model sistemi u molekularnoj biologiji · model sistemi • Živi organizmi nad kojima se vrše...

MODEL SISTEMI

U MOLEKULARNOJ BIOLOGIJI

Model sistemi

• Živi organizmi nad kojima se

vrše eksperimenti

• Razne prirodne nauke razni

model sistemi

• Izbor model sistema

• Model sistem – čovek - sa

etičkog, socijalnog i moralnog

aspekta potpuno

neprihvatljivo

• Delovi tkiva i telesne tečnosti

• Ćelijske kulture

Model sistemi u molekularnoj

biologiji

• Laka eksperimentalna manipulacija

• Mogućnost brzog uzgoja velikog broja jediniki

• Danas..... Iščitan genom

• Bakteriofagi

• E. coli

• Kvasac

• C. elegans

• D. melanogaster

• M. musculus

Bakteriofagi

Bakteriofagi – virusi bakterija

• U periodu razvoja molekularne

biologije, pored bakterija, glavni

model sistem

• Obligatni intracelularni paraziti

• Otkrio ih je Frederik Tvort 1915. godine.

• TEM snimak Tom Aderson 1942. godine.

• Genom je molekul DNK ili RNK koji svoje gene eksprimiraju tek nakon infekcije ćelije domaćina

• Virusi čija je simetrija kompleksna

• Veličina od 24 nm do 200 nm.

• Glava, vrat, okovratnik, rep, bazna ploča, fibrile, repne bodlje

Svaki bakteriofag prepoznaje

specifične molekule (“receptore”)

na bakterijskom zidu i vezuju se

posredstvom svojih fibrila samo za

one bakterije koje poseduju taj

specifični molekul.

Bakteriofagi

“gajenje” u bakterijskim kulturama • Latentni period – od infekcije do umnožavanja virusne nk i

formiranja novih kapsida

• Period eksplozije u broju formiranih faga

• Formiraju plakove

Litički rast

Nekoliko hiljada kopija DNK virusa

Lizogeni rast

• Umereni fag

• Profag

Bakteriofag

• Dvolančana DNK

• 45 kb do 200 kb

• Jednolančana DNK

• Dvolančana RNK

• Jednolančana RNK

• l fag - poseduje dvolančani molekul DNK

dužine168.903 bp na kojoj se nalazi 300 gena

• M13 - filamentozni bakteriofag sa jednolančanim

molekulom DNK

Bakteriofagi – model sistem

• DNK replikacije

• Ekspresije gena

• Rekombinacija DNK

• Ko-infekcija – za analizu mutacija

• Značaj u tehnologiji rekombinovane DNK (vektori)

• Fagna terapija

Fluktuacioni test

• 1943. godine, Salvador E. Luria i

Max Delbruck

• Rad «Mutation of Bacteria from

Virus Sensitivity to Virus

Resistance»

• Prvi eksperimentalni dokaz da su

fenotipske različitosti bakterija

posledica spontanih mutacija a ne

indukovane promene nastale

dejstvom spoljašnje sredine.

• Nobelova nagrada 1969. godine.

Ispitivali prirodu rezistencije E. coli na

infekciju bakteriofagom T1

Fluktuacioni test

• Hipoteza fiziološke rezistencije - Sve ćelije E. coli

imaju vrlo malu ali podjednaku šansu da prežive infekciju

bakteriofaga T1. Tonr karakter je svrsishodna osobina

bakterija koja je indukovana samom infekcijom tj.

prisustvom bakteriofaga T1.

• Očekivana distribucija rezistentnih klonova E.coli na

osnovu hipoteze fiziološke rezistencije – RAVNOMERNA

Fluktuacioni test

• Mutaciona hipoteza - Samo mali broj E. coli već

poseduje osobinu rezistentnosti na bakteriofag T1. U

uslovima kada se takvoj kulturi prezentuje bakteriofag,

samo taj mali broj bakterija ima mogućnost

preživljavanja i formiranja bakterijskih kolonija.

• Očekivana distribucija rezistentnih klonova E.coli na

osnovu mutacione hipoteze - NERAVNOMERNA

• Za potvrdu jedne od ove dve hipoteze Luri i Delbruck su u

eksperimentu pratili vremensku korelaciju prisustva faga i

nastanka rezistentnog fenotipa bakterija E. coli.

• Posle 17 generacija, kompletan sadržaj svake bakterijske

subkulture zasadili su u Perti šolje kao i sadržaj velike kulture u

10 Petri šolja u kojima je podloga sadržavala bakteriofage.

20 subkultura

bez prisustva

bakteriofaga T1

1 kulturu

bez prisustva

bakteriofaga T1

13-26

16.7

Tonr kolonija

Rezultati

fluktuacionog testa

• Pojava mutacija u bakterijskim kulturama je spontan i slučajan događaj koji nije u vezi sa selekcionim agensom odnosno prisustvom ili odsustvom bakteriofaga.

• Da je hipoteza o fiziološkoj rezistentnosti bila prava, ne bi bilo razlika u broju Tonr kolonija u okviru subkultura i «velike» kulture već bi njihovo prisustvo bilo ravnomerno.

• Detektovan različit broj rezistentnih kolonija u analiziranim kulturama objašnjen je vremenom nastanka mutacije koja dovodi do razvoja rezistentnog karaktera bakterije.

Test otiskivanja

• Da su mutacije nezavisne od dejstva

spoljašnje sredine definitivno je

potvrđena testom otiskivanja.

• Test otiskivanja, izveo je 1952.

godine američki nobelovac Joshua

Lederberg (1925 - 2008) u saradnji

sa svojom suprugom Esther

Lederberg.

Test otiskivanja

• Eksperiment se bazirao na zasejavanju

kulture E. coli koja nije bila u kontaktu sa

bakteriofagom T1 u jednoj (glavnoj –

master) Petri šolji.

• Nakon inkubacije čitava površina master

Petri šolje bila je ispunjena spojenim

mikrokolonijama E. coli (konfluentan rast).

• Pomoću sterilnog pliša, kolonije izrasle na master šolji su

“otisnute” na Petri šolju u kojoj je nalazio veliki broj

bakteriofaga T1.

• Posle inkubacije u “drugoj” Petri šolji izraslo je svega

nekoliko kolonija E. coli koje su bile rezistentne na T1.

• Nakon analize prostornog rasporeda rezistentnih

bakterija u drugoj Petri šolji eksperiment je nastavljen

uzimanjem dva uzorka sa konfluentnog sloja bakterija u

master Petri šolji.

Test otiskivanja

• Prvi uzorak uzet je iz onog dela master Petri šolje koja se po

prostornom rasporedu (geometrijski) poklapala sa

rezistentnim kolonijama izraslim na “otisnutoj” Petri šolji.

• Drugi uzeti uzorak bio je iz regiona master Petri šolje koji na

“otisnutoj” Petri šolji nije dao rezistentne kolonije E. coli.

• Oba uzorka su otisnuta na nove Petri šolje sa velikom

količinom bakteriofaga.

Test otiskivanja

• Posle inkubacije na novim Petri šoljama analiziran je broj formiranih rezistentnih kolonija.

• U otisku prvog uzorka broj rezistentnih kolonija bio je veliki.

• U otisku drugog uzorka broj rezistentnih kolonija bio je približno jednak broju kolonija izraslih u prvom delu eksperimenta.

Test otiskivanja

• Na osnovu ovakvog rasta Lederberg-ovi su zaključili da izrasle Tonr kolonije na otiscima potiču od postojećih Tonr bakterija sa master Petri šolje koje nisu bile u kontaktu sa bakteriofagom T1.

• Na ovaj način još jednom je potvrđen rezultat Fluktuacionog testa odnosno još jednom potvrđena nezavisnost nastanka mutacija od faktora spoljašnje sredine.

Bakterije

Bakterije

• Homologa populacija ćelija – klon

• Razmnožavanje prostom deobom

• Ćelijski ciklus kratak – 20 minuta

Naslednost osobina

Mutabilnost

Bakterije – model sistem

• Escherichia coli – gram -

• Vreme generacije 20 minuta

• Prekonoćna kultura sadrži

oko 2x109 ćel/ml

• Haploidna ćelija

• Bacillus subtilis - gram +

Bakterije u laboratorijskim uslovima

• Rastu u tečnom ili čvrstom (agaroznom) medijumu u

petrijevoj šolji – laboratorija

• Golim okom vidljive kolonije

• Eksponencijalan rast do stacionarne faze

Bakterijska ćelija

• 0.2 – 60 μm

• 70S ribozomi

• citoplazmatske

vezikule i

inkluzije

• Zid

• Pili

• Flagela

Bakterijska DNK

• Deo bakterijske ćelije u kojoj se nalazi molekul DNK - nukleoid

• Jedan kružni molekul DNK

• “Bakterijski hromozom”

• Veličina prokariotskog genoma proporcionalna broju gena

• Mali nekodirajući segmenti DNK - kod E. coli 11 %

• Nema introna* • Geni organizovani u operone

• Plazmidi i transpozoni

Plazmidi

• Ekstrahromozomski molekuli DNK koji imaju sposobnost autonomne replikacije - autonomni replikoni.

• Veličina od 1 kb do 400 kb.

• Sadrže gene čiji proteinski produkti učestvuju u procesu autonomne replikacije plazmidne DNK.

• Kod mnogih plazmida registrovano je prisustvo gena čiji su proteinski produkti odgovorni za razvoj otpornosti (rezistencije) bakterijske ćelije na određene antibiotike.

Bakterijski genom 105 – 107 bp

• Procesi koji mogu imati efekta na veličinu bakterijskog genoma:

• Mutacije po tipu delecija i inverzija.

• Transpozicija (aktivnost mobilnih genetičkih elemenata u okviru genoma).

• Horizontalni transfer gena - proces prenosa genetičkog materijala - segmenta molekula DNK iz jedne bakterijske ćelije u drugu

Prenos genetičkog materijala

Horizontalni transfer gena

Donatorska ćelija

Recipijentna ćelija Fragment molekula DNK

a. inkorporiran u hromozom recipijentne ćelije

b. opstaje u ekstrahromozomskom obliku - plazmid

• Transformacija

• Transdukcija

• Konjugacija

Transformacija

• Prihvatanje slobodne DNK iz spoljašnje sredine i transport u unutrašnjost ćelije.

• Otkriće fenomena transformacije bio je prvi naučni korak u dokazivanju nosioca naslednih osobina (Frederick Griffith).

Transdukcija

• Horizontalni transfer gena posredovan bakteriofagima

• Litički i lizogeni rast bakteriofaga

Generalizovana transdukcija

• Određeni umereni bakteriofagi kod prelaska iz lizogenog u litički ciklus imaju mogućnost da “upakuju” fragment bakterijske DNK u kapsid.

• Takvi fagi nazivaju se transdukujući fagi.

• Transdukujući fagi prenose fragmente bakterijske DNK iz jedne u drugu bakterijsku ćeliju.

Restriktivna transdukcija

• Ako transdukujući fag (koji sadrži i deo DNK bakterijskog

hromozoma) nanovo pređe iz litičkog u lizogeni ciklus (u

novoj bakterijskoj ćeliji) može doći do inkorporiranja

segmenta molekula DNK jedne ćelije u molekul DNK

nove bakterijske ćelije.

Konjugacija

• Horizontalni transfer gena posredovan plazmidima

• Prenos genetičkog materijala odvija se direktnim

kontaktom dve bakterijske ćelije

Konjugacija

• F faktor

• Prvootkriveni plazmid

• Konjugativni plazmid

Sadrži gene neophodne za

odigravanje konjugacije

PROCES

a. Kontakt 2 ćelije (preko pila)

b. Replikacija plazmida

c. Transfer plazmida

preko citoplazmatskog

mostića

Mycoplasma genitalium

• Klasa: Mollicutes

• Bakterije bez ćelijskog zida

• Veličina 0.2-0.3 μm

• Izolovan iz uretralnog brisa bolesnika sa uretritisom

• Parazit respiratornog i genitalnog trakta primata

• Najmanji poznati genom

580,070 bp

• 470 protein kodirajućih gena,

3 rRNK gena, 33 tRNK gena

E. coli

• Domaćin i čovek

• 1997. godine “očitan” genom

• 4,639,221 bp

• 4.288 proteina

• Najpoznatiji plazmid – F- faktor

Bakterije

Prvi prozor molekularne biologije

• Model sistem na kome su otkriveni i/ili dokazani

fundamentalni molekularno - biološki procesi:

semikonzeravativan način replikacije DNK, osnovi

postulati regulacije ekspresije gena, i sistema za

ispravku oštećenja na molekulu DNK, priroda mutacija ...

• Tehnologija rekombinovane DNK

Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae

• Pivski kvasac

• Tipičan i najintezivnije istraživan eukariot

• Jednoćelijski eukariotski organizam veličine 5 mm

• 90 minuta dovoljno da dođe do deobe

• Laka eksperimentalna manipulacija

• Haploidna

• Dipolidna

• Mating

(haploidna u diploidnu)

• Sporulacija i mejoza

(diploidna u haploidnu)

Saccharomyces cerevisiae

Najmanji eukariotski genom

• 1996. godine “očitan” genom

• 16 hromozoma

• 13.000.000 bp (13 Mb)

• 6.275 gena (funkcionalno 5.885 gen)

• U 231 genu detektovano prisustvo introna

• 23% “sličnosti” sa genomom čoveka

Saccharomyces cerevisiae

• Obrada primarnog transkripta

• Regulacija ekspresije gena kod eukariota

• Rekombinacija molekula DNK

• Replikacija molekula DNK

• Translacija

• Prvi model sistem funkcionalne genomike

• Kvaščev veštački hromozom – YAC – eukariotski vektor

Arabidopsis thaliana

• “Vinska mušica” botanike

• 1873. godine – prva mutacija

• Nemendelov način nasleđivanja

• 2000. godine – prvi sekvencirani genom biljaka

• 5 hromozoma

• 157 miliona bp

• 25.500 gena

Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans

• Model sistem u molekularnoj biologiji i biologiji razvića od 1965. godine

• Prvi je u eksperimentalnom radu upotrebio Sydney Brenner (Nobelova nagrada 2002).

• Valjkasti crvi široko rasprostranjeni u prirodi

• 1 mm

• Bilateralna simetrija

• Hermafrodit

• 959 ćelija u adultnom hermafroditu

• 1031 ćelija u adultnom mužjaku

Caenorhabditis elegans

• Larva (L1-L4), Juvenilni oblici, Adult

• 131 ćelija hermafrodita odnosno 111 ćelija mužjaka

tokom embriogeneze umire procesom apoptozom

• Dauer – forma rezistentna na sredinske faktore

• Životni vek 3 dana

Caenorhabditis elegans

• 1983. godine, John Sulston načinio mapu ćelija C. elegans

• 1986. godnine, Joch White uradio TEM-snimke svih ćelija

Caenorhabditis elegans

jaja

22 epidermalne ćelije

formiraju vulvu

Adultni hemafrodit – prominentan organ - gonade

• Mutacije u ćelijama vulve dovodi do razvoja embriona unutar organizma

• Detektovano na stotine mutacija koje uzrokuju promene na vulvi

• Neke od tih mutacija “pogađaju” gene čiji su proteinski produkti uključeni u procese prenosa signala i u kontroli ćelijske proliferacije

• Mnogi sisarski analozi ovih gena su onkogeni ili tumor supresorni geni

Genom

Caenorhabditis elegans

- Sekvenciran 2002. godine

- 5 para autozoma i 2X

- 100,258,171 bp duga DNK

- 19.000 – 20,000 - protein-kodirajućih gena

- Prosečno pet egzona po genu

- Jedinke sa dva polna hromozoma su hermafroditi

- Nondisjunkcijom, retko, gubi se jedan X hromozom i takvi crvi postaju mužjaci sposobni da fertilišu jaja hermafrodita

Caenorhabditis elegans

• Robert Horovitz identifikovao je gen ced-3 “odgovoran” za proces apoptoze tokom embrionalnog razvoja ove nematode.

• Protein kodiran od strane ovog gena je cistein proteaza homologa sisarskom enzimu koji konvertuje interleukin1-b (ICE, kaspaza 1).

APOPTOZA

2002. godine - Nobelova nagrada

za fiziologiju ili medicinu

2006. godine - Nobelova nagrada

za fiziologiju ili medicinu

• Andrew Zachary Fire

• Craig Cameron Mello

• 1998. godine

• RNK interferencija

Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster

• Jedan og glavnih model sistema u biologiji

• Dostupne i lake za laboratorijsku manipulaciju

• Početak XX veka, Morgan (Columbia University)

• Istraživanje “naslednosti”

• Boje očiju voćnih mušica

Drosophila melanogaster

• Veličina do 3 mm

• Dve nedelje dug život

• Ženka polaže 400 jaja,

• Ebriogeneza 1 dan

• Metamorfoza 5 dana,

• Larva sa gigantskih hr.

• Pupa, Adult

• Seksualni dimorfizam

• Ženke veće od mužjaka

• Mužjaci “bez rekombinacije”

• Larve karakteriše prisustvo imaginalnih diskova, tkiva nastalih invaginacijom epidermisa embriona.

• Svaki od njih ima oko 100 ćelija u embrionu i narasta u formaciju od preko 10.000 ćelija u larvi.

• Od ovih parnih formacija razvijaju se organi adultnih vinskih mušica kao što su oči, antene, genitalije, itd..

• Eksperimentalna manipulacija imaginalnim diskovima predstavlja jedan od najpoznatijih načina istraživanja metamorfoze i embrionalnog razvoja uopšte.

Genom

Drosophila melanogaster

• Jedan (X ili Y) polni i tri autozomna obeležena kao 2,3 i 4.

• 1998. godine sekvenciran genom

• 122.653.977 bp DNK, 13. 379 gena

• Mitohondrijska DNK od 19.517 bp

Drosophila melanogaster

• 50% proteina D. melanogaster ima svoje sisarske homologe

• Model sistem za istraživanje

- neurodegenerativnih bolesti

- malignih bolesti

- dijabetesa

Genetička sličnost sa H. sapiens

Mus musculus

Mus musculus

• Najčešći model sistem u molekularnoj biologiji i medicini

• Težina oko 20g, dužina do 20 cm, životni vek do 2 godine

• Najmarkantnija razlika između polova je ta što mužjaci nemaju bradavice

Embriogeneza

13 ICM ćelija

Stem ćelije

Kultivacijom sa odgovarajućim faktorima rasta može se indukovati rast svih

adultnih tipova ćelija miša

Placenta

Genom

Mus musculus

• “Očitan” 2002. godine

• 40 hromozoma

• 2.267.775.209 bp

• do 23.000 gena

• 80% homologije sa čovekom

• Mini human

Mus musculus

Bazični principi

otkriveni kod

C. elegans

i

D. Melanogaster

Bolesti čoveka

link

Transgeni miševi

• Mikroinjekciona metoda

• Muški pronukleusi izolovani iz oplođene jajne ćelije

• Gen od interesa inkorporiran u vektor

• Po principu slučajnosti klonirani gen se raspoređuje po genomu

• Jajna ćelija prenosi se u jajovod “lažno” trudnih ženki

• Embrioni sa kopijama rekombinovane DNK - transgen

Invertni mikroskop ( 400x) i specijalna mikromanipulatorna

injekciona pipeta kojim se fragmenti molekula DNK insertuju u pronukleuse

Transgeni miševi

• Transgeni se ugrađuju i u

somatske i u polne ćelije

te se prenose i na

potomstvo

• Proizvodnja linija

transgenih miševa

• Model sistemi za

istraživanje različitih

aspekata funkcije gena i

njihovih produkata

“Knockout” miš

Miševi sa izbačenim genom • Za razliku od transgenih miševa kod kojih je ugrađen

novi genski materijal, mogu se “proizvesti” i životinje kod kojih neki gen nedostaje ili je nefunkcionalan.

• Proizvodnja takvih životinja zasniva se na postupku kojim se normalni gen in vitro “zamenjuje” mutiranim genom.

• Vrlo koristan model sistem – daju odgovore na pitanja kako nedostatak nekog gena utiče na različite funkcije u ćeliji, tkivu i organizmu.

“Knockout” miš

• Kultivacija embrionalnih stem

ćelija

• Homolognom rekombinacijom

“dobija se” mutirana / inaktivna

kopija željenog gena

• Selektovane embrionalne

matične ćelije koje sadrže

promenjeni gen prenose se u

novu blastocistu a ona se

unosi u matericu “lažno”

trudne ženke

Miševi sa izbačenim genom

• Homolognom rekombinacijom se u ciljnu sekvencu

inkorporira gen za rezistenciju na lek npr. antibiotik

neomicin.

• Fragmente sa normalnim alelima, kod kojih se nije

odigrala rekombinacija, ubija neomicin

• Marker nehomologne rekombinacije je gen za timidin

kinazu čiji proteinski produkt fosforiliše ganciklovir.

• Fragmenti koji su rezultat nehomologne rekombinacija

“poseduje” i gen za timidin kinazu.

• Fosforilisani ganciklovir je nukleotidni analog. Njegovo

inkorporiranje u DNK, tokom sinteze DNK, dovodi do

smrti ćelije.

• Ovi fragmenti se “anuliraju” rastom u medijumu sa

ganciklovirom.

“Knockout” miš

• Preživljavaju samo DNK fragmenti koji su rezultat rekombinacije sa genom za rezistentnost na neomycin i bez gena za timidin kinazu

Miševi sa izbačenim genom

Nezaobilazan eksperimentalan model u istraživanjima

• Razvoja čoveka

• Biologije ponašanje čoveka

• Patogeneze bolesti čoveka

neoR TK