le diagnostic préimplantatoire (dpi) couplé au typage hla

Le diagnostic préimplantatoire (DPI)Le diagnostic préimplantatoire (DPI)Couplé au typage HLA Couplé au typage HLA

Service de génétique médicaleService de génétique médicaleHôpital Necker-Enfants MaladesHôpital Necker-Enfants Malades

ParisParis

Philippe BURLETPhilippe BURLET

Partie I

QU’EST CE QUE LE DPI AVEC TYPAGE HLA ?

Historique

- Première naissance après FIV à Londres en 1978

Historique

- Première naissance après FIV à Londres en 1978

- Première naissance après FIV à Paris en 1982

AMANDINEAMANDINE

Historique

- Première naissance après FIV à Londres en 1978

- Première naissance après FIV à Paris en 1981

- Première naissance après DPI à Londres en 1992

Pr ALAN HANDYSIDEPr ALAN HANDYSIDE

Historique

- Première naissance après FIV à Londres en 1978

- Première naissance après FIV à Paris en 1981

- Première naissance après DPI à Londres en 1992

- Première naissance après DPI à Paris en 2000

Valentin

Historique

- Première naissance après FIV à Londres en 1978

- Première naissance après FIV à Paris en 1981

- Première naissance après DPI à Londres en 1992

- Première naissance après DPI à Paris en 2000

- Première naissance après DPI-HLA à Chicago en 2000

ADAM

Historique

- Première naissance après FIV à Londres en 1978

- Première naissance après FIV à Paris en 1981

- Première naissance après DPI à Londres en 1992

- Première naissance après DPI à Paris en 2000

- Première naissance après DPI-HLA à Chicago en 2000

- Première naissance après DPI-HLA à Paris en 2011

3 centres en France :

PARISSTRASBOURGMONTPELLIER

ObstétricienObstétricienss Sage femmeSage femme

GénéticienGénéticien

CytogénéticienCytogénéticien

Biologiste MoléculaireBiologiste Moléculaire

Biologiste de la Biologiste de la Reproduction Reproduction

PsychologuePsychologue

PédiatrePédiatre

HématologueHématologue

Centre de DPI Centre de DPI PluridisciplinairePluridisciplinaire

- Anomalie(s) responsable(s) préalablement identifiées

- Recherche uniquement de cette anomalie

La législation française

- Autorisé qu’à titre exceptionnel

- maladie génétique d’une particulière gravité reconnue comme incurable au moment du diagnostic

Loi de bioéthique de 1994 :

Le 06 août 2004 : extension au DPI + HLA et Huntington (test d’exclusion)

le diagnostic a pour seuls objets de rechercher la maladie génétique

d'une part, et de permettre l'application de la thérapeutique, d'autre

part.

La réalisation du diagnostic est soumise à la délivrance d'une

autorisation par l'Agence de la biomédecine

Le DPI pour qui ?

Quelques maladies autosomiques récessives

Mucoviscidose - Amyotrophie spinale - Drépanocytose - Bêta-thalassémie - Ataxie de Friedreich –Maladie de Tay-Sachs - Nanisme

diastrophique - Polykystose rénale autosomique récessive - Epidermolyse Bulleuse

Quelques maladies autosomiques dominantes

Dystrophie myotonique de Steinert – STB -Neurofibromatose - Maladie de Huntington - Achondroplasie - Atrophie optique dominante -

Currarino - Charcot-Marie Tooth type 1A - Brachydactylie - Maladie de Hirschsprung - Maladie de von Hippel-Lindau - Néoplasie endocrinienne

multiple - Ostéogénèse imparfaite - Rétinoblastome héréditaire -

Quelques maladies liées à l'X  

Syndrome de l'X fragile - Myopathie de Duchenne et Becker - Hémophilie - Syndrome de Wiscott Aldrich - Syndrome de Lesch-Nyhan

- Rétinite pigmentaire lié à l'X - Pelizaeus Merzbacher - Myopathie myotubulaire - Maladie de Fabry - Incontinentia pigmenti -

Hydrocéphalie liée à l'X - Maladie de Hunter - Déficit en OTC -  

Quelques maladies mitochondriales  

NARP – MERF - MELAS 

Diagnostic d’exclusion  

Huntington, CADASIL, …  

Les autres formes de DPI

• DPI chromosomique

• PGS

• Sexing

DPI chromosomique

0

500

1000

1500

2000

2500

nombre de cycles débutés

translocationrobertsoniennetranslocationréciproqueaneuploïdie

autres

Aneuploïdie screening

• Âge maternel avancé

• Avortements spontanés

• Fausses couches répétées

« Sexing »

0

50

100

150

200

250

300

350

400

FISHFISH +ASPCR

CGH array

Harper 2011

Le DPI/HLA dans le mondeLe DPI/HLA dans le monde

• Anémie de Fanconi

• drépanocytose

• Béta/alpha Thalassémie

• Syndrome Wiscott-Aldrich

• X-ALD

• Hyper IGM syndrome

• Dysplasie ectodermique hypohydrotique

• Syndrome d’Omen

• Ataxie télangiéctasie

• Granulomatose chronique

• Neutropénie congénitale sévère

Les demandes de DPI / HLALes demandes de DPI / HLA

Drépanocytose Drépanocytose

Béta-thalassémie Béta-thalassémie

Béta-thal/drépano Béta-thal/drépano

Anémie de Fanconi Anémie de Fanconi

Alpha thalassémie Alpha thalassémie

AutresAutres((granulomatose septique chronique, Schwachman-Diamond)granulomatose septique chronique, Schwachman-Diamond)

« preimplantation HLA typing » « preimplantation HLA typing »

• Leucémies Leucémies • Blackfan DiamondBlackfan Diamond• Wiscott AldrichWiscott Aldrich

En 2010, cela fait vingt ans que le DPI existe et 50 000 cycles ont été effectués dans le monde.

Les mille premières naissances ont été atteintes en 2004.

On peut compter près de 10000 naissances.

A peu près un quart des cycles de DPI effectués le sont pour des maladies monogéniques.

Le taux de grossesse après DPI est de 22%.

Partie IILes étapes du DPI

Stimulation ovarienne

hormoneshormonesovaireovaire

DécapeptylDécapeptyl

3,0 mg3,0 mg, , IMIM

Env. 3 semainesEnv. 3 semaines

Pendant les règlesPendant les règles

ou à J18-22ou à J18-22

ponctionponction transferttransfert

Traitement de stimulationTraitement de stimulation

Inhibition de l’hypophyse :Inhibition de l’hypophyse :

blocage de la fonction ovarienneblocage de la fonction ovarienneStimulation de la fonction ovarienneStimulation de la fonction ovarienne

Schéma thérapeutiqueSchéma thérapeutique

Agoniste Retard (DPI)Agoniste Retard (DPI)

hCGhCGovulatioovulationn

Environ 12 joursEnviron 12 jours

Contrôles (prises de sang + échographies) Contrôles (prises de sang + échographies)

3-5 fois pendant cette période à Béclère3-5 fois pendant cette période à Béclère

biopsiebiopsie

ovulation

ovocyte

ovocyte

Ponction ovocytaire

ICSI

ovocyte

ICSI

ovocyte

Le clivage du zygote

ovocyte

Le clivage du zygote

2 pronucléi

Le clivage du zygote

2 blastomères

2 pronucléi

Le clivage du zygote

2 blastomères

4 blastomères2 pronucléi

Le clivage du zygote

2 blastomères

4 blastomères 8 blastomères

2 pronucléi

biopsie

8 blastomères

biopsie

8 blastomères

LaserLaser

biopsie

8 blastomères

LaserLaser

2 blastomères

8 blastomères

biopsie

Lyse des blastomères

Lyse des blastomères

Extraction d’ADN

Amplification pan-génomiqueAmplification pan-génomique

Multiple Displacement Multiple Displacement AmplificationAmplification

PCRPCR

PCRPCR

Mutation Marqueurs HLAMutation Marqueurs HLA

Détermination des embryonsDétermination des embryons sains sains

Mutation Mutation Marqueurs Marqueurs HLAHLA

Détermination des embryonsDétermination des embryons sains sains

Mutation Mutation Marqueurs Marqueurs HLAHLA

++ ++++-- --

Détermination des embryonsDétermination des embryons sains sains

Mutation Mutation Marqueurs Marqueurs HLAHLA

++ ++++-- --

Détermination des embryonsDétermination des embryons sains sains

Mutation Mutation Marqueurs Marqueurs HLAHLA

++ ++++-- --++ ++++-- --

Détermination des embryonsDétermination des embryons compatibles compatibles

Mutation Marqueurs Mutation Marqueurs HLAHLA

++ ++++-- --++ ++++-- --

Détermination des embryonsDétermination des embryons compatibles compatibles

Mutation Marqueurs Mutation Marqueurs HLAHLA

++ ++++-- --++ ++++-- --

++ ------ --

Détermination des embryonsDétermination des embryons compatibles compatibles

Mutation Marqueurs Mutation Marqueurs HLAHLA

++ ++++-- --++ ++++-- --

++ ------ --

Transfert des embryons

Grossesse

Naissance

NaissanceNaissance

GreffeGreffe

guérisonguérison

Embryons HLA compatible Embryons HLA compatible 16-17% 16-17%

((25%25% attendu) attendu)

et non atteint (et non atteint (11%11% contre contre 18%18% attendu) attendu)

    Take home baby rate = Take home baby rate = 9%9%

Résultats Résultats

Partie II

LE DIAGNOSTIC MOLECULAIRE

La PCR

Science, like nothing else among the institutions of mankind, grows like a weed Science, like nothing else among the institutions of mankind, grows like a weed every year. Art is subject to arbitrary fashion, religion is inwardly focused and driven every year. Art is subject to arbitrary fashion, religion is inwardly focused and driven only to sustain itself, law shuttles between freeing us and enslaving us. only to sustain itself, law shuttles between freeing us and enslaving us.

La PCR

La PCR

Méthodes d’analyse

• Le gel d’agarose

• Le séquenceur

Méthodes d’analyse

Les fragments d’ADN sont chargés négativement. Placés dans un Les fragments d’ADN sont chargés négativement. Placés dans un champ électrique, ils vont se déplacer de la cathode vers l’anode. Plus champ électrique, ils vont se déplacer de la cathode vers l’anode. Plus les fragments sont petits, plus ils vont migrer rapidement. les fragments sont petits, plus ils vont migrer rapidement.

• Le peu de matériel biologique disponible

Les difficultés du DPI

Analyse génétique 1-2 cellules/embryon

10 Millions

de cellules

Extraction d ’ADN

Analyse Génétique

DPIDPN

• Le peu de temps pour le diagnostic

Les difficultés du DPI

Rendu des résultats en 24h

pour transfert à J4

Rendu des résultats en

une semaine

DPIDPN

• Les risques de contamination

Les difficultés du DPI

Spermatozoïde Cellules du manipulateur

Cellules de la mère

Fragment d’ADN (amplification précédente)

• La qualité des embryons

Les difficultés du DPI

Absence de noyau

Noyau en dégénérescence

/ mauvaise morphologie

Pas de diagnostic

CMCN

Les difficultés du DPI

• allele drop out

Détermination des embryonsDétermination des embryons compatibles compatibles

Mutation Marqueurs HLAMutation Marqueurs HLA

++ ++++-- --++ ++++-- --

++ ------ --

deux méthodes alternatives utilisées deux méthodes alternatives utilisées ::

• AnalyseAnalyse directedirecte : :

détection de la MUTATIONdétection de la MUTATION • AnalyseAnalyse indirecteindirecte : :

utilisation de MARQUEURS polymorphesutilisation de MARQUEURS polymorphes

DPI - Stratégies DPI - Stratégies

L’analyse préalable

LA REGION HLALA REGION HLA

Chromosome 6Chromosome 6

LA REGION HLALA REGION HLA

6 p 216 p 21

LA REGION HLALA REGION HLA

Class IClass I

Class IIClass II

HLA-AHLA-A

HLA-CHLA-C

HLA-BHLA-B

HLA-DQHLA-DQ

HLA-DPHLA-DP

HLA-DRHLA-DR

LA REGION HLALA REGION HLA

Class IClass I

Class IIClass II

HLA-AHLA-A

HLA-CHLA-C

HLA-BHLA-B

HLA-DQHLA-DQ

HLA-DPHLA-DP

HLA-DRHLA-DR

D6SD6S276 276

D6SD6S16241624

D6SD6S510 510

D6SD6S2972 2972

D6SD6S273 273

D6SD6S1666 1666

D6SD6S2876 2876

D6SD6S2874 2874

D6SD6S2749 2749

D6SD6S1618 1618

D6SD6S1560 1560

D6SD6S439 439

D6SD6S16101610

D6SD6S1615 1615

D6SD6S426426

D6SD6S265 265

Le « génotypage » HLA

A BA B C DC D

B DB D B DB D A DA D A CA C B CB C

1/41/4

La drépanocytose

A SA S A SA S

S SS S S SS S A SA S S AS A A AA A

3/43/4

TYPAGE HLA ET DREPANOCYTOSETYPAGE HLA ET DREPANOCYTOSE

A BA B C DC D

B DB D B DB D A DA D A CA CB CB C

DREPANODREPANO

3/43/4

1 21 2 3 43 4

2 42 4 2 42 4 1 41 4 1 31 3 2 32 3

HLAHLA

1/41/4

3/163/16

DPI et HLA dossiers agence (2010)

19 dossiers constitués19 dossiers constitués

• 15 drépanocytose15 drépanocytose

• 4 béta-thalassémie4 béta-thalassémie

17 dossiers autorisés17 dossiers autorisés2 dossiers incomplets2 dossiers incomplets

4 grossesses 4 grossesses spontanéesspontanées

7 transferts7 transferts

11 couples11 couples

15 stim débutés15 stim débutés

59 embryons59 embryons

3 compatibles3 compatibles

3 enfants , 1 3 enfants , 1 compatiblecompatible

4 non compatibles4 non compatibles

QUESTIONS ETHIQUES

Risque d’instrumentalisation de la vie de cet enfant .

Risque que l’enfant décède avant la naissance du bébé compatible

Risque que la greffe échoue

Risque de négligence pour les frères et sœurs

Alternatives thérapeutiques : pas encore fiables (banques de donneurs)

Les embryons sains non HLA compatibles? la loi interdit un 2ème DPI tant qu’il reste

des embryons sains transférables

Risque de dérives ? : la Loi française qui encadre le DPI est très stricte

Augmenter les possibilités ne force personne à effectuer un choix qui heurte sa morale .

M. Onfray

LA FAMA NECKER – BECLERELA FAMA NECKER – BECLERE

Génétique moléculaireGénétique moléculaire

• P. BurletP. Burlet• N. GigarelN. Gigarel• J. SteffannJ. Steffann• A. MunnichA. Munnich

CytogénétiqueCytogénétique•M. Le Lorc’hM. Le Lorc’h•S. RomanaS. Romana•M. VekemansM. Vekemans

HôpitalHôpital NeckerNecker

Biologie de la Biologie de la reproductionreproduction

•R. FrydmanR. Frydman•N . FrydmanN . Frydman•L.HestersL.Hesters•A.BenachiA.Benachi•G.TachdjianG.Tachdjian

Hôpital Hôpital Antoine-BéclèreAntoine-Béclère