molecular biology - leishmaniasis
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Polymerase chain reaction of peripheral blood as a tool for
the diagnosis of visceral leishmaniasis in children
Por: Clara Pilar Vélez Gómez
Estudiante 3er semestre
INTRODUCTION
Proper use of PCR for diagnosis of leishmaniasis has proven to be a great help in allowing the doctor a clearer focus and direct to the patients.
The PCR can establish from small samples of DNA a clear and precise diagnosis of the disease, and this is much more reliable than electron microscopy and cultivation by the small amount of sample needed to perform it.
This technique decreases the risk of complications caused by invasive sampling, in children is particularly useful due to the being a less aggressive method reduces pain and discomfort for them represents the taking of other samples.
INTRODUCTION
Visceral leishmaniasis
Family Trypanosomatidae.
PCR•A short region of a DNA molecule, is copied many times by a DNA polymerase enzyme.
•The PCR objective is the direct amplification to a gene or DNA fragment or indirect amplification from an RNA present in mixtures of various sources.
•This copy is given from a very low concentration of DNA and can reap millions of copies in a short time
PCR/leshmaniasis
PCR has been shown to be a useful method for the diagnosis of VL because Leishmania DNA may be present in only minimal quantities in biological specimens
various biological samples may be employed in the reaction, including bone marrow, skin biopsies, lymph nodes, or buffy coat
To evaluate the efficacy of Polymerase chain reaction of peripheral blood as a tool for the diagnosis of visceral
leishmaniasis in children
GENERAL OBJETIVE
PACIENTES
Estudio de análisis prospectivo
En niños con diagnóstico de la LV
Hospital Universitario de la Universidad Federal de Mato Grosso do Sul (NHU-UFMS)
Marzo 2008 a marzo 2009.
PACIENTES
Se estudiaron 45 pacientes que presentaban: características clínicas serología positiva (≥ 1 / 80) dieron negativo en los
resultados del examen parasitológico o serológicas, pero que presentan una respuesta favorable al tratamiento especializado
Microscopia directa
Identificar amastigotes de
leshmania
Preparar frotis en el porta objetos a
partir de aspirados de médula ósea
fijado con metanol
teñidas con Giemsa analizados por especialistas
Asignar el resultado
Cultivo
Muestras de aspirado
de M.O
•Se cultivaron en medio NNN (Novy-Nicolle MacNeal), en una fase líquida de medio Schneider
•suplementado con 20% de suero fetal bovino
Incubar •A 24oC
Examinar
•Semanalmente por microscopía
Identificar
•Presencia del parásito, por un total de ocho semanas
Extracción PCR-DNA
Aislar el ADN de 300 L de aspirado de médula ósea o sangre periférica
GenomicPrepTM
Reacción
La secuencia de ADN amplificado por PCR fue la región conservada de la molécula de minicírculos
Un control negativo sin ADN en la mezcla y un control positivo que contiene 20 fg de ADN de Leishmania fueron incluidos en cada experimento.
PCR se realizó en un volumen total de reacción de 25 μL bajo las siguientes condiciones:
Reacción
30 ciclos de 30 cada/1
Se descompone por desnaturalizaci;on a 94*C
Recocer a 54*C
Extención a 72*C
Amplificación - electroforesis
Marcador: escalera de ADN de 100 pb (Promega).
Las muestras se considera positiva para Leishmania cuando un fragmento de ADN por PCR de 120 pb se detectó.
Reacción
PCR-RFLP
Longitud de los fragmentos de restricción polimorfismo: se analizaron por RFLP de acuerdo con el
protocolo.
PC
R Ingerida en productos lacteos • Se digere por: 1 U
de HaeIII (Invitrogen)
• 3 Horas a 37*C frag
men
tos
de
rest
ricc
ión
Separados en un gel de poliacrilamida al 10%
Vis
ua
liza
ció
n Con plata tinción
Resultados
PCR en sangre periférica vs microscopia directa de médula ósea por aspiración:
35 niños (77,8%) presentaron resultados positivos con ambos métodos.
De los 9niños con resultados negativos de PCR de sangre periférica, 8 tuvieron resultados positivos de la microscopía directa.
PCR de sangre periférica vs PCR de médula ósea por aspiración:
39 de cada 45 pacientes (86,7%) fueron un resultado positivo con ambos métodos.
Los 4 niños con resultados negativos de PCR de aspirado de médula ósea mostró resultados positivos de PCR de sangre periférica.
Resultados
PCR de sangre periférica vs cultivo de la médula ósea por aspiración:
11 pacientes (24,4%) presentaron resultados positivos con ambos métodos
De los 33 niños con los resultados del cultivo negativo, 32 tuvieron resultados positivos de PCR de sangre periférica.
Resultados
DISCUSSION
Thiago Leite Fraga
• We have demonstrated that PCR of peripheral blood is more sensitive for VL detection than microscopy of bone marrow aspirate (95.6% vs. 80%).
• Agree
Yvone Maia Brustoloni
• In our patients, the culture test demonstrated low sensitivity in detecting promastigotes. The value of using cultures for diagnosis may have been reduced because of the frequency of sample contamination.
• Agree
Rosimar Baptista Lima
• When the sensitivity of a method is evaluated, the inclusion of patients in the study in the absence of a goldstandard diagnostic technique may have important consequences.
• Agree
Maria Elizabeth Cavalheiros
Dorval
• The findings described here suggest that it may be advantageous to employ PCR of peripheral blood in place of traditional methods used for the diagnosis ofVL, including direct microscopy and culture tests.
• Agree
Personal conclusion
The PCR taken from a peripheral blood sample was shown to be highly specific in diagnosing VL
I can see that in patients who the microscopy and culture were not specific to confirm the diagnosis, the PCR could confirm the presence or absence of the infectious agent
The PCR taken from a peripheral blood sample showed to be very useful in diagnosing VL
The PCR is the less invasive method that allows rapid confirmation of the diagnosis of VL increasing the likelihood of patient survival
GRACIAS
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