mÉtodos de estudo: cÉlulas e tecidos · 20/8/2012 7 raduan corantes básicos o grupamento...
Post on 04-Oct-2018
213 Views
Preview:
TRANSCRIPT
20/8/2012
5
Raduan
FixaçãoFinalidades:
�Evitar a autólise;� Impedir a atividade e proliferação de bactérias;
�Endurecer as células ⇒⇒⇒⇒ resistir as próximas etapas;
� ↑↑↑↑ afinidade das estruturas celulares pelos corantes usados na M.O. e ↑↑↑↑contrastes na M.E.
� “Preservar” a morfologia e composição dos tecidos.
Raduan
FixaçãoAgentes Fixadores:
�Físicos:�Frio (Congelação); �Calor
�Químicos�Formaldeído (+comum);�Aldeído glutárico�Tetróxido de ósmio�Misturas fixadoras (Bouin,etc)
Microscopiaeletrônica
Raduan
Inclusão�Incluídos (protegidos) em parafina ou resina plástica ⇒⇒⇒⇒M.O.
�Incluídos em resinas do tipo epóxi (Araldite, Epon) ⇒⇒⇒⇒ M.E.
OBS.: Envolvem e penetram nas células.
20/8/2012
6
Raduan
InclusãoOBS.: Antes da inclusão a amostra sofre: �Desidratação([ ] ↑↑↑↑ etanol = 70%→→→→Absoluto)�Diafanização(clareamento = benzol, xilol ou toluol)
Raduan
Microtomia�Micrótomo
�Microscopia óptica: cortes de 1 a 6 µµµµm, geralmente;
�Microscopia eletrônica: cortes de 0,02 a 0,1 µµµµm, geralmente;
�Micrótomo de congelação(obtenção rápida de cortes, histoquímica, etc).
Raduan
Coloração�A maioria dos tecidos é incolor;
�Facilita a visualização dos componentes teciduais;
�Propicia contraste entre os componentes celulares;
20/8/2012
7
Raduan
Corantes básicos�O grupamento químico responsável pela cor (cromóforo) = catiônico
�Combinam-se com grupamentos ácidos (aniônicos) das moléculas celulares. Ex.: DNA, RNA (Basófilas = afinidade por corantes básicos)
Raduan
Corantes básicos�Azul de toluidina�Azul de metileno�Hematoxilina
Raduan
Corantes ácidos�Cromóforo = aniônico�Combinam-se com grupamentos básicos (catiônicos) das moléculas celulares. Ex.: Componentes básicos das proteínas citoplasmáticas (acidófilas = afinidade por corantes ácidos).
20/8/2012
8
Raduan
Corantes ácidos�Orange G�Fucsina ácida�Eosina
Raduan
HEMATOXILINA & EOSINA (H&E)
�Coloração dupla + utilizada na rotina histológica;
�Hematoxilina: cora em azul os núcleos celulares e estruturas de natureza ácida (basófilas);
�Eosina: cora em diversas tonalidades de vermelho o citoplasma e o colágeno do material extracelular (acidófilas).
MICROSCÓPIOS
20/8/2012
9
Raduan
Microscópio óptico�Parte mecânica
�Suporte para a parte óptica�Parte óptica
�Condensador �Objetiva�Ocular
Raduan
Microscópio óptico
Raduan
Microscópio ópticoAmpliação total da imagem =
Aumento da objetiva x
Aumento da ocular
20/8/2012
10
Raduan
Microscópio óptico�Poder de resolução (sistema óptico) = capacidade de separar detalhes
Raduan
Microscópio óptico�Limite de resolução = menor distância que deve existir entre 2 pontos para que eles apareçam, individualizados. Ex.: 2 partículas separadas por 0,3 µµµµm aparecem individualizadas em um sistema óptico com limite resolutivo de 0,2 µµµµm, porém aparecem como partícula única quando o limite resolutivo é de 0,5 µµµµm
Raduan
Microscópio ópticoLimite de resolução (LR)LR = K x λλλλ
ANK = constante de valor 0,61;AN = abertura numérica (AN= n x sen αααα; n=índice de refração; αααα= semi-
ângulo da abertura)
20/8/2012
11
Raduan
Microscópio óptico“ O que determina a riqueza de detalhes da imagem formada por um sistema óptico é o seu limite de resolução, e não o seu poder de aumentar o tamanho dos objetos”.
Raduan
Microscópio de Contraste de fase
�Transforma diferenças de fase dos raios luminosos em diferenças de intensidade;
≠≠≠≠ de fase ⇒⇒⇒⇒ ≠≠≠≠ de intensidade luminosa = perceptível
Traduzida
Raduan
Microscópio de Contraste de fase
�Utilizado no estudo de células e tecidos vivos;
�Estruturas celulares�Escuras = fase positiva�Claras = fase negativa
20/8/2012
13
Raduan
Microscópio Confocal�A iluminação é feita por um delgado feixe de raios laser, que varre ponto por ponto um determinado plano da célula = “corte óptico”;
�A imagem é formada exclusivamente pelas estruturas que estão no plano de varredura ⇒⇒⇒⇒ imagem muito nítida.
Raduan
Raduan
20/8/2012
14
Raduan
Raduan
Microscópio de fluorescência
�Utiliza fonte de luz ultravioleta;
Luz UV ⇒⇒⇒⇒ espécime ⇒⇒⇒⇒ Luz visível�Estruturas marcadas com corantes fluorescentes�Ex.:Alaranjado de acridina (DNA ⇒⇒⇒⇒ verde-amarelado; RNA ⇒⇒⇒⇒vermelho-alaranjado)
RaduanCitoesqueleto (cultura de fibroblastos)RITC-phalloidin – M. fluorescência
Citoesqueleto (cultura de fibroblastos)M. eletrônica
20/8/2012
15
Raduan
Microscópio eletrônico�Apresenta alta resolução;�Riqueza de detalhes;�Utiliza feixes de elétrons;�Cortes ultra-finos (20 a 100 nm)
Raduan
Microscópio eletrônicoTransmissãoAquecimento do cátodo (filamento de tungstênio) no vácuo = elétronsacelerados por uma ≠≠≠≠ de potencial de 60 a 100 kV ⇒⇒⇒⇒ placa perfurada ⇒⇒⇒⇒ feixes de elétrons ⇒⇒⇒⇒ lentes eletromagnéticas (condensadora) ⇒⇒⇒⇒objeto ⇒⇒⇒⇒ lentes (≈≈≈≈objetiva) ⇒⇒⇒⇒lente (projetora) ⇒⇒⇒⇒ tela fluorescente ou filme fotográfico
Raduan
Microscópio eletrônico de transmissão
20/8/2012
16
Raduan
Microscópio eletrônicoVarreduraBobina de varredura ⇒⇒⇒⇒ feixe de elétrons incide ponto por ponto do objeto
RaduanMicroscópio eletrônico de varredura
HISTOQUÍMICA E CITOQUÍMICA
20/8/2012
17
Raduan
HISTOQUÍMICA E CITOQUÍMICA
Métodos utilizados para a localização intracelular das diversas substâncias que compõem as células e tecidos.
Raduan
HISTOQUÍMICA E CITOQUÍMICA
Reações químicas específicas, ou interação macromolecular de alta afinidade ⇒⇒⇒⇒ compostos insolúveis, corados, ou elétron-densos ⇒⇒⇒⇒ localização de substâncias específicas (M.O. ou M. E.)
Raduan
HISTOQUÍMICA E CITOQUÍMICA
�Lipídios�Corantes + solúveis nos lipídios do que no líquido que o corante está dissolvido;
�Sudan IV ⇒ vermelho
�Sudan negro ⇒ preto
20/8/2012
18
Raduan
HISTOQUÍMICA E CITOQUÍMICA
�Ácido desoxirribonucléico (DNA)�Reação de FeulgenHidrólise do DNA (ácido clorídrico) ⇒⇒⇒⇒ DNA com radicais aldeído livres + reativo de Schiff⇒⇒⇒⇒ composto insolúvel e vermelho
*Intensidade da cor proporcional ao teor de DNA
Raduan
HISTOQUÍMICA E CITOQUÍMICA
�Ácido ribonucléico (RNA)�↑↑↑↑Afinidade por corantes básicos (azul de toluidina ou azul de metileno);
�Ribonuclease�Utiliza-se 2 preparações
Raduan
HISTOQUÍMICA E CITOQUÍMICA
�Polissacarídeos�Glicogênio
�P.A.S. (Periodic Acid-Schiff)�Amilase
�Utiliza-se 2 preparações
top related