facultad de quÍmica departamento de bioquÍmica laboratorio...

FACULTAD DE QUÍMICADEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA CLÍNICA(CLAVE 1807)

Licenciatura de QFB

Este material es exclusivamente para uso educativo y no de lucro

Laura Carmona SalazarRosalinda Velázquez Salgado

2017-II

ESTUDIO DEL METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS Y DE LÍPIDOS

DESDE EL ENFOQUE DE LA BIOQUÍMICA CLÍNICA

Glucosa Glucógeno

Glucosa 6-fosfato

Fosfoenol-piruvato

Piruvato

Hexo-cinasa

GLUCONEO-GÉNESIS

GLUCÓ-LISIS

SÍNTESISDE ÁCIDOSGRASOS

b-OXIDACIÓNVÍA DELASPENTOSASFOSFATO

OxalacetatoCICLODEKREBS

FOSFORILACIÓN

OXIDATIVA

EL METABOLISMO SE ENCUENTRA

ALTAMENTE REGULADO

INSULINA

2

TRANSDUCCIÓN

TRANSPORTE YMETABOLISMO

TRANSDUCCIÓNDE LA SEÑAL

INSULINAMETABOLISMO DE

modificando la toma de glucosa

TRANSPORTE DE GLUCOSA

INSULINAMETABOLISMO DE CARBOHIDRATOS

modificando vías metabólicas

ESTADO FISIOLÓGICO: ABUNDANCIA, BUENA NUTRICIÓN

LA INSULINADISMINUYE LOSNIVELES DEGLUCOSA

Metabolizay distribuye

JPEN (2004) 28:364-371

LA DIABETES MELLITUS (Diabetes sacarina)

Es un defecto en la producción o acción de la insulina

TIPO I: DIABETES JUVENIL O DEPENDIENTE DE INSULINA10%

TIPO II: NO DEPENDIENTE DE INSULINA O RESISTENTEA INSULINA

INSULINA

RESPUESTADISMINUIR LOS

NIVELES DE GLUCOSA

TRANSDUCCIÓNDE LA SEÑAL

SEÑAL

INSULINA

RESPUESTADISMINUIR LOS

NIVELES DE GLUCOSA

TRANSDUCCIÓNDE LA SEÑAL

SEÑAL

CONSECUENCIAS DE ESTA ENFERMEDAD

LA GLUCOSA NO PUEDE SER METABOLIZADA

NIVELES ELEVADOS DE GLUCOSA EN SANGRE Y EN ORINA

LA GLUCOSA NO PUEDE SER METABOLIZADA NI CAPTADA (TRANSPORTE DEPENDIENTE DE INSULINA)

EL ORGANISMO ES ENGAÑADO Y CREE QUE ESTA

EN UN ESTADO DE INANICIÓN

Glucosa 6-fosfato

Glucógeno Glucosa

Piruvato

Cuerpos

Hígado Glucosa

Cuerposcetónicos

Cerebro

ESTADO FISIOLÓGICO EN LA DIABETES MELLITUS

Síntesis de glucosa “de nuevo”Degradación del glucógeno

DEGRADACIÓN DE ÁCIDOS GRASOS Y PROTEÍNAS

ACUMULACIÓN DE CUERPOS CETÓNICOS(COMO CONSECUENCIA DELA INHIBICIÓN DEL CICLO DE KREBS)

b-OXIDACIÓN CONSUME EL NAD+

Cuerposcetónicos

Ácidosgrasos

Amino-ácidos

Proteína

Proteínas

MúsculoCuerposcetónicos

Tejidoadiposo

TGCÁcidosgrasos

Glicerol

Movilizaciónde

ácidosgrasos

Degradación deáminoácidos

Formación de

cuerpos cetónicos

SÍNTOMAS DE LA DIABETES MELLITUSLos niveles o respuesta baja de insulina modifica el metabolismo de glucosa y el transporte, locual provoca una acumulación de glucosa en sangre “HIPERGLUCEMIA”

De baja a moderada concentración de glucosa en sangre: Puede ser que la persona aún no presente síntomas todavía.

De moderada a alta concentración de glucosa en sangre:• El cuerpo intenta eliminar el exceso de glucosa por la orina (GLUCOSURIA),lo cual provoca que la persona sienta la necesidad de ir al bañorecurrentemente (poliuria), incluso varias veces por las noches. Esto traecomo consecuencia una intensa deshidratación junto con una fuertesensación de sed insaciable, boca seca y fatiga excesiva.sensación de sed insaciable, boca seca y fatiga excesiva.•También la deshidratación provoca que la piel se torne seca, generandocomezón, piel agrietada y mala cicatrización en las heridas. (Polidipsiaconsumo de grandes cantidades de agua)•La pérdida de peso es otro síntoma que aparece cuando la glucosa nopuede entrar a la célula, ya que por falta de insulina no se puedeaprovechar la glucosa y como un mecanismo de defensa se utilizan lasproteínas y las grasas para obtener energía. (Polifagia, deseo excesivo decomer)•La vista suele hacerse borrosa.•Las infecciones de cualquier tipo se desarrollan con mucho más facilidaddebido al exceso de glucosa en sangre, la cual alimenta a las bacterias.•Se puede presentar falta de sensibilidad en las extremidades, así comohormigueo y dolores.

DIABETES SIN TRATAMIENTO E INSULINA BAJA

PRODUCCIÓN EXCESIVA DE CUERPOS CETÓNICOS

ACIDOSIS O DISMINUCIÓN DE pH SANGUÍNEO

COMPENSACIÓN A TRAVÉS DE LA UTILIZACIÓN DEL BICARBONATOCOMPENSACIÓN A TRAVÉS DE LA UTILIZACIÓN DEL BICARBONATO

LA DISMINUCIÓN DE BICARBONATO CONDUCE A UN AUMENTO DE CO2

(AGOTAMIENTO DE BICARBONATO: ACIDOSIS METABÓLICA)

MODIFICACIÓN DE LA RESPIRACIÓN PARA COMPENSAR A TRAVÉS DE LA EXCRECIÓN DE CO2 POR LOS PULMONES

ESTADO DE COMA

GLUCOSA PLASMÁTICA EN AYUNOLos individuos normales mantienen una concentración de glucosa plasmática tras el ayuno de 10 a

16 hrs de 80-90 mg/dL GLUCOSA EN ORINA

La glucosa en orina aparece cuando el nivel de glucosa sanguínea excede el umbral renal de glucosa.En general este umbral es inferior a 160-180 mg/dL

GLUCOSA PLASMÁTICA POST-PRANDIAL DE DOS HORASSe determina la glucosa plasmática dos horas después de que el paciente realiza una ingesta de

aproximadamente 100 g de carbohidratos.Niveles arriba de 200 mg/dL indica diabetesNiveles menores de 140 o usualmente de 120 mg/dL son normales

PRUEBA DE TOLERANCIA A LA GLUCOSAEs una prueba definitiva para el diagnóstico de diabetes en pacientes que tienen niveles de glucosa

DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO

Es una prueba definitiva para el diagnóstico de diabetes en pacientes que tienen niveles de glucosainferiores a 140 mg/dL.

El protocolo es tomar antes y después de una ingesta oral de glucosa. HEMOGLOBINA GLUCOSILADA

Es una modificación que sufre la hemoglobina, una glucación en un aminoácido y guarda unarelación directa con la [glucosa] sanguínea

PRUEBA DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA

PROTOCOLO:1. El paciente tiene actividad física sin limitaciones e ingiere una dieta sin restricciones que tenga por lo menos 150 g de carbohidratos durante 3 días antes de la prueba.2. La prueba se realiza tras un ayuno de 10 a 16 hrs, sólo se permite ingerir agua.3. Se obtiene la muestra para glucosa sanguínea en ayunas4. Se le proporciona una dosis de glucosa de 75 g en agua con saborizante para administrarse por vía oral.5. La glucosa plasmática se determina cada 30 min durante 2 hrs.

LA HEMOGLOBINA GLUCOSILADA COMO UN ANÁLISIS EFICAZ PARA EL CONTROL DE LA DIABETES

Los eritrocitos no requieren de insulina para el transporte de glucosa

La hemoglobina se glucosila por medio de una reacciónno enzimática, que se denomina glucación, entre laglucosa y un residuo de valina de la cadena beta de la Hb,donde se forma una base de Schiff lábil( aldimina) quesufre un reordenamiento para formar una cetoaminaestable. La reacción continua durante los 120 días de vidaestable. La reacción continua durante los 120 días de vidadel eritrocito y es proporcional a la concentración deglucosa

PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS PARA LA DETERMINACIÓN DE GLUCOSA

MUESTRAS BIOLÓGICASSuero no hemolizadoPlasmaSangre entera

PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS PARA LA DETERMINACIÓN DE GLUCOSA

MÉTODOS

QUÍMICOS

ENZIMÁTICOS

MÉTODOS QUÍMICOSMÉTODOS QUÍMICOS

Se basan en reacciones de oxido-reducción, donde la glucosa es un excelente reductor, típicamente reduce los iones cúpricos (Cu2+) a iones cuprosos (Cu+) y dependiendo de la naturaleza para la producción de color es que hay varios métodos.El método de Somogyi-Nelson que utiliza el arsenomolibdato, el cual se reduce con el ion cuproso y forma un compuesto azul de molibdenoEl método de la o-toluidina, que es una amina aromática que con la glucosa forma una glucosamina y una base de Schiff que tras reordenamientos forma un cromógeno de color verde que se mide a 630 nm

PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS PARA LA DETERMINACIÓN DE GLUCOSA

MÉTODOS ENZIMÁTICOS

REFERENCIA.- HEXOCINASA que involucra un ensayo acoplado de dos reacciones:

GLUCOSA + ATP GLUCOSA-6-FOSFATO + ADP

GLUCOSA-6-FOSFATO + NADP+ 6-FOSFOGLUCONATO + NADPH + H+

HEXOCINASA

GLUCOSA-6

FOSFATO DESHIDROGENASA

GLUCOOXIDASA que cataliza la oxidación de glucosa a glucolactona y peróxido de hidrógeno (H2O2):

b-GLUCOSA + O2 D-GLUCONO-d-LACTONA + H2O2

Es específica para la b-glucosa

H2O2 + cromógeno reducido cromógeno oxidado + H2O

Trinder: 4-aminofenazona

DETERMINACIÓN DE HEMOGLOBINA GLUCOSILADA HbA1C

LA HEMOGLOBINA GLUCOSILADA SE FORMA DE MODO NO ENZIMÁTICO DONDE ESTA IMPLICADA UNA BASE DE SCHIFF (ALDIMINA LÁBIL) QUE SE REORDENA Y SE CONVIERTE EN UNA CETOAMINA ESTABLE

Se cuantifica en función de su carga, reactividad y estructura

CARGA: Cromatografía de intercambio iónico (la Hb glucosilada se une menos a la resina)HPLCHPLCELECTROFORESIS

REACTIVIDADColorimetría: Ácido tiobarbitúrico

ESTRUCTURACromatografía de afinidad

DETERMINACIÓN DE CUERPOS CETÓNICOS

78%

20% 2%EN SANGRE: CETONEMIAORINA: CETONURIA

PRUEBA DE NITROPRUSIATO: Solo reacciona el acetoacetato y acetona con el nitroprusiato en condiciones alcalinas dando un color púrpura.condiciones alcalinas dando un color púrpura.

ANÁLISIS ENZIMÁTICO: Para el acetoacetato y el ácido hidroxibutírico utilizando la b-hidroxibutírica deshidrogenasa (b-HBD):

NADH + H+ + ACETOACETATO b-HIDROXIBUTIRATO + NAD+

Cuya direccionalidad depende del pH, a pH neutro se favorece a la derecha y a pH de 8.5-9.5 hacia la izquierda.

b-HBD

RANGOS DE REFERENCIA: INFERIORES A 3 mg/dL (0.3 mM)

PROCEDIMIENTO ANALÍTICO PARA LA DETERMINACIÓN DE COLESTEROL

COLESTEROL = COLESTEROL + COLESTEROL TOTAL LIBRE ESTERIFICADO

FRACCIONAMIENTO DE LIPOPROTEÍNAS POR ELECTROFORESIS

QUILOMICRONES

LDL

VLDL

HDL

HDL Lipoproteína alfaLDL Lipoproteína betaVLDL Lipoproteína pre-beta

DETERMINACIÓN DEL PERFIL DE LIPOPROTEÍNAS

1. Precipitación selectiva a través del uso de cationes bivalentes (Ca2+, Mg2+ y Mn2+) ensoluciones de amortiguadores, heparina o sulfato de dextrán para precipitarselectivamente VLDL y LDL, dejando el HDL en el sobrenadante.

2. Determinación de los niveles totales de colesterol y triglicéridos en suero3. Determinación de HDL en el sobrenadante del precipitado4. Establecimiento de los niveles de LDL y VLDL a través del uso de formulas.

PROCEDIMIENTO ANALÍTICO PARA LA DETERMINACIÓN DE TRIGLICÉRIDOS

lipoproteinlipasa

Glicerolfosfato deshidrogenasa

Peroxidasa4-aminofenazona

DETERMINACIÓN DESEABLE LIMITANTE INDESEABLE

COLESTEROL TOTAL <200 mg/dL 200-249 mg/dL ≥ 250 mg/dL

COLESTEROL HDL ≥55 mg/dL 35-54 mg/dL < 35 mg/dL

COLESTEROL LDL < 130 mg/dL 130-159 mg/dL ≥ 160 mg/dL

GUÍA PARA LA VALORACIÓN DE LAS AFECCIONES CORONARIAS

TRIGLICÉRIDOS < 250 mg/dL 250-500 mg/dL > 500 mg/dL