infeccion por hhv6 en transplantados renales: una controversia en el diagnostico julieta giménez...
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INFECCION POR HHV6 EN INFECCION POR HHV6 EN
TRANSPLANTADOS TRANSPLANTADOS
RENALES:RENALES:
UNA CONTROVERSIA EN UNA CONTROVERSIA EN
EL DIAGNOSTICOEL DIAGNOSTICO
Julieta GiménezJulieta GiménezCarolina CarrizoCarolina Carrizo
Benito et. al,.Am J.. Transp 2004; 4:1197-1199Benito et. al,.Am J.. Transp 2004; 4:1197-1199
Hombre, 29 añosHombre, 29 años Enfermedad renal terminal por complicación de DBT tipo IEnfermedad renal terminal por complicación de DBT tipo I
SerologíaSerología pre-Tx
PositivoPositivo NegativoNegativo
CMVCMV
HSVHSV
VZVVZV
EBVEBV
HHV-6HHV-6
Treponema palidumTreponema palidum
Toxoplasma gondiiToxoplasma gondii
HCVHCV
HBVHBV
HIVHIV
Infection with Herpesvirus 6 after Kidney-Pancreas TransplantInfection with Herpesvirus 6 after Kidney-Pancreas Transplant Benito N. et al, American Journal of transplantation 2004; 4:1197-1199Benito N. et al, American Journal of transplantation 2004; 4:1197-1199
IntroducciónIntroducción
El procedimiento El procedimiento quirúrgico se realizó sin inconvenientesquirúrgico se realizó sin inconvenientes
Profilaxis:Profilaxis:
Trimetoprima – sulfametoxasolTrimetoprima – sulfametoxasol
GanciclovirGanciclovir
Alta 13 días post-trasplanteAlta 13 días post-trasplante
Crea 1.3 mg/dl y Glu: 73 mg/dlCrea 1.3 mg/dl y Glu: 73 mg/dl
Benito et. al,.Am J.. Transp 2004; 4:1197-1199Benito et. al,.Am J.. Transp 2004; 4:1197-1199
Caso ClínicoCaso Clínico
Caso ClínicoCaso Clínico
Días post-TxDías post-Tx
GBGB (cel/mm(cel/mm33))
HbHb (mg/dl) (mg/dl)
PlqPlq (/mm(/mm33))
1717 2222 3434 6161
91009100
10.5 10.5
145000145000
31003100
--
--
100100
77
-- MM
UU
EE
RR
TT
EE
ASTAST (UI/ml)(UI/ml)
ALTALT (UI/ml)(UI/ml)
FALFAL (UI/ml)(UI/ml)
GGTGGT (UI/ml)(UI/ml)
122122
222222
317317
9292
864864
11531153
11861186
416416
Progresión Progresión a a
normalizar normalizar las Ezlas Ez
CultivosCultivos sangre y sangre y orinaorina
LCRLCR SangreSangre
OtrosOtrospp65 (-) pp65 (-)
Biopsia HpBiopsia HpHHV-6 HHV-6
por PCRpor PCRSerologíasSerologías
Benito et. al,.Am J.. Transp 2004; 4:1197-1199Benito et. al,.Am J.. Transp 2004; 4:1197-1199
HHV-6 HHV-6 GeneralidadesGeneralidades
FamiliaFamilia HerpesviridaeHerpesviridae, , subgruposubgrupo Betaherpesvirinae Betaherpesvirinae
DNA lineal doble cadenaDNA lineal doble cadena (160-162 Kb)(160-162 Kb)
NucleocápsideNucleocápside icosahédrica icosahédrica
(90-100 nm)(90-100 nm)
EnvolturaEnvoltura glicoproteglicoproteicaica
Variantes A y B (90% de Variantes A y B (90% de
homología)homología)
De Bolle et al. Clinical Microbiology Review. Jan. 2005, 217-245De Bolle et al. Clinical Microbiology Review. Jan. 2005, 217-245
HHV-6 HHV-6 GeneralidadesGeneralidades
LATENCIALATENCIA
De Bolle et al. Clinical Microbiology Review. Jan. 2005, 217-245De Bolle et al. Clinical Microbiology Review. Jan. 2005, 217-245
MonocitosMonocitos
Células progenitoras Células progenitoras de MOde MO
Tropismo celular:Tropismo celular:
• CerebroCerebro• Glándulas salivalesGlándulas salivales• HígadoHígado• EndotelioEndotelio
CD46CD46: : en todas las en todas las células nucleadascélulas nucleadas
Infección primariaInfección primaria
Niñez (6 meses – 1 año) 20% Sexta enfermedadNiñez (6 meses – 1 año) 20% Sexta enfermedad
Reinfección o reactivación en huesped inmunocomprometidoReinfección o reactivación en huesped inmunocomprometido
Trasplantados Organo Sólidos (TOS) – Incidencia 32 %Trasplantados Organo Sólidos (TOS) – Incidencia 32 %
Trasplantados de Médula Osea (TMO) – Incidencia 48 %Trasplantados de Médula Osea (TMO) – Incidencia 48 %
Reinfección o reactivación en huesped inmunocompetenteReinfección o reactivación en huesped inmunocompetente
HHV-6 HHV-6 GeneralidadesGeneralidades
De Bolle et al. Clinical Microbiology Review. Jan. 2005, 217-245De Bolle et al. Clinical Microbiology Review. Jan. 2005, 217-245
Pruebas DiagnósticasPruebas Diagnósticas
SerologíaSerología IFIIFI
ELISAELISA
AislamientoAislamiento Cultivo convencionalCultivo convencional
Shell vial (cultivo rápido)Shell vial (cultivo rápido)
PCRPCR Cualitativa (linfocitos o plasma)Cualitativa (linfocitos o plasma)
SemicuantitativaSemicuantitativa
Cuantitativa Cuantitativa
Cuantitativa en tiempo realCuantitativa en tiempo real
Antigenemia Antigenemia Detección de Ag específicos en células Detección de Ag específicos en células mononucleares de sangre periféricamononucleares de sangre periférica
InmunohistoquímicaInmunohistoquímica
(IHC)(IHC)
p101 (HHV-6B)p101 (HHV-6B)
gp82 (HHV-6A)gp82 (HHV-6A)
Benito N. et al; Enferm Infecc Microbiol Clin 2003;21(8):424-32Benito N. et al; Enferm Infecc Microbiol Clin 2003;21(8):424-32
SerologíaSerología
Permite la detección de infección latente o seroprevalenciaPermite la detección de infección latente o seroprevalenciaPoblación adulta > 90% seropositivosPoblación adulta > 90% seropositivos
Infección primaria:Infección primaria: 4 veces IgG IFI ó 4 veces IgG IFI ó 1.6 veces IgG EIA 1.6 veces IgG EIA
Dockrell Dockrell et alet al, Transplantation 1999, Transplantation 1999 Lautenschlager Lautenschlager et alet al, Clin Infect Dis 1998, Clin Infect Dis 1998
Saxinger Saxinger et alet al, J Virol Methods 1988, J Virol Methods 1988
La detección de IgM es más controversial ya que puede La detección de IgM es más controversial ya que puede producirse tanto en infecciones primarias como en reactivacionesproducirse tanto en infecciones primarias como en reactivaciones
Dockrell Dockrell et alet al, Transplantation 1999, Transplantation 1999
DesventajasDesventajas: : NO DISTINGUE ENTRE VARIANTES NO DISTINGUE ENTRE VARIANTES NO ES DE UTILIDAD EN PACIENTES INMUNOSUPRIMIDOSNO ES DE UTILIDAD EN PACIENTES INMUNOSUPRIMIDOS
Aislamiento viralAislamiento viral
• Cultivo convencional:Cultivo convencional: Cocultivo de linfocitos del paciente con linfocitos de sangre de Cocultivo de linfocitos del paciente con linfocitos de sangre de
cordón umbilical activados y tratados con IL-2cordón umbilical activados y tratados con IL-2
Técnica laboriosa Técnica laboriosa (5 – 21 días)(5 – 21 días)Singh Singh et alet al, Ann Inter Med 1996, Ann Inter Med 1996
• Shell Vial:Shell Vial: Cultivo primario en fibroblastos humanos que permite la Cultivo primario en fibroblastos humanos que permite la detección de antígeno viral a las 24 - 72 hs.detección de antígeno viral a las 24 - 72 hs.
Singh Singh et alet al, Ann Inter Med 1996, Ann Inter Med 1996Singh Singh et alet al, Transplantation 1997, Transplantation 1997
PCRPCR
Técnica rápidaTécnica rápida
Elevada SensibilidadElevada Sensibilidad
PCR cualitativaPCR cualitativa Valor limitado en la correlación clínica y la infección activa Valor limitado en la correlación clínica y la infección activa
Secchiero Secchiero et alet al, J Infect Dis 1995, J Infect Dis 1995Singh Singh et alet al, Ann Inter Med 1996, Ann Inter Med 1996
Dockrell Dockrell et alet al, Rev Med Virol 2001, Rev Med Virol 2001
PCR cuantitativa, en tiempo real y multiplex PCRPCR cuantitativa, en tiempo real y multiplex PCR Permite detectar infección activa y distinguir entre variantesPermite detectar infección activa y distinguir entre variantes
Secchiero Secchiero et alet al, J Clin Microbiol 1995, J Clin Microbiol 1995Kidd Kidd et alet al, J Virol Methods 1998, J Virol Methods 1998
Emery Emery et alet al, Clin Infect Dis 2001 , Clin Infect Dis 2001 Gautheret –Dejean Gautheret –Dejean et alet al, J Virol Methods 2002, J Virol Methods 2002
ResumenResumenLatenciaLatencia
Célula no infectadaCélula no infectada Célula infectada productivaCélula infectada productiva
ReactivaciónReactivación ExpansiónExpansiónRespuestaRespuesta a la terapiaa la terapia
LatenciaLatencia Infección ActivaInfección Activa LatenciaLatenciaAislamiento Aislamiento viralviral -- ++ ++ --
PCR PCR cualitativa cualitativa plasmaplasma
-- ++ ++ --
PCR PCR cualitativa cualitativa leucocitosleucocitos
+/-+/- ++ ++ +/-+/-
PCR PCR cuantitativa cuantitativa leucocitosleucocitos
+/-+/- ++++ ++++++++ +/-+/-
Frecuencia de HHV-6 postFrecuencia de HHV-6 postTx de MOTx de MO
Método Muestra nInf. activa
(%)Estudio
PCR
PCR
PCR
PCR
PCR
PCR
PCR,IHC
qPCR
qPCR
Cultivo
Cultivo
Cultivo
Cultivo
GB y BAL
GB y plasma
GB
GB y plasma
GB
GB, orina y saliva
GB y piel
GB y LCR
GB
GB
GB
GB
GB
41
92
22
61
37
57
57
74
20
82
22
26
25
46
42.5
60
28
ND
60
ND
78
ND
38
ND
46
48
Takatsuka et al (2003)
Imbert-Marcille et al (2000)
Maeda et al (1999)
Chan et al (1997)
Wang et al (1996)
Wilborn et al (1994)
Appleton et al (1995)
Ljungman et al (2000)
Cone et al (1999)
Yoshikawa et al (2002)
Yoshikawa et al (2001)
Kadakia et al (1996)
Yoshikawa et al (1991)
De Bolle et al. Clinical Microbiology Review. Jan. 2005, 217-245De Bolle et al. Clinical Microbiology Review. Jan. 2005, 217-245ND: no determinadoND: no determinado
De Bolle et al. Clinical Microbiology Review. Jan. 2005, 217-245De Bolle et al. Clinical Microbiology Review. Jan. 2005, 217-245
Frecuencia de HHV-6 postFrecuencia de HHV-6 postTx renales y renopancreáticosTx renales y renopancreáticos
Método Muestra n Inf. activa (%)
Estudio
PCR
qPCR
PCR, Serología
Cultivo, Serología
Cultivo, Serología
GB
GB
Orina y suero
GB
GB
107
52
30
32
65
ND
23
50
31
55
Pacsa et al (2003)
Kidd et al (2000)
Ratnamohan et al (1998)
Herbein et al (1996)
Yoshikawa et al (1992)
ND: no determinadoND: no determinado
TEST DIAGNÓSTICO DE TEST DIAGNÓSTICO DE REFERENCIA REFERENCIA
para detectar infección por para detectar infección por HHV-6HHV-6
Volin et al, British Journal of Hematology, 2004Volin et al, British Journal of Hematology, 2004
??
UN MÉTODO DE CULTIVO PARA UN MÉTODO DE CULTIVO PARA DIAGNÓSTICO DE HHV-6DIAGNÓSTICO DE HHV-6
ObjetivosObjetivos
Procesar las muestras de plasma y leucocitos de los Procesar las muestras de plasma y leucocitos de los mismos pacientes mediante Nested PCRmismos pacientes mediante Nested PCR
Realizar Shell vial para detectar HHV-6 en pacientes Realizar Shell vial para detectar HHV-6 en pacientes trasplantados trasplantados
Materiales y MétodosMateriales y Métodos
Total de muestrasTotal de muestras: : 3131 LLeucocitos (obtenidos por dextran) eucocitos (obtenidos por dextran) 31 P31 Plasmalasma
SerologSerologíía IgG HHVa IgG HHV--6 :6 : 1144 (+) (+), 1 (-), 1 (-)
PPacientes trasplantadosacientes trasplantados (15)(15)
RRenales enales ((1313))
RRenopancreenopancreááticos ticos ((22))
AntAntiigenemia pp65 genemia pp65 : : 15(-)15(-)
Diagrama de trabajoDiagrama de trabajo
Muestras de Muestras de Pacientes trasplantadosPacientes trasplantados
LLeucocitoseucocitos
Shell vialShell vial Nested PCRNested PCRNested PCRNested PCR
PlasmaPlasma
Materiales y MétodosMateriales y MétodosShell VialShell Vial
200 ul de 200 ul de leucocitosleucocitos
previamente previamente acondicionadosacondicionados
CentrifugaciónCentrifugación1 h – 2200 rpm1 h – 2200 rpm
37º C37º C
48 hs48 hs
1)1) Células de fibroblastos humanos crecidas en forma de monocapa Células de fibroblastos humanos crecidas en forma de monocapa
Presencia Presencia de Antígenode Antígeno
AcMo AcMo ARGENEARGENE
2)2) IFIIFI
Ac Antiratón marcadoAc Antiratón marcado
Secchiero et al. J Infect Dis.Secchiero et al. J Infect Dis.1995;171:273-801995;171:273-80
Materiales y MétodosMateriales y MétodosNested PCRNested PCR
1)1) ExtracciExtracción de ADNón de ADN Columnas comerciales (Qiagen)Columnas comerciales (Qiagen)
1er producto de amplificación 520 pb1er producto de amplificación 520 pb2do producto de amplificación 258 pb2do producto de amplificación 258 pb
Termociclador: Abbot LCXTermociclador: Abbot LCX
2)2) AmplificaciónAmplificación
3)3) ElectroforésisElectroforésis258 pb258 pb
Nested- PCRNested- PCR
1º Producto de 1º Producto de amplificaciónamplificación
(520 pb) (520 pb)
2º Producto de 2º Producto de amplificaciónamplificación (258 pb) (258 pb)
Primer Ext.Primer Ext.Primer ExtPrimer Ext.
Primer Int.Primer Int.Primer Int.Primer Int.
Secuencia TargetSecuencia Target
Sensibilidad : 0.012 DICT Sensibilidad : 0.012 DICT 50 50 / ml/ ml
Nested- PCRNested- PCR
Muestra:Muestra: PlasmaPlasma
Gel de agarosa 2%Gel de agarosa 2%
258 pb258 pb
Detección de HHV-6 en TxDetección de HHV-6 en Tx
PCR Leucocitos SHELL VIAL PCR Plasma
1 4 / 4 1 / 4 0 / 42 3 / 3 0 / 3 0 / 33 2 / 2 0 / 2 0 / 24 1 / 1 0 / 1 0 / 15 1 / 1 0 / 1 0 / 1
6 0 / 2 0 / 2 0 / 27 0 / 2 0 / 2 0 / 28 0 / 2 0 / 2 0 / 29 0 / 2 0 / 2 0 / 210 0 / 2 0 / 2 0 / 211 0 / 2 0 / 2 0 / 212 0 / 2 0 / 2 0 / 213 0 / 2 0 / 2 0 / 214 0 / 2 0 / 2 0 / 215 0 / 2 0 / 2 0 / 2
POSITIVOS / Total de muestrasPACIENTES
31 31 31Total
NEGATIVONEGATIVO
POSITIVOPOSITIVO
Serología pre-Tx
NDNDCMV, HSV I y II, EBVCMV, HSV I y II, EBV
CMVCMVHCV, HBV, HIV , HHV-6HCV, HBV, HIV , HHV-6
DonanteReceptor
ND: no disponibleND: no disponible
Paciente 1Paciente 1
Sexo masculino, 54 añSexo masculino, 54 añosos
Causa de Tx: Causa de Tx: Insuficiencia Renal CrInsuficiencia Renal Crónica secundaria a poliquistosis ónica secundaria a poliquistosis (desde 35 años) (desde 35 años)
Transplante renal con donante vivo relacionadoTransplante renal con donante vivo relacionado
Paciente 1Paciente 1
El paciente evoluciona favorablementeEl paciente evoluciona favorablemente
Se lo controla por consultorio externo a partir de la 2da Se lo controla por consultorio externo a partir de la 2da semana pos-Trasplantesemana pos-Trasplante
Sin datos clínicos relevantesSin datos clínicos relevantes
Semanas 2 4 8 24
PCR Leucocitos Positivo Positivo Positivo Positivo
SHELL VIAL Negativo Negativo Positivo Negativo
PCR Plasma Negativo Negativo Negativo Negativo
Pos-Trasplante
CONCLUSIONESCONCLUSIONES
1-1- La frecuencia de La frecuencia de detección de HHV-6 en leucocitos por PCR detección de HHV-6 en leucocitos por PCR fue de 11/25 (44%), esto sugeriría infección fue de 11/25 (44%), esto sugeriría infección activa activa en 5 de en 5 de los pacientes estudiadoslos pacientes estudiados
22-- La PCR en plasma fue negativa en todos los pacientes y no La PCR en plasma fue negativa en todos los pacientes y no se encontraron se encontraron ssííntomas clntomas clíínicos asociados a nicos asociados a eenfermedad nfermedad porpor HHVHHV--66
33-- En 1/En 1/25 (4%)25 (4%) el Shell vial fue positivo con PCR positiv el Shell vial fue positivo con PCR positiva en la a en la misma muestra. Correspondería a un paciente que adquirió misma muestra. Correspondería a un paciente que adquirió infección primaria pos-trasplante. infección primaria pos-trasplante.
Esto no se correlacionó con enfermedadEsto no se correlacionó con enfermedad
CONCLUSIONESCONCLUSIONES
44-- EEl Shell Shelll vial es una alternativa complementar vial es una alternativa complementariia a las a a las ttéécncniicas moleculares paracas moleculares para detectar la infeccidetectar la infeccióón activa por n activa por HHVHHV--66
5-5- Son necesarios Son necesarios estudios en forma longitudinal y prospectiva estudios en forma longitudinal y prospectiva con mayor ncon mayor núúmero de pacientesmero de pacientes evaluandolos a diferentes evaluandolos a diferentes tiempos Postiempos Pos--Trasplante con el finTrasplante con el fin de definir unde definir un algoritmo algoritmo diagndiagnóóstico para la infeccistico para la infeccióón activa por HHV6.n activa por HHV6.
AgradecimientosAgradecimientos
Bioq. Alfredo MartínezBioq. Alfredo Martínez
Dra en Biología Cristina VidelaDra en Biología Cristina Videla
Servicio de Virología (CEMIC)Servicio de Virología (CEMIC)
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