molekulinės biologijos metodai
Post on 12-Oct-2015
249 Views
Preview:
DESCRIPTION
TRANSCRIPT
-
1MOLEKULINS MOLEKULINS
BIOLOGIJOS BIOLOGIJOS
METODAIMETODAI
Makromolekuli iskyrimas, iriavimas ir
kiekio nustatymas. Blotingai. Proteomika.
Makromolekuli sudties tyrimas. DNR
sekvenavimas, Genotipavimas, DNR
klonavimas, Gen ininerija, PGR,
Mikrogardels, Metabolomika, Masi
spektrometrija, etc.
1 1 dalisdalis
Makromolekuli Makromolekuli iskyrimas, iriavimas ir iskyrimas, iriavimas ir
kiekio nustatymas.kiekio nustatymas.Blottings. Proteomika
-
2Paruoimasir
iskyrimas
Elektro-
forez
Irykinimas, aptikimas ir
kiekio nustatymas
Rekombinacija Kita
DNR armin liz
AgarozsAgarozsgeliogelio(retai (retai ----PAGE)PAGE)
PGRPGR+
Southern Southern analizanaliz
Restrikcijos fermentai,
Plazmids
SekvenavimasSekvenavimas((sekoskaitasekoskaita))
RNR armin liz
AgarozsAgarozsgeliogelio(retai (retai ----PAGE)PAGE)
NorthernNorthernanalizanaliz,
AtvAtv..trtr..--PGRPGR
Nereikia skaldyti Rnazmis RNR pakankamai
maos .Baltymai ChromatoChromato--
grafijagrafijaNDSNDS--PAGEPAGE
WesternWesternanalizanaliz,
ImunopreciImunopreci--pitacijapitacija
.NeatliekamaNeatliekama .
Tiriama mediaga
Sekvenavimas(sekoskaita)
Aminor. sekos nustatymas
+ MASI SPEKTROMETRIJA+ MASI SPEKTROMETRIJA
Biologini makromolekuli iskyrimo metodai
I. CHROMATOGRAFIJAI. CHROMATOGRAFIJA
II. ELEKTROFOREZ (+GELIO ANALIZ)II. ELEKTROFOREZ (+GELIO ANALIZ)
1. Baltym elektroforez1. Baltym elektroforez
3. Nukleorgi elektroforez3. Nukleorgi elektroforez
2.2. WesternWestern geli analizgeli analiz
4. 4. Southern Southern ir ir NorthernNorthern geli analizsgeli analizs
MGINIO MGINIO IIGAVIMASGAVIMAS
I.BALTYM ISKYRIMAS
-
3Chromatografijahttp://en.wikipedia.org/wiki/Ion_exchange_chromatography
http://en.wikipedia.org/wiki/HPLC
http://en.wikipedia.org/wiki/Size_exclusion_chromatography
http://en.wikipedia.org/wiki/Affinity_chromatography
Pagrindinis baltym iskyrimo metodasPagrindinis baltym iskyrimo metodas..Ir mokslas, ir menas.Ir mokslas, ir menas.Iskiriant baltymus iuo metodu, j denatruoti daniausiai neprIskiriant baltymus iuo metodu, j denatruoti daniausiai neprireikia.ireikia.
Pagr. chromatografijos rys (vamzdelins chromatografijos rys):1. Jon main2. Gelfiltracijos3. Afinin4. Hidrofobins sveikos
Procedra/principasProcedra/principasTirpalas, kuriame yra norim tirti baltym (anglangl. . targettarget proteinsproteins), leidiamas pro vamzdelvamzdel, kuriame yra speciali matrica, sukurta baltymams sugauti arba j judjimui sultinti dl skirting baltym savybi (dydio, el.krvio, sudties).
1 Jon main chromatografija (baltym atranka pagal el. krv)
Baltymo molekuls leidiamos per prieingu el. krviu pakraut vamzdel
(kation/anion main vamzdel), kuris turi sulfonuot (e.g. SO3H, COOH, PO4) ar amonio (e.g. NH4 jei norima sudaryti teigiam krv) liekan.
Pagrindiniai jon main chromatografijos etapai:
1. Vamzdelio paruoimas: reikiamo pH buferis. Tam reikia inoti norimo
iskirti baltymo savybes (krv, izoelektrin tak).
2. Baltym (arba peptid, aminor.) tirpalo supylimas. Ne visos molekuls
ilieka vamzdelyje.
3. Isdymas: tirpalo drusk koncentracijos didinimas prie vamzdelio sieneli
prilipusi baltym iplovimui. Druskingas tirpalas, leidiamas vamzdeliu,
lemia baltym pakeitim druskomis, kadangi vamzdelio sienels labiau
linkusios jungtis su druskomis nei su baltymais. Geriausia yra laipsnikai
didinti drusk koncentracij, kad skirtingo krvio (taigi ir skirtingus) reikiamus
baltymus igauti atskirai. Galiausiai drusk koncentracija padidinama staigiai
ir smarkiai, iki 2-3 mol/L. Taip iplaunami visi, jei dar buvo lik, baltymai.
4. Drusk paalinimas (dializ).
Temperatra neturi didels takos jon main chromatografijos etap eigai,
taiau geriau yra dirbti su nedidele temperatra, kad baltymai bt stabilesni.
2 Gelfiltracijos chromatografija (baltym atranka pagal dyd)
1.1. Vamzdelis pripildomas Vamzdelis pripildomas labai smulkias poras labai smulkias poras turini ma turini ma rutuliukrutuliuk..Susidaro renginys, kurio Susidaro renginys, kurio veikimas panaus veikimas panaus kotuvo, kotuvo, taiau...prieingas.taiau...prieingas.
-
4Supylus i Supylus i
viraus viraus
vamzdel su vamzdel su
rutuliukais rutuliukais
skirting baltym skirting baltym
tirpal, maos tirpal, maos
molekuls molekuls
patenka patenka
rutuliuk poras, rutuliuk poras,
o didels netelpa o didels netelpa
ir iplaunamos ir iplaunamos
pro tarpus tarp pro tarpus tarp
rutuliuk rutuliuk
greiiau.greiiau.
3 Afinin chromatografija
Pats efektyviausias baltym atskyrimo metodas (vienu
ingsniu miinio grynumas padidinamas iki 1000 kart),
pagrstas dideliu biologinio tiriamo baltymo specifikumu, pvz.:
fermento substratui, antikno antigenui, receptoriaus ligandui.
Metodas remiasi tirpale esani baltym gebjimu jungtis prie
celiuliozj ar poliakrilamide montuoto ligando maos
specifins biomolekuls.
Taigi tik tiriamas baltymas isilaiko vamzdelyje.
Paskui jo molekuls ikraptomos praplaunant vamzdel tirpalu,
kuriame yra didel ligandoligando koncentracija.
Vide Vide
4 Hidrofobins sveikos chromatografija(baltym atranka pagal hidrofobines j savybes)
Hidrofobins baltym vietos jungiasi su tam tikromis
vamzdelio ar jo turinio vietomis.
Tirpale esanti didel amonio sulfato [(NH4)2SO4] koncentracija
stabilizuoja baltymus, o taip pat padidina j hidrofobins
sveikos su vamzdelio agarozs matrikso fenilo (C6H5)
grupmis tikimyb.
Toks jungimasis vyksta tik esant didelei drusk koncentracijai,
tad skirting baltym jungimasis kontroliuojamas keiiant pro
vamzdel pilamo tirpalo drusk koncentracij, arba pro
vamzdel leidiam tirpal praskiediant.
-
5Kt. chromatografijos rys (smulkesnms nei baltymai molekulms tirti):
adsorbcijos (stationary phase nonspecific absorbent, such as silica gel, porous polymers, or charcoal)duj (sample, dissolved in a solvent, is vaporized and carried by the innert gas through a column packed with sorbent)didelio skysio slgio (kartu su adsorbcijos, gelfiltracijos, jon main ar kt.)popieriausplono sluoksniosluoksnin (skystis skystis)
Kokybins (nenustato kiekio).Naudoja kapiliar princip
Dujskysio (maoms molekulms, daugiausia chemijoje, nes didels degraduoja auktoje T, kurios reikia iam metodui)
1. Baltym elektroforez ir gelio 1. Baltym elektroforez ir gelio ((WesternWestern) analiz) analiz
II. Elektroforez ir geli analiz
NNDSDS--PAGEPAGENDS-PAGE (SDS-PAGE) tinkama maesnms nei DNR molekuls sijoti.
NDS-PAGE reikia NNatrio DDodecyl (lauril) SSulfato-PPoliAAkrilamido GGelio EElelekktrotroforezforez.
NDS yra ploviklis (jo yra ampne, muile, dant pastoje, ...). Jis reikalingas baltymams
denatruoti ir suteikti vienod krv prie leidim per gel. NDS turi hidrofobin
uodeg, kuria ir jungiasi prie baltymo: kuo daugiau baltyme a.r., tuo daugiau NDS
molekuli prilips prie jo. Kadangi kiekviena NDS molekul turi dvigub neigiam krv,
bet koks baltymas tampa labai neigiamas.
PAGE atskiria baltymo molekules pagal dydpagal dyd. PAG yra panaus daugiasluoksn
tinkl, kuriame ir stringa link anodoanodo migruojanios molekuls.
Po kurio laiko pasiskirsiusios molekuls upilamos 25% acto rgties vandeninio
tirpalu: taip baltymai fiksuojami gelyje ir ilaikomi denatruoti. Po to jie perkeliami,
daomi, rykinami, tiriama j aminorgi seka, ir pan.
NDS-PAGE naudojama:
Baltymo dydiui nustatytiBaltymui identifikuotiMginio grynumui (purity) vertintiDisulfidiniams ryiams aptiktiBaltym kiekiui vertintiWestern blotting (Western analizs) paruoimui
-
6Pieno svarbaPieno svarba
Kadangi antiknai taip pat yra baltymai, jie irgi link lipti prie popieriaus.... Tad prie upilant pirmo antikno, reikia j panardinti Carnationlies pien.
Western blotting (Western analiz)Western analiz iskiria vien norim baltym i baltym miinio
naudojant specifin antigen. Metodas leidia nustatyti, kiek tiriamo
baltymo yra tam tikru momentu, taiau neleidia sprsti apie to baltymo
sintezs greit, ir jis netinka, kai baltymas labai greitai suyra (abiem
atvejais reikt atlikti imunoprecipitacijimunoprecipitacij).).
1. Baltym iskyrimas pagal dyd 1. Baltym iskyrimas pagal dyd NDSNDSPAGE.PAGE.
2. Ant PAG udjus 2. Ant PAG udjus nitroceliuliozsnitroceliuliozs membran, baltymai ant jos membran, baltymai ant jos perkeliami naudojant elektroforez. Nitroceliuliozs membranos perkeliami naudojant elektroforez. Nitroceliuliozs membranos pusje turi bti teigiamas krvis, o gelyje yra neigiamas, tad pusje turi bti teigiamas krvis, o gelyje yra neigiamas, tad neigiamai krauti baltymai migruoja ant membranos.neigiamai krauti baltymai migruoja ant membranos.pH turi bti maas, tarp nitroceliuliozs ir gelio neturi susidaryti oro burbuliuk.
3. Upilti pirminio antikno ant membranos (susidaro baltymo3. Upilti pirminio antikno ant membranos (susidaro baltymoantikno kompleksas).antikno kompleksas).
4. Upilti antrinio (pirminiam) antikno. is antiknas turi bt4. Upilti antrinio (pirminiam) antikno. is antiknas turi bti i prisijungs ferment, kuris padeda irykinti vis kompleks.prisijungs ferment, kuris padeda irykinti vis kompleks.
5. Tam, kad pamatytume, kiek ferment yra ant membranos, ant 5. Tam, kad pamatytume, kiek ferment yra ant membranos, ant jos dar reikia upilti tam fermentui veikti btino miinio su jojos dar reikia upilti tam fermentui veikti btino miinio su jospecifiniu substratu.specifiniu substratu.
6. Rentgenografikai (udedant speciali plvel) irykinama 6. Rentgenografikai (udedant speciali plvel) irykinama reakcija. Ji vyksta apie valand, matoma kaip viesa.reakcija. Ji vyksta apie valand, matoma kaip viesa.
7. Atliekama nuotraukos densitometrija.7. Atliekama nuotraukos densitometrija.
Antrinis antiknas gali bti ymimas ne fermentu, bet vytinia mediaga.
Kartais, kai reikia didelio jautrumo, pvz., tiriant labai maas baltym koncentracijas, naudojamas tretinis antiknas, turintis ferment, atskeliant Pi nuo H3PO4 arminje terpje.
-
7
-
8AKF I/D PGR
Magistrant molekulins biologijos laboratoriniai darbaiMagistrant molekulins biologijos laboratoriniai darbai
I dalis I dalis Organ ir audini preparavimas, isaugojimas ir paruoimas tyriOrgan ir audini preparavimas, isaugojimas ir paruoimas tyrimui (2 val.) mui (2 val.)
Eutanazija natrio pentobarbitaliu, raumen disekcija, stimuliavimas spec. vonelje registruojant jg, galingum ir pan., ualdymas skystame azote.
II dalis II dalis Baltym ekstrakcija ir igryninimas, baltym tirpalo paruoimasBaltym ekstrakcija ir igryninimas, baltym tirpalo paruoimas (4 val.)(4 val.)
Ultrahomogenizavimas, ekstrakcija tirpalais, centrifugavimas, baltym kiekio matavimas spektrofotometru, denatravimas NDS
III dalis III dalis Konkrei baltym kiekio matavimasKonkrei baltym kiekio matavimas Western blot Western blot analize (2 x 4 val.)analize (2 x 4 val.)
a} Geli pagaminimas, elektroforezs aparato ir elektroforezs tirpalo paruoimas, elektroforezs atlikimas, baltym pernaa ant membranos, membranos blokavimas pieno tirpalo milteliais, membranos merkimas tirpal su pirminiu antiknu bent pernakt.
b} Membranos merkimas tirpal su antriniu antiknu su fermentu, membrana pervieiama Rentgeno spinduliais, irykinama juosta, aptariami gauti skirting baltym kiekio (koncentracijos) tyrimo rezultatai.
2. Nukleorgi (DNR ir RNR) 2. Nukleorgi (DNR ir RNR) iskyrimas iriskyrimas ir elektroforezelektroforez
II. Elektroforez ir geli analiz
-
9Distiliuotas vanduo, vairs buferiniai tirpalai, NaOHNaOH
vairus maiymas, centrifugavimas
Fermentai (lizocimas,...)
Temperatra (kartis, altis (+liquid nitrogen))
Detergentai, denatratoriai (NDSNDS, etanolis, ...)
Nukleorgi (DNR ir RNR) iskyrimasNukleorgi (DNR ir RNR) iskyrimas
Labai vairiai atliekama Labai vairiai atliekama
procedra: priklauso nuo procedra: priklauso nuo
organizmo, jo audinio, organizmo, jo audinio,
reikiamo NR kiekio, ,
norimo iskyrimo greiio, norimo iskyrimo greiio,
laboratorijos, tyrjolaboratorijos, tyrjo
Automatizuoti DNR ekstrakcijos metodai
NR gryninimo automatin sistema QiuckGene-81.
-
10
NR gryninimo su QiuckGene-810 schema.
NR gryninimo, amplifikacijos ir nukleotid sekos analizs automatin sistema COBAS COBAS AmpliPrepAmpliPrep
Southern ir Northern analiz
II. Elektroforez ir geli analiz
-
11
io dao molekul siterpia tarp dvigrands DNR bazi, DNR spiral isiveja dl prisijungusio dao sukeliamos tampos. iedin DNR, kuri negali taip smarkiai deformuotis, prijungia maiauetidium-bromido ir nusidao ne taip rykiai.
Etidium-bromidas gali lengvai patekti mogaus lsteles, ir kadangi mogaus DNR yra linijin, ji smarkiai isivynioja jungdamasi su iuo dau. Todl su ia mediaga reikia dirbti labai atsargiai.
Agarozs gelio elektroforez
DNR molekul sukarpius RE fragmentus, jie atskiriami pagal dyd agarozs gelio
elektroforeze. RNR skaidyti nereikia.
AgarozsAgarozs gelis yra polisacharid gelis yra polisacharid matriksasmatriksas, sugaunantis juo dl elektrinio lauko
veikimo link anodo migruojanias molekules (poli- ar oligo-nukleotidus),
DNR fosfato molekuls turi stipr neigiam krv, tad migruoja link anodo. Paskui DNR
fragmentai irykinami, pvz, Etidium-bromidu ir paskui sekania xx--RayRay...
Edward M. Southern,Edinburgh Universitetas,1970-1980 m.
Southern analiz skirta nustatyti tam tikr DNR sek miinyje, pvz., surasti tam tikr gen (pvz., sukeliant lig, klonuot) genome.Optimaliomis slygomis galima aptikti ir tok maa kiek kaip 0,1 pg iekomos DNR.
Southern analiz (Southern blotting)
ATPATP ymjimasymjimas 3232PPPaveik us dsDNR, kur i norime p adaryt i yminija, n edideliu kiek iu DNazs, ike rpam i dvigra nds DN R fragm enta i.
dedama 32P, dATP ir kit dNTP, taip pat DN R po lim erazs I, tu rinios 5 3 p olimerazinio ir 5 3 egzonuk leazin io aktyv umo.
segus
Nick translation occurs a nd as the nick is tra nslate d down the DN A stra nd, th e po lymer ase activity co ntinues to nick wh ile th e exo nucle ase activity cont inues to fil l in t he nick. As this ha ppe ns, 32P becomes inco rpo rated into, a nd thus labe ls, the DN A. Heat th e DNA t o mak e it sing le stra nde d, the n imm ediately place it on ice to keep the two stra nds from re annealing to each ot her. (If the DN A is o n ice, th e DNA p asses through the anne aling tem per atur e too quickly fo r the DN A to rehy bridize int o do uble-stra nde d DNA.)
1. DNR sukarpoma specialiomis RE. 2. DNR fragmentai leidiami per agarozs gel.3. a) DNR denatruojama (bdama vis dar ant gelioant gelio), pvz., 0,5 mol/L NaOH, kuris
suskaido dsDNR iki ssDNR: tik ssDNR gali bti perneama ant membranos.b) Neprivalomas purino alinimo etapas. Atliekamas, jei DNR fragmentai yra didesni kaip 15 kb(p). 0,2 mol/L HCl per 15 min paalina purinus (A ir G). Taiau HCl reikia naudoti atsargiai, nes per mai fragmentai taip pat neperneami.Po io etapo neumirti normalizuoti tirpalo pH.
4. ssDNR pernaa ant nitroceliuliozs ar nailonins (dar smarkiau rianios ssDNR) membranos. Pernaa utikrinama kapiliar (kempins) poveikiu, buferiui keliaujant per gel ant membranos, kuri suria ssDNR. Procesas trunka kelias valandas. Kartais vietoj kapiliarinio poveikio pritaikomas greitesnis (procedra trunka apie 1 val.) vakuuminis. Po ssDNR pernaos ant membranos ji paveikiama UV, kad ssDNR kovalentikai susijungt su membrana. Taip pat galima nitroceliulioz kaitinti 80C temperatroje kelias valandas, taiau reikia bti atsargiems ji labai degi (kitaip dar vadinama piropiroksilinu).
5. Membranos paveikimas ymta ssDNR hibridizacija. ymta ssDNR komplementariai jungiasi su tiriama ssDNR. ymima daniausiai 32P paymtu ATP, biotinu/streptavidinu, arba bioluminescencine yme. Prie hibridizacij reikia atlikti priehibridizacij dti nespecifins ssDNR (daniausiai tam naudojama lai spermatozoid DNR), kad bt ublokuojamos nespecifins membranos vietos ir ymta ssDNR neprilipt bet kurioj membranos vietoj. Hibridizuojant naudojamas tas pats buferis, taiau j dar pridedama ymtos ssDNR.
6. ymtos ssDNR irykinimas. Jei buvo naudota 32P ym (daniausiai), irykinama atliekant rentgenografij; jei ymta buvo biotinu/streptavidinu, atpainimui taikoma kolorimetrija; o bioluminescencija matoma kaip vytjimas.
Southern analiz
-
12
SouthernSouthern blottingublottingu
nustatomas tam tikr nukleotid sek (gen) buvimas ir kiekis.
-
13
Northern analiz (Northern blotting)
E. Southern sukurt DNR sekos radimo metod pavadinus jo vardu.
Tie, kurie tyr RNR sek, ironizuodami pavadino j Northern analize
(kartais gal iek tiek sunkiai suprantamo mokslinink jumoras...).
Metodas taip pat vadinamas Northern hibridizacija arba RNR
hibridizacija.Metodo esm ta pati kaip Southern analizs, tik tiriama ne DNR, o RNR.
Agarozs gelis RNR itiesina (padaro linijin).
RNR (transkripto) buvimas ir jos kiekis parodo, kaip intensyviai tuo tuo
metu ir toje vietojemetu ir toje vietoje nuraoma tiriama genetin informacija.
Nukleorgi (ypa DNR) tyrimo metodais plaiai naudojamasi
ne tik mokslinse, bet ir teismo medicinos laboratorijose.
Pakrautos nailono membranos panaudojimas Northern analizs metu
-
14
-
15
top related