laporan praktikum teknologi produksi...
Post on 01-Nov-2020
44 Views
Preview:
TRANSCRIPT
LAPORAN PRAKTIKUM
TEKNOLOGI PRODUKSI BENIH
“KULTUR JARINGAN”
Disusun Oleh :
Nama : Nimas Ayu Kinasih
NIM : 115040201111157
Kelompok : L2 (Rabu, 09.15)
Asisten : Nindya Resha Pramesti
PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI
FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2013
I. PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang Pembuatan Bibit Secara Kultur Jaringan
Hingga saat ini, tanaman kentang menjadi salah satu tanaman hortikultura yang sangat
diminati oleh konsumen sebagai pengganti beras dan jagung. Perbanyakan tanaman kentang
secara konvensional dapat saja dilakukan, namun perbanyakan konvensional kurang bisa
diandalkan untuk memproduksi bibit dengan jumlah yang banyak dalam waktu yang singkat.
Untuk mengatasi masalah tersebut didapat suatu alternatif propagasi atau perbanyakan
menggunakan teknik kultur in vitro dengan cara kultur jaringan atau mikropopagasi, yaitu
dengan meristem tunas atau meristem tangkai bunga sebagai eksplan atau melalui organogenesis
in vitro dari eksplan ujung akar atau potongan dari bagian daun in vitro. Dengan kultur jaringan
yang telah ditentukan akan menciptakan suatu individu baru dengan jumlah yang cukup banyak
dan proses perkembangbiakan sel tanaman dapat berkembang dengan baik karena memiliki
media yang sesuai. Media merupakan faktor utama dalam perbanyakan dengan kultur jaringan.
Keberhasilan perbanyakan dan perkembangbiakan tanaman dengan metode kultur jaringan
sangat besar pengaruhnya terhadap pertumbuhan dan perkembangan eksplan serta bibit yang
dihasilkan. Bibit yang diharapkan dari kultur jaringan adalah bibit tersebut mempunyai beberapa
keunggulan, antara lain: mempunyai sifat yang identik dengan induknya, dapat diperbanyak
dalam jumlah yang besar sehingga tidak terlalu membutuhkan tempat yang luas, mampu
menghasilkan bibit dengan jumlah besar dalam waktu yang singkat, kesehatan dan mutu bibit
lebih terjamin, kecepatan tumbuh bibit lebih cepat dibandingkan dengan perbanyakan
konvensional.
Tahap-tahap dalam kultur jaringan pembuatan media, inisiasi, sterilisai, multiplikasi,
pengakaran, dan aklimatisasi. Tahapan ini juga merupakan syarat yang harus diperhatikan dalam
proses atau tahapan kultur jaringan.
1.2. Tujuan Pembuatan Bibit Secara Kultur Jaringan
Adapun tujuan dari kegiatan kultur jaringan ini adalah untuk memperbanyak tanaman
secara in vitro agar diperoleh benih-benih yang berkualitas, mempunyai sifat yang identik
dengan induknya, serta sehat.
II. TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Pengenalan Alat dan Pembuatan Larutan Induk
The basic equipment in most tissue culture facilities includes the following: An autoclave
is basically a large-sized but sophisticated pressure cooker, and is used for the sterilisation of the
medium, glassware and instruments. Autoclaves of different sizes are available commercially.
High-pressure heat is needed to sterilise media, water, and glassware. Certain spores from fungi
and bacteria are killed only at 121°C and 1.05kg/sq.cm (15 pounds per sq. inch) pressure. Self-
generating steam autoclaves are more dependable and faster to operate. The laminar flow
chambers provide clean filtered air that allows cultures to be handled under contamination-free
environment. Several types of laminar flow chambers are sold on the market and are available in
different sizes. The laminar-flow cabinets are located in the culture transfer area. Some large-
sized laboratories have sterile rooms in addition to laminar flow cabinets (Prakash, 1996).
2.2. Pembuatan Media in vitro
The main components of most plant tissue culture media are mineral salts and sugar as
carbon source and water. Other components may include organic supplements, growth
regulators, a gelling agent, (Gamborg et al., 1968; Gamborg and Phillips, 1995). Although, the
amounts of the various ingredients in the medium vary for different stages of culture and plant
species, the basic MS (Murashige and Skoog, 1962) and LS (Linsmaier and Skoog, 1965) are the
most widely used media.
Media compositions have been formulated for the specific plants and tissues (Nitsch and
Nitsch, 1969; Conger, 1981). Some tissues respond much better on solid media while others on
liquid media. In general, the choice of medium is dictated by the purpose and the plant species or
variety to be cultured. Plant extracts such as coconut milk, banana extract, and tomato juice can
be very effective in providing undefined mixture of organic nutrients and growth factors.
2.3. Isolasi dan Inokulasi Explant
Isolation is the process of making certain parts of the body sires to be embedded into your
PDA media. That part is going to grow into a pure culture. Insulation must be done very
carefully and cautious because it determines the resulting purity culture. Tissue culture planting
material derived from plant or plant tissue, either in the form of meristems, shoots and roads.
Tissue culture planting material is called the explant. Usually the tissue explant derived from
plants that are still actively dividing, and the goal of plant breeding is taken mikropropagasi plant
organ that is not derived from the generative organs. Explant to be planted (inoculated) in tissue
culture media must be in a state of sterile free of microorganisms. Separation plant and the
sterilization process is called isolation (Jackson, 2003).
2.4. Aklimatisasi
Acclimatization is the process of adjustment of the conditions of micro plantlets in bottles
(heterotrophic) to external environmental conditions (autotrophs). Plantlets were maintained under sterile
conditions in the environment (temperature and humidity) optimal, highly vulnerable to the external
environment (field). Plantlets were grown in culture in the laboratory has a different characteristic leaf
plantlets were grown in the field. Leaves of plantlets in general have a more open stomata, number of
stomata per unit area more, and often do not have a waxy coating on their surface. Thus, the plantlets are
very susceptible to low humidity. Given these properties, before planting in the field, requiring plantlets
acclimatization. Acclimatization can be conducted in a greenhouse or nursery, either in a greenhouse or
nursery. In acclimatization, growing environment (particularly moisture) gradually adapted to field
conditions. The move was made carefully and gradually, by providing containment. Hoods are used to
protect seedlings from the outside air and pest attacks because tissue culture seedlings are very susceptible
to pests and diseases outside air. Once the seedlings are able to adapt to the new environment gradually
released and the maintenance hatch seeds carried in the same manner with the generative seed
maintenance (Smith dan Spomer, 1995).
Isi gelas dengan aquades kurang lebih 50 ml
Tambahkan unsur-unsur yang sudah di stok :
Makro : 30 ml
Mikro A : 3 ml
Mikro B : 0,5 ml
Fe EDTA : 3 ml
Vitamin : 0,3 ml
CaCl2 : 3 ml
Tambahkan aquades hingga volume mencapai 300 ml
Stirer (aduk) dan ukur pH 5,8 (pH indikator)
Masukkan sukrosa (gula) dan agar-agar. Sukrosa : 9 gram dan agar-agar: 2,1 gram
Stirer (aduk) beberapa menit sampai larutan berwarna bening
Mikrowave selama 7 menit
Masukkan ke dalam botol kultur @15 ml. tutup dengan plastik dan rapatkan dengan karet gelang.
Bilas gelas dengan menggunakan aquades
III. MATERI BAHASAN
3.1. Pembuatan Media Perbanyakan (Inokulasi/Penanaman)
3.1.1. Metode (Tahap Pelaksanaan/Cara Kerja)
Tutup dengan plastik wrap dan di lubangi
3.1.2. Hasil Dan Pembahasan
Berdasarkan hasil praktikum untuk pembuatan perbanyakan media kultur,
kelompok kami tidak sampai melakukan pengamatan terhadap kontaminasi media karena
kegiatan praktikum yang dilakukan hanya sampai tahap sterilisasi dengan autoclaf.
Sedangkan kelompok kami menggunakan media kultur dari kelompok sebelumnya.
Tetapi media kultur dari kelompok sebelumnya dikatakan berhasil dan tidak
terkontaminasi. Hal ini terlihat saat penanaman berlangsung, media tidak terkontaminasi
bakteri maupun jamur sehingga dapat digunakan untuk penanaman eksplant. Hal ini
karena pembuatan media dilakukan sesuai langkah kerja dan alat-alat yang digunakan
dalam keadaan steril. Media yang banyak digunakan sampai saat ini adalah MS. Untuk
mengembangbiakan pada organogenesis yang diinginkan, kedalam media ditambahkan
zat pengatur tumbuh.
Menurut Kyte, 1996 pada prinsipnya, sterilisasi autoclave menggunakan panas
dan tekanan dari uap air. Temperature sterilasi biasanya 121o C, tekanan yang biasa
digunakan antara 15-17,5 psi (pound per square inci) atau 1 atm. Lamanya sterilisasi
tergantung dari volume dan jenis. Alat-alat dan air disterilkan selama 1 jam, tetapi media
antara 20-40 menit tergantung dari volume bahan yang disterilkan. Sterilisasi media yang
terlalu lama menyebabkan: penguraian gula, degradasi vitamin dan asam-asam amino,
inaktifasi sitokinin zeatin riboside, dan perubahan pH yang berakibatkan depolimerisasi
agar. Menurut (Smith & Spomer, 1995) persyaratan botol yang digunakan dalam kultur
in vitro adalah dapat melewatkan cahaya, mampu mengisolasi medium dari kehilangan
air, mencegah kontaminasi, memungkinkan pertukaran udara dan menyediakan area
tumbuh yang mencukupi. Penutup botol kultur yang digunakan umumnya sangat rapat
terutama untuk mencegah kontaminasi dari luar. Menurut Jackson (2003) penggunaan
penutup yang terlalu rapat dapat menghalangi pertukaran udara luar dan dalam botol,
meningkatkan kelembaban, dan meningkatkan kandungan etilen yang dapat
mempengaruhi pertumbuhan planlet.
Keluarkan dan segera masukkan ke ruang simpan
Sterilisasi autoclave 15 psi, 121°C selama 25 menit
3.2. Penanaman/Isolasi Dan Inokulasi Eksplan
3.2.1. Metode (Tahap Pelaksanaan/Cara Kerja)
a. Sterilisasi Eksplan
b. Penanaman di LAFC
3.2.2. Hasil Dan Pembahasan
NO DOKUMENTASI KETERANGAN
1
TANGGAL 6 MEI 2013
Mata tunas terlihat segar karena awal
penanaman.
2
TANGGAL 7 MEI 2013
Mata tunas tetap terlihat segar, tetapi
sebagian dari bagian ujungnya
mengalami browning akibat terkena
panas pinset saat inokulasi dan terlalu
lamanya perendaman dalam bayclean.
3
TANGGAL 8 MEI 2013
Mata tunas tetap terlihat segar dan
semakin memanjang, sehingga bagian
yang mencoklat berubah menjadi di
bagian tengah mata tunas. Muncul
cabang mata tunas baru.
4 - Libur nasional.
5
TANGGAL 10 MEI 2013
Mata tunas tetap terlihat segar dan
terus memanjang. Tetapi bagian
tengah mata tunas tetap mencoklat.
Cabang mata tunas tetap segar.
6
TANGGAL 11 MEI 2013
Mata tunas terlihat tetap segar dan
terus memanjang. Bagian tengah mata
tunas yang mencoklat semakin
menghilang. Cabang mata tunas
semakin segar.
- % eksplan yang hidup = 1/1 × 100% = 100%
- % inisiasi tunas = 1/1 × 100% = 100% dan tunas muncul 2 hari setelah inokulasi
- % inisiasi akar = 1/1 × 100% = 100% dan akar muncul 2 hari setelah inokulasi (tetapi
tidak terlihat dengan jelas munculnya akar)
- % kontaminasi = 0/1 × 100% = 0%
Setelah semua perlakuan dilaksanakan dengan runtut dan eksplan pun ditanam
pada media tanam, langkah selanjutnya adalah disimpan di ruang inkubasi untuk
dilakukan pengamatan. Berdasarkan hasil pengamatan yang dilakukan selama seminggu
setelah inokulasi didapati bahwa eksplan kentang tumbuh dengan subur. Hal ini dapat
diketahui tetap segarnya mata tunas dan semakin mengalami pemanjangan. Serta terdapat
cabang mata tunas yang baru tumbuh. Namun terlihat terjadinya browning (kecoklatan)
pada bagian eksplan akibat eksplan yang terkena panas dari pinset saat inokulasi dan
terlalu lamanya perendaman di dalam bayclean. Tetapi semakin lama bagian tersebut
hilang dan eksplant akan tumbuh menjadi planlet. Ini terjadi karena ada beberapa faktor
yang dapat mempengaruhi keberhasilan kultur jaringan.
Menurut Yusnita, 2005 bahwa faktor-faktor yang mempengaruhi keberhasilan dari
kultur jaringan antara lain adalah suhu, kelembaban relatif, cahaya, dan kondiisi eksplan.
Sedangkan untuk faktor-faktor yang mempengaruhi kontaminasi eksplan yang
diungkapkan oleh Pierik, 1999 adalah sebagai berikut :
Kualitas induk eksplan
Kualitas Media Penanaman
Pengalaman teknisi
Kualitas strelisasi eksplan, media, LAFC, Teknisi.
Konsentrasi Nutrisi pada media Penanaman
Kadar kontaminan di lingkungan
Salah satu yang sangat mempengaruhi pertumbuhan dan morfogenesis eksplan
dalam kultur invitro adalah genotip tanaman asal eksplan diisolasi. Hasil-hasil penelitian
menunjukan bahwa respon masing-masing eksplan tanaman sangat bergantung dari
spesies, bahkan varietas, atau tanaman asal eksplan tersebut. Pengaruh genotip ini
umumnya berhubungan erat dengan faktor-faktor lain yang mempengaruhi pertumbuhan
eksplan, seperti kebutuhan nutrisi, zat pengatur tumbuh, dan lingkungan kultur. Oleh
karena itu, komposisi media, zat pengatur tumbuh, dan lingkungan pertumbuhan yang
dibutuhkan oleh masing-masing varietas tanaman bervariasi meskipun teknik kultur
jaringan yang di gunakan sama. Perbedaan komposisi media, seperti jenis dan komposisi
garam-garam anorganik, zat pengatur tumbuh sangat mempengaruhi respon eksplan saat
dikulturkan. Perbedaan komposisi media biasanya sangat mempengaruhi arah
pertumbuhan dan regenerasi eksplan.
Seperti apa yang dikemukakan oleh Andria bin Muhayat bahwa “eksplan yang
terkontaminasi akan menunjukkan gejala seperti berwarna putih sampai biru (disebabkan
jamur) atau busuk (disebabkan bakteri) (Zulkarnain, 2009). Browning was a serous
problem for culture of Delaware protoplasts. Previous reports indicate that protoplasts of
dihaploid clones and commercial cultivars of potato have shown a similar phenomenon.
The reason for polarised browning is unknown, but this could be due to local changes in
pH on one side of the protoplasts, or alterations of components, particularly Fe2+
ions in
the culture medium. However, this phenomenon needs to be studied in more details
(Tavazza,1986).
3.3. Pembuatan Stok Media MS
Menghitung kebutuhan induk
Menyiapkan larutan induk yang telah di hitung dengan rumus pengenceran
Mencampur bahan dasar ke dalam beker glass ditambah sukrosa
Dan aquades steril
Mengukur Ph
Menambah agar kedalam media
Siapkan botol kultur
Tuang larutan ke dalam botol
Sterilkan dengan autoclave
Siampan dalam ruang simpan
Media Murashige dan Skoog (MS) sering digunakan karena cukup memenuhi unsur hara
makro, mikro, dan vitamin untuk pertumbuhan tanaman. Nutrien yang tersedia di media berguna
untuk metabolisme, dan vitamin pada media dibutuhkan oleh organisme dalam jumlah sedikit
untuk regulasi. Pada media MS, tidak terdapat zat pengatur tumbuh (ZPT) oleh karena itu ZPT
ditambahkan pada media (eksogen). ZPT atau hormon tumbuhan berpengaruh pada pertumbuhan
dan perkembangan tanaman. Interaksi dan keseimbangan antara ZPT yang diberikan dalam
media (eksogen) dan yang diproduksi oleh sel secara endogen menentukan arah perkembangan
suatu kultur (Zulkarnain, 2009).
3.4. Aklimatisasi
Aklimatisasi adalah kegiatan pemindahan plantlet (tanaman kecil) dari media in vitro ke
media in vivo (lingkungan sebenarnya). Proses pemindahan ini memerlukan keadaan yang
mendukung agar plantlet tidak mengalami stress lingkungan. Di antara kegiatan yang dilakukan
adalah memberikan kelembaban tinggi hingga 80% dan struktur media remah serta kandungan
nutrisinya yang memadai selama masa transisi plantlet. Akan tetapi pada kegiatan praktikum
kultur jaringan ini, proses kultur jaringan kentang tidak sampai pada tahap aklimatisasi
dikarenakan tidak ada alat yang mendukung (hanya sampai inkubasi saja). Planlet sangat rentan
terhadap kelembaban rendah. Mengingat sifat-sifat tersebut, sebelum ditanam di lapang, planlet
memerlukan aklimatisasi. Aklimatisasi dapat dilakukan di rumah kaca atau pesemaian, baik di
rumah kaca atau pesemaian. Dalam aklimatisasi, lingkungan tumbuh (terutama kelembaban)
berangsur-angsur disesuaikan dengan kondisi lapang.
Rainiyati, dkk (2011) menjelaskan bahwa pada aklimatisasi awal dalam kultur jaringan
kentang dilakukan pemindahan planlet dari lingkungan in vitro ke lingkungan semi steril dalam
medium greenleaf yang steril dengan penambahan unsur-unsur hara dari larutan stok MS½. Pada
tahap ini planlet diadaptasikan dari lingkungan heterotrof kelingkungan autorotrof dan induksi
untuk membentuk tunas sebagai bahan setek yang siap ditanam. Sebelum ditanam, setek mikro
(planlet) tersebut dibersihkan terlebih dahulu dari sisa-sisa medium kultur (agar) yang melekat
pada akar dengan cara mencucinya di bawah air mengalir. Kemudian planlet ditanam pada
medium greenleaf yang ditempatkan pada bak-bak aklimatisasi yang ditutup kain kasa dan
dipelihara selama 2 minggu.
Tahap awal aklimatisasi adalah menyediakan media tanam dari campuran tanah topsoil
dan kompos dengan perbandingan 1 : 1 yang telah disterilkan dengan sistem penguapan panas
dalam kukusan. Medium tanam selanjutnya dimasukkan dalam bak-bak penanaman berukuran 40
x 32 x 8 cm. Pemeliharaan selama aklimatisasi meliputi penyiraman, pembuangan tanaman yang
mati serta penyulaman. Penyiraman dilakukan setiap hari dengan menggunakan handprayer.
Untuk menjaga pertumbuhan yang baik tanaman disemprot dengan larutan pupuk NPK(3g L-1)
dan bayfolan (2ml L-1).
IV. KESIMPULAN
Berdasarkan kegiatan praktikum produksi benih dengan kultur jaringan yang telah dilakukan
maka didapatkan kesimpulan sebagai berikut :
Kesterilan media sangat mempengaruhi keberhasilan dari kultur jaringan.
Selain itu ada beberapa faktor yang mempengaruhi kontaminasi eksplan, antara lain:
Kualitas induk eksplan
Kualitas media penanaman
Pengalaman teknisi
Kualitas strelisasi eksplan, media, dan LAFC
Konsentrasi nutrisi pada media penanaman
Kadar kontaminan di lingkungan
Hasil kultur jaringan eksplan kentang yang diamati selama seminggu setelah inokulasi didapati
bahwa eksplan dalam keadaan segar dan tumbuh menjadi planlet.
DAFTAR PUSTAKA
Conger, B.V. 1981. Cloning Agricultural Plants via In Vitro Techniques. CRC Press, Boca Raton, FL
Gamborg, O.L. and Phillips, G.C. 1995. Media preparation and handling. In: Plant Cell, Tissue and
Organ Culture - Fundamental Methods. Gamborg, O.L. and G.C. Phillips (Eds.). Springer-
Verlag: Berlin. Pp.21-34.
Gamborg, O.L., Miller, R.A. and Ojima, K. 1968. Nutrient requirements of suspension cultures of
soybean root cells. Exp. Cell Res. 50: 151-158.
Kyte, Lydiane, & John Kleyn. 1996. Plants from Test Tubes. Timber Press: USA.
Jackson, MB. 2003. Aeration stress in plant tissue culture. Bulg J Plant Pysiol 28, 96-109.
Linsmaier, E.M. and Skoog, F. 1965. Organic growth factor requirements of tobacco tissue cultures.
Physiol. Plant. 18: 100-127.
Murashige, T. and Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco
tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473-497.
Nitsch, J.P. and Nitsch, C. 1969. Haploid plants from pollen grains. Science, 163: 85-87.
Pierik, R.L.M. 1999. In Vitro Culture of Higher Plants. Martinus Nijhoff: Dordrecht.
Prakash, J. 1996. Biovillage Biotechnologies. Rep. Asian Biotechnology and Biodiversity Farmer
Centred Agriculture Resource Management (FARM) Programme, UNDP/FAO/UNIDO. In
Vitro International: Bangalore, India.
Rainiyati, dkk. 2011. Proses Penyediaan Bahan Setek Kentang Asal Kultur Jaringan untuk Produksi
Bibit Kentang Mini pada Kelompok Tani Kentang di Kecamatan Kayu Aro Kabupaten Kerinci
ProvinsiJambi. Jurnal Pengabdian pada Masyarakat N0. 52 Tahun 2011.
Smith M & L Spomer. 1995. Vessels, gels, liquid media, and support system. In: J Aitken-Christie, T
Kozai & ML Smith (eds.) Automation and Environmental Control in Plants Tissue Culture.
Netherlands, Kluwer Academic Publishers. p. 371-404.
Tavazza, R. and Ancora, G. Plant regeneration from mesophyll protoplasts in commercial potato
cultivars (Primura, Kenebec, Spunta, Desiree). Plant Cell Rep., 5: 243-46, (1986).
Yusnita.2005.Kultur Organ Tanaman Eksplan. Balai Pengakajian Ilmiah. Universitas Sudirman:
Yogyakarta.
Zulkarnain. 2009. Kultur Jaringan Tanaman. Bumi Aksara: Jakarta.
KRITIK DAN SARAN UNTUK PRAKTIKUM
Sebenarnya untuk praktikum teknologi produksi benih sudah cukup baik. Tapi perlu adanya
perbaikan untuk koordinasi antara asisten dan praktikan agar praktikum dapat berjalan dengan lancar
dan menyenangkan.
Kritik :
Penjelasan tentang materi kultur jaringan sendiri kurang detail, sehingga beberapa materi
belum tersampaikan kepada praktikan. Namun dengan adanya fieldtrip lapang tentang kultur
jaringan anggrek dapat menyempurnakan materi kultur jaringan dari asisten.
Saran :
Karena sebagian besar hasil kultur jaringan praktikan menjadi kontam, sehingga perlu
diantisipasi sebelum praktikum kultur jaringan, yaitu dengan cara diberikan cara yang tepat agar
kontaminasi dapat diminimalisir. Semoga praktikum Teknologi Produksi Benih, khususnya kultur
jaringan bisa lebih baik lagi untuk ke depannya.
Semangat
top related