 µI. Os compostos. foram detectados a
276 nm e as concentrações de furfural e hidroximetilfurfural foram
determinadas a partir de curvas de calibração obtidas de compostos puros.
A perda de massa do bagaço de cana-de-açúcar durante o período de
biodegradação foi calculada como sendo:
Pm(%) = ( mi ~imf )x100% (equação 3)
onde:
Pm ... perda de massa
mi. .. massa inicial de bagaço (base seca)
mf ... massa final de bagaço (base seca)
O bagaço biodegradado foi caracterizado quimicamente conforme
metodologia descrita acima. Após a caracterização química foi possível
determinar a perda de cada componente do bagaço durante os períodos de
biodegradação estudados da seguinte forma:
Pc(%) = (mci - ~cf )x100% mci
(equação 4)
onde:
Pc perda do componente
mci %componente inicial X massa inicial de bagaço
mcf %componente final X massa final de bagaço
3.8 Análise do bagaço autoclavado: Foram utilizados 6 g do bagaço in natura, colocados em frasco Erlenmeyer de 250 ml e adicionados 100 ml
de água destilada. O frasco foi fechado com papel alumínio e autoclavado.por
30 min a 1, 05 bar. Após a descompressão da autoclave, o frasco foi retirado e
resfriado à temperatura ambiente. Depois da autoclavagem o líquido foi separado do bagaço filtrado em Sep-Pak C18 (Waters) e analisado por CLAE
30
-
como descrito no item 3. 7. Com as áreas obtidas foram calculadas as
porcentagens de xilana e glucana perdidas em função da autoclavagem.
3.9 Microscopia eletrônica de varredura (MEV): Amostras do bagaço
inoculado com P. tigrinus e do controle ( série 1) foram separadas e secas a
50ºC durante 40 min. Um conjunto de feixes de cada amostra foi preso no
suporte com uma fita de carbono e o conjunto foi mantido em dessecador até o
momento da análise morfológica em MEV, utilizando um microscópio modelo
JSMT-300 para a observação das fibras do bagaço antes e após o tratamento
fúngico.
3.1 O Espectros no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) e
análise por componentes principais (PCA): Amostras do bagaço original e
inoculado com P. tigrinus bem como das polpas obtidas (itens 3.11 e 3.12),
foram secas a 50ºC durante 40 min para análise por FTIR. Os espectros de
FTIR foram obtidos diretamente das amostras de bagaço utilizando a técnica
de reflexão difusa (DRIFT) em um equipamento Nicolet 520. Depois da
correção da linha base pelo método poligonal (Faix et ai., 1992), os espectros
foram normalizados pela absorção a 151 O cm", correspondente à vibração do esqueleto aromático da lignina, que não sofre influência de outros grupos. Para
as polpas obtidas dos processos kraft e Acetosov, os espectros foram
normalizados pela absorção em 900 cm", que corresponde ao carbono-1
anomérico do grupo 0-C-O em polissacarídeos (Gonçalves e Ruzene, 1999).
Os espectros de FTIR foram digitalizados e convertidos para arquivos texto
usando o programa OMNIC (Nicolet, lnc.). As absorbâncias normalizadas
foram analisadas por PCA como um conjunto de dados formados por uma
coluna correspondente aos números de onda e outra coluna com os
respectivos valores de absorbância. A matriz consistia de 557 valores de
intensidade de absorção medidos a cada 2 cm" entre 792 e 1865 cm",
fornecidos pelo espectrofotômetro FTIR. Os espectros normalizados foram
analisados pelos softwares de análise multivariada BIOTEC e FAEN
compilados em FORTRAN e desenvolvidos por Bruns (1994).
31
-
3.11 Determinação da composição do licor de polpação kraft pelo teste
ABC: A composição escolhida do licor utilizado para as polpações kraft foi de
15% de álcali ativo e 20% de sulfidez, valores próximos aos sugeridos na
literatura (Paturau, 1969). Para verificar se a composição do licor kraft utilizado
para as polpações correspondia aos valores de álcali ativo e sulfidez
desejados, foi feita a análise de uma alíquota do licor através do teste ABC
(TAPPI, 1985) que permite determinar as concentrações de hidróxido de sódio,
sulfeto de sódio e carbonato de sódio (quando presentes) dissolvidos no licor.
Estes testes foram realizados em triplicatas segundo a metodologia descrita
por Mimms et ai. 1993 .
Teste A
Em um Erlenmeyer de 250 ml foram colocados 5 ml do licor e adicionados
50 ml de água destilada e 25 ml de BaCb 10%. Foram adicionadas algumas
gotas de fenolftaleína e titulada a solução com HCI 0,5 N até o
desaparecimento da cor rósea (pH 8,3). O volume indicado na bureta (A) foi
anotado. A bureta não foi completada.
Teste B
Foram adicionado 5 ml de formaldeído 40% à solução após a viragem da fenolftaleína no teste A A solução volta a ter coloração rósea e após 30 s continuou-se a titulação até a cor rósea desaparecer. Foi anotado o volume
indicado na bureta (B). A bureta não foi completada.
Teste C
Foram adicionadas algumas gotas de alaranjado de metila à solução após a segunda viragem da fenolftaleína no teste B. A titulação foi continuada até o primeiro traço da cor vermelha aparecer (pH 4,0). Foi anotado o volume
indicado na bureta (C).
Através das relações abaixo é possível obter o volume de HCI 0,5 N necessário
para neutralizar a quantidade de cada componente adicionado ao licor de
polpação (expresso em base de NaOH ou Na20 equivalente) e, através de
32
-
cálculos estequiométricos, calculou-se a quantidade do componente realmente
dissolvido no licor:
NaOH = 2A-B Na2S = 2(8-A) Na2C03 = C-B
3.11.1 Polpação kraft: As reações de polpação kraft do bagaço in natura desmedulado, do controle dos processos de biodegradação e do bagaço
biodegradado, foram realizadas em reatores de aço inox 316 com capacidade
total de 85 ml (3 cm de diâmetro por 12 cm de altura). Foram feitas reações
com nível de álcali ativo de 15% e sulfidez de 20% (sendo todos os valores
expressos em base de Na20). As reações foram realizadas à temperatura de
170ºC utilizando-se 8 ml de licor para 2 g de bagaço (relação licor/ bagaço de
4: 1 ). O bagaço ficou embebido no licor durante um período de 24 h para
garantir que não haveria a limitação da reação por penetração ou difusão do
licor na matriz lignocelulósica. O reator foi carregado e fechado e a reação foi
conduzida por imersão do reator em banho de silicone pré-aquecido a 170ºC e
a temperatura foi mantida constante durante toda a reação. Após o tempo
pré-determinado de reação, o reator foi imerso em água fria para rápido
resfriamento até temperatura ambiente. O reator foi aberto e o material residual
obtido foi filtrado a vácuo sobre papel de filtro em funil de Büchner. A polpa ou
bagaço não desfribado foi lavada abundantemente com água destilada para a
máxima remoção do licor residual (8 a 1 O lavagens com 2 L de água cada).
Durante o processo de lavagem, a polpa era desfibrada manualmente com o
auxílio de um bastão de vidro. Para o bagaço in natura as palpações kraft foram realizadas com 5, 1 O, 15, 20, 40 e 60 min de reação; para o bagaço das
bolsas foram realizadas com 20, 40 e 60 min de reação e para os frascos com
e sem agitação foram realizadas as palpações com 20 min de reação.
3.12 Polpação Acetosolv do bagaço: A polpação Acetosolv do bagaço· de cana-de-açúcar desmedulado foi realizada com ácido acético 93%, na
presença de HCI como catalisador, conforme metodologia otimizada para
bagaço por Benar (1992).
33
-
Os experimentos foram realizados em bateladas, utilizando-se 2 g de
bagaço de cana que foram pesados com precisão de O, 1 g e colocados em um
balão de fundo redondo de 100 ml juntamente com 25 ml de ácido acético
glacial [relação bagaço:solvente 1 :14 (m/v)], 70 µL de HCI 37% e 2 ml de
água destilada. Este procedimento foi realizado para o bagaço in natura bem
como para as amostras biodegradadas e de controle obtidos dos três sistemas
(agitação, estacionário e em bolsas). A polpação em escala ampliada para o
· bagaço in natura foi realizada em batelada, utilizando-se 30 g de bagaço de
cana que foram pesados com precisão de O, 1 g e colocados em um balão de
fundo redondo de 1000 ml juntamente com 372,5 ml de ácido acético glacial
[relação bagaço:solvente 1 :14 (m/v)], 1,05 ml de HCI 37% e 24,5 ml de água
destilada. Para as amostras de controle e bagaço biodegradado pelas três
cepas nas bolsas, as· palpações foram também realizadas em escala
ampliada em batelada, utilizando-se 44 g de bagaço de cana que foram
pesados com precisão de O, 1 g e colocados em um balão de fundo redondo de
2000 ml juntamente com 500 ml de ácido acético glacial [relação
bagaço:solvente 1 :14 (m/v)], 1,4 ml de HCI 37% e 35 ml de água destilada.
Foi utilizado um condensador para evitar a evaporação do ácido.
O balão foi aquecido em banho de óleo de silicone à temperatura de
refluxo do solvente (ácido acético) (110 ± 5ºC) por 120 min. O banho levou em torno de 30 min para atingir essa temperatura.
Após a polpação, a polpa foi removida e filtrada em funil de Büchner. O
licor de polpação contendo lignina foi separado e guardado. A polpa obtida foi
lavada exaustivamente com água destilada a 70ºC até a água de lavagem
atingir pH>3,5.
As polpas foram secas em estufa a 11 OºC por 2 h e levadas
posteriormente a um dessecador por 30 min e foram calculados os
rendimentos das palpações. As polpas foram guardadas para análises
posteriores, como descrito nos itens 3.12 e 3.14.
34
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3.13 Determinação do número kappa: O número kappa (medida da lignina
residual na polpa) foi determinado pela oxidação por permanganato de potássio
e titulação com tiossulfato de sódio, seguindo-se a metodologia padrão (TAPPI,
1985).
As polpas foram secas em estufa a 11 OºC por 2 h. As amostras de
polpa de bagaço tratado e não tratado foram pesadas em béqueres com
massas entre 0,30 e 0,35 g (com precisão de 0, 1 mg) e cada uma delas foi
· suspensa em 1 O ml de água destilada. Cada suspensão de polpa foi
transferida com 140 ml de água para um Erlenmeyer de 500 ml que foi
mantido a 25ºC sob agitação magnética. Foram misturados 25 ml de uma ·-·-·· .
solução padrão de KMn04 O, 1 N (recém preparada) com 25 ml de H2S04 4 N
em um Erlenmeyer de 125 ml, que foi mantido a 25ºC sob agitação magnética
(solução A).
A solução A foi adicionada quantitativamente a cada Erlenmeyer
contendo a suspensão de polpa, utillzando-se 50 ml de água destilada para
lavar as paredes do Erlenmeyer. Após exatos 1 O min (medidos com um
cronômetro) foram adicionados 5,0 ml de uma solução de KI 0, 1 N. Essa·
mistura foi titulada com uma solução padronizada de Na2S203 O, 1 N até
próximo ao ponto de viragem (desaparecimento da cor castanha). Foram
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