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UNIVERSIDADE DE CUIBÁ
Programa de Pós-Graduação em Biociência Animal Área de Concentração Saúde Animal
LUCIANA PALÚ
AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE FERRO SÉRICO E FERRITINA EM RATOS, APÓS CLAMPEAMENTO TOTAL
DO PEDÍCULO HEPÁTICO E REPERFUSÃO, EM DIFERENTES TEMPOS
Cuiabá, 2013
UNIVERSIDADE DE CUIBÁ Programa de Pós-Graduação em Biociência Animal
Área de Concentração Saúde Animal
LUCIANA PALÚ
AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE FERRO SÉRICO E FERRITINA EM RATOS, APÓS CLAMPEAMENTO TOTAL
DO PEDÍCULO HEPÁTICO E REPERFUSÃO, EM DIFERENTES TEMPOS
Cuiabá, 2013
LUCIANA PALÚ
AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE FERRO SÉRICO E FERRITINA EM RATOS, APÓS CLAMPEAMENTO TOTAL
DO PEDÍCULO HEPÁTICO E REPERFUSÃO, EM DIFERENTES TEMPOS.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biociência Animal, da Universidade de Cuiabá – UNIC, como requisito para obtenção do Título de Mestre.
Orientador: Prof. Dr. Lázaro Manoel de Camargo
Cuiabá, 2013
FICHA CATALOGRÁFICA
Bibliotecária: Daniely Cristina Bejo da Silva / CRB1 - 0611
P184a Palú, Luciana. Avaliação da concentração de ferro sérico e ferretina em ratos, após
clampeamento total do pedículo hepático e reperfusão, em diferentes tempos / Luciana Palú. – 2013.
77f.: il.; 30cm. Orientador: Prof. Dr. Lázaro Manoel de Camargo. Dissertação (mestrado) – Universidade de Cuiabá - UNIC,
Programa de Pós-Graduação em Biociência Animal, Cuiabá, 2013. Inclui bibliografia.
1. Análise bioquímica. 2. Ferro sérico. 3. Clampeamento-pedículo hepático. 4. Reperfusão. 5. Ratos. I. Título: Avaliação da concentração de ferro sérico e ferretina em ratos, após clampeamento total do pedículo hepático e reperfusão, em diferentes tempos. II. Universidade de Cuiabá.
CDU – 619:577.1
LUCIANA PALÚ
AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE FERRO SÉRICO E FERRITINA EM RATOS, APÓS CLAMPEAMENTO TOTAL
DO PEDÍCULO HEPÁTICO E REPERFUSÃO, EM DIFERENTES TEMPOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biociência Animal, da Universidade de Cuiabá – UNIC, como requisito para obtenção do Título de Mestre. Orientador: Prof. Dr. Lázaro Manoel de Camargo
BANCA EXAMINADORA
______________________________________ Prof. Dr. Lázaro Manoel de Camargo - UNIC
______________________________________________ Profa. Dra. Ana Helena Benetti Gomes - UNIC
______________________________________________ Profa. Dra. Lisiane Pereira de Jesus - UFMT
Cuiabá, ___ de ____________ de 2013.
Conceito Final: _____________
Aos meus pais , pelo exemplo de persistência e honestidade, a mim pelo comprometimento e dedicação e ao Lázaro pela paciência, tolerância e pelas agradáveis horas compartilhadas. Em especial ao meu filho Guilherme Palú pelo carinho, incentivo e pela luz que trouxe à minha vida.
AGRADECIMENTOS Ao Prof. Dr. Lázaro Manoel de Camargo, meu orientador, por sua dedicação, contribuição científica e profissionalismo. Ao Prof. Dr. Sílvio Henrique de Freitas, meu coorientador, pelo comprometimento, ensinamentos e profissionalismo. À Profa. Dra. Ana Helena Benetti Gomes por participar das minhas bancas de qualificação e defesa de dissertação, pela paciência e pelos apontamentos que ajudaram em muito o meu crescimento como pesquisadora. À Prafa. Dra. Lisiane Pereira de Jesus por participar de minha banca de defesa de dissertação e pelas correções e incentivos realizados à minha pessoa que muito engrandeceram como profissional. À Universidade de Cuiabá que colaborou e propiciou esse mestrado com competência, pela oportunidade e pela contribuição para meu crescimento pessoal e profissional. Ao Prof. Dr. Marcelo Diniz dos Santos pela brilhante coordenação do nosso Mestrado e pelo companheirismo e comprometimento durante essa minha jornada. Ao Prof. Dr. Carlo Ralph De Musis pelo infinito conhecimento, pelo carinho, comprometimento e ajuda com a parte de estatística de minha dissertação. À Fundação de Amparo a Pesquisa de Mato Grosso – FAPEMAT por acreditar no meu trabalho e financiar o mesmo propiciando sua conclusão. À minha eterna chefe Ilza Marta de Souza pelo companheirismo, comprometimento, pela amizade sincera e profícua e por todos os ensinamentos de vida que permitiram meu crescimento pessoal. Ao amigo Márcio Ferrari pelo incentivo e pela eterna amizade e por esse ser fantástico que és. À professora Ângela Maria Nolasco Monteiro por acreditar em mim e no meu trabalho no início de minha carreira e pela eterna amizade e dedicação para comigo. À Profa. Lívia Saab Muraro pela consideração e ajuda na realização da parte experimental da minha dissertação. Aos funcionários e professores do Hospital Veterinário da Universidade de Cuiabá pela ajuda e dedicação durante a realização da parte experimental de minha dissertação. Ao acadêmico William Barella da Rocha pelo companheirismo e dedicação no acompanhamento e na coleta e processamento dos materiais gerados na parte experimental de minha dissertação.
Ao funcionário Willian Carneiro de Franca Leão pelo carinho e ajuda com os animais do biotério. Aos colegas Nestor Albino de Aguiar Junior e Cristiane Calçada pelo comprometimento e pela ajuda na realização dos exames laboratoriais da parte experimental de minha dissertação. Aos colegas do mestrado pelo companheirismo, pela paciência e agradável convívio. Ao professor Walmir Cibin Watanabe, meu professor de Inglês, que contribuiu com minha formação e possibilitou minha proficiência. Aos amigos Inês Gameiro Colvara Beloli, Michelle Igarashi e Kledir Anderson H. Spohr pelo carinho, paciência, pelo incentivo, pela maravilhosa amizade e pelos momentos de alegria que passamos juntos durante esses dois anos.
“O tempo é muito lento para os que esperam, Muito rápido para os que têm medo, Muito longo para os que lamentam,
Muito curto para os que festejam, Mas, para os que amam, o tempo é eterno.”
Shakespeare
AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE FERRO SÉRICO E FERRITI NA EM RATOS, APÓS CLAMPEAMENTO TOTAL DO PEDÍCULO HEPÁTICO E
REPERFUSÃO EM DIFERENTES TEMPOS
RESUMO
No trauma hepático, torna-se necessário o bloqueio do fluxo sanguíneo para facilitar as manobras cirúrgicas reparadoras. Uma das formas de conter essa hemorragia é por meio do clampeamento total do pedículo hepático (artéria hepática, veia porta e colédoco). No entanto, esse procedimento resulta na congestão esplâncnica e, consequentemente, perfusão sanguínea deficiente de órgãos como fígado, estômago, intestino delgado, parte anterior do intestino grosso, pâncreas e baço. Além disso, ao restabelecer o fluxo sanguíneo desses órgãos, novas complicações, além das lesões já causadas pelo clampeamento, surgirão. Avaliou-se neste estudo, as concentrações de ferro sérico e ferritina após desclampemaneto do pedículo hepático em vários tempos. Foram utilizados 42 ratos Wistar, machos, com três meses de idade e peso médio 300 gramas, distribuídos aleatoriamente em quatro grupos experimentais: grupo controle (GC) – representados por seis animais que não foram submetidos ao clampeamento do pedículo hepático; grupo E10, representado doze animais que foram submetidos ao clampeamento do pedículo hepático por 10 minutos; grupo E20, representado doze animais que foram submetidos ao clampeamento do pedículo hepático por 20 minutos e grupo E30, representado doze animais foram submetidos ao clampeamento do pedículo hepático por 30 minutos. Cada grupo clampeado foi subdividido em quatro subgrupos representados por três animais, nos quais desclampeados para reperfusão: subgrupo R15, - submetidos a 15 minutos de reperfusão, subgrupo R30 - submetidos a 30 minutos de reperfusão, grupo R60 - submetidos a 60 minutos de reperfusão e grupo R120 - submetidos a 120 minutos de reperfusão.
Palavras chaves: Ferritina. Ferro sérico. Isquemia. Ratos wistar. Reperfusão.
Determination of serum iron and ferritin in rats af ter total hepatic pedicle clamping and reperfusion at different times.
ABSTRACT
In hepatic trauma, it is necessary the blocking of the blood flow to facilitate reparative surgical maneuvers. One way to stop this hemorrhage is through total clamping of the hepatic pedicle (hepatic artery, portal vein and common bile duct). However, this procedure results in splanchnic congestion and hence poor blood perfusion of organs such as liver, stomach, small intestine, anterior part of the large intestine, pancreas, and spleen. Furthermore, by restoring blood flow to those organs, new complications, as well as injuries caused by clamping, arise. This study evaluated, the concentrations of serum iron and ferritin after the declamping of pedicular liver at various times. It was used a total of 42 male Wistar rats with three months old and weighting 300 grams, randomly divided into four groups: control group (CG) - represented by six animals that haven´t been submitted to the hepatic pedicle clamping; E10 Group, represented by twelve animals which have been submitted to the hepatic pedicle clamping for 10 minutes; E20 group, represented by twelve animals which have been submitted to the hepatic pedicle clamping for 20 minutes and E30 group, represented by twelve animals which have been submitted to the hepatic pedicle clamping for 30 minutes. Each group has been subdivided into four clamped subgroups represented by three declamping animals from reperfusion: subgroup R15, - submitted to 15 minutes of reperfusion, subgroup R30 - subjected to 30 minutes of reperfusion, group R60 - subjected to 60 minutes of reperfusion and group R120 - subjected to 120 minutes of reperfusion.
Keywords: Ferritin. Iron. Ischemia. Male Wistar. Reperfusion.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Tabela 1 – Valores médios de ferro sérico (mcg/dL) em ratos submetidos a 10 (T10), 20 (T20) e 30 (T30) minutos de clampeamento seguidos de reperfusão por 15, 30, 60 e 120 minutos.
72
Tabela 2 - Tabela 2 – Valores médios de ferritina (ng/mL) em ratos submetidos a 10 (T10), 20 (T20) e 30 (T30) minutos de clampeamento seguidos de reperfusão por 15, 30, 60 e 120 minutos.
72
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - A: Vilo intestinal normal, não isquêmico, de intestino delgado eqüino. B: Mucosa de intestino delgado eqüino após 60 minutos de obstrução estrangulatória
21
Figura 2 - Eventos celulares relacionados à conversão da xantina
desidrogenase a xantina oxidase durante a hipóxia. 26
Figura 3 - Transporte do ferro através do epitélio intestinal 36 Figura 4 - Transporte do ferro através da membrana do macrófago 36 Figura 5 - Endocitose do complexo transferrina-receptor da
transferrina 38
Figura 6 - Homeostase do ferro 39 Figura 7 - Molécula de ferritina com átomos de ferro em sua poção
central 40
Figura 8 - Regulação molecular da produção da hepcidina 44 Figura 9 - Animal sendo submetido a tosquia da região abdominal
com máquina tosquiadeira 64
Figura 1 0 - Anti-sepsia da região abdominal do animal com PVPI
tópico 64
Figura 1 1 - Panos de campos colocados sobre o animal 65 Figura 1 2 - Celiotomia pré-reto umbilical com bisturi 65 Figura 1 3 - Ampliação da incisão da cavidade abdominal com
tesoura Merzenbaum 66
Figura 1 4 - Ilustração do pedículo hepático 66 Figura 1 5 - Apresentação do hilohepático 67 Figura 1 6 - Clampeamento do pedículo hepático com pina vascular 67 Figura 1 7 - Animais durante a isquemia e a reperfusão 68 Figura 1 8 - Animais durante a reperfusão 68 Figura 1 9 - Intestino delgado e estômago congestos após 70
clampeamento do pedículo hepático. Figura 20 -
Notar em C (grupo controle) pigmento de hemossiderina dentro do macrófagos, aumenta progressivamente (setas), nos grupos E1 (10 minutos), E2 (20 minutos) e E3 (30 minutos). Reação de Perls (Ferrocianeto-férrico) 10X.
71
Figura 2 1 - Concentração de ferro sérico (mcg/dl) de ratos
submetidos ao clampeamento (isquemia) seguido de reperfusão por 15, 30, 60 e 120 minutos.
73
Figura 2 2 - Concentração de ferritina (ng/ml) de ratos submetidos ao
clampeamento (isquemia) seguido de reperfusão por 15, 30, 60 e 120 minutos.
74
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 17 2 REVISÃO DE LITERATURA 20 2.1 ISQUEMIA 20 2.2 REPERFUSÃO 23 2.2.1 Patofisiologia da injúria de reperfusão 25 2.3 METABOLISMO DO FERRO 31 2.3.1 Absorção intestinal do ferro 33 2.3.2 Transporte do ferro para os tecidos 37 2.3.3 Ferritina 40 2.3.4 Sobrecarga de ferro 44 REFERÊNCIAS
48
3 3.1 3.2
OBJETIVOS OBJETIVO GERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS
56
56
56
4 ARTIGO 57 AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE FERRO SÉRICO E
FERRITINA EM RATOS, APÓS CLAMPEAMENTO TOTAL DO PEDÍCULO HEPÁTICO E REPERFUSÃO, EM DIFERENTES TEMPOS
4.1 INTRODUÇÃO 60 4.2 MATERIAL E MÉTODO S 62 4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 69 4.4 CONCLUSÃO 74 REFERÊNCIAS 75 5. CONCLUSÕES GERAIS
79
1.INTRODUÇÃO
O sistema digestório está envolvido com secreções e absorções de
nutrientes, tais como: minerais, proteínas, vitaminas, açúcares e gorduras. As
enzimas e alguns tipos de ácidos estão envolvidos na digestão dos alimentos. A bile,
o suco pancreático e a água também contribuem no processo. O sistema digestório
possui uma barreira mucosa capaz de protegê-lo contra as ações do suco gástrico
durante o processo de digestão, além de impedir a penetração de microorganismos
patogênicos no organismo. A absorção de nutrientes, vitaminas e minerais está
localizada no intestino delgado (CAMARGO, 2004).
Restrepo e Felix (1994) observaram que a isquemia intestinal constitui uma
injúria associada a alta letalidade. Com o aumento crescente de problemas que
afetam a sociedade moderna, a enfermidade vascular abdominal adquire
preponderante importância epidemiológica. A gravidade e a extensão da necrose
intestinal isquêmica dependem do vaso principal afetado, da qualidade e da
circulação colateral e de sua capacidade de resposta, além do estado da circulação
geral e do grau de reperfusão. A isquemia resulta na liberação de grande quantidade
de agentes tóxicos endógenos, que são produtos normais e do metabolismo celular,
gerados inicialmente pela hipoperfusão e anóxia, agravando-se com a reperfusão
dos tecidos afetados. Esses produtos tóxicos exercem ação deletéria, tanto local,
como sistêmica.
Devido à lesão de mucosa, a isquemia se torna particularmente grave no
intestino, desencadeando efeitos intensos e complexos, em decorrência da absorção
de endotoxinas e da ocorrência de distúrbios hidroeletrolíticos e no equilíbrio ácido-
base, que se manifestam em órgãos à distância e cujo tratamento é mais difícil que
a correção dos distúrbios isquêmicos ou ressecção cirúrgica intestinal (MOORE,
1990).
Nas lesões sangrantes dos órgãos drenados pelo sistema porta, torna-se
necessário o bloqueio de seus vasos sanguíneos para que procedimentos cirúrgicos
reparadores possam ser realizados (SILVA JR. et al., 2002; ARAÚJO JR. et al.,
2005). Desde 1908, para conter hemorragias hepáticas, Pringle propôs a realização
do clampeamento total do pedículo hepático (artéria hepática, veia porta e
colédoco), procedimento que resulta na congestão esplâncnica e,
consequentemente, perfusão sanguínea deficiente de órgãos como fígado,
estômago, intestino delgado, parte anterior do intestino grosso, pâncreas e baço
(SEBE, 1999; CAMARGO et al., 2003; FREITAS, 2004; CAMARGO, 2004;
BRASILEIRO et al., 2007; PIRES, 2008). Na sequência, ao restabelecer o fluxo
sanguíneo hepático, reperfusão, novas agressões surgirão além das lesões já
causadas pelo período de isquemia (MIRANDA et al., 2004, SILVA, et al., 2006).
Da mesma forma, supõe-se que nos casos de dilatações vólvulo-gástrica,
encarceramentos nefro-esplênico ou gastro-esplênico, torção esplênica,
intussuscepção e torção intestinal, em que ocorre compressão seguida de
descompressão do pedículo hepático, ou seja, uma isquemia seguida de reperfusão
possa culminar com o comprometimento dos órgãos envolvidos com o sistema porta,
como fígado, baço, pâncreas, estômago, intestino delgado, além das lesões em
órgãos remotos, como pulmões, rins, coração e musculatura esquelética (CAMPOS
e YOSHIDA, 2004; MIRANDA et al., 2004; FRANCISCO NETO et al., 2005;
CAMARGO et al., 2006; TEIXEIRA et al., 2009; FREITAS et al., 2009).
O evento isquêmico inicia uma resposta inflamatória que se perpetua após a
reperfusão sanguínea, em grande parte, devido à produção de espécies reativas do
metabolismo do oxigênio (BERNADI, 2007). Esse fenômeno é conhecido como
lesão de isquemia e reperfusão. Esse evento envolve mecanismos fisiopatológicos e
vias metabólicas complexas, ainda pouco esclarecidas, porém o resultado final é a
falência de órgãos e morte do paciente (MIRANDA et al., 2004; SILVA, et al., 2006).
Sendo assim, células submetidas à isquemia, que não sofreram lesão
irreversível, com a reperfusão, em vez de se recuperarem, evoluem para morte por
necrose. Os mecanismos propostos incluem a formação de espécies reativas de
oxigênio nas células parenquimatosas, endoteliais e nos linfócitos que infiltram a
lesão, que produzidas durante a reperfusão causam lesão celular diretamente por
agredir uma variedade de moléculas celulares e indiretamente pela promoção da
síntese de mediadores pró-inflamatórios (DAEMEN et al., 2002).
O radical hidroxil (HO) é o mais reativo das espécies reativas de oxigênio
(EROs), o qual é responsável pela peroxidação lipídica e lise da membrana celular.
A presença do ferro (Fe++), íon metálico de transição, associado com o peróxido de
hidrogênio, por meio da reação de Fenton ou Haber-Weiss, potencializa a formação
do radical hidroxil (CAMPOS e YOSHIDA, 2004). Estudos desenvolvidos por Freitas
et al. (2009, 2009a), realizando o clampeamento total do pedículo hepático (manobra
de PRINGLE, 1908), mostraram, pela técnica do ferrocianeto-férrico, acúmulo
progressivo de pigmentos férricos (hemossiderina) nos macrófagos presentes no
parênquima esplênico, durante a congestão esplâncnica. Supõe-se que, com a
reperfusão, esse íon ferro acumulado alcance a corrente sanguínea, potencializando
a formação de radicais hidroxil e, consequentemente, as injúrias promovidas pelas
espécies reativas do oxigênio.
Com a evolução dos estudos na área dos transplantes hepáticos, modelos
experimentais de isquemia e reperfusão hepática têm sido muito difundidos. Além
dos transplantes hepáticos, esses modelos podem ser utilizados em inúmeras outras
situações, como em ressecções hepáticas, devido a tumores, traumas com lesão
hepática e choque hemodinâmico. Pela relevância dos resultados obtidos com a
isquemia promovida pelo clampeamento total do pedículo hepático (manobra de
Pringle modificada), em diferentes tempos (SEBE, 1999; CAMARGO, 2004; PIRES;
2008; FREITAS, 2009), propõe-se neste estudo, pesquisar a concentração de ferro
sérico e ferritina, após clampeamento total do pedículo hepático e reperfusão em
diferentes tempos.
O objetivo deste trabalho é avaliar e correlacionar a concentração de ferro
sérico e ferritina após o clampeamento total do pedículo hepático (isquemia),
seguido do desclampeamento (reperfusão), em tempos definidos. Tempos definidos
para isquemia, pelo clampeamento do pedículo hepático (10, 20 e 30 minutos),
seguido de reperfusão pelo desclampeamento em tempos definidos (15, 30, 60 e
120 minutos).
2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 ISQUEMIA
A obstrução mecânica dos vasos sanguíneos do intestino pode levar à
isquemia, que é uma redução crítica do suprimento sanguíneo, causando perfusão e
oxigenação inadequadas do tecido. Durante a isquemia intestinal, as células
realizam glicólise anaeróbia, gerando acúmulo de ácido láctico intracelular e uma
produção deficiente de ATP. O aumento da concentração sanguínea de lactato e
próton tem sido associado a um prognóstico desfavorável em cavalos com
isquemia/reperfusão de cólon maior. As células da mucosa epitelial são as mais
suscetíveis à injúria e rapidamente lesadas em virtude de comprometimento do fluxo
sanguíneo (ROWE e WHITE, 2002).
As mudanças na mucosa metabolicamente ativa isquêmica (Figura 1) podem
ser graduadas em severidade de Grau I (desenvolvimento de um espaço
subepitelial, chamado espaço de Gruenhagen, e um leve desprendimento epitelial
no topo da vilosidade) ao Grau V (completa perda da arquitetura da vilosidade, com
severa hemorragia da mucosa e perda da lâmina própria). No cólon equino, ao
contrário do intestino delgado, a isquemia completa causa necrose celular e
desprendimento de pequenos aglomerados de células epiteliais da superfície (MAIR
et al., 2002).
Figura 1 - A: Vilo intestinal normal, não isquêmico, de intestino delgado equino. As células da mucosa formam uma barreira impermeável. B: Mucosa de intestino delgado equino após 60 minutos de obstrução estrangulatória. Há perda de integridade da barreira epitelial.
Fonte: Rowe e White ( 2002).
Nas lesões sangrantes dos órgãos drenados pelo sistema porta, torna-se
necessário o bloqueio de seus vasos sanguíneos para que procedimentos cirúrgicos
reparadores possam ser realizados (SILVA JR et al., 2002; ARAÚJO JR et al., 2005).
Desde 1908, para conter hemorragias hepáticas, Pringle propôs a realização
do clampeamento total do pedículo hepático (artéria hepática, veia porta e
colédoco), procedimento que resulta na congestão esplâncnica e,
consequentemente, perfusão sanguínea deficiente de órgãos como fígado,
estômago, intestino delgado, parte anterior do intestino grosso, pâncreas e baço
(SEBE, 1999; CAMARGO et al., 2003; CAMARGO, 2004; FREITAS et al., 2006;
PIRES, 2008).
Na sequência, ao restabelecer o fluxo sanguíneo hepático, novas agressões
surgirão além das lesões já causadas pelo período de isquemia (MIRANDA et al.,
2004, SILVA et al., 2006).
Da mesma forma, supõe-se que nos casos de dilatação vólvulo-gástrica,
encarceramentos nefro-esplênico ou gastro-esplênico, torção esplênica,
intussuscepção e torção intestinal, ocorre compressão seguida de descompressão
do pedículo hepático, ou seja, isquemia seguida de reperfusão, o que pode culminar
com o comprometimento dos órgãos envolvidos com o sistema porta, como fígado,
baço, pâncreas, estômago, intestino delgado, além das lesões em órgãos remotos,
como pulmões, rins, coração e musculatura esquelética (CAMPOS e YOSHIDA,
2004; MIRANDA et al., 2004; FRANCISCO NETO et al., 2005; CAMARGO et al.,
2006; TEIXEIRA et al., 2009; FREITAS et al., 2009).
O evento isquêmico inicia uma resposta inflamatória que se perpetua após a
reperfusão sanguínea, em grande parte, devido à produção de espécies reativas do
metabolismo do oxigênio (ERMO) (BERNADI, 2007). Esse fenômeno é conhecido
como lesão de isquemia e reperfusão. Esse evento envolve mecanismos
fisiopatológicos e vias metabólicas complexas, ainda pouco esclarecidas, porém o
resultado final é a falência de órgãos e morte do paciente (MIRANDA et al., 2004;
SILVA, et al., 2006).
Darien et al. (1995) realizaram um estudo envolvendo obstrução
estrangulatória intestinal induzida em equinos, com o objetivo de avaliar e
estabelecer parâmetros de graduação para a avaliação das lesões histopatológicas
do intestino isquêmico ao longo do tempo. Os autores observaram que após uma
hora de isquemia, o escore histopatológico do grupo experimental diferiu
significativamente do grupo controle. Ocorreu separação progressiva de células
epiteliais com células adjacentes e membrana basal, formação de edema,
hemorragia e acúmulo de debris necróticos na lâmina própria. O escore
histopatológico aumentou progressivamente com duas horas de reperfusão.
Com a isquemia, ocorre falta de produção de energia na célula e inicia-se um
processo degenerativo. Com cinco minutos de isquemia já existem alterações nas
mitocôndrias, sendo que estas precedem as mudanças citoplasmáticas e de
membrana, que ocorrem nos primeiros 30 minutos, pela ativação de fosfolipases,
produção de citocinas e acumulação de ácido aracdônico (SMITH, 2002).
A persistência da isquemia promove falha no transporte de íons pelas bombas
de membrana, tornando possível a entrada do cálcio no citoplasma, e isto ativa
proteases que causam dano à membrana celular e aglutinação nuclear. O cálcio
aumentado na mitocôndria inibe a fosforilação oxidativa (SMITH, 2002).
No intestino, podem ocorrer mudanças histológicas após 30 minutos de
isquemia, quando células epiteliais da mucosa e células mesoteliais da serosa
separam-se de sua membrana basal. Este parece ser um mecanismo de separação
causado pelo movimento de água do leito vascular para o espaço subepitelial. A
separação inicialmente ocorre no ápice das vilosidades, e pode se agravar com a
persistência da isquemia. A mudança é similar no cólon, porém ocorre mais
lentamente. A serosa reage de maneira similar, com as células mesoteliais
desprendendo-se da membrana basal antes de existirem alterações de membrana
ou citoplasmáticas visíveis. Após 180 minutos de isquemia, a lâmina própria e a rede
vascular da mucosa têm perda de sua arquitetura. O tecido está necrótico e se torna
homogêneo, com falta de definição nuclear e estrutura celular (SMITH, 2002).
Algumas células, como as células musculares, parecem ser mais resistente à
isquemia, o que provavelmente se deve a uma maior reserva de energia intracelular
das células. Existem também diferenças na resposta a isquemia de baixo fluxo e a
obstrução arteriovenosa total (SMITH, 2002). A isquemia do intestino pode ocorrer
por encarceramento (causando constrição arteriovenosa direta), por volvulo
intestinal (quando aumenta o retorno venoso), assim como por torções, hérnias
estranguladas e obstrução vascular por trombo-embolismo devido à infecção por
Strongylus vulgaris (pouco expressivo atualmente). A distensão de segmento
intestinal próximo à lesão e a distensão cecal por disfunção também causam
isquemia, já que a pressão intraluminal aumentada acaba comprimindo capilares e
vênulas (MATOS et al., 2000).
O evento isquêmico inicia uma resposta inflamatória que se potencializa com
a reperfusão sanguínea, devido à produção de espécies reativas do metabolismo do
oxigênio (ERMO), também conhecido como lesão de isquemia e reperfusão
(BERNADI, 2007). Esse evento envolve mecanismos fisiopatológicos e vias
metabólicas complexas, ainda pouco esclarecidas, que pode levar a falência de
órgãos e, em alguns casos, até a morte do paciente (MIRANDA et al., 2004; SILVA,
et al., 2006).
2.2 REPERFUSÃO
O conceito de injúria de reperfusão foi introduzido através da observação de
que a reperfusão do intestino isquêmico produziu um dano maior do que aquele
causado por um período de isquemia unicamente (PRICHARD et al., 1991).
As lesões causadas por isquemia progridem com a reperfusão. Se a
reperfusão ocorre enquanto as células são ainda viáveis, ocorre uma cascata de
eventos em conjunto, desencadeados pela entrega de oxigênio ao tecido
previamente isquêmico. A injúria resultante é chamada injúria de reperfusão e
baseia-se na renovação de oxigênio ao tecido, com participação de células
endoteliais e receptores aferentes para criar a resposta inflamatória subsequente
(SMITH, 2002).
Embora faça sentido que o oxigênio é necessário para ressuscitar as célula
previamente isquêmicas, o sistema inato de defesa de muitos tipos de células é
responder à mudança isquêmica com uma resposta inflamatória, e esta parece ser
uma defesa inicial contra invasão bacteriana e é destinada a remover células
danificadas do sistema. Se muitas células estiverem lesadas, o efeito da reperfusão
pode causar um quadro inflamatório suficiente para impedir a sobrevivência das
células, retardando a cura (SMITH, 2002).
Na década de 80, através de estudos em tecidos transplantados e em animais
submetidos a modelos de isquemia e reperfusão experimental, constatou-se que, em
determinadas situações, as lesões produzidas durante o período isquêmico
evoluíam com o retorno da perfusão (PARKS e GRANGER, 1986). Presumiu-se que
parte dos insucessos no tratamento poderiam ser atribuídos ao agravamento das
lesões preexistentes, chamadas lesões de reperfusão. Isso ressaltou a necessidade
de se associar à correção cirúrgica, procedimentos para prevenir ou atenuar as
lesões de reperfusão.
O esclarecimento mais aceito com relação ao mecanismo da injúria de
reperfusão é de que o início do dano tecidual ocorre por metabólitos oxigenados
reativos e a exacerbação do quadro se deve aos neutrófilos (MAIR et al., 2002).
A injúria de reperfusão inicia com uma mudança no metabolismo intracelular
em tecido previamente isquêmico. O processo depende da produção celular de
citocinas e leucotrienos como sinais para numerosas células sanguíneas e teciduais
necessárias para o evento (SMITH, 2002).
Assim, a injúria de reperfusão ocorre quando há déficit de suprimento
sanguíneo ao tecido, antes da ocorrência de morte celular irreversível, e consiste em
eventos bioquímicos posteriores ao retorno da perfusão, que causam dano ao órgão.
O processo pode ser iniciado por vários mecanismos que criam uma resposta
inflamatória (ROWE e WHITE, 2002).
Existem controvérsias sobre a ocorrência de injúria de reperfusão no cólon
maior de cavalos submetidos à isquemia experimental. Vários modelos de obstrução
estrangulatória in vivo têm falhado para documentar a evidência de injúria de
reperfusão, enquanto outros têm demonstrado alterações histológicas compatíveis
com injúria de reperfusão na mucosa do cólon maior após isquemia de baixo fluxo.
Todavia, existem evidências para sugerir que a reperfusão pode exacerbar a injúria
no cólon maio após isquemia (ROBINSON e SPRAYBERRY, 2003).
2.2.1 PATOFISIOLOGIA DA INJÚRIA DE REPERFUSÃO
A hiperemia é a primeira resposta do tecido isquêmico quando o fluxo
sanguíneo é restabelecido. Com este aumento no fluxo sanguíneo, ocorrem danos
físicos e bioquímicos no sistema vascular já comprometido pela isquemia,
exacerbando o edema da mucosa, hemorragia e necrose (ROWE e WHITE, 2002).
A exemplo do que ocorre na isquemia de baixo fluxo, quando o fluxo normal
retorna ocorre uma resposta hiperêmica, duplicando o fluxo sanguíneo normal para
o tecido afetado. Os danos celulares se aceleram durante a reperfusão, com
mudanças na permeabilidade vascular, dano na mucosa e na serosa, assim como
acúmulo de fluido na submucosa, muscular e serosa. O edema nas camadas
submucosa e mucosa causa colapso vascular, levando à redução do fluxo abaixo do
normal. A redução do fluxo também está parcialmente associado à turgidez das
células endoteliais e marginação de neutrófilos à vasculatura. Os neutrófilos migram
para todos os tecidos, mas predominantemente para as camadas mucosa e serosa,
acumulando-se inicialmente ao redor de vasos sanguíneos e capilares. Com a
progressão da reperfusão, a maior injúria é observada na serosa, com considerável
acúmulo de neutrófilos. No entanto, os neutrófilos são encontrados em todas as
camadas do intestino (SMITH, 2002).
O tônus da musculatura lisa vascular é regulado pelo balanço de substâncias
vasodilatadoras (óxido nítrico, prostaciclina) e vasoconstritoras (endotelina,
eicosanóides), derivadas do endotélio. Muitas dessa substâncias requerem um
endotélio intacto para exercerem seus efeitos. Quando ocorre dano ao endotélio de
artérias e veias, há perda de vasodilatadores derivados do endotélio, causando um
aumento da sensibilidade aos agentes vasoconstritores, assim como um acréscimo
de resposta a outros agentes contráteis (ROWE e WHITE, 2002).
Um iniciador primário da injúria de reperfusão no intestino equino é a
produção de radicais livres derivados do oxigênio. A maioria das células, incluindo
células endoteliais e células da mucosa intestinal, possui a xantina desidrogenase,
que quando é convertida a xantina oxidase (Figura 2), catalisa a conversão da
hipoxantina a xantina. Durante a isquemia, a (SMITH, 2002). Com o retorno do
oxigênio aos tecidos, a xantina oxidase catalisa hipoxantina está aumentada no
citoplasma das células. O cálcio, aumentado na célula isquêmica, e as proteases,
promovem a conversão da xantina desidrogenase a xantina oxidase a
metabolização da hipoxantina em ácido úrico, formando radicais livres derivados do
oxigênio, que causam peroxidação lipídica, degradação de enzimas e de ácidos
nucléicos e aumento de permeabilidade vascular (MATOS et al., 2000).
Figura 2 - Eventos celulares relacionados à conversão da xantina desidrogenase a xantina oxidase durante a hipóxia.
Fonte: Rowe e White (2002).
A nível celular, uma importante reação que ocorre durante a reperfusão é a
produção de radicais livres, os quais são ativos contra a membrana das células,
causando perturbação no metabolismo celular. Como estes radicais são produzidos
em excesso durante a reperfusão, superam a capacidade dos mecanismos
antioxidantes do indivíduo, como os antioxidantes enzimáticos (superóxido
dismutase, catalase e glutation peroxidase) ou pelas moléculas não enzimáticas
(alfa tocoferol, ascorbato, beta caroteno) (ROWE e WHITE, 2002).
A reação mais frequentemente citada com relação à produção de radicais
livres envolve a enzima xantina oxidase. Durante a isquemia, a xantina
desidrogenase é convertida a xantina oxidase, a qual produz radicais livres ao
transformar a hipoxantina, acumulada no tecido isquêmico, em xantina. Existem
evidências da existência de outras enzimas produtoras de radicais livres em
diferentes segmentos intestinais (ROWE e WHITE, 2002).
Na reintrodução de oxigênio ao tecido isquêmico durante a reperfusão,
radicais livres derivados do oxigênio são produzidos quando o oxigênio reage com a
xantina oxidase e a hipoxantina acumulada, produzindo o ânion superóxido. Em
equínos, o sistema enzimático xantina desidrogenase e xantina oxidase está
presente no intestino delgado, mas tem baixa atividade no intestino grosso. Em meio
aquoso o ânion superóxido é relativamente instável, desdobrando-se a peróxido de
hidrogênio e oxigênio. Como oxidante, o ânion superóxido pode enzimas específicas
que são essenciais para a função celular. Apesar de não ser altamente tóxico, ele
pode gerar outros radicais extremamente tóxicos, como o radical hidroxil, que é um
poderoso oxidante (ROBINSON e SPRAYBERRY, 2003).
Prichard et al. (1991) relataram em seu trabalho que no intestino delgado
eqüino não-isquêmico, a localização do segmento intestinal influencia o nível de
atividade enzimática total do sistema xantina desidrogenase e xantina oxidase. Além
disso, foi observado que duas horas de isquemia elevaram o nível médio de
atividade da xantina oxidase de 27% para 41%.
O peróxido de hidrogênio é formado pela redução divalente do oxigênio ou a
partir do ânion superóxido através da enzima superóxido dismutase, e é um agente
oxidante poderoso, sendo precursor de radicais hidroxil. O peróxido de hidrogênio
pode se difundir através das membranas e reagir com metais de transição para
formar radical hidroxil. Este pode causar peroxidação lipídica das membranas
celulares, degradação do colágeno, inativação de enzimas e transporte de proteínas
e causar mutagênese por dano ao DNA (ROBINSON e SPRAYBERRY, 2003).
Os metabólitos reativos do oxigênio têm numerosas atividades biológicas,
variando de citotoxicidade direta para as células endoteliais e epiteliais a alterações
não tóxicas na função intestinal. Eles podem, por exemplo, aumentar a adesão de
neutrófilos às células endoteliais e também aumentar a agregação plaquetária
(ROBINSON e SPRAYBERRY, 2003).
A lipoperoxidação da membrana celular pelos metabólitos reativos do
oxigênio pode levar a alterações estruturais e funcionais assim como à geração de
mediadores inflamatórios derivados dos fosfolipídeos, como leucotrieno B4 e fator
ativador de plaquetas (ROBINSON e SPRAYBERRY, 2003).
Os neutrófilos desempenham um papel importante na isquemia de
reperfusão. Eles podem ser responsáveis pelo aumento de permeabilidade
microvascular observados após isquemia e reperfusão, em virtude da adesão e
diapedese das células inflamatórias através do endotélio vascular. Quando os
neutrófilos são ativados, há geração de mais radicais oxigênios que compõem a
injúria celular. Neutrófilos ativados também liberam grânulos lisossomais que
danificam a matriz intersticial e a membrana basal capilar (ROBINSON e
SPRAYBERRY, 2003).
O acúmulo de radicais livres derivados do oxigênio nos neutrófilos, durante a
ativação, é responsável pela maior parte da inflamação e dano tecidual visto durante
a reperfusão. Isto também explica o fato de que a injúria inicial pode se expandir ao
tecido adjacente viável, causando dano tecidual irreversível. Além disso, a injúria de
reperfusão pode causar dano em locais distantes da lesão inicial, tendo sido
observada lesão pulmonar, como resultado de citocinas e neutrófilos ativados na
circulação (SMITH, 2002).
Numerosos mediadores inflamatórios estão envolvidos na injúria de
reperfusão, como o fator ativador de plaquetas, metabólitos do ácido aracdônico,
leucotrieno B4 e tromboxane A2. O fator ativador de plaquetas é produzido por
células endoteliais, neutrófilos, macrófagos e plaquetas, podendo causar agregação
e degranulação plaquetária, contração da camada muscular, ativação e quimiotaxia
de neutrófilos e aumento de permeabilidade vascular. Os metabólitos do ácido
aracdônico, leucotrieno B4 e tromboxane A2 são associados ao recrutamento de
neutrófilos e à disfunção microvascular (ROBINSON e SPRAYBERRY, 2003).
O nível de cálcio, que já estava aumentado no meio intracelular, se ele eleva
ainda mais, bloqueando a produção de energia da célula, já comprometida, e
ativando proteases que exacerbam a degradação do núcleo celular e do citoplasma.
Além disso, as lipoxigenases formadas podem causar dano à membrana das células
(ROBINSON e SPRAYBERRY, 2003).
As células da mucosa e as células mesoteliais da serosa ao serem
danificadas no início da isquemia são capazes de liberar citocinas para alertar outras
células, mas as células endoteliais atuam como os iniciadores primários da injúria de
reperfusão. Estas células participam da produção de citocinas, da migração e
adesão de neutrófilos à vasculatura e também atuam na mudança de fluxo
sanguíneo após a reperfusão (SMITH, 2002).
As células endoteliais são responsáveis pela manutenção da pressão
sanguínea, permeabilidade vascular, tônus vascular, adesão de células
inflamatórias, coagulação e agregação de plaquetas. Quando estas células são
lesadas, ocorre passagem de eritrócitos e neutrófilos pela junção intercelular além
de deslocamento de fluido e proteínas para o interstício, levando ao colapso de
pequenos vasos sanguíneos. Sob estímulo de radicais livres ou plaquetas, as
células endoteliais produzem citocinas, que atraem e ativam neutrófilos durante a
injúria de reperfusão. Ao aderirem e migrarem do endotélio, os neutrófilos
exacerbam a lesão e aumentam a permeabilidade vascular (ROWE e WHITE, 2002).
Neutrófilos e plaquetas, ao acumularem-se nos vasos, promovem a obstrução
de capilares, alterando o fluxo sanguíneo. Além disso, as células endoteliais, ao
tornarem-se túrgidas, causam redução do lúmen dos vasos sanguíneos. As
alterações no formato das células endoteliais aumentam a permeabilidade capilar,
permitindo o movimento de fluido e proteínas para o interstício. A resposta inicial à
reperfusão resulta em aumento do fluxo sanguíneo ao tecido lesado,
consequentemente o aumento da permeabilidade vascular aumenta a pressão
intersticial, levando ao colapso de capilares (SMITH, 2002).
A adesão do neutrófilo ao endotélio pode ser prevenida com o uso de
anticorpos monoclonais contra as proteínas do complexo receptor de adesão
(ROWE e WHITE, 2002).
Os neutrófilos ativados liberam radicais livres, proteases e ácido hipocloroso,
que causam injúria vascular e na mucosa durante a reperfusão. Radicais livres
causam dano por peroxidação lipídica nas membranas celulares e suas organelas, e
subseqüente ativação de fosfolipase A2. Além de lesar a célula diretamente, esta
enzima produz a liberação de ácido aracdônico (substrato para síntese de
eicosanóides), fator de agregação plaquetária e lisofosfatidilcolina, que causam
efeitos nocivos ao tecido. A produção de compostos oxidativos pelos neutrófilos é
chamada explosão respiratória, e fazem parte do mecanismo pelo qual os neutrófilos
fagocitam e destroem microrganismos (ROWE e WHITE, 2002).
A ação dos eicosanóides, do fator de agregação plaquetária e a formação de
radicais livres estimulam o acúmulo de neutrófilos no tecido pós-isquêmico (MATOS
et al., 2000).
As alterações nas células endoteliais, associado ao colapso de capilares,
provocam o chamado “fenômeno de não-refluxo”, que causa danos adicionais ao
tecido isquêmico (SMITH, 2002).
As alterações de membrana das células endoteliais permitem a expressão de
moléculas de adesão e receptores, necessários para a adesão e migração de
neutrófilos. Esta migração dos neutrófilos gera um quadro inflamatório mais
expressivo no tecido, porque os neutrófilos ativados liberam elastase, radicais livres
derivados do oxigênio e outras proteases que atacam o colágeno e a membrana das
células (SMITH, 2002).
Foram identificadas alterações na morfologia mitocontrial da camada
muscular do jejuno equino após isquemia de baixo fluxo (DABAREINER et al.,
1995). Além disso, durante o vólvulo do cólon maior, os neurônios do plexo
mioentérico sofrem degeneração e são reduzidos numericamente, comparado ao
normal (SCHUSSERe WHITE, 1997). Estas lesões podem estar associadas aos
episódios de cólicas recorrentes em equinos que sofreram longo processo
inflamatório após isquemia e reperfusão.
O óxido nítrico pode estar envolvido na injúria de reperfusão. O óxido nítrico
produz inibição da motilidade, regula o fluxo sanguíneo através do relaxamento da
musculatura vascular, reduz a adesão de neutrófilos ao endotélio vascular, inibe a
formação de microtrombos e ainda antagoniza o vasoespasmo produzido por
substâncias vasoconstritoras. Na inflamação, a síntese de óxido nítrico é
aumentada, e ele passa a exercer efeitos indesejáveis, interferindo na regulação da
circulação local e sistêmica e produzindo moléculas altamente reativas (radicais
hidroxil e dióxido de nitrogênio e ânion peroxinitrito) (MATOS et al., 2000).
A apoptose é outro fator que tem sido atribuído à injúria de reperfusão
intestinal, e é importante sob o ponto de vista clínico, visto que pode afetar a
integridade da barreira da mucosa, predispor à inflamação durante a reperfusão e
ainda contribuir para as complicações durante o pós-operatório (ROWE e WHITE,
2002).
2.3 METABOLISMO DO FERRO
O ferro (Fe) é um metal de transição facilmente encontrado na natureza,
como por exemplo, na maioria dos solos e águas da superfície terrestre.
Provavelmente por isso foi incorporado a numerosas proteínas de importância crítica
nos animais, vegetais e de micro-organismos, além de estar presente na estrutura
de muitas enzimas e proteínas intracelulares essenciais, em quantidades que variam
de acordo com o tipo de tecido e a fase do desenvolvimento (THEIL, 2003; LIU et al.,
2006).
O ferro exerce papel importante no metabolismo dos mamíferos devido à
facilidade com que ganha e perde elétrons. Essa propriedade faz desse elemento
um componente essencial na composição da hemoglobina, mioglobina, citocromos e
várias outras enzimas e cofatores (WRIGHTING e ANDREWS, 2008).
A facilidade com queo ferro perde e ganha elétrons pode resultar na doação
de elétrons para o oxigênio, causando a geração de ânions superóxido e
radicalhidroxil, que são tóxicos às estruturas celulares, proteínas, lipídeos e DNA;
daí a necessidade de regular a concentração de ferro nos fluidos biológicos
(DOMENICO et al., 2008).
No homem adulto normal, o ferro existente é cerca de 40 mg/kg de peso
corporal, do qual 80% está incorporado à hemoglobina presente nos eritrócitos, que
contém 0,34% de ferro em seu peso (cerca de 1,0 mg de ferro por 2 mL de sangue
total); 15% está nos músculos e 5% fazem parte dos citocromos e demais enzimas
(EMERIT et al., 2001).
Diariamente, 200 bilhões de novos eritrócitos são produzidos e requerem 20
mg de ferro para síntese de hemoglobina, representando 80% da demanda em
humanos e não surpreende o fato de ser a anemia por deficiência de ferro o maior
problema de saúde pública em todo o mundo, uma vez que as condições sociais
econômicas da população são um fator determinante (HENTZE et al., 2004).
Em países desenvolvidos, a prevalência de anemia por deficiência de ferro
tem diminuído rapidamente durante as últimas cinco décadas. Entretanto, a
prevalência desta deficiência de forma subclínica tem aumentado
consideravelmente, sendo mais comum em crianças entre 1-3 anos, em
adolescentes de ambos os sexos, em mulheres grávidas e na população idosa
(SUOMINEN et al., 1998).
Alterações no pool de ferro celular são relatadas em doenças neuro e
cardiodegenerativas, intolerância à glicose, diabetes melitus, neoplasias, anemia por
deficiência de ferro, hemocromatose, entre outras (TUOMAINEN et al., 1998;
TUOMAINEN et al., 2003).
Assim, muitos esforços têm sido feitos para descobrir novos mecanismos de
transporte no interior da célula e através das membranas biológicas a fim de melhor
compreender a fisiopatologia de várias doenças (WILSON, 2006).
O ferro é um metal altamente tóxico quando em seu estado livre e por este
motivo sua grande maioria, quando no organismo humano, encontra-se ligada à
hemoglobina, mioglobina e hemossiderina, formas nas quais se apresenta menos
tóxico (ZUNQUIN et al., 2006).
Outra forma de proteger as células dos danos causados pelo ferro é a
produção de ferritina, presente tanto nas células do organismo humano quanto nas
plantas e bactérias, porém, em proporções distintas em cada uma delas (THEIL,
2003; LIU et al., 2006).
O controle da concentração sistêmica do ferro ocorre através da regulação de
sua aquisição e estocagem de acordo com a necessidade do organismo, uma vez
que seu sistema de excreção não está totalmente elucidado (HUNT e ROUGHEAD,
2000).
A perda normal de ferro em humanos ocorre através da esfoliação dos
enterócitos, células da pele, menstruação, suor e parto. Entretanto, esse processo é
independente do status do ferro no corpo (DOMENICO et al., 2008).
A absorção do ferro proveniente da dieta é altamente regulada e envolve
transporte através da membrana apical das células absortivas e, em seguida,
através da membrana basolateral destas células para o interior do sangue, ligado à
transferrina, uma glicoproteína de transporte (ANDREWS, 2000; ANDREWS, 2007;
SCHMIDT, 2007; ANDREWS, 2008).
A incapacidade de manter normal a concentração de ferro leva à deficiência
na homeostase e a desordens clínicas cujas patologias mais frequentes são a
anemia por deficiência de ferro e a deposição parenquimal dos tecidos, conhecida
como Hemocromatose Hereditária (ANDREWS, 2000).
2.3.1 ABSORÇÃO INTESTINAL DO FERRO
Apesar de seu mecanismo de absorção ainda não estar completamente
elucidado, o ferro que chega ao estômago é dissociado a sais de ferro solúveis que
podem ser reduzidos a íons ferrosos ou quelados no estado de valência ferroso ou
férrico a fim de manterem sua estabilidade e promoverem sua absorção (DONOVAN
e ANDREWS, 2004).
Fisiologicamente, os maiores determinantes da absorção do ferro são: a
quantidade de reservas corporais de ferro e o grau de eritropoiese (a absorção
aumenta com as reservas diminuídas e com a atividade eritropoiética) (DONOVAN e
ANDREWS, 2004).
No entanto, só é possível retirar da dieta um máximo de 3,5 mg de Fe/dia
(WALTERS et al., 1973), mesmo com abundância de ferro biodisponível ou com a
absorção aumentada do indivíduo ferropênico (HENTZE et al., 2004).
A biodisponibilidade do ferro depende da forma, composição na dieta e
fatores gastrointestinais, como secreção gástrica, motilidade intestinal e patologias
gastrointestinais, uma vez que sua absorção se dá no intestino proximal (HUNT e
ROUGHEAD, 2000).
A captação do ferro em indivíduos saudáveis, a partir da composição da dieta,
depende principalmente da necessidade do organismo e da interação com os
demais componentes alimentares, uma vez que existe uma singular diferença entre
a absorção de ferro heme e não-heme e a quantidade de ferro disponível em dietas
que não envolvem o consumo de carnes vermelhas (HUNT e ROUGHEAD, 2000;
BAECH et al., 2003; WELLS et al., 2003; MILMAN et al., 2004).
O ferro heme (ferro encontrado na carne vermelha) é mais bem absorvido
(12-20%) e pouco afetado por outros componentes da dieta; já a absorção do ferro
não-heme (ou ferro inorgânico – 1-7%) será aumentada por aminoácidos e ácido
ascórbico (YANG et al., 1999) e diminuída por hemicelulose, celulose, pectina,
fitatos, proteína da soja, polifenóis e tanatos presentes nas frutas e verduras
(MILMAN et al., 1990; HUANG et al., 1999; BEARD e TOBIN, 2000; HUNT e
ROUGHEAD, 2000; BAECH et al., 2003).
Indivíduos que consomem carne com maior frequência em relação àqueles
que possuem uma dieta isenta de carne (os considerados vegetarianos), possuem
uma maior facilidade de elevar seus índices hematológicos, ao contrário destes que
mantêm seus estoques de ferro estável, pelo menos em curto prazo (WELLS et al.,
2003; MILMAN et al., 2004).
A absorção do ferro presente na dieta dos vegetarianos depende da
necessidade de seu organismo em manter o balanço do ferro, porém, mulheres
premenopausadas demonstraram um status de ferro prejudicado, talvez devido à
influência hormonal ou à menstruação (HUANG et al., 1999).
A absorção máxima ocorre no duodeno e na parte superior do jejuno onde a
superfície vilosa é maior e na qual o conteúdo da luz intestinal é ácido ou neutro. Há
uma progressiva diminuição de absorção distal ao ambiente mais alcalino, embora
exista potencialidade para absorção de algum ferro ao longo de todo o tubo
digestivo, do estômago ao reto (LIU et al., 2006).
As condições associadas à absorção aumentada de ferro incluem deficiência
de ferro, anemias hemolíticas e sideroblásticas, hipóxia, administração de cobalto e
eritropoetina, hemocromatose, cirrose e derivação porta-cava, alguns tipos de
insuficiência pancreática e os estágios finais da gravidez (HUNT e ROUGHEAD,
2000; DONOVAN e ANDREWS, 2004; GARCIA et al., 2007).
Existe diminuição da absorção de ferro em pacientes com sobrecarga de
ferro, hipoplasia eritróide, estados de má absorção generalizada, neoplasia maligna,
infecções, estados inflamatórios e acloridria (HUNT e ROUGHEAD, 2000;
DONOVAN e ANDREWS, 2004; GARCIA et al., 2007).
A regulação da absorção intestinal do ferro se dá através das cristas das
células duodenais, as quais percebem a necessidade do corpo por ferro para
realizar a eritropoiese e demais funções essenciais do organismo (WRIGHTING e
ANDREWS, 2008) e assim estas células são programadas, quando maduras, para
realizarem toda absorção do ferro proveniente da dieta (EMERIT et al., 2001).
O íon férrico (Fe+++), proveniente da dieta, é convertido em íon ferroso (Fe++)
pela ação de uma redutase férrica que está localizada na superfície apical do
enterócito, presente na mucosa duodenal. O Fe++ é então transportado para o
interior do enterócito através de um transportador de metal divalente (DMT1),
podendo ser incorporado ao citosol sob forma de armazenamento, a ferritina, ou
transportado através da superfície basolateral desta célula para o plasma, sob ação
da ferroportina. O Fe++ é, subsequentemente, convertido em Fe+++ por ação de uma
ferro-oxidase associada à membrana, a hefaestina (Figura 3) (HENTZE et al., 2004;
DOMENICO et al., 2008)
A presença do DMT1, de acordo com estudos com ratos, não é essencial à
transferência materna através da placenta, mas é requerida para o transporte
intestinal e nos eritrócitos precursores (DOMENICO et al., 2008).
A ferroportina é um transportador encontrado em todos os tipos de células
envolvidas na exportação do ferro, principalmente mucosa duodenal, macrófagos e
células da placenta, além de estar diretamente associada às oxidases, como a
ceruloplasmina e hefaestina (DOMENICO et al., 2008).
A deleção do gene que determina a expressão de transportadores de
membrana ou de ferro-oxidases provoca acúmulo de ferro nos macrófagos,
hepatócitos e células do cérebro causando danos ao tecido parenquimatoso destes
órgãos, o que comprova sua importância nestas células (DOMENICO et al., 2008).
FIGURA 3 - Transporte do ferro através do epitélio intestinal
Fonte: Pietrangelo (2007),
Nos macrófagos, o Fe++, que foi reciclado dos eritrócitos senescentes pela
fagocitose, é exportado através da ferroportina onde é imediatamente convertido em
Fe+++ por glicosilfosfatidilinositol (GPI) ligado à ceruloplasmina, uma ferro-oxidase
(Figura 4) (DOMENICO et al., 2008).
FIGURA 4 - Transporte do ferro através da membrana de macrófago.
Fonte: Domenico et al. (2008).
2.3.2. TRANSPORTE DO FERRO PARA OS TECIDOS
O ferro é exportado das células para o plasma pela ferroportina, ligando-se
então à transferrina, uma glicoproteína transportadora de alta afinidade por este
elemento, e que é produzida pelo fígado, retina, testículos e cérebro. Esta proteína
possui 80 kDa e 2 sítios de ligação (DOMENICO et al., 2008).
Um homem adulto tem aproximadamente 20-30% de ferro circulando no
plasma ligado à transferrina, a qual é capaz de transportar, através do plasma, cerca
de 30 mg/dia de ferro para as células, inicialmente na forma de apotransferrina
(transferrina com apenas 1 de seus sítios ocupados pelo ferro). A afinidade do ferro
por esta proteína de transporte limita a capacidade desse elemento de produzir
radicais tóxicos (EMERIT et al., 2001; DOMENICO et al., 2008).
Para que o ferro seja internalizado nas células, é necessária a presença de
receptores na superfície das membranas – o receptor da transferrina (TfR1) - que
permite a endocitose do Fe+3 (AISEN, 2004).
No plasma (pH 7,2), a Tf-Fe+3 liga-se ao receptor da transferrina (TfR)
localizado na superfície da célula de onde é internalizado por endocitose, cujo
endossomo é formado por uma capa de claritina (ANDREWS, 2008; DOMENICO et
al., 2008).
O pH desse endossomo torna-se ácido (aproximadamente pH=5,5) que, por
ação de uma bomba de prótons (H+ATPase) facilita a liberação do Fe+3 antes
ligado à Tf, o qual é convertido em Fe+2, pela ação de uma redutase endossomal
(STEAP3), cuja mutação resulta em anemia microcítica, e então é transportado para
o citosol por um transportador de metal bivalente-1 (DMT1) (ANDREWS, 2008;
DOMENICO et al., 2008).
Em contrapartida, nos eritrócitos precursores, em células de rápida divisão,
como as neoplásicas, concentra-se, em sua superfície, uma grande quantidade de
receptores TfR, responsáveis pelo provimento de ferro para estes tecidos, estando
presente em todas as células, exceto nos eritrócitos maduros (ANDREWS, 2008).
Outro receptor da transferrina, o TfR2, apesar de pouco conhecido,
apresenta-se primariamente no fígado e se liga ao Fe+3 com baixa afinidade quando
comparado ao TfR1 e que o complexo TfR-(Tf-Fe+3) é o principal processo de
obtenção do ferro do plasma para os tecidos periféricos (AISEN, 2004).
O ferro (Fe+2) resultante desse catabolismo será recuperado e terá dois
caminhos: será armazenado sob a forma de ferritina em células não-eritróides ou
incorporado à hemoglobina em células eritróides ou exportado pela ferroportina para
o plasma e o endossomo contendo o complexo Tf-TfR será reciclado (ANDREWS,
2008; DE DOMENICO et al., 2008) (Figura 5).
FIGURA 6 - Endocitose do complexo transferrina-receptor da transferrina.
Fonte: Domenico et al. (2008).
Levando-se em consideração a biodisponibilidade do ferro, estudos mostram
uma correlação significativa entre o ferro presente na dieta, a concentração sérica
do ferro, a capacidade total de ligação do ferro bem como o índice de saturação da
transferrina. Porém, não há correlação com a ferritina, pois esta reflete o balanço de
ferro a longo prazo, e as primeiras refletem o “status” de ferro a curto prazo, sendo
então os mais apropriado para avaliar o ferro da dieta (MILMAN et al., 2004).
Vários fatores podem obscurecer a associação entre a ferritina sérica e a
captação de ferro da dieta: a existência de variações na biodisponibilidade do ferro
da dieta, devido as variações na composição das refeições; a ingestão de
componentes alimentares capazes de exacerbar ou inibir a absorção do ferro;
discrepância no cálculo entre o ferro absorvido e o ferro disponível na dieta
(BOUGLE et al., 2000; MILMAN et al., 2004; KRISTENSEN et al., 2005).
O fígado é o primeiro órgão de passagem dos nutrientes provenientes da
dieta e, por isso, capta o ferro excedente da capacidade de ligação da transferrina
plasmática, através de seus hepatócitos e reutiliza a hemoglobina resultante da
degradação de eritrócitos senescentes através de seus macrófagos do sistema
reticuloendotelial (MILMAN et al., 2004) (Figura 6).
FIGURA 6 - Homeostase do ferro.
Fonte: Domenico et al. (2008).
2.3.3 FERRITINA:
A ferritina é uma grande proteína nanocadeia de α-hélice apresentando
massa molecular de aproximadamente 450 kDa que circunda um núcleo sólido
contendo milhares de átomos de Ferro (≈ 4.500 átomos) e oxigênio por proteína
(Figura 7) (KALANTAR-ZADEH et al., 2006).
FIGURA 7: Molécula de ferritina com átomos de ferro em sua poção central.
Fonte: Galvis (2007).
Possui formato esférico, sendo formada por 12-24 subunidades em α-hélice
(apoferritinas) e composta estruturalmente por cadeias leves de 19 kDa (L) e
pesadas de 21 kDa (H) ligadas não covalentemente. O diâmetro da cavidade que
acomoda o mineral dentro da ferritina é 5-8 nm, e seu diâmetro externo é de 12 –
13nm (KALANTAR-ZADEH et al., 2006).
O substrato da ferritina é o Fe+2, que é oxidado a Fe+3dentro da ferritina e
representa o estoque de ferro nesta proteína. O fígado e o baço são ricos em
subunidade L, enquanto o coração é rico em subunidades H (DOMENICO et al.,
2008).
Esta proteína de armazenamento também está presente nos fluidos corporais
e hemácias circulantes. Porém, encontra-se em altas concentrações nas células do
fígado e nos centros de reciclagem dos eritrócitos (células do retículo endotelial) no
fígado, bílis e medula óssea (WALTERS et al., 1973; ROY e ANDREWS, 2001).
A ferritina pode ser modificada a hemossiderina; ambas, proteínas de reserva
intracelulares, que podem ser mobilizadas de acordo com a necessidade, sendo a
primeira de fácil mobilização, em detrimento da segunda, que é mais estável
(WALTERS et al., 1973).
A síntese de ferritina ocorre em todas as células do organismo, mas
principalmente nos hepatócitos, medula óssea e macrófagos que, quando presentes
no reticuloendotelial, exercem papel importante no “turnover” do ferro tendo sido
descritos como sistema mononuclear fagocitário (WALTERS et al., 1973).
Os macrófagos, principalmente no baço, depois da fagocitose dos eritrócitos
senescente, degradam a hemoglobina, e a fração heme é catabolizada pela
hemoxigenase. Sempre que a capacidade dos macrófagos para degradar eritrócitos
ou heme é excedida, hemoglobina ou heme são lançadas na circulação, onde se
ligam a haptoglobina, hemopexine e albumina (EMERIT et al., 2001).
O “ferro livre” na circulação liga-se à transferrina plasmática. Já no fígado, a
ferritina das células de Kupfer é incorporada pelos hepatócitos que possuem tanto
receptores para transferrina e ferritina como para hemoglobina, haptoglobina e
heme, e podem receber ferro de todas estas moléculas, especialmente da ferritina
oriunda das células de Kupfer (ROY e ANDREWS, 2001).
Estudos demonstram que a relação direta entre a concentração de ferritina no
soro e os estoques de ferro nos tecidos vêm sendo utilizados como parâmetros
auxiliares no diagnóstico de várias doenças relacionadas ao balanço de ferro
(WALTERS et al., 1973), podendo também estar elevados em etilistas ativos e em
indivíduos com doenças hepáticas de caráter autoimune ou causadas por algum
agente etiológico (DE VALK e MARX, 1999).
Atualmente, a ferritina, juntamente com parâmetros como o volume
corpuscular médio (VCM), hemoglobina (HB) e saturação dos receptores da
transferrina sérica (TfRs), detectam estágios iniciais da depleção dos estoques de
ferro, possuindo sensibilidade de 83% e especificidade de 80% (VENDT et al.,
2007).
A ferritina é considerada uma proteína de fase aguda e marcador tumoral
inespecífico (SUOMINEN et al., 1998) que, quando elevada, pode indicar patologias
graves em curso como carcinoma hepatocelular, leucemias, doença de Hodgkin’s,
câncer de cabeça e pescoço, bem como doenças renais, infecciosas, inflamatórias e
sistêmicas (DE VALK e MARX, 1999; LUNEDO et al., 2004).
Durante a resposta de fase aguda, citocinas proinflamatórias como a
interleucina - 1β e fator de necrose tumoral – α aumentam a síntese de ambas as
subunidades de ferritina (L e H) e mesmo na deficiência de ferro, o nível desta esta
proteína continua elevado conduzindo a interpretações duvidosas quanto aos
estoques de ferro (KALANTAR-ZADEH et al., 2006).
Por ser considerada uma proteína de fase aguda, a ferritina é um indicador
que sofre variações, tornando a mensuração dos estoques de ferro discutível, uma
vez que se encontra elevada, principalmente em processos inflamatórios e doenças
hepáticas (WOLFF et al., 2004; KALANTAR-ZADEH et al., 2006).
A hiperferritinemia está associada às disfunções hepáticas, provavelmente
porque o fígado é o principal órgão produtor e reciclador de ferritina circulante. Suas
altas concentrações têm sido relatadas em pacientes portadores de insuficiência
renal crônica com doença glomerular e proteinúria, dos quais 40 – 70% deles
apresentam inflamação e, consequentemente, proteína C-reativa aumentada
(KALANTAR-ZADEH et al., 2006). Por esta razão, recomenda-se uma avaliação
criteriosa através de parâmetros como enzimas do fígado (γ-glutamil transferase e
alanima transferase) e indicadores de inflamação e infecção (contagem de
leucócitos e proteína C-reativa), a fim de se evitar um falso diagnóstico e,
consequentemente, uma conduta terapêutica inadequada (TUOMAINEN et al., 1998;
HAIDARI et al.,2001).
A inflamação é um dos fatores geradores de interferência quando se avaliam
os estoques de ferro no organismo e seu papel frente à doença arterial coronariana
(CAD) (KALANTAR-ZADEH et al., 2006). Além disso, pacientes diabéticos
apresentam concentrações de ferritina superiores aos não-diabéticos, talvez esse
seja um dos principais motivos que justifiquem a maior predisposição a desenvolver,
de maneira precoce, as placas de ateroma (HAIDARI et al., 2001).
Um componente chave do metabolismo do ferro é a hepcidina, um hormônio
peptídico circulante que regula a entrada do ferro no plasma e que é primariamente
secretado pelos hepatócitos, existindo evidências da presença de RNAm no cérebro,
pâncreas e células hematopoiéticas. (LUUKKONEN e PUNNONEN, 2006; ROE et
al., 2007).
A deleção do gene HAMP, que determina a expressão da hepcidina, resulta
na mais severa forma de doença por acúmulo de ferro. Em contrapartida, o aumento
da expressão deste gene diminui a absorção de ferro provocando anemia
(LUUKKONEN e PUNNONEN, 2006; ROE et al., 2007).
A hepcidina regula negativamente o transporte do ferro no plasma ligando-se
à ferroportina, levando-a a ser fosforilada, internalizada e degradada em lisossomas
(WRIGHTING e ANDREWS, 2008).
A remoção da ferroportina da superfície das células previne a exportação do
ferro, levando a uma diminuição da concentração citosólica de ferro, que é estocado
na ferritina. Essa remoção da ferroportina da superfície das células não inibe o
transporte, mas reduz a exportação desse ferro (DOMENICO et al., 2008).
A expressão da hepcidina pode ser regulada de várias maneiras: a
transcrição do gene HAMP que codifica a hepcidina depende da sinalização de
receptores da BMPs (Proteínas morfogenéticas ósseas) e desencadeiam o fator de
transcrição SMAD. A ativação dos receptores BPMs (BPMRs) da superfície da célula
desencadeia a fosforilação do receptor SMADs (R-SMADs), que dimeriza com
SMAD4 (ANDREWS, 2008).
A hemojuvalina (HJV) quando se liga a superfície da membrana funciona
como co-receptor de BPMs, aumentando a eficiência da interação da BPM com seu
receptor. O heterodímero SMAD4-(SMAD-R) desloca-se dentro do núcleo onde
induz a transcrição do gene HAMP. A hemojuvelina solúvel pode ligar-se a BPM e
bloquear a ativação da BPMRs e, consequentemente, a expressão da hepcidina
(ANDREWS, 2008).
Citocinas inflamatórias, como interleucina-6 (IL6), ligam-se aos receptores,
ativando o sinal transdutor e ativador da transcrição-3 (STEAT3), o qual liga-se ao
gene promotor do HAMP e induz a expressão da hepcidina. A ativação do STAT3
requer a presença de SMAD4. O TfR2 e HFE funcionam independente do SMAD4
na ativação do gene HAMP, talvez por um sinal independente ou por interferência na
transdução pelo BMPR (DOMENICO et al., 2008).
Sob condições de hipóxia, o fator de transcrição induzido por hipóxia (HIF)-1/2
liga-se ao gene promotor HAMP e bloqueia a expressão da hepcidina. Defeitos na
eritropóiese resultam em níveis elevados de fator de diferenciação do crescimento-
15 (GDF15), que se liga ao GDF-15R e induz um sinal que bloqueia a transcrição do
gene HAMP (Figura 8) (DOMENICO et al., 2008).
FIGURA 8 - Regulação molecular da produção da hepcidina
Fonte: Domenico et al. (2008).
2.3.4. SOBRECARGA DE FERRO
O ferro em excesso facilita a replicação viral e as infecções bacterianas,
diminui a resposta imunológica do hospodeiro, induz fibrinogênese, podendo causar
lesão celular por liberação de radicais livres (EMERIT et al., 2001).
A liberação de radicais livres provoca dano às células por catalisar a
conversão do superóxido e peróxido de hidrogênio em espécies de radical livre que
atacam as membranas celulares, proteínas e a molécula de DNA. Para reduzir esta
ameaça, o ferro circulante liga-se à transferrina e acumula-se nas células sob a
forma de ferritina (EMERIT et al., 2001).
Em indivíduos saudáveis, não ocorre um apreciável acúmulo de “ferro livre”,
uma vez que o mesmo é mantido sob a forma de ferritina ou é quelado a compostos
como citrato ou adenosina difosfato, e o “ferro livre” pode participar da catálise de
formação do radical hidroxil (DE VALK e MARX, 1999; EMERIT et al., 2001).
O dano celular provocado pelos radicais livres atinge proteínas, açúcares,
DNA, lipídeos e demais moléculas orgânicas; além de relacionar-se à formação de
placa de ateromas devido à peroxidação lipídica, envolvendo principalmente a
lipoproteína de baixa densidade (LDL) (YANG et al., 1999; HAIDARI et al., 2001).
O radical hidroxil é capaz de retirar um átomo de hidrogênio de ácidos graxos
poliinsaturados para iniciar a peroxidação lipídica (EMERIT et al., 2001). Uma vez
acumulado, o hidroperóxido lipídico pode adicionar-se diretamente ao “ferro livre”
(DE VALK e MARX, 1999; EMERIT et al., 2001).
A oxidação de LDL ocorre nas células endoteliais da parede dos vasos
sanguíneos, nas células musculares lisas, linfócitos ou macrófagos, e este processo
resulta na formação do LDL oxidado, que é reconhecido pelos “scavenger”
(receptores presentes nos macrófagos) e, dessa forma, ocorre acúmulo de lipídeos
no interior destas células, formando as “foam cells” (células espumosas) (DE VALK e
MARX, 1999; WOLFF et al., 2004).
O LDL oxidado tem a capacidade de destruir a integridade do endotélio
facilitando, assim, o acúmulo desses monócitos e outros componentes do sangue
circulante, promovendo a lesão aterosclerótica (DE VALK e MARX, 1999; WOLFF et
al., 2004).
Vários estudos apontam o ferro em excesso como fator determinante para a
formação da placa aterosclerótica e lesões pré-neoplásicas em presença de
elevadas concentrações de ferritina, ferro sérico, LDL colesterol e prática de
exercícios físicos intensos, associados a um desequilíbrio entre fatores antioxidantes
e pró - oxidantes (YANG et al., 1999; ZUNQUIN et al., 2006).
A superprodução de radicais superóxido e peróxido de hidrogênio (estresse
oxidativo) ocorre em vários quadros patológicos, inclusive em doenças infecciosas,
doenças inflamatórias e doenças que envolvem isquemia e reperfusão (DE VALK e
MARX, 1999; EMERIT et al., 2001; RAMAKRISHNAN et al., 2002).
Zunquin et al. (2006) relatam a ação da caseína, uma proteína do leite, que
age como antioxidante em atletas que, em busca de um melhor desempenho físico,
usam suplementação com ferro no intuito de obter uma elevação da concentração
de hemoglobina e, consequentemente, uma maior eritropoiese.
Esta sobrecarga de ferro é considerada fator de risco para doenças
coronarianas, principalmente infarto agudo do miocárdio, sendo que homens e
mulheres posmenopausadas são mais predispostos à mortalidade cardiovascular,
levando-se em consideração as práticas etilista e tabagista, o sedentarismo e o
consumo de uma dieta rica em gordura (DE VALK e MARX, 1999; HAIDARI et al.,
2001; WOLFF et al., 2004).
Tuimainen et al. (1998) encontraram uma relação bastante significativa entre
a concentração dos receptores da transferrina e a ferritina sérica (TfR/ferritina),
quando associados ao aumento do risco de ocorrência do primeiro episódio de
infarto agudo do miocárdio em homens, ao contrário de outros autores que em seus
estudos não encontraram correlação direta entre ferritina sérica e doenças
cardiovasculares, sugerindo a interrelação com outros fatores (KNUIMAN et al.,
2003).
A elevação do “ferro livre” exerce papel crucial na carcinogênese e
crescimento rápido de tumores em modelos animais e cultura de células, como
demonstram alguns relatos em que o ácido ascórbico é utilizado como antioxidante.
Além disso, o ácido ascorbico também participa ativamente na absorção de ferro
pelos enterócitos transformando Fe+3 em Fe+2 (YANG et al., 1999).
Apesar de participar do metabolismo, o ferro não tem meios específicos para
ser eliminado do organismo humano, o que o torna mais hábil no papel de
catalisador de reações de oxi-redução (YANG et al., 1999).
As perdas fisiológicas de ferro resumem-se a pequenas quantidades
excretadas na urina, bílis, suor, descamação dos enterócitos, trato urinário e pele,
além das perdas ocultas no tubo digestivo e, nas mulheres pré-menopausadas,
durante a gravidez e menstruação (WRIGHTING e ANDREWS, 2008), tendo em
vista que, durante a menstruação, a mulher adulta normal perde aproximadamente
20-30mL de sangue e eleva a necessidade de 0,8 – 1,36 mg para 2,34 - 2,84 mg de
ferro (HUANG et al., 1999). Entretanto, homens com idade superior a 50 anos que
realizaram flebotomia reduziram significativamente seus estoques de ferro e
demonstraram uma diminuição na oxidação do LDL-colesterol. Em contrapartida,
mulheres que fazem uso de contraceptivos orais por tempo prolongado têm sua
perda de sangue, através da menstruação, reduzida e, consequentemente, seus
estoques de ferro aumentados (HAUDARI et al, 2001).
Ainda na tentativa de reduzir os estoques de ferro, a terapêutica atual dispõe
do deferroxamine (DFX), droga administrada por via intravenosa e considerada
quelante do ferro. Porém, a excreção corresponde a menos de 0,03 μL de ferro total,
tendo sido utilizada esse medicamento somente em pacientes com sobrecarga
severa de ferro e saturação total de transferrina (EMERIT et al., 2001).
O deferroxamine é capaz de quelar o “ferro livre” no interior das células, o
qual se combina com o ferro formando o ferrioxamine, produto excretado na urina,
fezes e bílis. A regulação da sobrecarga de ferro através do DFX é por excreção,
enquanto a flebotomia é a retirada de todos os elementos do sangue. Ainda são
necessários estudos relacionados à seu risco/benefício na terapia da sobrecarga de
ferro (EMERIT et al., 2001).
Pela relevância dos resultados obtidos com a isquemia promovida pelo
clampeamento total do pedículo hepático (manobra de Pringle modificada), em
diferentes tempos (SEBE, 1999; SEBE et al., 2000; CAMARGO et al., 2003;
CAMARGO, 2004; FREITAS, 2003; PIRES; 2008; FREITAS et al., 1999, 2000, 2006,
2009, 2009a), propõe-se neste estudo, pesquisar a concentração de ferro sérico e
ferritina, após clampeamento total do pedículo hepático e reperfusão em diferentes
tempos.
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3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GERAL
Avaliar e correlacionar a concentração de ferro sérico e ferritina após o
clampeamento total do pedículo hepático (isquemia), seguido do desclampeamento,
em tempos definidos.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar a concentração de ferro sérico e ferritina após o clampeamento total
do pedículo hepático em tempos definidos para isquemia em 10, 20 e 30 minutos,
seguida de reperfusão pelo desclampeamento do pedículo hepático em tempos
definidos de 15, 30, 60 e 120 minutos.
4. ARTIGO
AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE FERRO SÉRICO E FERRITI NA EM RATOS, APÓS CLAMPEAMENTO TOTAL DO PEDÍCULO HEPÁTICO E
REPERFUSÃO, EM DIFERENTES TEMPOS
RESUMO
Avaliação da concentração de ferro sérico e ferriti na em ratos, após
clampeamento total do pedículo hepático e reperfusã o em diferentes tempos
No trauma hepático, torna-se necessário o bloqueio do fluxo sanguíneo para facilitar as manobras cirúrgicas reparadoras. Uma das formas de conter essa hemorragia é por meio do clampeamento total do pedículo hepático (artéria hepática, veia porta e colédoco). No entanto, esse procedimento resulta na congestão esplâncnica e, consequentemente, perfusão sanguínea deficiente de órgãos como fígado, estômago, intestino delgado, parte anterior do intestino grosso, pâncreas e baço. Além disso, ao restabelecer o fluxo sanguíneo desses órgãos, novas complicações, além das lesões já causadas pelo clampeamento, surgirão. Avaliou-se neste estudo, as concentrações de ferro sérico e ferritina após desclampemaneto do pedículo hepático em vários tempos. Foram utilizados 42 ratos Wistar, machos, com três meses de idade e peso médio 300 gramas, distribuídos aleatoriamente em quatro grupos experimentais: grupo controle (GC) – representados por seis animais que não foram submetidos ao clampeamento do pedículo hepático; grupo E10, representado doze animais que foram submetidos ao clampeamento do pedículo hepático por 10 minutos; grupo E20, representado doze animais que foram submetidos ao clampeamento do pedículo hepático por 20 minutos e grupo E30, representado doze animais foram submetidos ao clampeamento do pedículo hepático por 30 minutos. Cada grupo clampeado foi subdividido em quatro subgrupos representados por três animais, nos quais desclampeados para reperfusão: subgrupo R15, - submetidos a 15 minutos de reperfusão, subgrupo R30 - submetidos a 30 minutos de reperfusão, grupo R60 - submetidos a 60 minutos de reperfusão e grupo R120 - submetidos a 120 minutos de reperfusão.
Palavras chaves: Ferritina. Ferro sérico. Isquemia. Ratos wistar. Reperfusão.
ABSTRACT
Determination of serum iron and ferritin in rats af ter total hepatic pedicle clamping and reperfusion at different times .
In hepatic trauma, it is necessary the blocking of the blood flow to facilitate reparative surgical maneuvers. One way to stop this hemorrhage is through total clamping of the hepatic pedicle (hepatic artery, portal vein and common bile duct). However, this procedure results in splanchnic congestion and hence poor blood perfusion of organs such as liver, stomach, small intestine, anterior part of the large intestine, pancreas, and spleen. Furthermore, by restoring blood flow to those organs, new complications, as well as injuries caused by clamping, arise. This study evaluated, the concentrations of serum iron and ferritin after the declamping of pedicular liver at various times. It was used a total of 42 male Wistar rats with three months old and weighting 300 grams, randomly divided into four groups: control group (CG) - represented by six animals that haven´t been submitted to the hepatic pedicle clamping; E10 Group, represented by twelve animals which have been submitted to the hepatic pedicle clamping for 10 minutes; E20 group, represented by twelve animals which have been submitted to the hepatic pedicle clamping for 20 minutes and E30 group, represented by twelve animals which have been submitted to the hepatic pedicle clamping for 30 minutes. Each group has been subdivided into four clamped subgroups represented by three declamping animals from reperfusion: subgroup R15, - submitted to 15 minutes of reperfusion, subgroup R30 - subjected to 30 minutes of reperfusion, group R60 - subjected to 60 minutes of reperfusion and group R120 - subjected to 120 minutes of reperfusion.
Keywords: Ferritin. Iron. Ischemia. Male Wistar. Reperfusion.
4.1. INTRODUÇÃO
O sistema digestório está envolvido com secreções e absorções de
nutrientes, tais como: minerais, proteínas, vitaminas, açúcares e gorduras. As
enzimas e alguns tipos de ácidos estão envolvidos na digestão dos alimentos. A bile,
o suco pancreático e a água também contribuem no processo. O sistema digestório
possui uma barreira mucosa capaz de protegê-lo contra as ações do suco gástrico
durante o processo de digestão, além de impedir a penetração de microorganismos
patogênicos no organismo. A absorção de nutrientes, vitaminas e minerais está
localizada no intestino delgado (CAMARGO, 2004).
Restrepo e Felix (1994) observaram que a isquemia intestinal constitui uma
injúria associada com alta letalidade. Com o aumento crescente de problemas que
afetam a sociedade moderna, a enfermidade vascular abdominal adquire
preponderante importância epidemiológica. A gravidade e a extensão da necrose
intestinal isquêmica dependem do vaso principal afetado, da qualidade e da
circulação colateral e de sua capacidade de resposta, além do estado da circulação
geral e do grau de reperfusão. A isquemia resulta na liberação de grande quantidade
de agentes tóxicos endógenos, que são produtos normais e do metabolismo celular,
gerados inicialmente pela hipoperfusão e anóxia, agravando-se com a reperfusão
dos tecidos afetados. Esses produtos tóxicos exercem ação deletéria, tanto local,
como sistêmica.
Devido à lesão de mucosa, a isquemia se torna particularmente grave no
intestino, desencadeando efeitos intensos e complexos, em decorrência da absorção
de endotoxinas e da ocorrência de distúrbios hidroeletrolíticos e no equilíbrio ácido-
base, que se manifestam em órgãos à distância e cujo tratamento é mais difícil que
a correção dos distúrbios isquêmicos ou ressecção cirúrgica intestinal (MOORE,
1990).
Nas lesões sangrantes dos órgãos drenados pelo sistema porta, torna-se
necessário o bloqueio de seus vasos sanguíneos para que procedimentos cirúrgicos
reparadores possam ser realizados (SILVA JR. et al., 2002; ARAÚJO JR. et al,
2005). Desde 1908, para conter hemorragias hepáticas, Pringle propôs a realização
do clampeamento total do pedículo hepático (artéria hepática, veia porta e
colédoco), procedimento que resulta na congestão esplâncnica e,
consequentemente, perfusão sanguínea deficiente de órgãos como fígado,
estômago, intestino delgado, parte anterior do intestino grosso, pâncreas e baço
(SEBE, 1999; CAMARGO et al., 2003; FREITAS, 2004; CAMARGO, 2004;
BRASILEIRO et al., 2007; PIRES, 2008). Na sequência, ao restabelecer o fluxo
sanguíneo hepático, reperfusão, novas agressões surgirão além das lesões já
causadas pelo período de isquemia (MIRANDA et al., 2004; SILVA, et al., 2006).
Da mesma forma, supõe-se que nos casos de dilatações vólvulo-gástrica,
encarceramentos nefro-esplênico ou gastro-esplênico, torção esplênica,
intussuscepção e torção intestinal, em que ocorre compressão seguida de
descompressão do pedículo hepático, ou seja, uma isquemia seguida de reperfusão
possa culminar com o comprometimento dos órgãos envolvidos com o sistema porta,
como fígado, baço, pâncreas, estômago, intestino delgado, além das lesões em
órgãos remotos, como pulmões, rins, coração e musculatura esquelética (CAMPOS
e YOSHIDA, 2004; MIRANDA et al., 2004; FRANCISCO NETO et al., 2005;
CAMARGO et al., 2006; TEIXEIRA et al., 2009; FREITAS et al., 2009).
O evento isquêmico inicia uma resposta inflamatória que se perpetua após a
reperfusão sanguínea, em grande parte, devido à produção de espécies reativas do
metabolismo do oxigênio (BERNADI, 2007). Esse fenômeno é conhecido como
lesão de isquemia e reperfusão. Esse evento envolve mecanismos fisiopatológicos e
vias metabólicas complexas, ainda pouco esclarecidas, porém o resultado final é a
falência de órgãos e morte do paciente (MIRANDA et al., 2004; SILVA, et al., 2006).
Sendo assim, células submetidas à isquemia, que não sofreram lesão
irreversível, com a reperfusão, em vez de se recuperarem, evoluem para morte por
necrose. Os mecanismos propostos incluem a formação de espécies reativas de
oxigênio nas células parenquimatosas, endoteliais e nos linfócitos que infiltram a
lesão, que produzidas durante a reperfusão causam lesão celular diretamente por
agredir uma variedade de moléculas celulares e indiretamente pela promoção da
síntese de mediadores pró-inflamatórios (DAEMEN et al., 2002).
O radical hidroxil (HO.) é o mais reativo das espécies reativas de oxigênio
(EROs), o qual é responsável pela peroxidação lipídica e lise da membrana celular.
A presença do ferro (Fe++), íon metálico de transição, associado com o peróxido de
hidrogênio, por meio da reação de Fenton ou Haber-Weiss, potencializa a formação
do radical hidroxil (CAMPOS e YOSHIDA, 2004). Estudos desenvolvidos por Freitas
et al. (2009, 2009a), realizando o clampeamento total do pedículo hepático (manobra
de Pringle, 1908), mostraram, pela técnica do ferrocianeto-férrico, acúmulo
progressivo de pigmentos férricos (hemossiderina) nos macrófagos presentes no
parênquima esplênico, durante a congestão esplâncnica. Supõe-se que, com a
reperfusão, esse íon ferro acumulado alcance a corrente sanguínea, potencializando
a formação de radicais hidroxil e, consequentemente, as injúrias promovidas pelas
espécies reativas do oxigênio.
Com a evolução dos estudos na área dos transplantes hepáticos, modelos
experimentais de isquemia e reperfusão hepática têm sido muito difundidos. Além
dos transplantes hepáticos, esses modelos podem ser utilizados em inúmeras outras
situações, como em ressecções hepáticas, devido a tumores, traumas com lesão
hepática e choque hemodinâmico. Pela relevância dos resultados obtidos com a
isquemia promovida pelo clampeamento total do pedículo hepático (manobra de
Pringle modificada), em diferentes tempos (SEBE, 1999; CAMARGO, 2004; PIRES;
2008; FREITAS 2009), propõe-se neste estudo, pesquisar a concentração de ferro
sérico e ferritina, após clampeamento total do pedículo hepático e reperfusão em
diferentes tempos.
O objetivo deste trabalho foi avaliar e correlacionar a concentração de ferro
sérico e ferritina após o clampeamento total do pedículo hepático (isquemia),
seguido do desclampeamento (reperfusão), em tempos definidos. Tempos definidos
para isquemia, pelo clampeamento do pedículo hepático (10, 20 e 30 minutos),
seguida de reperfusão pelo desclampeamento em tempos definidos (15, 30, 60 e
120 minutos).
4.2. MATERIAL E MÉTODOS
Para realização deste estudo, o projeto foi submetido à aprovação do Comitê
de Ética da Universidade de Cuiabá – UNIC, Registro: nᵒ56 CEP/UNIC/2009 –
protocolo nᵒ 2009-097.
O experimento foi desenvolvido na sala de técnica operatória do Hospital
Veterinário da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade de Cuiabá –
UNIC. Os animais foram fornecidos pelo Biotério da Universidade de Cuiabá – UNIC,
mantido pelo Hospital Veterinário da Faculdade de Medicina Veterinária.
Foram utilizados 42 ratos da raça Wistar, machos, três meses de idade e
peso médio de 300 gramas. Os animais ficaram alojados em gaiolas, com
temperatura ambiente mantida por ar condicionado em 22oC, umidade em 65% e
luminosidade controlada artificialmente com lâmpadas fluorescentes (luz do dia -
Phillips – 40 Watts), com 12 horas de luz e 12 horas de escuro, água e alimentação
ad libitum. Após jejum alimentar de duas horas, os animais foram anestesiados com 25
mg/Kg de xilazina e 50 mg/Kg de cetamina, associadas na mesma seringa, pela via
intraperitoneal, seguido de tricotomia (Figura 9) e antissepsia (Figura 10), colocação de
panos de campos (Figura 11). Em continuidade realizou-se celiotomia mediana pré-umbilical
(Figuras 12 e 13), identificação e clampeamento do pedículo hepático (Figuras 14, 15 e 16),
e desclampeamento de acordo com cada tempo em estudo (Figuras 17 e 18).
Os animais foram distribuídos aleatoriamente em quatro grupos
experimentais: grupo controle (C) – representados por seis animais em que não foi
realizado o clampeamento do pedículo hepático, grupo E1, representado 12 animais
submetidos ao clampeamento do pedículo hepático por 10 minutos, grupo E2,
representado 12 animais submetidos ao clampeamento do pedículo hepático por 20
minutos e grupo E3, representado 12 animais submetidos ao clampeamento do
pedículo hepático por 30 minutos. Em seguida, cada grupo foi subdividido em quatro
subgrupos: grupo R15, - representado por três animais de cada grupo (E1, E2 e E3)
submetidos a 15 minutos de reperfusão, após o desclampeamento do pedículo
hepático, grupo R30 - representado por três animais de cada grupo (E1, E2 e E3)
submetidos a 30 minutos de reperfusão, após o desclampeamento do pedículo
hepático, grupo R60 - representado por três animais de cada grupo (E1, E2 e E3)
submetidos a 60 minutos de reperfusão, após o desclampeamento do pedículo
hepático e grupo R120 - representado por três animais de cada grupo (E1, E2 e
E3) submetidos a 120 minutos de reperfusão, após o desclampeamento do pedículo
hepático.
Após a coleta de sangue dos animais de todos os grupos, eutanasiaram-se os
animais por aprofundamento do plano anestésico e cloreto de potássio a 10%.
Figura 9 - Animal sendo submetido a tosquia da região abdominal com máquina tosquiadeira.
Fonte: Sebe et al. (1999).
Figura 10 - Anti-sepsia da região abdominal do animal com PVPI tópico.( Polivinil Pirrolidona Iodo)
Fonte: Sebe et al. (1999).
Figura 11 - Panos de campo colocados sobre o animal e fixados com pinças
Backhaus®.
Fonte: Sebe et al. (1999).
Figura 12 - Celiotomia pré-retro umbilical com bisturi.
Fonte: Sebe et al. (1999).
Figura 13 - Ampliação da incisão da cavidade abdominal com tesoura Metzenbaum®.
Fonte: Sebe et al. (1999).
Figura 14 - Ilustração do pedículo hepático.
Fonte: www.facmed.unam.mx. 2012.
Figura 15 - Apresentação do hilo hepático (sistema porta hepático).
Fonte: Arquivo pessoal (2012).
Figura 16 - Clampeamento do pedículo hepático com pinça vascular.
Fonte: Arquivo pessoal (2012).
Figura 17 - Animais durante a reperfusão (desclampeados).
Fonte: Arquivo pessoal (2012).
Figura 18 - Animais durante a reperfusão.
Fonte: Arquivo pessoal (2012).
Ao final de cada período de reperfusão, obteve-se de cada animal uma amostra
de sangue venoso colhido da veia cava caudal, acondicionado em tubo de coleta de
sangue à vácuo, sem anticoagulante, que foi posteriormente centrifugado, em
centrífuga (Modelo- Excelsa II 206 BL, Marca- FANEM) em velocidade de 3.000 rpm
durante cinco minutos, para obtenção do soro, a ser analisado a concentração de
ferro sérico e ferritina.
A avaliação da concentração de ferro sérico e ferritina foram realizadas no
Laboratório de Análises Clínicas do Hospital Geral Universitário.
Para análise das amostras, foram utilizados analisadores automatizados. Para
dosagem de ferro sérico, o analisador utilizado foi o modelo A15 da marca
BioSystems, utilizando kit de ferro marca BioSitems. Já para o dosagem de ferritina,
o analisador é o modelo AxSYM da marca Abbott, utilizando kit de ferritina marca
AxSYM-Abbot.
Os dados obtidos na fase experimental serão submetidos à análise estatística
empregando-se o software Jandel Sigma Stat para Windows (Jandel Corporation,
1993).
As informações colhidas referentes ao ferro sérico e da ferritina foram
analisadas estatisticamente utilizando o software IBM SPSS 21.0, consistindo em
análises de variâncias com comparações post hoc pelo teste de Dunnet. Os
pressupostos de aderência dos resíduos a distribuição normal e homogeneidade de
variâncias, respectivamente, obtendo resultados não significativos para ambos.
4.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Foi realizada análise de variância para repetições múltiplas (one way RM
ANOVA) na avaliação das diferenças das médias ao longo do tempo dentro de cada
grupo, seguida pelo teste de Student-Newman-Keuls. A comparação entre os
grupos, nos diferentes intervalos,foi realizada pelo teste-t de Student. As diferenças
serão consideradas estatisticamente significativas quando p>0,05.
4.3.1. Resultado macroscópico quanto à coloração
Na ocasião do clampeamento, todos os órgãos drenados pelo sistema porto
apresentaram-se congestos (Figura 19).
Figura 19 - Intestino delgado e estômago congestos após clampeamento do pedículo hepático. Fonte: Arquivo pessoal (2012).
4.3.2. Resultado microscópico
A congestão esplâncnica causada pelo clampeamento total do pedículo
hepático (manobra de Pringle, 1908), favorece o acúmulo progressivo de pigmentos
férricos (hemossiderina) nos macrófagos presentes no parênquima esplênico
(FREITAS et al. 2009, 2009a). (Figura 20)
Figura 20 - Notar em C (grupo controle) pigmento de hemossiderina dentro do macrófagos, aumenta progressivamente (setas), nos grupos E1 (10 minutos), E2 (20 minutos) e E3 (30 minutos). Reação de Perls (Ferrocianeto-férrico) 10X.
Fonte: FREITAS et al. (2009, 2009ª).
Logo, com a reperfusão, esse íon de ferro poderia alcançar a corrente
sanguínea, favorecer a formação de espécies reativas de oxigênio como os radicais
hidroxil e, consequentemente, injúrias celulares.
No entanto, como não houve aumento significativo de ferro sérico,
provavelmente essa injúria celular não ocorrerá. Logo, o mesmo não pode afirmado
com a ferritina, pois a mesma apresentou-se diferença significativa, apenas no grupo
reperfusão de 120 minutos.
4.3.3. Resultados Bioquímicos
A Tabela 1 apresenta os valores médios de ferro sérico em ratos após
clampeamento por 10, 20 e 30 minutos, seguido de reperfusão por 15, 30, 60 e 120
minutos.
C
E2
E1
E3
Tabela 1 – Valores médios de ferro sérico (mcg/dL) em ratos submetidos a 10 (T10), 20 (T20) e 30 (T30) minutos de clampeamento seguidos de reperfusão por 15, 30, 60 e 120 minutos
Ferro sérico
Tempo Clampeamento C R15 R30 R60 R120
T10 214,4 125,8 203,8 190,4 242,5
T20 214,4 173,3 201,5 217,2 341,4
T30 214,4 302,7 217,5 303,4 210,7
A Tabela 2 apresenta os valores médios de ferritina em ratos após
clampeamento por 10, 20 e 30 minutos, seguido de reperfusão por 15, 30, 60 e 120
minutos.
Tabela 2 – Valores médios de ferritina (ng/mL) em ratos submetidos a 10 (T10), 20 (T20) e 30 (T30) minutos de clampeamento seguidos de reperfusão por 15, 30, 60 e 120 minutos
Ferritina
Tempo Clampeamento C R15 R30 R60 R120
T10 9,69 29,0 13,4 27,5 53,7
T20 9,69 14,5 24,4 26,5 79,2
T30 9,69 31,3 28,6 22,7 137,9
No estudo estatístico desenvolvido para comparar os resultados obtidos no
experimento entre o grupo controle e os diferentes tempos de reperfusão 15, 30, 60
e 120 minutos para as quantificações realizadas para a variação da quantidade do
ferro sérico não detectaram diferenças significativas, estando as variações do ferro
sérico entre o grupo controle e os grupos experimentais em diferentes tempos. Ao se
comparar o mesmo fator entre os diferentes tempos de reperfusão observou-se que
o grau de significância estava dentro do prescrito pela literatura, não se detectando
diferenças significativas na quantificação do ferro sérico não demonstrou nenhum
grau de significância (Figura 21).
Figura 21 - Concentração de ferro sérico (mcg/dl) de ratos submetidos ao clampeamento (isquemia) seguido de reperfusão por 15, 30, 60 e 120 minutos.
No estudo estatístico desenvolvido para se comparar os resultados obtidos no
experimento entre o grupo controle e os grupos tempos de reperfusão observou-se
que as quantificações realizadas para a variação da ferritina sérica apresentou
diferenças significativas somente para o grupo de tempo de reperfusão de 120
minutos. Ao se comparar o grupo controle e os grupos de reperfusão com tempos de
15, 30 e 60 minutos não detectou-se grau de significância estando os resultados
compatíveis com os citados na literatura consultada (FREITAS et.al., 2003).
Ao compararmos os resultados obtidos para a ferritina sérica entre os grupos
de reperfusão em diferentes tempos observou-se que a variação obtida entre os
tempos de 15,30 e 60 minutos foram não significativos não havendo variação
significativa da ferritina sérica entre os grupos comparados. Já quanto comparamos
os grupos com tempos de reperfusão de 15,30 e 60 minutos com o grupo de
reperfusão com tempo de 120 minutos observou-se um nível significância menor que
1%, sendo o resultado obtido para a ferritina sérica para o tempo de reperfusão de
120 minutos muito superior aos grupos de reperfusão para 15,30 e 60 minutos
(Figura 22).
Figura 22 - Concentração de ferritina (ng/ml) de ratos submetidos ao clampeamento (isquemia) seguido de reperfusão por 15, 30, 60 e 120 minutos.
4.4. CONCLUSÃO
A concentração de ferro pode não ser alterada após clampeamento e
reperfusão do pedículo hepático em diferentes tempos, ao passo que a ferritina pode
ter aumento da concentração após reperfusão em tempos mais longos.
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5. CONCLUSÕES GERAIS
A concentração de ferro pode não ser alterada após clampeamento e
reperfusão do pedículo hepático em diferentes tempos, ao passo que a ferritina pode
ter aumento da concentração após reperfusão em tempos mais longos.
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