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1
Elodie BOUCHOUX, DVM
sanofi R&DAnimal Research & Welfare
Veterinary
Services
Formation de « niveau I »
Mise en place d'un programme sanitaire en animalerie de recherche "rongeurs"
2
Définitions d’un programme sanitaire, objectifs et évaluation du risque
3
Statut Sanitaire : définitions
•
AXENIQUE ou ‘GERM‐FREE’
•
GNOTOXENIQUE: mono… (gnotobiotique)
•
HETEROXENIQUE (agnotobiotique)–
SPF / VAF: "specific
/ specified"
–
SOPF: SPF + opportunistes
•
HOLOXENIQUE (agnotobiotique)–
CONVENTIONNEL
DEFINITION "POSITIVE"
DEFINITION "NEGATIVE"
NON DEFINI
!
Transfert/maintenance d'une flore "pure"
(isolateur)
& Liste d'exclusion (zone protégée, CCF, IVC, isolateur…)
4
Immuno‐déficience
/ fragilisation infections opportunistes
Interférences expérimentales
Durée de vie et de reproduction
Performances d’élevage
Colonies d’animaux âgés
Statut "SOPF"
"Specific
and Opportunistic
Pathogen
Free "
5
Radio‐biologie, immunologie, cancérologie…
«
Wasting
syndrome
», septicémies, mortalités..
Abcès sous‐cutanés, conjonctivites…
‐
Au début : souris nude
ou destinées à
irradiation
‐
Actuellement : toute les lignées immuno‐ déficientes ou sensibles, fragilisées
Statut "SOPF"
"Specific
and Opportunistic
Pathogen
Free "
6
Exemple de fragilisation la souris «
cystic
fibrosis
»ou mucoviscidose : B6.129‐cftrtm1Hgu
Statut SPF : mortalité
vers 15 semainesStatut SOPF : durée de vie normaleAgent mis en cause :
Pseudomonas aeruginosa
Statut "SOPF"
"Specific
and Opportunistic
Pathogen
Free "
Pseudomonas aeruginosa
7
1. Quelle est mon activité
?
2. Quels sont mes besoins ?
3. Liste d'exclusion
Déployer une démarche
8
3. Liste d'exclusion
3. Programme de gestion sanitaire
4. Programme de contrôle sanitaire
5. Plan de crise (contamination) ?
10
5. Plan de de crise (contamination)
Si je ne fais rien
Pourquoi contrôler ?!
11
Programme de Gestion & Contrôle Sanitaires
•
Objectifs•
Type(s) de
recherche•
Modèles animaux
•
Ressources•
Limitations
•
Spécificités locales•
Résultats
précédents•
Etc.
PROGRAMME LOCAL
GUIDELINES / RECOMMANDATIONS
STANDARDS / REFERENCES
12
Recommandations FELASA pour les colonies d’élevage de souris, de rats, de hamsters, de cobayes et de lapins
13
FELASA Approved
Health
Monitoring Report
Name/address Date Unit N°
Latest
test date
Rederivation
Species
Strain(s) each
of them
tested
at
least once a year
Agents Historical
Latest
Laboratory
Method
results test
pos/tested
pos/tested
Recommandations FELASA pour le contrôle sanitaire
14
Documents de référence internationaux pour le contrôle sanitaire
•
Recommandations FELASA (Health
monitoring)•
Laboratory Animal Centre, MRC, UK
(Newsletter n°
38 ‐
1969)
•
ICLAS
guide to microbiological
monitoring and disease diagnosis
of laboratory
animals
•
ILAR Journal 19‐4, 1998 (USA)•
Publications des éleveurs et schémas de contrôle sanitaire :–
Jackson Laboratory
–
CRL (ex. : tests sérologiques pour les infections virales des rongeurs : monographies, interprétation des résultats...)
15
Documents de référence internationaux pour le contrôle sanitaire
•
JSLA : Japanese
Society of Laboratory Animals•
UFJ (draft) : Association of Laboratory Animal Facilities
of
National University
in Japan•
ANZCCART Facts
Sheet
(Australia
and New Zealand)
•
EU Directives : commerce international / importation d’animaux, d’œufs, d’embryons
•
OIE International Animal Health
Code (8e édition 1998, 9e en 1999) ‐
Code sanitaire pour les animaux terrestres
(17ème
édition, oct.2008)
–
Toutes espèces, maladies transmissibles et commerce
16
http://www.lal.org.uk
http://www.felasa.org
17
Comment aborder le Comment aborder le problproblèème ?me ?
Quels microQuels micro‐‐organismes rechercher ?organismes rechercher ?Quelles dQuelles déécisions prendre et quelles cisions prendre et quelles
actions mener ?actions mener ?
18
Pathogenic
potential…
And research interaction:
‐
Primary
pathogens
‐
Known
research interactions
‐
Occasional
pathogens
‐
Suspected
research interactions
‐
Opportunistic
pathogens ‐
Interference
under
special
conditions
‐
Other
organisms
‐
Significance
unkown
RISK ASSESSMENT :
‐
FOR EACH SPECIES / COLONY / STRAIN / STOCK / GROUP
‐
AT A PARTICULAR INSTITUTION
Evaluation du risque et prise de décision relatives à un micro‐organisme donné
Risk
Assessment
: ILAR Journal 19‐4, 1998
19
Risk
Assessment: ILAR Journal 19‐4, 1998
•
Prevalence
Low
Medium
High
NA
•
Species uniqueness
Low
Medium
High
NA
•
Research / disease effects
Low
Medium
High
NA
•
Manipulation and access
Low
Medium
High
NA
•
Replaceability
/ availability
Low
Medium
High
NA
•
Type of research
Low
Medium
High
NA
•
Movement / transportation
Low
Medium
High
NA
•
Supplies, equipment, materials
Low
Medium
High
NA
•
Transmissibility of agent
Low
Medium
High
NA
•
Zoonotic
potential
Low
Medium
High
NA
•
Concurrent use of hazardous agent Low
Medium
High
NA
•
OVERALL RISK
LOW
MEDIUM
HIGH
20
Prévalence des agents infectieux
•
Analyses réalisées sur tous les échantillons soumis au RADS sur une période de 5 ans (USA) et 3 ans (Eur.)
•
Hors colonies d’élevage CRL•
+ de 500 000 souris et 80 000 rats
•
Virus–
Souris: 0% (K virus, Sendai Virus) à
32% (MNV)
–
Rats: 0% (LCMV) à 6 % (RRV)
•
Bactéries–
Souris: 13% (P. pneumotropica) ‐
16% (Helicobacter genus)
–
Rats: 23% (Staph. aureus) – 6% (Helicobacter genus)
•
Autres–
Amibes : 3% chez les rats, 8% chez les souris
21
Interférence des agents infectieux en recherche
22
Risk
Assessment: ILAR Journal 19‐4, 1998
•
Prevalence
Low
Medium
High
NA
•
Species uniqueness
Low
Medium
High
NA
•
Research / disease effects
Low
Medium
High
NA
•
Manipulation and access
Low
Medium
High
NA
•
Replaceability
/ availability
Low
Medium
High
NA
•
Type of research
Low
Medium
High
NA
•
Movement / transportation
Low
Medium
High
NA
•
Supplies, equipment, materials
Low
Medium
High
NA
•
Transmissibility of agent
Low
Medium
High
NA
•
Zoonotic
potential
Low
Medium
High
NA
•
Concurrent use of hazardous agent Low
Medium
High
NA
•
OVERALL RISK
LOW
MEDIUM
HIGH
23
Symbiotique Commensale"Liste des agents
opportunistes" Pathogènes
Flore de barrière
Immuno‐ déficient
Immuno‐ compétent
Fragilisé, sensible
HÔTE
"Un monde de gris"
24
I R
Liste d'exclusion SOPF Aspects quantitatifs
Pathogénicité
et charge infectieuse
Résistance de l'hôte
25
Listes de SCREENING et d'EXCLUSION
Liste : " la plus longue possible ! "
… tant que les résultats restent négatifs!
Dérives possibles :
‐
recherche d’agents négatifs non pertinents
‐
utilisation de tests peu sensibles
‐
report ambigu des résultats négatifs dans les rapports de contrôle sanitaire :
* absence de résultats cumulatifs
* utilisation des notes de bas de page…
26
Ex. : positivité
pour
Staphylococcus
aureus
sur C57 BL/6 sur "lésions" d'alopécie
Streptococcus
faecalis
Lactobacillus
salivaris
Escherichia coli
Protozoaires entériques non pathogènes
27
Liste SPF (VAF ou FELASA)+
Staphylococcus
aureus
*
Proteus sp
*
Pseudomonas aeruginosa
*
Klebsiella
pneumoniae
/ oxytoca
*
Streptococci
‐haemolytic
Pneumocystis carinii
Corynebacterium
bovis
Helicobacter spp
Tous les protozoaires
Tout micro‐organisme associé
à
une lésion
Liste
d’exclusion
Statut
sanitaire
"SOPF"
"Specific and Opportunistic Pathogen Free "
*
Marqueurs de bio‐exclusion
Mise en œuvre des
contrôles sanitaires
29
Contrôles sanitaires
1.
Avant réception
2.
A réception
3.
Après quarantaine
4.
Dans les colonies d’élevage ou d’expérimentation = surveillance sanitaire
5.
En cas de signes cliniques ou de suspicion = diagnostic
30
BUTS DU CONTROLE SANITAIRE (1)
•
Vérifier la conformité
du statut sanitaire par rapport aux standards SPF, SOPF et
axénique/germ‐free
•
Les agents recherchés peuvent avoir des conséquences sur :
–
la santé
humaine (zoonoses)
–
la santé
de l'animal et/ou ses performances zootechniques
–
sur les résultats expérimentaux et leur reproductibilité
31
BUTS DU CONTROLE SANITAIRE (2)
•
Les agents recherchés peuvent contaminer les produits biologiques (biosecurité, usage
thérapeutique / diagnostique)
•
Vérifier indirectement les bonnes conditions d'élevage / de maintien et leur influence sur l'état
général des animaux
•
Tenter d'apporter une réponse lors de l'apparition d'anomalies : mortalité, signes cliniques,
modification de réactivité, …
•
Obligation éthique et légale (3 R) !
32
CONTRÔLES SANITAIRES
SUIVI SANITAIRE DIAGNOSTIC
STABULATION
AUTOPSIE ET PRELEVEMENTS
PARASITO. BACTERIO. SEROLOGIE
ANAPATHBIO.MOLEC.
33
Techniques utilisées
en suivi
sanitaire
Signes
cliniques, performances d’élevage
lésions
macroscopiques, histopathologie
parasitologie, bactériologie
sérologie
, biochimie,
biologie
moléculaire
34
Techniques utilisées
en suivi
sanitaire
Signes
cliniques, performances d’élevage
lésions
macroscopiques, histopathologie
parasitologie, bactériologie
sérologie
, biochimie,
biologie
moléculaire
Animalier !
35
Echantillonnage en contrôle sanitaire
36
Echantillonnage ?
Concepts de :
Unité
/ Entité
Microbiologique
Zone Biologique
Bio‐zone
Sentinelles
37
"Micro‐isolateur" ou "Cage à
couvercle filtrant"
Niveau primaire de bio‐exclusion
Zone protégée SPF / VAF
Niveau secondaire de bio‐exclusion
Micro‐isolateurs SOPF1 2
38
Echantillonnage
•
Echantillon pour contrôle intégré
au groupe–
Nombre
–
Technique d’analyse destructive ou non ?–
Exemple du RRV…
•
Sentinelles–
Contact direct si possible
–
Indirect :•
Efficacité
? (faux négatif)
•
Transfert de litière ?•
Flux d'air ?
•
Conditions identiques de manipulation, exposition, administration, stress…
que les animaux pour lesquels le contrôle sanitaire est effectué
?
39
"Sentinelles"•
POURQUOI ?–
ANIMAUX EN EXPERIMENTATION
–
ANIMAUX IMMUNODEPRIMES–
ANIMAUX PRECIEUX (Tg)
–
DUREE D ’EXPOSITION MINIMUM
•
COMMENT ?–
TRANSMISSION DE(S) AGENT(S) RECHERCHE(S) !
–
CONTACT DIRECT & INDIRECT (LITIERE)–
CAGES SEPAREES•
EN BAS DES PORTOIRS
•
ECHANGES DE LITIERE SALE•
MANIPULATION "A BLANC"
–
DUREE DE CONTACT–
DELAI APRES CONTACT (SEROCONVERSION)
40
Echantillonnage
–
Nombre (taille de la colonie, densité)–
Fréquence
–
Age–
Frottis / organes pour bactériologie
–
Sensibilité
de la technique : pool / enrichissement ?
–
Risque de « Faux Négatifs
»
Ex.: coccidies du lapin
41
EchantillonnageLog 0.05
Log N*= taille de l'échantillon
N* = % d’animaux non infectés
Binomial Formula (ILAR News, 1976)•
"As the prevalence of infection, or assay positives, decreases, the
sample size required to detect the infection with a high level of confidence increases"
Prevalence Sample Size*30% 8-1010% 25-30
* For 95% confidence of detecting at least one positive.
42
Echantillonnage : limites
Groupes expérimentaux, "unité" de taille généralement < 100
En général, l'agent n'a pas
une diffusion homogène
Les groupes sont souvent hétérogènes :espèces, souche, âge (nouveau‐nés, jeunes adultes, adultes en
vieillissement…), immunocompétence, "stress " expérimental, statut sanitaire / flore...
Essai jamais
100 % spécifique & 100 % sensible
43
EchantillonnageExemple : recherche de coccidies chez le lapin :
FELASA >
4 âgés de 12‐14 semaines, jeunes adultes
>
4 âgés > 6 mois (anciens reproducteurs)
INRA (F) lapins de 5 ‐
7 semaines,
idéalement : 1 semaine après sevrage fèces récoltés pendant 3 ‐
4 jours
Stress / conditions d'environnement / densité impact sur l'excrétion et la détection
Plus adapté
Choix délibéré
d'un niveau de sensibilité
?
Manque d’expérience en élevage de lapins SPF ?
Echantillon inadapté
à
l'agent / à l'espèce
44
Zone protégée / Cages ouvertes
N > 100 ‐
Formule ILAR / loi binomiale* Contamination
45
Zone protégée / Isolateur / Cages ouvertes
* Contamination
46
* Contamination
Zone protégée / Isolateur / Cages ouvertes
47
Animaux sentinelles en isolateur ?
2 cages sentinelles, chacune avec 4 nu/nu
et 4 nu/+,
SOPF
Tous les 3 mois :
‐
2 nu/nu
et 2 nu/+ envoyées au labo
‐
2 nu/nu
et 2 nu/+
conservées pour re‐test
48
Système CCF Cages à couvercle filtrant
Contamination*
Des CCF au portoir et cages IVC Individually
Ventilated
Cages
?
50
Systèmes IVC
?
51Unité microbiologique ?
52Unité microbiologique ?
53
Prise de décision en contrôles sanitaires
54
Exemple d’application en élevage :
Action en cas de résultat positif :
:–
a = arrêt immédiat de la colonie et vide sanitaire /
recyclage–
b = recyclage planifié
/ anticipé
–
c = pas d’action sauf mention au certificat sanitaire
Chaque agent est PRE‐classifié
Rapport de contrôle sanitaire et application de la liste d’exclusion
55
Rapport de contrôle sanitaire
SPF / VAF (*) PROFILE SCREENING(*) Virus Antibody Free: exclusion list including zoonotic
agents,
pathogens and known interfering agents.This list does not concern immunodeficient
animals.
•
VIRUSES (#)•
BACTERIA (#)
•
PARASITES (#)•
PATHOLOGY (#)
(#)
Recycle policy:(a): immediate terminationor(b): planned future recycle of the colony
56
Rapport de contrôle sanitaireADDITIONAL TESTING IN A SPF COLONYMONITORING OF RESIDENT FLORA
‐
Opportunistic / commensal
/ symbiotic flora of the skin, intestinal, respiratory and genital tracts
‐
Except if associated
to lesions: not
considered as "contaminants" belonging to an exclusion list but as
constituent of a normal flora in a barrier room
•
LIST OF MICRO‐ORGANISMS :
Recycle policy:(c): no action
57
Liste SPF ou SOPFListe SPF ou SOPF
"contamination" ou non ?"contamination" ou non ?
"Dérive de flore"
versus
Contamination‐‐‐
portage vs. maladie
Recyclage Invalidation étude / test
Pas d'action
58
En cas de résultat NEGATIF :
–
Vrai ou faux négatif ?
–
Non présent OU non détecté
?
Echantillon
utilisé
?
Système de "sentinelles" utilisé
?
Lieu de prélèvement ?
Temps de prélèvement, cinétique de l'infection ?
Technique appropriée, etc.
59
Intérêt de la sérologie pour la surveillance des infections virales
?
•
Echantillon unique anticorps testés pour plusieurs valences virales, avec tropisme différent
•
Anticorps sériques détectables rapidement et sont persistants
•
Les essais sérologiques sont sensibles, spécifiques, rapides et économiques
Exemple de la pathogenèse du SDAV
60
Sérologie vs. PCR dans un exemple d'infection virale
PCR
serology
Où
?
SDAV
61
Sérologie : interprétation des résultats
•
Causes de faux négatifs et de résultats positifs–
Sensibilité
et spécificité
limitées de l'essai
–
Erreurs de laboratoire•
Préparation et stockage impropres de l'échantillon.
•
Déviation des SOPs
•
Erreurs administratives / de retranscription
–
Erreur de sélection de l’échantillon
62
Sérologie : prudence avec les bactéries
•
Faible spécificité–
Bactéries : génétique et antigènes complexes
–
Antigènes cellulaires complets : réactions croisées•
Faible sensibilité–
Bactéries non‐invasives
–
Antigènes purifiés : risque de ne pas détecter toutes les souches d'une espèce
•
Utile par exemple pour :–
Mycoplasma
pulmonis
: structure antigénique
simple et
infection invasive–
C. piliforme, CAR bacillus
: contraintes de culture
63
En cas de résultat POSITIF
de sérologie à visée bactérienne ?
• Technique : spécificité, sensibilité, valeur prédictive
‐
Sérologie avec antigènes bactériens (C. piliforme) ‐
Résultats "borderline" / douteux…
réaction non spécifique début de séroconversion
Sérologie : à confirmer avec une autre technique
64
En pratique…
65
Quelques cas vécus…• Contamination MHV
–
Elevage de souris génétiquement modifiées / zone protégée
–
Programme sanitaire de l’animalerie•
Contrôles trimestriels de l’animalerie selon guidelines FELASA
•
Avant introduction d’animaux : Contrôles sanitaires de moins de 3 mois + historique annuel / Questionnaire sanitaire
•
Pas de locaux de quarantaine spécifique => confiance
–
Détection de MHV lors d’un contrôle sanitaire de routine•
Retest
=> confirmation MHV+
•
Origine : Importation récente de souris contaminées
•
« Burn‐out
»
•
Impact : euthanasie d’animaux, retard projets
66
Quelques cas vécus…
•
Contamination Pseudomonas
aeruginosa–
Géniteurs NSG SOPF maintenus en isolateurs
–
Descendants transférés dans un isolateur de stock => lots expérimentaux
–
Manipulation sous hotte – cage de transport
–
Protocoles expérimentaux nécessitant une irradiation subléthale
–
1 étude : Mort de 100% des animaux dans les 24h post‐irradiation
–
Contrôles sanitaires + Anatomie pathologique + Performances zootechniques dans l’isolateur de production
–
Contamination P. aeruginosa
–
Origine : eau de boisson / filtres
67
Quelques cas vécus…• Rats WBN/Kob
–
Rats Wistar Bonn‐Kobori–
Modèle de fibrose pancréatique
–
Elevage SLC Japan–
Contrôle sanitaire éleveur / Standards sanitaires Japon
–
Options possibles–
Démarche entreprise•
Quarantaine
•
CS arrivage (Staph. aureus, Prot. mirabilis, Helicobacter genus)
•
CS fin de quarantaine (Past. pneumotropica, P. mirabilis, Helico. genus)
–
Gestion des animaux•
Hébergement
•
Manipulation
•
Animaux sentinelles («
propres
»
et « sales »)
68
Quelques cas vécus…•
Résultats de contrôle sanitaire positifs chez l’éleveur :
Contamination au parvovirus murin (MPV) 1/2–
Les animaux positifs provenaient de 2 isolateurs chez
l’éleveur:•
Les isolateurs hébergeaient des lignées transgéniques SOPF + 1 petite
production de souris FVB/N SOPF•
Un 3eme isolateur recevant des animaux d’un des isolateurs
contaminé
était MPV‐
–
Impact pour l’utilisateur•
Contamination de lignées transgéniques élevées pour ce client dans
les 2 isolateurs + possible pour le 3eme isolateur•
Souris FVB/N livrées sur le site de l’utilisateur
–
Après enquête, animaux contaminés FVB livrés sur le site de l’utilisateur 2 mois auparavant => confirmation de la
contamination du site mais «
limitée
»
à
une zone IVC
69
Quelques cas vécus…•
Résultats de contrôle sanitaire positifs chez l’éleveur
: Contamination au parvovirus murin (MPV) 2/2
–
Mise en place d’un plan d’action chez l’éleveur et le client•
Redérivation
des lignées TG
•
Arrêt de toute livraison de souris en provenance de cette zone•
Nombreux contrôles sanitaires sérologiques et PCR chez le client
pour évaluer l’ampleur de la contamination + chez l’éleveur sur 1 isolateur resté
négatif
–
Impact•
Lignées TG : 5 mois de retard sur les projets
•
Site utilisateur : aucune évidence de circulation du virus à l’extérieur de la zone contaminée par les souris FVB/N
•
Euthanasie de nombreux animaux
–
Investigations Eleveur
70
En conclusion
Approche locale, centrée sur les besoins de la recherche
Respect mutuel des exigences de travail
Définition des unités microbiologiques
Pertinence des choix :origine des animaux, liste d’agents à
rechercher,
échantillons et techniques d’analyse
Merci de votre attention
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