genética 2001/2002prof.doutor josé cabeda a genética molecular em análises clínicas
Post on 17-Apr-2015
126 Views
Preview:
TRANSCRIPT
2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda Genética
A Genética Molecular em Análises Clínicas
Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos
EspectrofotometriaEspectrofotometria ElectroforeseElectroforese Revelação dos ácidos nucleicosRevelação dos ácidos nucleicos FotografiaFotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagemSistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geisQuantificação de bandas em geis Reacções de restriçãoReacções de restrição
Sistemas R/MSistemas R/MMontar uma reacção de restriçãoMontar uma reacção de restrição
Espectrofotometria
Lei de Bert-LambertLei de Bert-LambertC=C=AA
maxmax
L=1 cmL=1 cm AA(suporte)(suporte)
A(solvente)A(solvente)
Espectrofotometria
Lei de Bert-LambertLei de Bert-Lambert C=C=AA
maxmax
L=1 cmL=1 cm AA(suporte)(suporte)
A(solvente)A(solvente)
Espectofotometria
Espectrofotometria
Lei de Bert-LambertLei de Bert-Lambert C=C=AA
maxmax
L=1 cmL=1 cm AA(suporte)(suporte)
A(solvente)A(solvente) AA(contaminantes)(contaminantes)
maxmax=260 nm=260 nm max(proteínas) max(proteínas) =280 nm=280 nm ref ref =320 nm=320 nm Concentração = f(ODConcentração = f(OD260260). Se L=1cm:). Se L=1cm:
dsDNA 1OD=50µg/mldsDNA 1OD=50µg/ml ssDNA 1OD=40µg/mlssDNA 1OD=40µg/ml ssRNA 1OD=40µg/mlssRNA 1OD=40µg/ml Oligos 1OD=20µg/ml (varia muito com a sequência)Oligos 1OD=20µg/ml (varia muito com a sequência)
..
Quantificação de DNA
)280(
)260(
fPureza
Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos
EspectrofotometriaEspectrofotometria ElectroforeseElectroforese Revelação dos ácidos nucleicosRevelação dos ácidos nucleicos FotografiaFotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagemSistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geisQuantificação de bandas em geis Reacções de restriçãoReacções de restrição
Sistemas R/MSistemas R/MMontar uma reacção de restriçãoMontar uma reacção de restrição
Fazer um gel de agarose
Electroforese
ELECTROFORESE
V=IR V=IR P=IP=I22RR A resistência é inversamente proporcional á secção e á A resistência é inversamente proporcional á secção e á
força iónica da soluçãoforça iónica da solução
TIPOS DE GEIS Agarose (TAE e TBE)Agarose (TAE e TBE)
SeakamSeakam NusieveNusieve Nusieve 3:1Nusieve 3:1 outras (LMP, HGT, etc)outras (LMP, HGT, etc) formamida como desnaturanteformamida como desnaturante
Acrilamida Acrilamida Acrilamida/bisacrilamida Acrilamida/bisacrilamida
/TEMED /peróxido de amónio/TEMED /peróxido de amónio SDS como desnaturanteSDS como desnaturante
HorizontaisHorizontais VerticaisVerticais
Electroforese em campo pulsado (PFGE)
Electroforese Capilar
Electroforese em capilares de pequeno Electroforese em capilares de pequeno diâmetro (cerca de 50 µm de diâmetro diâmetro (cerca de 50 µm de diâmetro interno)interno)
Utiliza campos eléctricos muito elevados Utiliza campos eléctricos muito elevados (20-30 kV), já que os capilares dissipam o (20-30 kV), já que os capilares dissipam o calor com muita eficiênciacalor com muita eficiência
Separações muito boas, num período de Separações muito boas, num período de tempo inferior. tempo inferior.
Electroforese Capilar (II)
Fluxo Electro-osmótico (FEO):Fluxo Electro-osmótico (FEO): A superfície do capilar de vidro-silica contém grupos A superfície do capilar de vidro-silica contém grupos
funcionais carregados negativamente, os quais atraem iões funcionais carregados negativamente, os quais atraem iões carregados positivamente. Estes iões migram para o pólo carregados positivamente. Estes iões migram para o pólo negativo, carregando consigo moléculas do solvente. negativo, carregando consigo moléculas do solvente.
Moléculas neutras viajam á velocidade do FEOMoléculas neutras viajam á velocidade do FEO Moléculas positivas são mais rápidas que o FEOMoléculas positivas são mais rápidas que o FEO Moléculas negativas são mais lentas que o FEOMoléculas negativas são mais lentas que o FEO todas as moléculas migram para o pólo negativo (com todas as moléculas migram para o pólo negativo (com
velocidade que depende da sua carga e do seu peso velocidade que depende da sua carga e do seu peso molecular), onde podem ser detectadas com o mesmo tipo de molecular), onde podem ser detectadas com o mesmo tipo de aparelhagem utilizado em HPLC.aparelhagem utilizado em HPLC.
Electroforese capilar (III)
Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos
EspectrofotometriaEspectrofotometria ElectroforeseElectroforese Revelação dos ácidos nucleicosRevelação dos ácidos nucleicos FotografiaFotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagemSistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geisQuantificação de bandas em geis Reacções de restriçãoReacções de restrição
Sistemas R/MSistemas R/MMontar uma reacção de restriçãoMontar uma reacção de restrição
REVELAÇÃO DOS ÁCIDOS NUCLEICOS
Brometo de etidio e análogosBrometo de etidio e análogos RadioactividadeRadioactividade
3232P e P e 3333PP 3535SS 125125II 1414CC 33HH Tempos de exposiçãoTempos de exposição Cassetes com e sem ecran repetidorCassetes com e sem ecran repetidor Necessidade de secagem dos geisNecessidade de secagem dos geis
Nitrato de prataNitrato de prata
Marcação de sondas
Radio-isótoposRadio-isótopos 3232PP 3333PP 3535SS 33HH 1414CC 125125II
DigoxigeninaDigoxigenina BiotinaBiotina
detecção directa da cadeia dupladetecção directa da cadeia dupla
Marcação de sondas
Enzimas para a marcação de sondas PolimerasesPolimerases
Actividade exonucleoliticaActividade exonucleolitica Temp. optimaTemp. optima estabilidade térmicaestabilidade térmica
TdTTdT
Tipos de sondas
OligonucleótidosOligonucleótidos inserts de plasmideosinserts de plasmideos prod. de PCRprod. de PCR
Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos
EspectrofotometriaEspectrofotometria ElectroforeseElectroforese Revelação dos ácidos nucleicosRevelação dos ácidos nucleicos FotografiaFotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagemSistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geisQuantificação de bandas em geis Reacções de restriçãoReacções de restrição
Sistemas R/MSistemas R/MMontar uma reacção de restriçãoMontar uma reacção de restrição
Fotografia
FOTOGRAFIA
Abertura do diafragmaAbertura do diafragma Tempo de exposiçãoTempo de exposição Focagem e profundidade de focoFocagem e profundidade de foco Filtros necessáriosFiltros necessários Tipos de fotos PolaroidTipos de fotos Polaroid Sistemas alternativosSistemas alternativos
Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos
EspectrofotometriaEspectrofotometria ElectroforeseElectroforese Revelação dos ácidos nucleicosRevelação dos ácidos nucleicos FotografiaFotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagemSistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geisQuantificação de bandas em geis Reacções de restriçãoReacções de restrição
Sistemas R/MSistemas R/MMontar uma reacção de restriçãoMontar uma reacção de restrição
Aquisição computorizada de imagens de geis
Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos
EspectrofotometriaEspectrofotometria ElectroforeseElectroforese Revelação dos ácidos nucleicosRevelação dos ácidos nucleicos FotografiaFotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagemSistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geisQuantificação de bandas em geis Reacções de restriçãoReacções de restrição
Sistemas R/MSistemas R/MMontar uma reacção de restriçãoMontar uma reacção de restrição
Integração de histogramas
Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos
EspectrofotometriaEspectrofotometria ElectroforeseElectroforese Revelação dos ácidos nucleicosRevelação dos ácidos nucleicos FotografiaFotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagemSistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geisQuantificação de bandas em geis Reacções de restriçãoReacções de restrição
Sistemas R/MSistemas R/MMontar uma reacção de restriçãoMontar uma reacção de restrição
Reacção de restrição
SISTEMAS R-M
Protecção contra DNA estranhoProtecção contra DNA estranho TIPO I: pouco frequentes (1%)TIPO I: pouco frequentes (1%) TIPO II: (93% das enzimas)TIPO II: (93% das enzimas)
reconhecem sequencias simétricas cortando reconhecem sequencias simétricas cortando entre as sequenciasentre as sequencias
As endonucleases requerem MgAs endonucleases requerem Mg2+ 2+ e as e as metiltransferases requerem s-adenosylmetioninametiltransferases requerem s-adenosylmetionina
endonucleases compostas por um homodimeroendonucleases compostas por um homodimero metiltransferases compostas por monomerometiltransferases compostas por monomero
SISTEMAS R-M
TIPO IIs:TIPO IIs: como as Iis, mas com sequencias de como as Iis, mas com sequencias de
reconhecimento assimétricas e interrompidasreconhecimento assimétricas e interrompidas local de corte a até 20 nucleótidos da sequência local de corte a até 20 nucleótidos da sequência
reconhecidareconhecida Metilação efectuada po 2 metilases (uma para Metilação efectuada po 2 metilases (uma para
cada cadeia, podendo ser metiladas bases cada cadeia, podendo ser metiladas bases diferentes em cada cadeia)diferentes em cada cadeia)
TIPO III: pouco frequentes (<1%)TIPO III: pouco frequentes (<1%) TIPO IV: as restantesTIPO IV: as restantes
MONTAR UMA REACÇÃO DE RESTRIÇÃO
Instabilidade térmicaInstabilidade térmica Concentração de glicerolConcentração de glicerol Tampão de reacçãoTampão de reacção Actividade enzimática:Actividade enzimática:
1UI digere 1µg de DNA em 50µl em uma hora1UI digere 1µg de DNA em 50µl em uma hora conformação e pureza do DNAconformação e pureza do DNA utilizar 2-3 x mais enzimautilizar 2-3 x mais enzima volume total > 50µlvolume total > 50µl Homogeneizar por pipetagemHomogeneizar por pipetagem Verificar a temperatura de reacçãoVerificar a temperatura de reacção
2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda Genética
Genética Molecular em Medicina Transfusional
Técnicas de estudo de mutações Técnicas de estudo de mutações desconhecidasdesconhecidas
Técnicas de estudo de mutações desconhecidas
Métodos Baseados No TmMétodos Baseados No Tm Melting Profiles and GC clampsMelting Profiles and GC clamps DGGEDGGE
• PerpendicularPerpendicular• ParaleloParalelo
CDGECDGE TTGETTGE
Métodos Baseados na conformaçãoMétodos Baseados na conformação SSCPSSCP HAHA CSGECSGE
“Melting Profiles”
Vários domínios de fusãoVários domínios de fusão As moléculas de DNA fundem por etapasAs moléculas de DNA fundem por etapas Moléculas parcialmente fundidas migram mais devagar no gelMoléculas parcialmente fundidas migram mais devagar no gel Moléculas totalmente fundidas migram de acordo com o seu PmMoléculas totalmente fundidas migram de acordo com o seu Pm Podem-se adicionar GC clamps para impedir a fusão totalPodem-se adicionar GC clamps para impedir a fusão total
Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)
Gradiente de desnaturaçãoGradiente de desnaturação QuímicoQuímico TemperaturaTemperatura
O gradiente pode ser:O gradiente pode ser: Perpendicular ao Perpendicular ao
campo eléctricocampo eléctrico Paralelo ao campo Paralelo ao campo
eléctricoeléctrico
Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)
heteroduplexes
homoduplexes
Constant Denaturing Gel Electrophoresis (CDGE)
Temporal Temperature Gradient Gel Electrophoresis (TTGE)
Não existe um gradiente no gel, Não existe um gradiente no gel, em cada momento da corridaem cada momento da corrida
Existe uma temperatura Existe uma temperatura crescente ao longo da corridacrescente ao longo da corrida
Em cada momento, a migração Em cada momento, a migração em cada molécula depende de em cada molécula depende de esta já ter atingido ou não esta já ter atingido ou não algum domínio de fusãoalgum domínio de fusão
Temporal Temperature Gradient Gel Electrophoresis (TTGE)
VantagensVantagens
Mais fácil de fazer os Mais fácil de fazer os geisgeis
Mais reprodutível de Mais reprodutível de gel para gelgel para gel
DesvantagensDesvantagens
Mais difícil de acertar Mais difícil de acertar a gama de Tma gama de Tm
Métodos baseados na conformação Conformação do dsDNAConformação do dsDNA
não depende da sequêncianão depende da sequência A conformação de homodupletos é diferente da A conformação de homodupletos é diferente da
dos heterodupletosdos heterodupletos A conformação dos heterodupletos depende da A conformação dos heterodupletos depende da
sequencia de “mismatch”sequencia de “mismatch” Conformação do ssDNA Conformação do ssDNA
depende da sequência (forma zonas de dupleto depende da sequência (forma zonas de dupleto intramolécular, dependentes da sequência)intramolécular, dependentes da sequência)
Single Strand Conformation Polimorfism (SSCP) dsDNA é desnaturadodsDNA é desnaturado dsDNA é diluidodsDNA é diluido Renaturação rápidaRenaturação rápida Corrida em condições semi-Corrida em condições semi-
desnaturantes e a temperaturas desnaturantes e a temperaturas fixasfixas
Resultado depende muito de:Resultado depende muito de: Temperatura de corridaTemperatura de corrida Concentração de desnaturanteConcentração de desnaturante Presença de certos químicos Presença de certos químicos
(ex: glicerol, etc)(ex: glicerol, etc)
WT1
WT2
mutantes
Heteroduplex Analysis (HA)
Heterodupletos causam Heterodupletos causam Distorção na conformaçãoDistorção na conformação Migração no gel mais lentaMigração no gel mais lenta
Heterodupletos podem existir por:Heterodupletos podem existir por: Co-amplificação por PCR de heterozigotosCo-amplificação por PCR de heterozigotos Introdução de DNA WT e M no mesmo PCRIntrodução de DNA WT e M no mesmo PCR
Correm-se no mesmo gel amostras WT, M e Correm-se no mesmo gel amostras WT, M e WT+MWT+M
Heteroduplex Analysis (HA)
Sensibilidade entre 80-90% (fragmentos <300bp)Sensibilidade entre 80-90% (fragmentos <300bp) Utilização do análogo de acrilamida (MDE ou Utilização do análogo de acrilamida (MDE ou
DEM) aumenta a sensibilidade da HADEM) aumenta a sensibilidade da HA A adição de ureia ao gel pode criar um ambiente A adição de ureia ao gel pode criar um ambiente
semi-desnaturante que aumenta a resolução do semi-desnaturante que aumenta a resolução do HAHA
Conformation Sensitive Gel Electrophoresis Principio:Principio:
Ambiente ligeiramente desnaturante aumenta a Ambiente ligeiramente desnaturante aumenta a capacidade de mutações pontuais produzirem alterações capacidade de mutações pontuais produzirem alterações conformacionais.conformacionais.
Método:Método: Electroforese em 6-10% PAGE com tampão tris-taurina Electroforese em 6-10% PAGE com tampão tris-taurina
e 100% PEG e 15% formamida (desnatirante)e 100% PEG e 15% formamida (desnatirante) Pode utilizar-se BAP ou PDA como “crosslinker”, Pode utilizar-se BAP ou PDA como “crosslinker”,
aumentando a força do gel e tamanho dos seus porosaumentando a força do gel e tamanho dos seus poros Utilizar fragmentos com 300-800 bpUtilizar fragmentos com 300-800 bp
Hibridização
desnaturar
Hibridização
Adicionar sonda
Hibridização
Hibridização
Adicionar substracto
Dot-Blot
Variações
Hibridização em microplacaHibridização em microplaca hibridização reversahibridização reversa
DEIA(hibridização reversa em microplaca)(detecção com anti-dsDNA)
Inno-Lippa
Hibridização em filtroHibridização em filtro Várias sondas por filtro dispostas em tiras Várias sondas por filtro dispostas em tiras
(tipo código de barras)(tipo código de barras) Hibridização reversaHibridização reversa Marcação no produto do PCRMarcação no produto do PCR
Resultados do INNO-LIPA
MEIA
Southern Blot
Northern Blot
Semelhante ao SouthernSemelhante ao Southern Utiliza RNA e não DNAUtiliza RNA e não DNA Não utiliza reacções de restriçãoNão utiliza reacções de restrição
top related