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MICROBIOLOGIE INDUSTRIELLE

Cours théorique 3ème Année TA

Prof. A. TANTAOUI ELARAKI

Microbiologie Industrielle

Présentation générale

� Cours Théorique: 24 heures

� Travaux Pratiques: 14 heures� Enseignants

- Cours théorique: A. TANTAOUI ELARAKI

- Travaux Pratiques: H. AMAROUCH

Microbiologie Industrielle

Présentation générale (suite)

- Polycopié distribué

- Présentation Data show- Participation des étudiants souhaitée

- Rappels si nécessaire (les réclamer)- Possible de déborder du cadre strict du

Microbiologie industrielle

Plan du cours

� Introduction� I- La souche microbienne à usage industriel

� II- Les microorganismes d’intérêt industriel dans les IAA

� III- Les micro-organismes utilisés dans l’industrie laitière

� IV- La levure boulangère

Introduction

� Microbiologie industrielle: étudie les micro-organismes utilisés dans l’industrie

� Microbiologie industrielle alimentaire: concerne les micro-organismes utilisés dans l’industrie alimentaire

� Microbiologie alimentaire: généralement réservée aux microbes indésirables

Introduction (suite)

� Remarques:1- un même micro-organisme peut être indispensable

dans un produit et indésirable dans un autre2- Microbiologie industrielle = biotechnologie

- Microbiologie industrielle: définition des souches, nature, systématique, propriétés, etc.

- Biotechnologie: exploitation industrielle de leurs propriétés.

Introduction (suite)� Rôle essentiel des MO dans les industries de

fermentation (biotechnologies):- Panification: boulangerie, viennoiseries, etc.- Fermentations laitières: fromages, yaourts, autres laits

fermentés, etc. - Fermentations végétales : olive, choucroute, cornichons - Fermentations carnées: saucissons fermentés, jambon, - Fermentation alcoolique: Brasserie, Cidrerie, Œnologie- Fermentation acétique: Vinaigrerie

� Multiples fonctions des microorganismes:

- Fonction technologique;

- Rôle dans la conservation;- Fonction nutritionnelle;

- Intérêt sanitaire.

1. Fonction technologique

1.1. Fermentation

o Métabolisme = Transformation de la matière première

•••

Fermentation des sucres

Transformation des Protéines

Transformation des Lipides

1.2. Qualité organoleptique

o Changements

� Goût

� Odeur

� Apparence physique

� Consistance / Texture (les propriétés rhéologiques du produit)

Modification de la composition

chimique et de la texture

2. Rôle dans la conservation/amélioration de la qualité hygiénique

� Production de substances antimicrobiennes

o Acides organiques (Acides lactique, acétique, propionique)

o Bactériocines / antibiotiques

o Alcools

o Diacétyle

• Inhibition de micro-organismes pathogènes et/ou d’altération

Salmonella spp., Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Shigella spp.,

Staphylococcus aureus, Clostridium, Bacillus cereus, etc.

Diminution du risque d'intoxications alimentaires d’origine

microbienne

La plus ancienne méthode d'assurance qualité utilisée par l'homme de façon

empirique 6

3. Fonction nutritionnelle

� Production de vitamines (Vitamines du groupe B, Ac. folique, etc.)

� Amélioration de la digestibilité de nutriments complexes

� Disponibilité d’acides aminés essentiels

� Meilleure disponibilité d’oligo-éléments ( ex.: Phytates et fer dans le pain)

4. Intérêt sanitaire

� Probiotiques: Action bénéfique sur la santé humaine ou animaleo Diminution du taux de cholestérol dans les aliments

o Diminution de l’acuité de l’intolérance au lactose

o Colonisation de l’intestin / micro-organismes utiles§§§§ Lutte contre les pathogènes dans l’intestin

§§§§

Rôle anti-cancer

Dégradation de toxines (exp. Bactéries lactiques et mycotoxines)

Chapitre I- La souche microbienne à usage industriel

� I.1- Caractéristiques du micro-organisme idéal

� I.2- Obtention des souches� I.3- Amélioration des souches

� I.4- Conservation des souches

I- La souche microbienne à usage industriel

I.1- Caractéristiques de la souche idéale

- Croissance rapide sur un substrat peu coûteux avec rendement élevé

- Production intense des enzymes nécessaires- Transformation dans des conditions simples, y

compris récupération du produit désiré

- Stabilité génétique- Autres (selon le cas)

I.2- Obtention des souches

� I.2.1- « Screening technic » pour l’obtention de nouvelles souches

� I.2.2- Collection de souches (« souchothèques »)

I.2- Obtention des souches (suite)� I.2.1- Screening technic

- Principe:

> passer au crible grand nombre de souches> chercher là où on a le plus de chance de trouver

I- La souche microbienne à usage industrielI.2- Obtention des souchesI.2.1- Screening technic

� Technique: souvent culture en boîte de Petri, milieu et conditions soigneusement choisis, puis purification des souches

- Exemples:

> souche capable de fermenter le lactose> souche pour décomposer les hydrocarbures

I- La souche microbienne à usage industrielI.2- Obtention des souchesI.2.1- Screening technic

� Inconvénient: trop long

- Exemple: découverte d’un Actinomycète producteur d’oxytétracycline

2 ans55 chercheurs134 726 souches5000 échantillons de sol

I- La souche microbienne à usage industrielI.2- Obtention des souchesI.2.2- Collections de souches

� Définition: laboratoires spécialisés dans:

- l’isolement- l’identification

- la caractérisation- l’entretien et le stockageLes souches sont répertoriées et mises à

la disposition des utilisateurs

I- La souche microbienne à usage industrielI.2- Obtention des souchesI.2.2- Collections de souches

� ExemplesATCC: American Type Culture Collection (USA)CBS: Central Bureau voor Schimmel culture (NL)NRRL: Northern Regional Research Laboratory

(USA)CCTM: Centre de Collection de Types Microbiens

(CH)NCIB: National Collection of Industrial Bacteria

NCTC: National Collection of Type Culture (UK)

I.3- Amélioration des souches

� I.3.1- Sélection naturelle� I.3.2- Mutagenèse

� I.3.3- Recombinaison génétique « naturelle »� I.3.4- Fusion cellulaire induite (fusion de

protoplastes)

� I.3.5- Recombinaison génétique in vitro (génie génétique)

I- La souche microbienne à usage industrielI3- Amélioration des souches (suite)

� I.3.1- Sélection naturelle- Choisir l’individu le plus performant

- Le cultiver- Sélectionner le plus performant de sa

descendance (2ème génération)- Poursuivre sur plusieurs générations

Applications sur moisissures productrices d’antibiotiques (+ 25%)

I- La souche microbienne à usage industrielI.3- Amélioration des souches (suite)

� I.3.2- Mutagenèse

- Principe- Dose efficace

- Agents mutagènes- Criblage des mutants- Applications

I- La souche microbienne à usage industrielI.3- Amélioration des souchesI.3.2- Mutagenèse (suite)

� Principe: provoquer changements génétiques par mutation

� Dose efficace

- Dose mortelle pour 99,5 à 99,9% de la population (0,1 à 0,5% de survivants)

- Fréquence de mutation: 10-2 (10-6 à 10-8 pour mutation naturelle)

� Agents mutagènes chimiques

- Propionolactone- Analogues bases pur. & pyr.- Agents alkylants à l’azote- Acide nitreux- Oxyde d’éthylène- Dérivés de l’acridine- Sulfates et sulfonates (EMS)- Epoxydes- Ethylène- imines

� Agents mutagènes physiques

- Rayons UV- Rayons γ- Rayons X

� Criblage des mutants: mise en évidence et récupération

Exemples:- Mutant auxotrophe pour un facteur de

croissance donné- Mutant résistant à un agent antimicrobien

chimique- Mutant capable de fermenter un glucide

� Applications- Amélioration de Penicillium chrysogenum pour

production de pénicilline (sélection naturelle et mutagenèse)

- Souches mutantes de levure insensibles à la répression catabolique du glucose (pour assimilation du maltose)

- Souches mutantes de levure capables de synthétiser la thiamine

I- La souche microbienne à usage industrielI.3- Amélioration des souches (suite)

� I.3.3- Recombinaison génétique « naturelle »

- I.3.3.1- Reproduction sexuée

- I.3.3.2- Parasexualité

I- La souche microbienne à usage industrielI.3- Amélioration des souchesI.3.3- Recombinaison génétique « naturelle »

� I.3.3.1- Reproduction sexuée

- Possible pour les Ascomycètes (ex. : levure)

- Conditions restrictives:o même espèce

o signes sexuels opposés

Gamète mâle

Levure + ou a

Gamète femelle

Levure - ou α

A (n) B (n)

Conjugaison

Zygote

Crossing-over

RecombinésA B

� I.3.3.2- Parasexualité (cas des Fungi imperfecti)

Cycle de reproduction découvert chez certaines espèces de moisissures parmi les champignons imparfaits

Filament A (n)

Filament B (n)ANASTOMOSE

HETEROCARYON FUSION NUCLEAIRE (10-6-10-7)

HAPLOIDISATION (méïose)

Spores obtenues:Type parental AType parental BTypes haploïdes recombinésTypes diploïdes recombinés

- Notion d’hétérocaryon forcéMaintien de l’hétérocaryon dans un milieu minimum, les souches parentales A et B ayant 2 auxotrophies différentes

- Conditions restrictives:

. Filaments de même espèce

. Filaments compatibles

I- La souche microbienne à usage industrielI.3- Amélioration des souches

� I.3.4- Fusion cellulaire induite (fusion de protoplastes)

- Objectif

- Principe- Technique

- Quelques applications- Exemple détaillé

I- La souche microbienne à usage industrielI.3- Amélioration des souchesI.3.4- Fusion cellulaire induite

� Objectif: obtenir des recombinaisons génétiques entre cellules qui ne peuvent pas fusionner « naturellement »

� Principe:- Élimination de la paroi par attaque enzymatique

(milieu isotonique)

- Mélange des 2 populations cellulaires en présence d’ions Ca++ et de polyéthylène glycol

- Régénération de la paroi

- Criblage des recombinants (marqueurs génétiques)

� TechniqueExemple de technique de fusion cellulaire

induite chez les moisissures

Souche A (a-b-c+d+) Souche B (a+b+c-d-)

protoplastes protoplastes

Cultures Cultures

MM MMMC MC

Contrôle

des mutations

Contrôle

des mutations

Viabilité des protoplastes

PEG 30% + Ca++

Fusion

(0,1-1% au lieu de 10-6)

Culture sur MMRégénération et réversion

des produits de fusion(a+b+c+d+)

Culture sur MCRégénération et réversion

des protoplastes A (a-b-c+d+), B (a+b+c-d-)

et des produits de fusion(a+b+c+d+)

Enzymes lytiques

� Quelques applications

- Streptomyces (antibiotiques)- Penicillium chrysogenum (pénicilline)

- Aspergillus niger (acide citrique)- Schizosaccharomyces pombe

- Saccharomyces lipolytica

Souches de même signe sexuel

� Quelques applications (suite)- Candida tropicalis (Deutéromycète): souches

stables avec caractères des 2 parents- Hybridations interspécifiques ou intergénériques. Lactococcus lactis subsp. lactis et Lc. lactis subsp.

cremoris. Lc lactis subsp. lactis et Lactobacillus reuteri. Candida albicans et C. tropicalis

. C. tropicalis et Pichia guillermondi

� Exemple détaillé: FCI de 2 levures pour la valorisation de sous-produits amylacés par production d’éthanol. Caractéristiques des 2 partenaires et du produit de fusion

Pousse à 37°CNe fermente pas mélibiose

Fermente dextrines

Pas de gène MALPetites colonies lisses

Diploïde (asque à 4 spores)

Ne pousse pas sur lactose

Ne pousse pas à 37°CFermente mélibiose

Ne fermente pas dextrines

Possède gène MALGrandes colonies lisses

Plyploïde (pas de spores)

Pousse sur lactose

Pousse à 37°C

Fermente mélibiose

Fermente rapidement maltose

Fermente dextrines

Aptitude légère à la sporulation

Colonies grandes et rugueuses

Pousse sur lactose

Saccharomyces diastaticus

Souche 1384 RD

Saccharomyces uvarum

Souche 21 RS

Produit de la fusion

I- La souche microbienne à usage industrielI.3- Amélioration des souches

� I.3.5- Recombinaison génétique in vitro(génie génétique)

- Objectif- Principe

- Exemple d’application

I- La souche microbienne à usage industrielI.3- Amélioration des souchesI.3.5- Recombinaison génétique in vitro

� Objectif:

Introduire un gène intéressant (humain, animal, végétal ou microbien) dans une cellule étrangère (réceptrice) pour qu’il s’exprime dedans.

Avantages des cellules réceptrices microbiennes (bactéries surtout): facilité de culture et vitesse de reproduction et de métabolisme

� Principe- Découper le gène intéressant par action mécanique ou

par action enzymatique (enzymes de restriction: extrémités cohésives)

- L’attacher à ADN familier (plasmide, ADN viral) pour former un ADN hybride (rôle des transférases terminales et de la ligase)

- Introduire l’ADN hybride dans la cellule réceptrice: cellule transformée ou génétiquement modifiée

� Exemple d’application: transformation d’Escherichia coli pour la

production de somatostatine humaine

I.4- Conservation des souches

� Objectif: prolonger la durée d’utilisation des souches, avec leurs propriétés

� Principe: maintenir les souches en vie tout en les empêchant de se multiplier

� Techniques:- Conservation sous huile de paraffine- Congélation- Lyophilisation

I- La souche microbienne à usage industrielI.4. Conservation des souchesTechniques

� Conservation sous huile de paraffine

- Rôle de l’huile. Très faible passage de l’O2 (assurer la concentration critique en O2)

. Empêcher la dessiccation du milieu

- Durée de stockage: plusieurs mois àplusieurs années à +4°C

� Congélation- Congélation lente ou rapide (azote

liquide)

- Pour éviter formation de cristaux:. Congélation rapide

. Addition d’agents protecteurs - Durée de conservation: illimitée (jusqu’à

décongélation)

� Lyophilisation- Évaporation de l’eau à basse température

sous vide- Récipient scellé pour éviter réhumidification- Inconvénient: forte mortalité (réduite par

agents protecteurs)- Durée de conservation: illimitée, même à

température ambiante (jusqu’à ouverture des récipients)

Chapitre II- Les microorganismes d’intérêt industriel

� Introduction� II.1- Les bactéries- II.1.1- Bactéries lactiques- II.1.2- Bactéries acétiques- II.1.3- Micrococcaceae- II.1.4- Propionibactéries

� II.2- Les microorganismes fongiques- II.2.1- Généralités- II.2.2- Principales utilisations industrielles- II.2.3- Les levures- II.2.4- Les moisissures

Il s’agit de microorganismes

� sans risque pour le consommateur (i.e., non

pathogènes, non toxinogènes) = GRAS (Generally Recognized As Safe):

long historique de consommation saine et sans risque avéré

� Capables de :

§ jouer un rôle technologique et/ou sanitaire bénéfique

§ Augmenter la valeur ajoutée du produit

§ Améliorer sa valeur nutritionnelle et sa salubrité

Bactéries, Levures, Moisissures8

Introduction

I.1. Les bactéries

Groupe de micro-organismes le plus large et le plus diversifié.

Procaryotes (Règne desMonera)

Structure schématique d’une bactérie

PLACE DANS LE MONDE VIVANT

Monde vivant: 5 règnes:

Animalia Plantae Protista Fungi Monera

Microorganismes

Structures cellulaires deux groupes de microorganismes

Procaryotes

Moisissures***Levures***

Algues**Protozoaires**

Monera

CyanobactériesBactéries***RicketsiesArchaebactéries

MycoplasmesChlamidiae(Virus)

*** importants pour l'alimentation** moins importants

Eucaryotes: Protistes supérieurs

Groupes de bactéries utilisées en IAA

Bactéries lactiques

Bactéries acétiques

Micrococcacea

Propionibactéries

Divers (Bacillus, Brevibacterium, etc.)

� Transformation de produits d’origine animale :

Charcuterie (e.g., saucissons fermentés),

Produits laitiers : Fromages, Yogourt, Laits fermentés,

� Transformation de produits d’origine végétale :

� Cornichons, Choucroute, Olives fermentées, produits à base de riz

� Autres applications industrielles :

� Vinaigre, Arômes (Vanille, goût de fruits), vitamines, acides aminés, etc. 11

I.1.1. Les bactéries lactiques

I.1.1.1. Définition et TaxonomieGram positif

� Non pathogènes

� Forme variable (Bacilles, cocco-bacilles, cocci, ovoides)

� Catalase négative

� Microaérophiles ou anaérobies

� Acide lactique = produit principal de la fermentation de sucres

Le groupe microbien le plus exploité à travers l’histoire de l’humanité.

Principaux genres :

Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus,

Streptococcus, Carnobacterium, Bifidobacterium,Weissella

Applications :� Fermentations de produits végétaux ou animaux� Ensilages pour la production d’aliments du bétail

� Œnologie (fermentation malo-lactique)� Pro-biotiques

La Fermentation des sucres produit :

o Soit Acide lactique presque exclusivement ( Homo-fermentation)

C6H12O6

Glucose

2CH3CH(OH)COOHAc. lactique

o Soit Acide lactique + Acide acétique + Ethanol + CO2, etc.

( Hétéro-fermentation)

Changements fréquents dans la classification des BL:

� En 1919 (début): une seule famille, 4 genres

Famille:Lactobacillaceae

Genres :Streptococcus, Leuconostoc, Lactobacillus, Pediococcus14

� Actuellement

Au moins 9 genres/3 familles :

Famille :Lactobacillaceae

1 Genre :Lactobacillus

Famille :Streptococcaceae

7 Genres :Lactococcus, Leuconostoc, Carnobacterium, Streptococcus,

Enterococcus, Weissella, Vagococcus

Famille : Actinomycetaceae

1 Genre :Bifidobacterium

I.1.1.2. Genres des bactéries lactiques d'importance industrielle

� genre Lactococcus

Nouveau taxon à partir de 1987

Auparavant inclus dans le genreStreptococcus

• Gram positif

• cocci isolées, en diplococques ou en courtes chaînes

• Métabolisme du glucose : Homo-fermentaire

2 lactates (C3)Glucose (C6)

2 isomères de lactate : L(+) et D(-)

Lactococcus: L(+) > 90%

D(-) : Indésirable.

AcidoseNon digéré par la Lactate déshydrogénase (LDH) humaine16

Détermination du type de lactate (Utilisation de lactate déshydrogénase : LDH)

LDH du muscle spécifique pour L(+): stéréospécificité

Lactate (L+) + NAD+ Pyruvate + NADH, H+

Ajout de semicarbazide

- Spectrophotométrie à 340 nm = concentration L(+)

- Dosage de l’acide lactique total (titrimétrie) = Acidité titrable

Acidité titrable – L(+) = D(-)

OMS recommandation : Moins de 100 mg de D(-) lactate / Kg poids/ jour

L(+) lactate D(-) lactatePyruvate

Espèces :

Lactococcus lactis: très utilisée dans les levains lactiques

§ Deux sous espèces :

- Lactococcus lactissubsp.lactis

- Lactococcus lactissubsp.cremoris

§ Une variété

- Lactococcus lactissubsp.lactis vardiacetylactis

Lc. garviae

Lc. plantarum

Lc. raffinolactis 18

� genre Lactobacillus

־ Le groupe de BL le plus complexe et le plus hétérogène > 90 espèces

ou sous-espèces différentes

־ Remaniements taxonomiques nombreux et fréquents

Homofermentaires: C6 ======> 2 C3

Thermobacterium(15°C -; 45°C +)

Streptobacterium( 15°C +; 45°C +)

Hétérofermentaire: C6 ====> C3 + C2 + CO2

Betabacterium(15°C +; 45°C -)19

HOMOFERMENTAIRES HETEROFERMENTAIRES

Streptobacterium

Lb. plantarum

Lb. casei

Lb. sakei

Lb. curvatus

Betabacterium

Lb. fermenti

Lb. buchneri

Lb. brevis

Lb. cellobiosis

Lb. viridescens

Lb. san fransisco*

Thermobacterium

Lb. helveticus

Lb. jugurti

Lb. bulgaricus

Lb. lactis

Lb. acidophilus

Lb. leichmanii

Lb. delbreuckii

Lb. salivarius

Lb. jansenii20

־ Rôle important dans l'industrie agro-alimentaire (ferments, producteurs

d'arômes, probiotiques...)

־ Très utilisé en ind. laitière : Ferments thermophiles (yaourt + fromages)

־ Production de L(+) ou D(-) dépend des espèces

o Lb. delbruekii(toutes les sous espèces y comprisLb. debruekiissp.

bulgaricus) : D(-)

o Lb. casei: L(+)

o Lb. sakeietLb. curvatus: Mélange racémique (DL)

־ Sur MRS agar (de Man, Rogosa et Sharpe) à 37° C : Colonies blanches,

lisses, convexes, diamètre d'environ 2 mm.21

� genre Leuconostoc

� Cocci ou Ovoïde,

� Association sous forme de cellules isolées ou en diplocoque

� Typiquement hétéro-fermentaires

� Acide lactique D(-) par fermentation du glucose

� Réduit le Triphenyl-Tetrazolium-chloride (TTC)

� Résiste à la vancomycine

� Résiste à l’azoture de Na (Sodium azide)

� Il est détruit par pasteurisation

� Produit du diacétyle à partir du citrate à pH < 5.5

� Peu acidifiant

� Utilisation dans l’industrie laitière :

o Aromatisation (diacétyle, acétoïne, éthanol)22

o Production d’exo-polysaccharides (EPS) : Dextranes, Fructosanes,

Levanes, etc.

Lu. dextranicum, Lu. mesenteroides ssp. mesenteroides

־ Importance

o Technologie

Consistance (viscosité),

Stabilisant : prévention de la synérèse (wheying-off) du

yaourt au cours de la conservation (liant de l’eau)

Qualité gustative (production de substances aromatiques :

diacétyle, acétoine, acétaldéhyde)

o Santé (consommateur)

- Probiotiques

o Bactéries du levain

- Protection contre les infections phagiques ?

Espèces principales du genre :

Lu. mesenteroidessubsp. mesenteroides*Lu. mesenteroidessubsp. cremoris*Lu. mesenteroidessubsp. dextranicum*Lu. lactis*

Lu. oenos**Lu. gelidumLu. carnosumLu. paramesenteroides

* Utilisées en Ind. laitière

** œnologie

� genre Enterococcus

�Cocci, Gram+, catalase-

� cellules isolées, ou associées en paires (diplocoques) ou courte chaîne

� Homo-fermentaires : L(+) lactate

� Résistent à la pasteurisation

� Résistent à l’azoture de sodium

� Résistent aux sels biliaires (bon potentiel probiotique)

§ Principales espèces

E. avium

E durans*

E. faecalis*

E. faecium*

*Levains ?

Présent dans de nombreux produits fermentés largementconsommés à l’échelle internationale;Non permis en tant que ferments industriels

E. malodoratus

E. casseliflavus

E. gallinarum

� genre Pediococcus

� Cocci, Gram positif

� Catalase négative ou pseudocatalase

� Association : cellules isolées, diplocoques ou tétrades

� Homo-fermentaire : lactate DL (mélange racémique)

� Peu d’importance dans l’industrie laitière

� Charcuterie (saucisson fermenté, jambon, etc.)

� Fermentations végétales (ensilage, olives fermentées, choucroute, etc.)

� Redouté en brasserie (« Beer sickness » = « maladie de la bière» =

trouble biologique de la bière) 28

Principales espèces

P. cerevisiae(Produits de charcuterie fermentés)

P. acidilactici (Produits de charcuterie fermentés)

P. damnosus(Bière, altération)

P. pentosaceus(Produits fermentés à base de viande)

P. halophilus (Fermentations végétales)

P. parvulus(Fermentations végétales)29

� genre Streptococcus

Strepto = flexible (chapelet) ; coccus = grain

§ Cocci, Gram+, Catalase-,

§ Association en chaînettes plus ou moins longues, rarement en cellules isolées

ou en diplocoques

§ Groupe hétérogène : plusieurs types de classification

- Classification sérologique de Lancefield ancienne mais encore utilisée :

20 groupes deA à H et de K à V

Lactococcus= exStreptococcusGroupe N de Lancefield

Enterococcus= exStreptococcusGroupe D de Lancefield (streptocoques

fécaux = indice de contamination fécale)

§ Classification simplifiée (sérologie + température de croissance) 30

Croissance

Groupe

Pyogènes

Viridans

Groupesérologique

A,B,etc.

Pyogènes

S. pyogenes et S. agalagtiae

Viridans

e.g., S. salivarius, S. mutans, S. salivarius subsp. thermophilus; S. mitis; S. sanguis

NB : de toutes les espèces de Streptococcus,seule Str. salivariussubsp.

thermophilusest officiellement utilisée dans la composition de levains

thermophiles (yaourt et fromage à pâte pressée)

Agents infectieux :

• pneumonie

• Angines

� genre Carnobacterium

Genre proposé en 1987

Auparavant considéré comme espèce deLactobacillus: Lb. carnosus

Souches isolées de viande de volaille

§ Validation d’un nouveau genre :Carnobacterium

C. divergens: ex Lb. divergens

C. piscicola: ex Lb. piscicolaet ex Lb. carnis

Nouvelles espèces :C. gallinarumet C. mobile

§ 1993 :C. alterfunditumet C. funditum

§ 1999 :C. inhibenspour une souche isolée du tube digestif d'un saumon del'Atlantique

§§§§ Caractères morphologiques et physiologiques

� Bacilles minces, droits ou légèrement incurvés, à Gram positif, se présentant de manière isolée ou groupés par deux ou parfois en courtes chaînes,

� non sporulés, mobiles ou immobiles, aéro-anaérobies, àcatalase négative, oxydase négative, nitrate réductase négative,

� métabolisme fermentatif (production d'acide lactique), � incapables de croître sur des milieux à l'acétate, ne cultivant ni

en présence de 8 p. cent de NaCl ni à 45°C,� cultivent à 10°C et parfois à 0°C.

§ Habitat

Viandes (bœuf, porc, mouton et volailles), Poissons, Eau douce

§ Importance

o Levains dans les fermentations carnées

o Altération de produits carnés: verdissement observé aprèsouverture desemballages de produits carnés emballés sous vide.

= Production d'eau oxygénée + air = oxydation de la myoglobine (formation de

cholémyoglobine) et des porphyrines.

Espèce impliquée :Carnobacterium viridans

� genre Bifidobacterium

§ Bacilles à gram positif, non mobiles, non sporulants, de forme

variable (polymorphe): bacilles droits, bifurqués en V ou en Y en amas

§ Anaérobies stricts mais peuvent tolérer un peu d’O2 en présence de CO2.

§ Typiquement catalase négative (parfois faiblement positive)

§ Température de croissance : 20 à 46,5°C, Opt. 36-38°C

§ Fermentent : glucose, galactose et fructose : Lactate L(+)

§ GC% = 57,2 – 64,5 (Lactobacillus< 50 %)

§ Hétérolactique sans production de CO2

o 2 glucoses 3 acétates + 2 lactates

o Fructose Phosphocétolase (enzyme caractéristique)34

+Acétyl-P(C2)

Erythrose-4-P(C4)

+2 Xylulose-5-P(C5)

2 Ribulose-5-P(C5)

2 Acétyl-P + 2-G-3-P(C2) (C3)

3 Acétates

3 ADP 3 ATPSedoheptulose-7-P + Glyceraldehyde-3-P(C7) (C3)

2 Glucoses

TranskétolaseTPP

2 Glucose-6-P

2 Fructose-6-PPhosphoketolaseTPP

Transaldolase

2 Acides lactiques

Bilan : 2 glucoses 3 acétate + 2 lactate

Observation microscopique deBifidobacterium

Microscope photonique Microscope électronique

I.1.2. Bactéries acétiques

Bactéries capables de convertir les sucres ou l’alcoolen acide acétique= production duvinaigre

� GenreAcetobacter

� Bacilles à gram négatif� Aérobies stricts: Inhibés par insuffisance en oxygène ouprésence de dioxydede soufre (SO2) 37

PRODUCTION DE VINAIGRE PAR VOIE MICROBIENNE

AC. ACETIQUEETHANOL

CH3-CH2OHETHANOL

2CH3-CHO + 2H2OACETALDEHYDE

Présenceabondanted’oxygène

CH3-CH2OH + CH3COOH

Acetobacter aceti

Espèce :Acetobacter aceti: ubiquitaire (fleurs, fruits, abeilles, drosophiles, eau, sol, etc.)

Matière première: Vin, cidre, bière, vinasse38

Mélasse : étape préalable de fermentation anaérobie: transformation de sucre en alcoolpar les levures.

I.1.3- MicrococcaceaeGenres utilisés dans la Fermentation des produits carnés :Charcuterie

Micrococcus(utile vs altération)Staphylococcus(utile vs pathogène + altération)

� genre Micrococcus

Description Taxonomique

� Gram positif; Forme sphérique (0.5-2.0µm de diamètre)

� Cellules en paires, tétrades or amas irrégulier,

Non mobile, non sporulantAérobie strictColonies pigmentées : jaune ou rougeMétabolisme respiratoireCatalase positiveHalo-tolérant ( 5% NaCl)Croissance optimale : 25-37°CGC% élevé (66-73)

��

Réservoir naturel: Peau des mammifères, sol, aliments, air

Trois espèces fréquentes :M. luteus, M. roseusetM. varians.

� Réduit les nitrates et nitrites …

� genre Staphylococcus

Staphylococcus≠ Micrococcus

Micrococcus: produit de l’acide à partir du glucose seulement et enaérobiose

Caractères généraux du genreStaphylococcus

� Cocci à Gram positif

� Immobiles

� Non sporulés

� Se présentant sous forme isolée ou groupés en paires ou en amas

� Aaéro-anaérobies facultatifs

� Catalase positive

� Fermentent le fructose, le glucose, le glycérol et la N-acétylglucosamine

avec production d’acide ;

� Ne fermentent pas l'arabinose, le cellobiose, le raffinose, le ribose et le

furanose ;

� Températures de croissance comprises entre 15 et 42°C ;

� Pousse en présenced’une concentration en NaCl de 15 % ;

� Les colonies sont circulaires, lisses, légèrement surélevées, pigmentées en

crème et parfois en orange43

Staphylococcus carnosus:

Souches isolées de saucissons secs

� Au départ identifiées commeStaphylococcus simulans.

� Les hybridations ADN-ADN montrent qu'elles constituent une

nouvelle espèce (Staph. carnosus).

� Autres sources :

o Saucissons

o Poissons fermentés

o Sauces à base de crevettes ou à base de soja)44

� Comparaison des séquences des ARNr 23S révèlent que les souches de

Staphylococcus carnosusse répartissent en 3 groupes (F, A et B).

o Groupe F présentent des caractères phénotypiques particuliers /A & B

exclues de l'espèceStaph. carnosus

Nouveau taxonStaph. condimenti.

o Groupes A et B : hétérogénéité génétique mais les homologies ADN -

ADN sont supérieures à 73 %

A et B = Même Espèce

• Caractères génomiques et caractères phénotypiques : 2 sous-espèces :

§ Staph. carnosussubsp.carnosus(Groupe A); et

§ Staph. carnosussubsp.utilis (Groupe B)45

Staph. carnosussubsp.carnosus

o phosphatase positive

o Coagulase négative

o Acidification du D-mannose et du D-sorbitol

Staphylococcus carnosussubsp.utilis

o Phosphatase négative, Sorbitol et mannose négatifs

o Aucun cas d'infection due àStaphylococcus carnosusn'a été décrit et ce

germe ne produit ni entérotoxines ni coagulase ni « clumpingfactor » ni

hémolysine.46

Rôles dans la fabrication des produits carnés :

� Accélération et stabilisation de la formation de la couleurrose/rouge

caractéristique des produits de charcuterie.

= Activité de la nitrate réductase :

NO (monoxyde d’azote) réagit avec la myoglobine pour donnerde la

nitrosomyoglobine (Couleur rouge stable).

Eviter l'oxydation grâce à leur catalase qui dégrade l'eau oxygénée élaborée par

les bactéries lactiques. Une oxydation importante conduità des anomalies dans

la couleur et le goût et diminue la durée de conservation (rancissement).

Elles sont également capables d’acidifier modérément et decontribuer au

développement de l'arôme.47

Nitrate réductase staphylococcique :

NADH,H+ NAD+

NADH,H+

Myoglobine Nitrosomyoglobine(Composé stable de couleur

NO3- NO2-

NADH,H+ NAD+

H2O H2O

Hémoglobine Methémoglobine

Nitrosamines

rose/rouge)SANS DANGER)

Amines secondaires

Anémie

Cancer ??

I.1.4- Les propionibactéries

� Bacilles à Gram positif

� Produisent l'acide propionique par fermentation du glucose et de l’acide lactique

� Non sporulés,

� Immobiles,

� Anaérobies stricts ou aéro-tolérants,

� Catalase positive.

� Se présentent de manière isolée ou groupés en paires ou en courtes chaînes ou en V ou enYou en amas évoquant des lettres de l’alphabet chinois

� Peuvent également apparaître sous des formes coccoïdes, bifides voire ramifiées.

� Croissance optimale : entre 30 et 37°C et les colonies peuvent être blanches, grises, roses,rouges, jaunes ou oranges.

� GC % élevé (67%): Actinobactéries 49

� D'après leur habitat, les espèces du genrePropionibacteriumsont divisées

en deux groupes : groupe du lait et groupe de la peau

o Groupe "Propionibactéries classiques" ou " Propionibactéries du

Habitat naturel : Fromages et autres produits laitiers; parfois ensilages,

olives fermentées, jus de fruits altérés et sol :

Propionibacterium freudenreichii, P. acidipropionici, P. cyclohexanicum, P.

jensenii, P. microaerophilum, P. thoenii

Niche écologique : Peau, bouche ou intestin

Espèces :Propionibacterium acnes(espèce typique)

P. australiense, P. avidum, P. granulosum, P. propionicum

Pathogènes : Infections chez l'homme (acné) et les animaux

o Propionibactéries de la peau ou Groupeacnes

� Classification d’après des critères génétiques

Homologie des séquences de la sous unité 16S rRNA : Trois groupes

o P. australiense: deux sous-espèces deP. freudenreichii(espèce type du

genre) etP. cyclohexanicum

o P. acidipropionici, P. granulosum, P. jensenii, P. microaerophilumetP.

thoenii

o P. acnes, deP. avidumet deP. propionicum.

I.2.1- Place dans le Monde vivantI.2.2- Caractères distinctifs par rapport aux

autres micro-organismesI.2.3- Paramètres physico-chimiques de la

croissance

I.2.4- Principales utilisations industrielles

I.2- Les micro-organismes fongiques

I.2.1- Place dans le monde vivant:

� Protistes supérieurs (cellules eucaryotes)

� Souvent rapprochés à tort des végétaux� Se distinguent de tous les autres micro-

organismes

Monde vivant

ProtistesMétaphytes Métazoaires

(Champignons) Protozoaires

Protophytes

Bactéries

Algues bleu vert

Autres

algues unicellulaires

Protistes Inférieurs Protistes Supérieurs

Classification du Monde Vivant(d’après Langeron, 1945)

Eubactéri-ales

MycobacteriaMicroorganismes

fongiques

Algobacteria Algues bleu vert

Autres Algues unicel.

MollicutesRickettsiales

Protozoobacteria

Protozoaires

Le monde microbien

SchizomycètesProtistes inférieurs

Ensemble des ProtistesEnsemble des microbes

étaphytes

Métazoaires

Champignons(Fungi, Mycètes)

Champignons macroscopiques

Champignons microscopiques (micromycètes;

microorganismes fongiques)

Moisissures Levures(Unicellulaires)(Mycéliennes)

(du latin Fungus)

(du grec Mykes)

100100

I.2.2- Caractères distinctifs par rapport aux autres micro-organismes

o Par rapport aux bactéries: les fungi sont eucaryotes (bactéries: procaryotes)

101101

Schéma montrant la structure eucaryote

d’une cellule de levure (ci-contre)

en comparaison avec la cellule bactérienne procaryote (ci haut)

102102

I.2.2- Caractères distinctifs par rapport aux autres micro-organismes (suite)

o Par rapport aux autres Protistes supérieurs:� Hétérotrophes pour le C� Nutrition azotée simple: NH4

+ ou NO3-

� Saprophytes (le plus souvent); mais aussi espèces parasites ou symbiotiques

� Structure filamenteuse ou mycélienne (sauf levures)

103103

Structure filamenteuse (mycélienne) des champignons

104104

Structure filamenteuse

des moisissures

Filaments cloisonnés(champignons supérieurs)

Filaments non cloisonnés(champignons inférieurs)

105105

Spores de reproductionchez les moisissures

Conidies (champignons supérieurs)

Sporangiospores (champignons inférieurs)

106106

- Levures: état unicellulaire dominant, formes variées, souvent ovo ïde ou globuleuse

107107

- Levures: parfois pseudomycélium

108108

Cicatrice de bourgeonnement

Bourgeonnement de la levure

Bourgeon

Métabolismes des sucres

Fermentaire : production d’alcool et de CO2

Respiratoire (Cycles de krebs) : production de CO2 et d’eau

Rarement pathogènes pour l’Homme

Deux espèces infectieuses :

Candida albicans(vaginites, prurits, infections buccales et œsophagiennes)

Cryptococcus neoformans(mammites)54

110110

I.2.3- Paramètres physico-chimiques de la croissance:

� pH

� Activité de l’eau (aw)� Température� Oxygénation

111111

� pHo Croissance dans une large gamme de

pH (souvent de 2 à 8)o Mais plutôt acidophiles ou, du moins,

acidotolérants (supportent mieux les pH acides que les bactéries)

o Application: milieux à pH de 3,5 à 4,5 pour leur isolement

112112

Valeurs cardinales du pH de croissance de quelques micro -organismes

Minimum Optimum MaximumSt. aureus

Bacillus subtilis

Cl. sporogenes

Lactobacillus sp.E. coli

Salmonella

Proteus

4,04,2

3,04,3

6,8-7,56,8-7,2

6,0-7,6

5,5-6,06,0-8,0

6,0-7,5

6,0-7,0

CandidaSaccharomyces

2,32,0

4,0-6,54,0-5,0

9,88,6

PenicilliumAspergillus

1,61,6

4,5-6,7 3,0-6,8

113113

� Activité de l’eau (aw)

o Adaptation aux basses aw (milieux sucrés ou à faible humidité)

114114

Bactéries à Gram négatif, quelques levures 0,95- ≈ 1

Majorité des cocci, lactobacilles, qq moisissures 0,91- 0,95

Majorité des levures 0,87- 0,91

Majorité des moisissures, Staphylococcus aureusMoisissures xérophilesLevures osmophiles

0,80- 0,870,67- 0,750,60- 0,65

Valeurs moyennes des aw minimales des

différents groupes microbiens

115115

Activités de l’eau minimale permettant la croissance des microorganismes à une

température proche de leur optimum

Micrococcus

Staph. aureus

Bacillus

Clostridium

Lactobacillus

Hal. halobium

0,90-0,95

0,84-0,92

0,90-0,99

0,90-0,98

0,90-0,94

E. coli

Salmonella

Pseudomonas

Saccharomyces

Penicillium

Aspergillus

0,94-0,97

0,93-0,96

0,96-0,98

0,62-0,94

0,80-0,83

0,70-0,82

116116

� Température

o mésophiles en général: températures optimales moyennes

o Certaines capables de se développer àbasse température (mésophiles psychrotrophes)

117117

Températures cardinales de croissance de quelques microorganismes fongiques

Min. Opt. Max.

Debaryomyces hansenii

Saccharomyces cerevisiae

Aspergillus flavusBotrytis cinerea

Cladosporium herbarum

Mucor mucedoPenicillium brevicompactum

Penicillium camemberti

Penicillium roquefortiGeotrichum candidum

10- 4- 66

- 2624

302225

15-2522

15-2518-2022-30

118118

� Oxygénation; en général:

o Moisissures: aérobies strictes (ou micro-aérophiles)

o Levures: aéro-anaérobies facultatives (métabolisme des glucides selon conditions d’oxygénation)

119119

1: paroi

2: membrane nucléaire

3: noyau

4: vacuole

5: réticulum endoplasmique

6: membrane cytoplasmique

7: inclusions cytoplasmiques

8: mitochondries

Structure de la cellule de levure en fonction de l’oxygénation

120120

Conclusion:

� Prolifération favorisée dans les conditions oùles bactéries ne sont pas compétitives (pH acides, aw faible, etc.)

� Activité métabolique intense due à une grande diversité de l’équipement enzymatique

121121

I.2.4- Principales utilisations industrielles

I.2.4.1- Production d’enzymesI.2.4.2- Production de produits du

métabolisme primaireI.2.4.3- Production de produits du

métabolisme secondaire

I.2.4.4- Fabrication de produits alimentairesI.2.4.5- Exemples d’applications industrielles

122122

I.2.4.1- Production d’enzymes

Espèces Produit Substrat Intérêt

L Kluyveromyces fragilis

Saccharomycopsis lipoytica

Lactase

Lipase

Carboné Dégr°lactose

Lipolyse

Aspergillus niger

Aspergillus oryzaeMucor miehei

Mucor pusillus

Endothia parasitica

Lactase

AmylasePrésure fongique

Divers Dégr°lactose

Dégr°amidonCoagulat.°lait

123123

I.2.4.2- Production de produits du métabolisme primaire

L Saccharomyces cerevisiae Kluyveromyces fragilis

Candida utilisCandida tropicalis

Kluyveromyces fragilis

Ethanol

EthanolBiomasse protéique

Glucose

LactoseMélasse

Lactoserum

Prod. Alcool

,,Alimentation

Aspergillus niger

Paecilomyces varioti Aspergillus niger

Acide citrique

Biomasse protéique,,

Divers

LSP*EFB**

Acidulant

Alimentation ,,

*LSP: Liqueur sulfitique de papeterie; **EFB: effluent de fabrique de bonbons

124124

I.2.4.3- Production de produits du m étabolisme secondaire

Penicillium chrysogenumCephalosporium acremonium

Aspergillus flavus

Aspergillus nigerFusarium sp.

Fusarium graminearum

Pénicillines Céphalosporines

Aflatoxines

StérigmatocystineZéaralénone

Trichothécènes

Carboné,,

Graines*

Graines**Graines***

Céréales

Thérapeutique,,

Cancérigène

,,Œstrogène

ATA****

* arachide, maïs, etc.; ** oléagineux, céréales; *** maïs et autres céréales; **** Aleucie Toxique Alimentaire

I.2.4.4- Production de produits alimentaires

L Saccharomyces cerevisiae

Sacch. carlsbergensis

Pain, vin, ale, saké

Bière

Selon pdt

Alimentaire

Penicillium roqueforti

Penicillium camemberti

ou P. caseicolum

Aspergillus oryzae

Fromage à pâte « persillée »

From. à croûte moisie

Caillé de fromagerie

Amidon de riz

Alimentaire

Fromage à pâte « persillée »

Fromage à croûte moisie

I.2.4.5- Exemples d’applications industrielles � pour les moisissures

§ Industrie laitière

Affinage de fromages (Penicillium camemberti, P. roqueforti, P. candidum, etc.)

Production d’enzyme pour la coagulation du lait : Chymosineremplace la« présure » animale

§ Charcuterie

Affinage (ensemencement de surface)

Les meilleurs saucissons secs sont souvent recouverts d’une « fleur » demoisissure blanche :

Croute ensemencée demoisissures blanche :Penicillium nalgiovensisP. camemberti, ouP. chrysogenum

§ Fermentation du riz et de la sauce de soja, etc. (Asie)

§ Production de colorants et aromatisants alimentaires

§ Production d’acides (Citrique, Lactique, etc.)

§ Enzymes (Cellulases, lipases, protéases, amylases, etc.)

§ Industrie pharmaceutique (antibiotiques; exp. Pénicilline)

§ Environnement

Attention! Présence d’espèces capables de produire des mycotoxines: aflatoxines, ochratoxines, zéaralénone, fumonisines, etc.

� pour les levures

§ Fermentations

� Panification

� Œnologie,Brasserie (la plus ancienne connue)

� Laitière (Kefir; Koumiss, fromages traditionnels)

� Végétale (olive, cornichon, choucroute, cassava, etc.)

§ Production de substances utiles

� Enzymes : Lipases (exp.Yerrowia lipolitica), protéases, amylases, etc.

� Vitamines (vitamines B, niacine, acide folique) acides animés, etc.

Espèces utilisées

� Saccharomyces cerevisiae(panification, brasserie)

� Saccharomyces carlsbergensis(Brasserie)

� Debaryomyces hansenii :affinage de saucisson sec/fromages

� Candida utilis :affinage de fromage

� Candida milleri(sauvage de la farine): « Sourdough » = pain acide

� Saccharomyces kefir: fermentation du kefir

• Cas deYerrowia lipolitica :

§ Industrie de bio-fermentation

- Production industrielle de lipases

- Production de méthane à partir de lipides et acides gras

- Production d’acide citrique à partir des alcanes et des huiles

végétales en aérobiose

§ Industries fromagère

- Affinage de certains

types de fromages (lipolyse)57

Chapitre III- Les microorganismes utilisés dans l’industrie laitière

III.1- GénéralitésIII.2- Les bactéries lactiques

III.3- Les propionibactériesIII.4- Les microorganismes fongiques

III.5- Les levains lactiques

Les bactéries lactiques

Les propionibactéries

Levures et moisissures

Fermentation de certains laits fermentés :

Kefir (Saccharmycess kefir)

Koumiss (lait de jument fermenté :Torula spp.Mycodermaspp.

Affinage de fromages : camembert, brie, Roquefort

- Divers (exp.Brevibacterium linens; Micrococcus luteus; M. varians,

Corynebacterium) 62

III.1- Généralités

III.2- Les Bactéries lactiques

� Essentielles dans les fermentations laitières :

Au moins 5 rôles :

- Acidification du lait (Fermentation du lactose et production d’acide)

- Coagulation du lait

- Concentration du lait : Facilitation de la synérèse et de l’égouttage du

caillé

- Aromatisation : production de substances aromatiques

- Inhibition de pathogènes et de microorganismes d’altération =

amélioration de la qualité hygiénique et prolongation de ladurée de

conservation.

• Bactéries lactiques utilisées dans les fermentations laitières:

• Espèces utilisées

• Lactococcus :

Lac. lactis subsp lactis;Lac. lactis subsp.lactis var. diacetylactis;Lac. lactis subsp. cremoris

• Leuconostoc :

• Leu. cremoris, Leu. dextranicum

• Lactobacillus :

• Lb. bulgaricus; Lb. casei; Lb. lactis; Lb. plantarum;

• Streptococcus

• Str. thermophilus69

Levains lactiques: voir III.5

III.3- Les propionibactéries

Exp. Fromages du type suisse : Emmental; Gruyère

Production d’acide propionique (acide organique le plus inhibiteur pour les

micro-orgrganismes indésirables) et d’acide acétique

Production de CO2 : Yeux du fromage (ouvertures, trous)

Utilisation dans l’industrie laitière :

Propionibactéries classiques (P. freudenreichii, P. jensenii, P. thoenii) :

Fromages à pâte pressée = production de gaz = Trous (yeux) du fromage

(exp. Gruyère, Emmental) = Rôle essentiel :

Affinage en cave « chaude »

• Fermentation du lactate ou pyruvate

Goût: Acétate + Propionate

Acétate, propionate et CO2

Saveur de noisette

Texture : CO2 Ouvertures = Trous = Yeux

• Activité lipolytique : Acides gras libres issus de la lipolyse

• Composés d’arôme: composés ramifiés dérivés du catabolisme de

l’isoleucine

• Inhibition de la microflore indésirable : acides organiques et

bactériocines = amélioration de la qualité hygiénique et préservation

• Potentiel probiotique :

production de Vitamine B12

modulation bénéfique la flore intestinale principalementen

favorisant la population indigène bifide (Bifidobacterium).76

Adaptation efficace aux stress digestifs.

Restent vivantes dans le tractus digestif humain et adhèrent aux cellules

épithéliales ainsi qu’au mucus de l’intestin.

Rôle potentiel dans la prévention du cancer du colon :

Diminuer les activités enzymatiques impliquées dans la carcinogenèse

Induction de l’apoptose (mort programmée de cellules isolées) de cellules

d’adénocarcinome colorectal

ProductionProductionProductionProduction dddd’’’’AcidesAcidesAcidesAcides grasgrasgrasgras àààà courtecourtecourtecourte chachachachaîîîînenenene agissantagissantagissantagissant

sursursursur lesleslesles mitochondriesmitochondriesmitochondriesmitochondries desdesdesdes cellulescellulescellulescellules canccanccanccancééééreuses.reuses.reuses.reuses. 77

III.3- Les microorganismes fongiques

III.3.1- Schéma général de la fabrication d’un fromage

III.3.2- Classification des fromages

III.3.3- Flore fongique des fromages

140140

Caillé

Lactosérum Caillé égoutté

Coagulation

Egouttage

Affinage

Fromage frais

Fromage affiné

II.3.1- Schéma général de la fabrication des

fromages

Addition de levain lactique(1 à 3 % V/V ou dose indiquéesur sachet de levain en poudre)

Lait caillé(action de laprésure)

pH acide :~5,0 à 5,2

Addition de présure(selon la force) :Emprésurage

~15 min

Lait acidifié mais noncoagulé : pH ~6,2

DécoupageMoulageEgouttage

Lait (pasteurisé ou cru)

Démoulage

Affinage: Facultatif et varie selon le type de fromage

Egouttage

Affinage

146146

Microbiologie industrielleIII.3.2- Classification des fromages

Types de pâte Affinage Exemples

Fraîche Sans affinage Jben, Petit-Suisse

Molle Croûte moisie

Moisissure interneCroûte lavée

Camembert, Brie,

Bleus, Roquefort (brebis) Munster, Livarot

Pressée

Ferme non cuite

Ferme cuite

Croûte moisie

Croûte lavéeCroûte lavée

Ouverture, cr. morgée

Ouverture, cr. sècheSans ouv., cr. morgée

St-Nectaire, Tomme

St-Paulin, ReblochonCantal

Comté

Emmenthal, GruyèreBeaufort

147147

III.3.3- Flore fongique des fromages- Principales moisissures des fromages- Principales levures des fromages- Flore « acidophile » de la surface des

fromages- Penicillium roqueforti- Penicillium camemberti (ou P. caseicolum)

Microorganismes

Penicillum roqueforti

P. candidum ou P.camemberti

Geotrichum candidum :Moisissure levurioforme

Rôle principal

Arômatisation (méthyle-cétonesCouleur

Apparence (feutrageblanc)Aromatisation(protéolyse, lipolyse)Responsable d'amertume

• Aromatisation:Composé soufrés

• Aspect blanc etduveteux (sous saforme mycélienne)

• Aspect crème (formelevuriforme) ouintermédiaire

Exemple deproduits

Fromage bleu àmoisissure interneRoquefort

Camembert, Brie

Fromages despécialité :Chabichou duPoitou, Pouligny StPierre, Crottin deChavignol,Rocamadour.

Principales moisissures des fromages

Principales Levures des froPrincipales Levures des froPrincipales Levures des froPrincipales Levures des fromamamamagesgesgesges

Saccharomycescerevisiae

Debaryomyceshansenii

Arômatisation(Diacétyle, acétoine,alcool)

Production de CO2

Protection dessurfaces de différents

Laits fermentés(kéfir, Lben, etc.)Fromages rouges àcroute lavée (exp.Munster)

Fromages rouges àcroute lavée

Kluyveromyces lactis

Kluyveromycesmarxianus

fromages (antimucor)

Arômatisation

Munster

Fromage despécialité de lait devache ou de chèvrecru ou pasteurisé

Candida utilis Arômatisation Fromages lactiquesTommes blanchesPâtes persillées

Chabichou du Poitou

Crottin de Chavignol

Pouligny St Pierre

Rocamadour79

Camembert

Roquefort

Penicillium roqueforti

Fromage rouge à croute lavée

Croute rose/rouge : Consortium de Microorganismes

Bactéries :Brevibacterium linens, Corynebacterium casei, Staphylococcus

saprophyticus, Micrococcus spp(pigments : couleur),

Levures : Debaryomyces hansenii, Candida catenulata,et Candida lusitaniae82

153153

� La flore « acidophile » (FA)o Levures:

� Saccharomyces fragilis� Saccharomyces kephir

� Candida sp.� Rhodotorula sp.o Moisissure « levuriforme »

� Geothrichum candidum

Geotrichum candidum

(filament se fractionnant en éléments unicellulaires)

154154

o Rôle et propriétés de la FA� Relève le pH après acidification du caillé

par les bactéries lactiques et permet au Penicillium camemberti de se développer

� Sensible au sel• Salage excessif: inhibition de la FA, pas de

développement du Penicillium• Salage insuffisant: développement excessif

de la FA (accident « peau de crapaud »)

155155

o Geothrichum candidum participe aussi à l’affinage des fromages, àl’aide de ses enzymes:

- lipases: pH opt. 5,6-7,0 (stables de pH 4,2 à 9,8)

- Protéases: pH opt. 5,5-6,0

156156

� Penicillium roqueforti

Têtes conidiennes

Conidies

157157

Enzymes de P. roqueforti participant à l’affinage des fromages

Enzymes pH optimum Stabilité pH

Protéases 3,5 sur caséine

5-5,5 sur caséine

3,5 sur caséine7-8 sur caséine

Lipases 5-6,5

158158

� Penicillium camemberti

Têtes conidiennes

Conidies

159159

Enzymes de P. camemberti participant à l’affinage des fromages

Enzymes pH optimum Stabilité pH

Protéases 3,5 sur caséine

5-5,5 sur caséine

3,5 sur caséine7-8 sur caséine

Lipases 9-9,6 4-11,5

160160

� Rôle dans l’affinage:

- Après démoulage et salage: ensemencement des spores de Penicillium camemberti (ou P. caseicolum)

- Séjour au hâloir: salle climatisée (13-15°C; 90% HR)

161161

� Phénom ènes superficiels; succession de groupes microbiens:

- Flore acidophile (voir plus haut)- Penicillium camemberti (ou P. caseicolum)- Ferments du rouge

162162

- Penicillium caseicolum: fleurissement (feutrage blanc vers 8ème jour au hâloir); fromages placés sur claies en bois et retournés pour aération

Production de protéases et de lipases qui diffusent vers le centre

- Ferments du rouge: Microcoques et Brevibacterium linens (très protéolytiques)

163163

� Phénomènes en profondeur:

Diffusion des protéases du Penicillium et des ferments du rouge (affinage centripète): fromage « affiné à cœur », puis fromage « coulant »

164164

Croûte de P. caseicolum Fraction déjà affinée

Fraction non encore affinéeLipases

Protéases

Schéma de l’affinage centripète du Camembert

165165

Affinage centripète duCamembert

Croûte moisie

Partie superficielle de la pâte, affinée

Partie centrale pas encore affinée

III.4- Les levains lactiques industriels

III.4.1- Définition et classificationIII.4.2- Métabolisme des bactéries lactiques- Métabolisme des sucres- Métabolisme des protéines- Métabolisme des lipides

III.4.3- Production industrielle des levains- Historique- Technologie de production

III.4.4- Ensemencement des levains lactiques

III.4III.4III.4III.4.1.1.1.1---- DEFINITION ET CLASSIFICATIONDEFINITION ET CLASSIFICATIONDEFINITION ET CLASSIFICATIONDEFINITION ET CLASSIFICATION

Définition : « Préparation d’une ou de plusieurs bactéries destinée à être ajoutée à

la matière première en vue d’accélérer la fermentation » : Starters

Levain lactique industriel : levain constitué de bactérieslactiques et commercialisé

sous forme liquide, concentrée-congelée ou lyophilisée (poudre)

Les levains lactiques disponibles sur le marché sont classés selon :

� la température optimale de croissanceet

� Leur compositionen souches de bactéries lactiques. 70

plusieurs souches appartenant à la même espèce ou à

différentes espèces du même genre ou de genres différents

O Selon la température de croissance:

� Levains thermophiles : Croissance optimale : 40 à 45°C.

§ Yaourt: Streptococcus salivariussubsp.thermophiluset Lactobacillus

delbrueckiisubsp. bulgaricus.

� Levainsmésophiles :

§ Croissance optimale : 25 à 32°C.

Utilisés dans plusieurs types de fromage et laits fermentés:

Camembert, Brie, kéfir, fromage frais, etc.

O Selon la composition:

• Levain à culture pure : Une seule souche

• Levain mixte de composition connue : combinaison de deux ou

LEVAINS MESOPHILES

Bactérie lactique

Lactococcus lactis

Lc. lactis var. diacetylactis

Leuconostoc cremoris

Leu. dextranicum

Enterococcus durans

Ent. fœcalis

Ent. fœcium

Rôle Principal

Acidification

Acidification +Arômatisation

Arômatisation +formation des "yeux"

Arômatisation

Acidification +

Exemple de Produit

Fromages et laits fermentés

Fromages avec des yeux etlaits fermentés

Beurre, Laits fermentés

Fromages de spécialités

Arômatisation

LEVAINS THERMOPHILES

Acidification

Acidification +Aromatisation

Acidification

Arômatisation + formationdes "yeux"

Bactérie lactique

Streptococcus salivariussubsp.thermophilus

Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus

Lb. lactis

Lb. helveticus

Lb. acidophilus

Bifidobacterium

Propionibacterium*

* Bactéries non lactiques

Exemple de produit

Yaourt, fromages à pâte cuite

idem + produits fermentés desBalkans (ex. Kéfir)

idemLb. bulgaricus

Emmental + Fromages italiens

Laits fermentés

Emmental, Gruyère, etc.

III.4.2- MÉTABOLISME DES BACTÉRIES LACTIQUES

- Métabolisme des Sucres

Métabolisme fermentaire

Fermentation≠ Respiration

־ Respiration : Oxydation biologique de la matière organiqueoù O2

atmosphérique est l’accepteur final des électrons et des protons.

־ Fermentation : Ensemble de réactions d’oxydo-réduction oùles

matières organiques jouent le rôle d’oxydants et de réducteurs

Libération d’énergie : Respiration > Fermentation ~ 20 fois

� Sucres simples

o Voies fermentaires dans le cas de l’Homo-fermentation

Hexoses =

Théorique : C6H12O6

Glucose

2 C3H6O3

Lactate

Pratique: Acide lactique (>80 %) + autres produits divers

Genre de bactéries lactiques typiquement homofermentaires :

Lactococcus, Pediococcus, Streptococcus, Enterococcus,Lactobacillus

(Thermobacterium + Streptobacterium)

GlucoseATP

ADPGlucose-6-P

Fructose-6-PATP

Fructose-1,6 D i-P

D i-OH -Acétone-P +

Glycéraldéhyde-3P

Acide lactique (L+, D- ou DL)

Phospho-enol-pyruvate

ADPATP

Acide pyruvique

NADH, H+

NADH, H+Acide 1,3-D i-P glycérique

Acide 3, Phophoglycérique

Acide 2, Phophoglycérique

Acide pyruvique

Lactate racémase

D-Lactate déshydrogénase

Lactate D(-)

L-Lactate déshydrogénase

Lactate L(+)

Lactate D(-) et Lactate L(+)50/50

o Voies fermentaires dans le cas de l’Hétéro-fermentation

־ Hexoses, Pentoses

Produits : Acide lactique + Acide acétique + CO2 + Ethanol, etc.

équimolaire

Genre de BL typiquement hétérofermentaires :

Leuconostoc, Lactobacillus(groupe:Βetabacterium)

Glucose

ATP ADP

Glucose-6-P

ATP ADP

Acétyle-P

Gluconate-6-P

NADP+ NADPH, H+NADP+

NADPH, H+CO2

Acétate

NADH, H+

AcétaldéhydeAcétaldéhyde-TPP

Ethanol

NADH, H+

Acide lactique

Diacétyle

NADH, H+

Acétoine

NADH, H+

2,3-butylène glycol

Acétyl-CoA

Glycéraldéhyde-36P-P

Ribulose-5-P

Xylulose -5-P

+Acétyl-P(C2)

Erythrose-4-P(C4)

2 Xylulose-5-P +(C5)

2 Ribulose-5-P(C5)

3Acétates

3 ADP 3ATPSedoheptulose-7-P +Glyceraldehyde-3-P(C7) (C3)

2Acétyl-P +2-G-3-P(C2) (C3)

2 lactates

2 Glucoses

TranskétolaseTPP

2 Glucose-6-P

2 Fructose-6-PPhosphoketolaseTPP

Transaldolase

Bilan : 2 glucoses 3 acétates + 2 lactates9

o Voies fermentaires dans le cas des Bifidobactéries

� Lactose

Le sucre principal du lait

Utilisation par la bactérie =

Hydrolyse du lactose

Métabolisme des monosaccharides qui le constituent

Production d’énergie (ATP)

o Voies fermentaires

Hydrolyse du lactose: Deux types d’enzymesLactase (β-glucosidase ou la phospho-β glucosidase)

Lactose

Lactose-P

Glucose + galactose

Glucose-6-phosphate + galactose

β -galactosidase

phospho-β -galactosidase

Galactose-6P

Tagatose-6-P

Glucose

Glucose-6-P

Tagatose-1-6-DiP

3-PGAL+ DHAP

VOIE de TAGATOSEPHOSPHATE

Glycolyse

LACTOSE

PEP-PTS

LACTOSE-PPHOSPHO-β -GALACTOSIDASE

- Métabolisme des Protéines

Protéines du lait :

Caséines : Protéines majeures

• κκκκ-Caséines (kappa)

• β-caséines (Beta)

• αααα-Caséines (alpha)

Protéines hydrosolubles (lactosérum)

• αααα-lactalbumine

• β-Lactoglobuline

Protéolyse :

• Coagulation

• Production de peptides et acides aminésassimilables par les bactéries lactiques

Bactéries lactiques protéolytiques

Lactococcus

Lactobacillus

Carnobacterium

Pediococcus

Protéines (macromolécules)

Protéinases

Paroi bactérienne

oligopeptides(2 à 15 a.a)

Protéines + oligopeptides

Espace périplasmique

Membrane plasmique

MilieuExtérieur

Oligopeptides > 3 aa

Peptides +Acides aminés

IntérieurCytoplasme

Peptidases

• Endo-peptidases

• Exo-peptidases Di et tri-Peptidases

Acides aminés

Protéines detransport

Acides aminés

Différentes voies métaboliques

Substances aromatiques :

Tryptophane : Indole

Alcool, acides organiques,

Acide aminés soufrés : composés soufrés volatiles

Substances toxiques : Amines biogènes

Histidine : Histamine

Tyrosine : tyramine

Défauts de flaveur (H2S)

Ammoniac (NH3)

Dégradation

Acide aminéDésamination

Transamination

AcidesAminés

Molécules soufréesCH3SH;H2S,etc.

IndolePhénols

AldéhydesNH3

Décarboxylation

Amines(Certaines sont toxiquesen grande concentrations)

oxydative

Acides α cétoniques

Réduction

Alcools

Oxydation

Acides

- Métabolisme des Lipides

Bactéries lactiques:généralement faiblement lipolytiques

Triglycérides

Acide gras libre

Glycérol

Triglycéride

Liaison ester

Métabolisme des triglycérides

Deux étapes

1- Lipolyse: action de Lipase (extracellulaire)

Estérase: coupure de la liaison ester entre le glycérol et un acide

Estérase :Libération d’un acidegras du triglycéride

2- Oxydation biologique de(s) l’acide(s) gras libéré(s):

(β-oxydation)

R-CH(O)-CH 2-COOH R-CH(OH)-CH2-COOH

R-(CH2)n COOH R-CH=CH-COOH

R-C(O)-CH3

METHYL CETONE

Rancidité : AromatisationRecherchée dans certains produits laitiers (Fromage roquefort,smen)

III.4.3- PRODUCTION INDUSTRIELLE DES LEVAINS

- Historique

Antiquité : préparation de fromages par acidification du lait par la flore

naturelle qu’il contient

Vers la fin du XIXème :

� Premier levain : transfert d'une petite quantité de crème fraîche

pour la fabrication du beurre.

� Pratique adoptée dans la fabrication de fromages.

Mélange inconnu de bactéries (levain complexe), maintenu dans

l'usine par un transfert quotidien pour de longues périodespouvant aller

jusqu'à 30 ans.

• 1800: Installation de crémeries et d’usines de fabrication du beurre et

du fromage. Emergence d’une Industrie laitière.

� Préparation des levains préparés dans les laiteries : lait ou crème

acidifiés spontanément.

• 1914: large utilisation de levains complexes d'identité inconnue et séchés

� Emballage de la poudre dans de petites bouteilles et

commercialisation en Europe et aux USA

� Problème de retard de fermentation :Echange de levains performants

de proche en proche

• 1930 : Apparition d’entreprises privées de production et de distribution

de levains lyophilisés aux industries laitières.

• Actuellement l’industrie de levain: bio-Industries ou industrie de bio-

fermentation (Biotechnologie) = industrie florissante

• La disponibilité de souches de levains lactiques caractérisés et définis

stimule l’innovation et la mise au point de nouveaux produits laitiers.

- Technologie de Production

� Milieu de culture

Milieux naturels :

• Laits sélectionnés :

• Exempt d'antibiotiques

• Vaches non nourries d'ensilage (pâturage naturel)

• Très bonne qualité microbiologique

• Lactosérum

• Milieux synthétiques :

• Riches en nutriments (sucres, extrait de viande, extrait de

levures, peptones, etc.)

• Pouvoir tampon élevé

• Inhibiteur de phages (Chélateurs de Ca++)

Les milieux synthétiques sont coûteux mais performants

� pH

pH contrôlé :

• Contrôle interne :milieu de culture à pouvoir tampon élevé

(Glycérophosphates)

• Contrôle externe : Addition automatique d'une solution basique dans le

fermenteur.

� Agitation

Modérée :Mélange efficace sans trop d'incorporation d’O2 (50 à 70tpm)

- Concentration et Conditionnement

� Centrifugation

Concentration du levain obtenu

Pb : source principale de contamination !

� Conditionnement

- Séchage (Lyophilisation)

Avantages

Facile à transporter et à conserver (petits emballages légers: sachets, bouteillesou boîtes)

Cellules viables de l'ordre de 1011 cellules/g

Inconvénients

Taux de mortalité des cellules élevé

Certaines souches supportent mal la lyophilisation

- Congélation

Avantages

Meilleure activité

Taux de mortalité moins élevé

Inconvénients :

Encombrement: difficile à transporter

Conservation à température négative obligatoire

III.4.4- Ensemencement des levains lactiques

� Ensemencement direct

Addition directe du levain dans la cuve de fermentation. Levains adaptés :

• Lyophilisés

• Concentrés congelés

Concentration élevée en cellules viables.

� Ensemencement semi direct

• Préparation de pied de cuve (culture mère):

Cuve spécifique pour la préparation de la quantité nécessaire pour

l’inoculation de la cuve de fermentation

• Inoculation de lait pasteurisé ou de lait reconstitué.

Les levains lyophilisés sont généralement utilisés pour préparer une culture

mère qui, après un certain nombre de transferts, sert à inoculer la cuve

de fermentation.

Pied decuve

Cuve de fermentation

Levainconditionné

1 à 3% (v/v)

� Levain sui generis (unique en son genre, typique)

Lait ou lactosérum liquides.

Produit dans l’industrie laitière par la standardisation de technique

traditionnelle de fabrication de fromage de spécialité

Teneur en eau élevée: coût élevé du transport.

Certains types précis de fromage: Fromages typiques

204204

IV- La levure boulangère

IV.1- Schéma général du procédé de la levurerie

IV.2- Identité de la levure boulangèreIV.3- Rôle dans la panificationIV.4- Critères de choix

IV.5- Principales caractéristiques de Saccharomyces cerevisiae

205205

INOCULUM

MILIEU DE CULTURE

PRODUIT DESIRE

Souche de levure

Préparation de l’inoculum

Mélasse brute

Corrections

Programme d’alimentation

Température

Oxygénation

Mousse

Inoculation

Récupération

III.1- Schéma général du procédé de la levurerie

206206

IV.2- Identité de la levure boulangère

Saccharomyces cerevisiaelevure boulangère

levure de bière

207207

IV.3- Rôle dans la panification

o Élasticité de la mie (production de CO2) o Arôme du pain: produits secondaires de la

fermentationo Apport nutritionnel: acides aminés

indispensables, vitamines, etc.

208208

IV.4- Critères de choix

� Activité élevée (production de CO2)� Absence d’amertume� Thermophilie (souhaitable)� Activité amylasique: � Rare chez Saccharomyces cerevisiae� Bonne chez S. diastaticus

209209

IV.4- Principales caractéristiques

o Aéro-anaérobie facultativeo Reproduction asexuée par bourgeonnement

(nécessite beaucoup d’énergie)

210210

o Production de cellules (croissance) et production d’éthanol toujours en compétition

211211

GLUCOSE C6H12O6

ACIDE PYRUVIQUE 2CH3COCOOH

Cycle de Krebs

6 CO2 + 6 H2O + 38 ATP

Croissance importante

2 CH3CH2OH + 2 CO2 + 4 ATP

Croissance faible

Effet Glucose

(Crabtree)

Effet Pasteur

212212

o Caractéristiques nutritionnelles� Glucides utilisables� Glucose, fructose et mannose (formes D): en

aérobiose et en anaérobiose� Saccharose: grâce à l’invertase, constitutive, à

activité très rapide� Amidon: amylase à activité très réduite ou

inexistante� Lactose: non utilisable

213213

o Caractéristiques nutritionnelles(suite)� azote: NH 4

+, acides aminés, urée (milieu riche en biotine)

NO3- non utilisable

� sels minéraux• P et S: besoins importants; H 3PO4, H2SO4

(acidification), (NH 4)2SO4 (azote en plus) • Alcalino- terreux: Mg (nécessaire); Ca (stimulant)• Oligo- éléments: Cu & Fe (nécessaires à la

respiration); Zn (également né cessaire)

214214

o Caractéristiques nutritionnelles (suite)� Facteurs de croissance

Nature Besoin Demande

mg/g MS

Observations

Biotine

InositolAc. Panthotén.

Thiamine

Ac. nicotin.Pyridoxine

Néces.

StimuleStimule

Stimule

Néces.Stimule

Remplaçable (D-biotine-méthyl-ester, etc.)

Apport exogène nécessaire pr act. enz. max.Remplaçable (nicotinamide)

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