genomic equivalence

Oleh :Dian Ida LestariF. Yudha Christianti

KESEIMBANGAN GENOMIK

Rumusan Masalah

Keseimbangan Genomik dan Differensial Ekspresi Gen Tingkat Embrio

Keseimbangan Genomik dan Diferensial Ekspresi Gen Tingkat Molekuler

Keseimbangan Genomik

Pengertian :adalah suatu keadaan di mana semua sel somatik dalam tubuh berisi gen yang sama dan karenanya menciptakan makhluk seutuhnya.

Differensial Ekspresi Gen

Setiap sel tersusun dari set gen yang sama, namun tidak semua gen di dalam sel berekspresi, sesuai dengan kondisi lingkungan internal dan eksternal sel.

Hanya 3-5% saja yang di ekspresikanMisal: 1. Di dalam pankreas, gen mengekspresikan

hormon insulin 2. Pada sel darah merah, gen mengekspresikan hemoglobin

Keseimbangan Genomik dan Diferensial Ekspresi Gen Tingkat Embrional

Transdeterminasi

Metaplasia

Kloning

Transdeterminasi

Merupakan proses perubahan perkembangan sel-sel imaginal menjadi struktur organ yang lainnya dari determinasi normalnya. Contoh :

Imaginal discs pada Drosophila melanogaster normalnya terdeterminasi berkembang menjadi antena, akan tetapi kemudian dapat menghasilkan struktur acak pada kaki lalat/

Gambar Perkembangan Normal Imaginal Discs pada Drosophila melanogaster

Gambar imaginal discs yang mengalami transdeterminasi

METAPLASIA

Merupakan penggantian reversible sel-sel yang terdiferensiasi dengan sel-sel terdiferensiasi dewasa lainnya.

Perubahan dari satu jenis sel yang lain umumnya mungkin menjadi bagian dari proses pematangan normal atau disebabkan oleh beberapa jenis stimulus yang abnormal.

Contoh Pembentukan lensa baru pada Salamander dibentuk dari sel-

sel iris dorsal.

Metaplasia pada Salamander

A micrograph of Barrett's esophagus.

Sebuah kondisi di mana lapisan esofagus diubah oleh kontak yang terlalu lama asam lambung.

Kloning

Dari Bahasa Yunani - klon, ranting Kumpulan turunan suatu individu yang

dihasilkan tanpa melalui perkawinan; kumpulan replika sebagian atau seluruh makromolekul (contoh, DNA atau antibodi)

Suatu individu yang tumbuh dari satu sel somatik induknya serta memiliki identitas genetik yang sama dengan induknya

Klon: Koleksi molekul atau sel yang semua identitasnya sama dengan molekul atau sel penurunnya

Contoh Kloning

• Kloning pada Amfibi

• Kloning pada domba Dolly

• Kloning pada Tikus

• Kloning pada tumbuhan

Kloning pada Amfibi

Kloning pada Domba Dolly

Kloning pada Tikus

Kloning Tumbuhan

Genomic Equivalence and Differensial gene Expresion;Molecular Investigation

1. Gene cloning2. Transferring gene3. DNA and RNA blotting4. DNA Library 5. The polymerase chain reaction

1. Gene Cloning

Metode untuk memurnikan atau mengidentifikasi dan

memperbanyak suatu potongan DNA tertentu (klon)

yang dikehendaki dari campuran potongan-potongan

DNA yang kompleks.

Gene Cloning

Ketika keseluruhan DNA dari suatu organisme diekstraksi, akan diperoleh seluruh gen yang dimiliki organisme tersebut

Pada kloning gen, hanya gen (DNA) tertentu yang diisolasi, dimurnikan, dan diperbanyak (diklon)

Tujuan mengklon Gen

Menentukan urutan basa nukleotida penyusun gen tersebut

Menganalisis atau mengidentifikasi urutan basa nukleotida pengendali gen tersebut

Mempelajari fungsi RNA / protein/enzim yang disandi gen tersebut

Mengidentifikasi mutasi yang terjadi pada kecacatan gen yang mengakibatkan penyakit bawaan

Merekayasa organisme untuk tujuan tertentu, misalnya memproduksi insulin, ketahanan terhadap hama, dll.

Sumber DNA untuk diklon

DNA kromosom cDNA (complementary DNA) yang disintesis

menggunakan mRNA sebagai cetakan (template)

DNA yang dihasilkan dari perbanyakan menggunakan PCR

Bahan / Alat untuk Mengklon

Enzim endonuklease restriksi Enzim ligase Vektors (biasanya plasmid atau bakteriofage) Inang (Host) Metoda untuk memasukkan DNA ke dalam sel inang

Cara Mengklon DNA (1) Isolasi vektor kloning (plasmid

bacterial) & DNA sumber gen Pemotongan DNA sumber gen

& vektor kloning menggunakan enzim restriksi yang sama

Penyisipan potongan DNA sumber gen ke dalam vektor kloning yang telah dipotong menggunakan enzim restriksi yang sama; potongan disambung dengan bantuan enzim DNA ligase

Cara Mengklon DNA (2)

Vektor kloning yang telah tersisipi potongan DNA dimasukkan ke dalam sel inang (transformasi sel inang)

Menempatkan sel ke dalam medium dg ampisilin dan X-gal

Identifikasi sel pengklon pembawa gen yang dikehendaki

DNA Library Genom DNA dipotong-potong dengan

menggunakan endonuklease Semua fragmen yg dihasilkan diklon secara

random ke dalam vektor plasmid Sebagian besar informasi genetik akan berada

dalam campuran kultur bakteri. Kultur bakteri, yang masing-masing hanya berisi

satu fraksi dari genom yang membawa semua gene tersebut dikenal dengan istilah library

Pembuatan DNA Library

DNA BlottingSOUTHERN BLOTTING

Teknik ini dikembangkan oleh SOUTHERN (1975)Contoh penggunaan metode ini adalah :Untuk menentukan apakah gen tertentu yang diisolasidari suatu organisme (misal: gen Penisilin asilase dari B.subtilis) terdapat dalam bentuk yang sama dengan yang

terdapat dalam organisme lain, misal B. Megaterium

Teknik lain, seperti :- NORTHERN BLOTTING → RNA- WESTERN BLOTTING → Protein

Tahap-tahapan dalam SOUTHERN BLOTTING

n Isolasi DNA kromosom (mis, B. megaterium) DNA dipotong → fragmen-fragmen

n Fragmen dipisahkan dengan elektroforesis (gel agarosa)n Fragmen DNA → denaturasi (alkali) → DNA s.s.n Gel agarosa dijiplak pada kertas nitroselulosan Fragmen pada kertas difiksasi (pemanasan 80oC)n Kertas direndam dlm larutan yg berisi probe DNA ss*(diberi

radioisotop)n Jika komplemen → DNA probe akan berhibridisasi dg

DNA s.s pd kertas nitroselulosa

SOUTHERN BLOTTING Con’t

8. Kertas diletakkan pd plat autoradiografi → untuk melihatposisi probe yang komplemen

9. Dengan membandingkan hasil audiografi terhadap gelagarosa asli → maka fragmen mana yg merupakan genpembawa kode untuk enzim penicillin asilase dapatdiketahui dg tepat.

10. Selanjutnya fragmen dari gel tsb dapat diisolasi.

*) misal digunakan DNA probe yang berasal dari gen murni pengkode enzim Penicillin asilase (B. subtillis)

PCR (Polymerase Chain Reaction) Adalah suatu teknik / metode dimana setiap

fragmen DNA dapat diamplifikasi atau diperbanyak berkali-kali,dengan cepat tanpa menggunakan sel.

PCR dapat melipat gandakan DNA milyaran kali dalam beberapa jam. Peristiwa ini harus ada primer karena DNA polimerase akan menambahkan nukleotida hanya pada rantai nukleotida yang sudah ada sebelumnya dengan bantuan primer.

Manfaat PCR Memperkuat gen spesifik sebelum diklon. Membuat fragmen Gen DNA secara berlimpah Kerjanya sangat spesifik dan ampuh. Dapat mendeteksi DNA gen virus yang sulit

untuk dideteksi Dapat mendeteksi/ mendiagnosis DNA sel

embrionik yang mengalami kelainan sebelum dilahirkan.

untuk melacak asal usul seseorang dengan membandingkan “finger print”

PCR (Polimerase Chain Reaction)Syarat dalam tabung reaksi terdapat :1. Template (DNA yang telah diketahui

urutannya)2. Primer (oligonukleotida, 15-20 pb)

Merupakan molekul DNA untai tunggal sintetik yang pendek yang komplemen thd ujung2 DNA target

3. Enzim polimerase → termostabil4. Prekursor nukleotida

Proses PCR1. Denaturasi DNA ds menjadi DNA ss (94oC,

60”)2. Annealing (55 oC)3. Sintesis (72 oC)Satu siklus : Dimulai dari denaturasi, annealing sp

sintesis→ 5 menit Proses polimerisasi satu molekul DNA ds menghasilkan 2 copy

Perbanyakan DNA dengan PCR (Polymerase Chain Reaction)

Transfering Gene

1. Konjugasi 2. Trasformasi3. Transduksi

Konjugasi

Perpindahan molekul genetik dari satu sel bakteri ke sel bakteri lainnya secara kontak antar sel.

Sel donor akan memberikan informasi genetik kepada resipien.

Plasmid akan mengontrol formasi filamen permukaan sel yang dibutuhkan untuk mengadakan kontak pada waktu terjadinya perkawinan.

Konjugasi Con’t

Plasmid memiliki sistim khusus untuk replikasi dan transfer DNA plasmid dan sistem pengontrolan

Plasmid memiliki faktor F yang merupakan faktor konjugatif ,

Transformasi

Proses perpindahan genetik dimana sel resipien membutuhkan molekul DNA bebas (DNA yang berada diluar sel atau yang telah dimurnikan)

Dalam laboratorium transformasi dapat dilakukan dengan mengisolasi DNA donor kemudian menambahkannya pada suspensi sel resipien.

Transformasi dapat terjadi secara alami.

Transformasi Con’t

Pada prinsipnya transformasi akan terjadi bila sel resipien mampu menerima DNA yang telah diisolasi dari sel donor.

Transformasi dapat terjadi pada bakteri Gram positif ataupun Gram negatif

Transformasi dapat dipindahkan dari sel bakteri kepada sel tanaman.

Transduksi

Adalah transfer genetik dari sel ke sel oleh virus dari sel inang .

Transduksi terbagi 2 Tranduksi Khusus : hanya terjadi pada beberapa

virus tertentu, gen inang langsung diintegrasi kedalam genom virus,lalu ditransfer ke resipien selama proses lisogenisasi (pembentukan lisogen )

Lisogen adalah bakteri yang mengandung faga lengkap

Transduksi Con’t

Transduksi umum : gen gen inang yang berasal dari suatu genom akan menjadi bagian dari partikel DNA virus yang sudah matang dari suatu tempat atau penambahan pada genom virus.

Virus yang telah mengalami transduksi tidak mampu melisiskan inang. Hal ini disebabkan sel bakteri telah menggantikan tempat penting pada gen virus.