hemaglutinacija za određivanje krvnih grupa · – luksogeni (elisa s kemiluminiscencijom) –...
Post on 06-Mar-2020
2 Views
Preview:
TRANSCRIPT
1
Hemaglutinacija za određivanje krvnih grupa
2
Bakterijska aglutinacija
Koliki je titar protutijela
za analizirane serume?
3
4
Pasivna aglutinacija
•aglutinacija prilagođena za detekciju topivih antigena
•na površinu eritrocita se adsorbira inače topivi antigen
•puno osjetljivija od reakcije precipitacije
•umjesto eritrocita – sintetske kuglice (npr. lateks) – brzo očitavanje (3-5 min), lako vežu
antigene, same su neantigenične
Pasivna aglutinacija na stakalcu – test za dokazivanje reumatoidni faktora (protutijela na
vlastite IgG molekule) u serumu bolesnika s reumatoidnim artritisom
IgG molekule (antigen) vezane na čestice lateksa
normalni serum aglutinacija – serum bolesnika
5
Coombsov test
hemolitička bolest novorođenčadi
6
Inhibicija aglutinacije – dijagnostika gripe
• testira se protutijelo (u serumu pacijenta)
• dijagnostika gripe
7
Inhibicija aglutinacije
Kako može doći do lažno pozitivne reakcije?
• testira se antigen (u urinu ili uzorku krvi)
• detekcija upotrebe nedopuštenih tvari (npr.
kokain, heroin ...)
Što je antigen (vezan na čestice)?
8
Inhibicija aglutinacije - test za rano otkrivanje trudnoće
• testira se antigen (humani korionski
gonadotropin u urinu žene)
9
10
Radio-imuno test (na čvrstoj fazi)
• razvijen 1960. – određivanje konc. inzulina u plazmi
• endokrinolozi Berson i Yalow
• Nobelova nagrada 1977.
• princip RIA – kompetitivno vezanje radioaktivno-označenog
antigena i neoznačenog antigena (koji se testira)
na protutijelo visokog afiniteta
Detekcija hepatitis B virusa u uzorcima krvi
koncentracija neoznačenog antigena
% o
znač
enog
ant
igen
a ve
zano
g za
ant
i-HBs
Ag
Imunotestovi
• molekule protutijela su visoko-specifične za odgovarajuće antigene –
mogu detektirati 1 molekulu proteinskog antigena između 100.000.000
sličnih molekula
• razvijen je čitav niz senzitivnih i visoko specifičnih tehnika kojima se mjeri
njihovo prisustvo
12
ELISA – enzimski imunotest na čvrstoj fazi
(enzyme-linked immunosorbent assay)
• Jeli se određuje antigen ili protutijelo?
• Jeli je kvalitativna ili kvantitativna metoda?
13
ELISA
• Kvalitativna ELISA: pozitivni / negativni rezultat (unaprijed određena granica)
• Kvantitativna ELISA: standardna krivulja apsorbancije serijskih razrijeđenja testirane molekule poznatih razrijeđenja
Omogućava brzo testiranje prisustva i kvantifikaciju specifičnih molekula (antigena ili
protutijela) u uzorku
Upotreba:
• detekcija prisutnosti različitih infektivnih bolesti (npr. u ljudi Salmonella, E. Coli,
ospice, gripa, HIV; u životinja: Trichinella u svinja i bruceloza u goveda)
• Testovi na trudnoću
• Testiranje na prisutnost određenih droga, lijekova
• Testiranje alergena
ELISA
15
Mikrotitarske pločice za enzimski imunotest na čvrstoj fazi • razne plastike (polivinil, polistiren) imaju svojstvo da na svojoj površini adsorbiraju
monomolekulske slojeve proteina
16
Osnovni princip ELISA - direktna ELISA
antigen protutijelo s vezanim enzimom
bezbojni supstrat
obojeni produkt
označeno protutijelo vezano za antigen
17
ELISA
ENZIMI – konjugirani s protutijelom
– alkalna fosfataza – peroksidaza hrena – β – galaktozidaza
SUPSTRATI
– kromogeni - spektrofotometar – luksogeni (ELISA s kemiluminiscencijom) – luminometar
• količina obojenog produkta koji nastaje mjeri se pomoću specijalnih
spektrofotometrijskih čitača pločica koji mjere apsorbanciju svih bazenčića u vrlo
kratkom roku (nekoliko sekundi)
18 Lehninger, str. 181
Indirektna ELISA – koristi se češće od direktne
Detekcija prisustva antigena
? npr. kazein iz mlijeka, goveđi albumin
19 Lehninger, str. 181
Indirektna ELISA – koristi se češće od direktne
Detekcija prisustva serumskih protutijela protiv HIV-a ---- ŠTO JE TADA ANTIGEN?
20
ELISA
21
Sandwich ELISA – za detektiranje antigena
Indirektna ELISA Indirektna sandwich ELISA
Imobilizacija antigena (vezanje za površinu bazenčića) – nespecifično u indirektnoj ELISA-i
I – plastična površina
Ag - antigen
Ab – protutijelo specifično za antigen
anti-Ab – protutijelo dobiveno u drugoj vrsti specifično za protutijelo Ab
AB – protutijelo dobiveno u drugoj životinjskoj vrsti specifično za isti antigen (ali različite epitope)
anti-AB – protutijelo dobivenoj u drugoj vrsti specifično za protutijelo Ab ili AB
W – ispiranje E – enzim S – kromogeni supstrat
Praktikum !!
top related