mitochondrie et reproduction v4 - reseau meetochondrie

Mitochondrie et reproduction

Julie Steffann INSTITUT IMAGINE

Hopital Necker-Enfants Malades Paris

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13 polypeptides

70 polypeptides

ADN mt

ADN nucléaire

ADP

LA CHAINE RESPIRATOIRE

22 tRNA et 2 rRNA

CI

CII

CIII CIV CV

ATP

H+ H+ H+

H+

O2 H2O NADH NAD+

Cellules somatiques

homoplasmie homoplasmie hétéroplasmie

La ségrégation mitotique

ADNmt 1 ADNmt 2

mitochondrie ovocyte fécondé

Embryon préimplantatoire

Blastomères

Ovocytogenèse

ADNmt 1 ADNmt 2

mitochondrie ovocyte fécondé

blastocyste Blastomères

Théorie du « bottleneck »

ovocytes matures

cellules primordiales germinales

≈ 10 ADNmt/cell

≈200 000 ADNmt

≈ 1000 ADNmt/cell.

≈ 200 000 ADNmt (11 000 - 903 000)

Wai, Biol Reprod 2010

Nb de copies ADNmt/cell

20 000 40 000

160 000

Cree, Nat Genet 2008

Nb de copies ADNmt x 103

Nb de copies d’ADNmt au cours du développement embryonnaire chez la souris

5  

centrifugation

Removal of the mitochondria

Cattle embryos N°1 N°2 Chiaratti et al., 2010

In vitro culture (9 days)

In vitro culture (9 days)

mtDNA copy number

D 0

J 9

Induced mtDNA-depletion is spontaneously reversible during early embryogenesis

Nb de copies d’ADNmt au cours du développement embryonnaire chez l’homme

Steuerwald, 2000

Reynier, 2001

Barrit, 2002

May-Panloup, 2005

90 000 à 1 550 000 copies d’ADNmt

Lin, 2004

300 000 à 1 100 000 copies d’ADNmt

7  

QUESTION

Ovocytes et embryons porteurs de mutations de l’ADNmt: modèles spontanés de déficit énergétique

Mutation de l’ADNmt Arrêt de développement embryonnaire

?

Mutation de l’ADNmt Impact sur le métabolisme mitochondrial ?

Transfert à J5 de 1 à 3 embryons

« sains »

Biopsie embryonnaire J3

Stimulation, ponction ovarienne et ICSI

Diagnostic PCR 12 à 24 heures

Le diagnostic préimplantatoire

mutant wild-type

Gigarel et al., MGM, 2005

MT-TL1 m.3243A>G MELAS

MT-TK m.8344A>G MERRF

MT-ATP6 m.9185T>G m.8993T>G NARP or LEIGH

mtDNA

MT-ND3 m.10197G>A LEIGH

Neurogenic muscle weakness Ataxia Rétinitis Pigmentosa

Myopathy Encephalopathy Lactic Acidosis Stroke-like episodes

Myoclonic Epilepsie Ragged-Red Fibers disease

1 ♀ hétéroplasmique 3 embryons

0

1

2

3

4

5

6

7

0 10-20 20-30 30-40 40-50 50-60 60-70 70-80 80-90 100

Nb d ’embryons/ovocytes

% de mutation Steffann, 2005

7 ovocytes

Blok,1997

Données humaines ovocyte/embryon mutation m.8993T>G

0 1-10 11-20 21-30 31-40 41-50 51-60 61-70 71-80 81-90 91-100

% de mutation

Nombre d’embryons

2 ♀ hétéroplasmiques 38 embryons

X 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

0

10

20

30

40

50

60

84 oocytes Brown, 2001

Données humaines ovocyte/embryon mutation MELAS

1 ♀ hétéroplasmique 14 embryons

Monnot et al., 2011; Steffann et al., 2015

0

1

2

3

4

5

6

7

0-10 10-20 20-30 30-40 40-50 50-60 60-70 70-80 80-90 90-100

5 ovocytes Nb d ’embryons/ovocytes

% de mutation

Données humaines ovocyte/embryon mutation MERRF

Conclusions

La présence d’une mutation de l’ADNmt ne semble pas impacter le développement embryonnaire précoce

Mutation de l’ADNmt Arrêt de développement embryonnaire

NON

Impact sur le métabolisme mitochondrial

?

FIV avec ICSI MATERIEL et METHODES

Embryons totaux (J3-J5) n=41 Ovocytes n=36 12 MELAS 5 MERRF

19 TEMOINS

12 MELAS 12 MERRF 17 TEMOINS Lyse

10’ à 65°

+ 15 µl H2O

+ mix PCRfluo

Mesure du nombre de copies d’ADNmt par

qPCR

+ mix qPCR

wt mutant

Mesure du taux d’hétéroplasmie

0

200,000

400,000

600,000

800,000

1,000,000

embryos oocytes

mtDNA copies in human control oocytes and embryos

No mtDNA réplication and no mtDNA degradation during early embryogenesis

Or Degradation = Synthesis

mtDNA copy number

200,000

400,000

600,000

800,000

1,000,000

1,200,000

m.3243A>G control m.8344A>G 0

p = 0.0003

EMBRYOS : mtDNA copy number

mtDNA copy number in embryos carriers of - m.3243A>G MELAS - m.8344A>G MERRF

2 hypothesis: 1 / mutation-dependent activation of mtDNA replication? 2/ only MELAS embryos with high-mtDNA copy number survive?

mtDNA copy number

p = 0.53

Monnot et al., 2011, JMG

mtDNA copy number in m.3243A>G MELAS cells increases gradually with early human development Monnot et al., 2011, JMG

A correlation between mtDNA copy numbers and mutant loads was observed in m.3243A>G MELAS embryos (R2=0.42, p<0.0013)

Mutant load (%)

Monnot et al., 2011, JMG

Pas de sélection négative contre les embryons porteurs d’un taux élevé de mutation au cours du développement embryonnaire précoce.

CONCLUSIONS

Les taux d’hétéroplasmie ovocytaires et embryonnaires sont superposables.

Il existe une sélection négative contre les cellules germinales ayant un taux élevé de mutation MELAS (>80%).

La maturation ovocytaire est probablement affectée par des taux élevé de mutation MELAS. Il n’y pas de sélection négative contre d’autres mutations (NARP et MERRF). Effet moins délétère sur la respiration cellulaire?

Défaut fertilisation Défaut de l’ADNmt

Défaut de l’ADNmt Défaut maturation

Mutations de l’ADNmt / infertilité Vers le développement de nouveaux « traitements »?

Le transfert nucléaire

Wang et al., Cell., 2014

Fuseau meiotique Tachibana et al, Nature 2009

ZYGOTE

Entre ovocyte M2

Transfert noyau de GP

Pronucléi Craven L et al., 2010 Nature

-20 000 gènes nucléaires -37 gènes mitochondriaux

ü Interdit en France? Projet à soumettre à l’ABM ü Risque à long terme? Transcriptomique sur embryons « corrigés »

Mitochondries et amélioration des capacités ovocytaires?

Transfert d’ooplasme à partir de cellules immatures ovocytaires pour augmenter les

chances de succès de la fécondation in vitro « ovascience »

AUGMENT

7 mai 2015 : naissance du premier bébé avec le traitement AUGMENT d’ovascience

Dr Casper, Toronto, Mount Sinai Hospital

Une collaboration Necker/Béclère Laboratoire de Génétique

Moléculaire Institut IMAGINE •  J. Steffann •  S. Monnot •  N. Gigarel •  A. Munnich •  A. Rotig •  J-P. Bonnefont

Hôpital Necker-Enfants Malades

Biologie de la reproduction et

Gynécologie Obstétrique •  N. Frydman •  L. Hesters •  A. Benachi

Hôpital Antoine-Béclère

Agence de biomédecine