laboratorio calculo eficiencia transformacion_analisis resultados transformacion.pdf
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Resultados Prctica
Transformacin
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Eficiencia de Transformacin
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Para clculo de eficiencia
Nmero de colonias transformadas
Cantidad de plsmido agregado a
bacterias que estn en placa
a. Cantidad total de AN de plsmido al inicio
b. Cantidad de AN de plsmido !en las
bacterias" que se agreg a la placa
Clculo transformantes por ug plsmido
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Nmero de colonias transformadas
Conteo en la placa
#i $a% muc$as se puede contar & de laplaca' o la mitad % multiplicar
E() *+,
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E(emplo a partir de una colonia !una colonia
en la solucin de transformacin"
a. Cantidad total de AN de plsmido al inicio
Concentracin de plsmido) ,',- ugu/
0olumen de plsmido) *,u/
0olumen de solucin de transformacin) 12,u/
0olumen /3 !agregado antes de placas") 12,u/
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Cantidad de plsmido agregado a
bacterias que estn en placa
a. Cantidad total de AN de plsmido al inicio
AN !ug"4 conc. plsmido!ugu/" x5ol. plsmido !ul"
Cantidad AN4 ,.,-ugu/ 6 *,u/
Cantidad total de AN !plsmido" que usaron) ,.-ug
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Cantidad de plsmido agregado a
bacterias que estn en placa
b. Cantidad de AN de plsmido !en las bacterias" que
se agreg a la placa !es una fraccin del total"
7raccin de AN usado4 0olumen en placa0olumen total en tubo
7raccin AN4 *,,u/ 2*, u/ 4 ,.1
8de dnde salieron los 2,,u/9
Total de plsmido en la placa4 fraccin 6 cantidad inicial plsmido
Total de plsmido en la placa4 ,.1 6 ,.-ug 4 ,.*:ug
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Clculo transformantes por ug
plsmido
Eficiencia de transformacin4
nmero de transformantes ug de plsmido en placa
Eficiencia de transformacin4
*+, transformantes,.*:ug4 **-; transformantesug
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Aplicaciones transformacin
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C2,
C
2,) 7amilia grande en?imas' la ma%or@a
catali?a o6idacin de sustancias orgnicas
/os sustratos de las en?imas C
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Anlisis funcional de mutaciones en
C
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0ariantes anali?adas
Variante Mutacin Haplotipo base (5 SNPs codificantes)
NomenclaturaC
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#ecuencia
Plsmido con gen CP!"!
#ntroducir al gen sil$estre las
$ariantes deseadas por
mutag%nesis dirigida
H
&ransformar ' coli para tenermucas copias de los
plsmidos con las $ariantes
deseadas
&ransformar le$aduras
'xtraer microsomas
Medir concentracin
de CP!"! en
extractos
*eterminar acti$idad
en+imtica
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utagBnesis irigida
M i b i d i di i id
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Mecanismo bsico de mutagnesis dirigida
CAF
FTC
CAF
FCC
CAF
FCC
CAF
+ polimerasa
+ primer
Replicacin
FCC
CFF
Mutante
T$r
Traduccin
Original
FTC
CAF
0al
Traduccin
Cambio de un aminocido
Protena original
Protena mutante
primer
(1)
(2)
(3)
(5)
(4)
(6)
Val Thr
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*ise,o de primers para mutag%nesis
dirigida
#tratagene)
Primer tiene la mutacin utacin debe de estar en el medio /ongitud de 12D>2 nucletidos % contenido FC de
por lo menos >,I. /a Tm alrededor de ;-JC. El e6tremo del primer tiene que ser C o F
5
5
3
3
*
*
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#iguientes pasos
iniprep para aislar plsmidos
#ecuenciar para confirmar cambio
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0ector p
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Transformacin /e5aduras
Transformacin de le5adura es mu%
similar a la transformacin de E.coli
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/e5adura N0#c*DOR
utacin en =RA en?imapara s@ntesis de uracilo. Nopuede crecer en medio sinuracilo
OR) e6presa la en?imareductasa $umana. /a acti5idadde p>2, depende de electrones
que le da la citocromo p>2,reductasa. /a acti5idadendgena de la reductasapuede no ser suficiente' por esose sobree6presa para asegurarla e6presin de C
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E6traccin de microsomas
icrosomas son artefactos tipo
5es@cula que se forman a partir delRE cuando las cBlulas se rompen enel laboratorio
No se encuentran en las cBlulas in5i5o
#e pueden separar del resto de lacBlula por centrifugacin diferencial CBlulas sin romper' ncleos %
mitocondrias sedimentan a *, ,,,g En?imas solubles % RE fragmentado
!que contiene p>2," quedan ensolucin A *,, ,,,g el RE sedimenta como
un KpelletL pero las en?imas solublesquedan en sobrenadante
As@ se a@slan % concentranmicrosomas con p>2,
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Cantidad de prote@na'
concentracin P>2,
Concentracin de prote@na) espectrofotmetro
Concentracin P>2,) mBtodo mura % #ato
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Acti5idad En?imtica
-it
P.5/01lo
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Acti5idad en?imtica
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Abundancia relati5a
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Acti5idad en?imtica relati5a
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Oacer el clculo de eficiencia detransformacin con datos propios
0er manual de insTAclone
E(ercicio adicional de clculo de eficiencia
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