mutant - biopd 1.pdffrequenti tumori alla pelle) e si trovano in molti altri tumori...

I segnali Notch

Numerosi segnali extracellulari sono proteinediffusibili, in grado di coprire anche notevolidistanze prima di giungere alla cellulabersaglio dotata del recettore (es: ormoni,ligandi TGF-beta, BMP)

Esistono anche segnali che rimangono sullasuperficie della cellula “sorgente”, perciòsolo le cellule a diretto contatto con questapotranno ricevere il segnale (juxtacrinesignaling)

Nella pathway di Notch, la cellula “sorgente”esprime un ligando transmembrana (DSLDelta Serrate Ligand, Jagged nei vertebrati)Mentre la cellula che “riceve” esprime ilrecettore Notch

Notch mutant

In una cellula non stimolata,il fattore di trascrizione“dormiente” CSL non è ingrado di attivare in manieraefficiente i promotori bersaglio

In presenza di un ligando DSL,Notch viene processatoproteoliticamente

La porzione intracellulare delrecettore Notch (NICD)trasloca al nucleo, riconosceCSL e promuove latrascrizione di geni target

Il taglio proteolitico di Notch richiede due (TRE!) diverseproteasi che lavorano in serie

L’azione delle proteasi è attivata dal cambio conformazionaledi Notch indotto dall’interazione con i ligandi di tipo Delta

L’interazione ligando-recettore coinvolge anche la cellulasorgente, in cui l’endocitosi di Delta è parte integrantedell’attivazione di Notch (l’endocitosi “tira” su Notchcambiandone la conformazione?)

Trasduzione del segnale: cosa succede al promotore

1) CSL lega HDAC; istoni deacetilati; promotore spento

2) Delta signaling: CSL lega Notch ICD; HDACvengono scalzate (derepressione); promotore puòessere acceso debolmente

3) Legame di MAM (mastermind): reclutamentoefficiente delle HAT; promotore acceso

Gli effettori di Notch: HES repressors / trancription factors

Il signaling di Notch è importante neiprocessi di differenziamento in cui lecellule devono fare una scelta di tipobinario (es: nella neurogenesi primaria,dove inibisce la formazione dineuroblasti - vs. glia -, o neldifferenziamento dell’intestino, dovepromuove la formazione di cellulemucipare - vs. enterociti)

In questi casi, le cellule del tessuto informazione hanno un destino “didefault” (cioè in assenza di segnaliesterni istruttivi) e un destino che vieneindotto attivamente da Notch

Il differenziamento in risposta a Notchavviene in maniera controllata ma“casuale” (non è possibile prevederequale cellula seguirà un dato destino)perché prevede una competizione tracellule vicine (inibizione laterale)

NICD

DESTINO DI DEFAULT

DESTINO INDOTTO

Neurogenesi primaria: come mai solo alcune celluledel neuroectoderma diventano neuroni?

AltoDelta

AltoNotch

Destinoprimario didefault(neuroblasto)

Destinosecondarioindotto(glia)

A cosa serve l’inibizione laterale?? ==> Minime asimmetrie tra celluleinizialmente uguali vengono amplificate e stabilizzate portando aldifferenziamento (casuale ma ordinato) di due popolazioni diverse

NeuroectodermaCellule equivalentiCampo di equivalenza

Neuroblastie Glia

AltoDelta

AltoNotch

Destinoprimario didefault(neuroblasto)

Destinosecondarioindotto(glia)

tempo

All’inizio tutte le cellule esprimonoSIA il ligando DeltaSIA il recettore Notch

Attivazione di Notch si oppone alprogramma di differenziamento didefault (verso neuroblasti) epromuove invece il destino gliare

Attivazione di Notch inibiscel’espressione di Delta

La cellula A risponde meglio/prima a Notch, equindi esprime meno ligando Delta

La cellula B avrà meno stimolazione di Notch, equindi esprime più ligando Delta

La cellula A riceve sempre più stimolazione diNotch e non si differenzia (diventa Glia)

La cellula B invece non riceve stimolazione e sidifferenzia in Neuroblasto

A

B

A

B

Glia

Neuroblasto

Notch Delta

Notch DeltaNeurogenin

Geni del differenziamento neuronale

Delta (induce le altre cellule a Glia)NeurogeninGeni del differenziamento neuronale

Nella cellula che NONrisponde a Notch

I segnali Hedgehog (HH) controllano lo sviluppo embrionale sia negli invertebrati(Drosophila), dove sono stati scoperti, sia nei vertebrati

Come molti altri segnali (Wnt, TGF-beta, BMP etc.) la pathway di HH viene“riutilizzata” durante la vita degli organismi per regolare numerosi processi, siadurante le diverse fasi dello sviluppo embrionale, sia durante la vita adulta

Nei vertebrati, i segnali Hh sono stati studiati principalmente per il loro ruolo:- come morfogeni nel controllo del differenziamento cellulare (identità D-V deineuroni nel SNC, polarità dell’arto e numero/identità delle dita negli arti)- come regolatori della proliferazione/sopravvivenza cellulare

I segnali Hedgehog

Wild-type Hedgehog mutantdenticles

In assenza del ligando

Il recettore Ptc (12TM)mantiene Smo inattivo

Ci (cubitus interruptus) èmantenuto sui microtubuli(Hedgehog SignalingComplex) e processatoproteoliticamente nellaforma Ci-R (repressoria)

Solo Ci-R può traslocare alnucleo, e qui inibisceattivamente la trascrizionedei promotori bersaglio

GSK3CK1

(b-TRCP)

In presenza del ligando

Ptc non è più in grado diinibire Smo (il ligandoINATTIVA il recettore)

Ci (cubitus interruptus) non vienetagliato ed è libero di traslocare alnucleo nella forma full-lenght(fosforilazione del HSC?)

Ci associa con CBP epromuove la trascrizionedei promotori bersaglio

Smo blocca ilcomplesso che“taglia” Ci

In assenza di ligando In presenza di ligando

Smoothened è una proteina trasmembrana (7TM) e si pensa che in assenza delligando venga mantenuta in vescicole intracellulari dove è inattivo

solo quando HH lega il recettore, Smo può localizzare sulla membranacitoplasmica e da qui attivare Ci

Nei vertebrati esistono tre diversi omologhi di Ci, i fattori di trascrizione Gli1-3

La relativa importanza della funzione repressoria/attivatoria cambia nei differenti Gli(Gli3 principalmente repressorio, Gli2 principalmente attivatorio)

Spesso i fattori Gli funzionano in maniera combinatoriale + feedback (Gli1)

Un modello semplificato per il funzionamento di HH come morfogeno

HH HH

Smo inattivo

Ci-R

Smo parzialmente attivo

Ci+CBP

Smo attivo

promotorerepresso

promotoreinattivo

(tx basale)

promotoreattivo

Sorgentedi HH

A B C

GRADIENTI…

Mutazioni inattivanti di Patched

HH HH

Ci+CBP

Smo è sempre attivo

promotoreattivo

Sorgentedi HH

C

promotoreattivo

C

Ci-R

promotorerepresso

A

Mutazioni inattivanti di Smoothened

promotorerepresso

A

HH HH Sorgentedi HH

promotorerepresso

promotoreinattivo

(tx basale)

A B

HH HH Sorgentedi HH

Mutazioni che aboliscono solo la funzione attivatoria di Ci(Ci lega il DNA ma funziona solo come repressore)

HH HH

Ci+CBP

promotoreinattivo

(tx basale)promotore

attivo

Sorgentedi HH

B C

Mutazioni che aboliscono solo la funzione repressoria di Ci(Ci lega il DNA ma funziona solo come attivatore)

ESEMPI DI GRADIENTI MORFOGENETICI CHE COINVOLGONO UNGRADIENTE DI SHH:

- Neural tube D/V (Generazione di motoneuroni, interneuroni etc)- Divisione del campo dell’occhio (anlage) in due!- Sviluppo arto (ZPA)- Somite (induce Sclerotomo e patterning miotomo e dermatomo)

… e molti altri…

Shh controlla il differenziamento D/V dei neuroni nel SNC

Il gradiente di Shh si traduce nell’espressione localizzatadi combinazioni di fattori di trascrizione

Differenti fattori Gli contribuiscono a formare il gradiente di risposta a Shh

Glirepressori

Gliattivatori

Manca il contributo ATTIVATORIO di Gli2;Le cellule non sono in grado di percepire ladose massima di SHH (V3, rosso)

Manca il contributo REPRESSORIO di Gli3;Le cellule non sono in grado di distinguerecorrettamente tra dosi intermedie di SHH

I segnali HH nei vertebrati hanno un ruolo fondamentale anche nellamorfogenesi cranio-facciale

SHH (secreto dal mesoderma assiale) è importante per stabilire la polarità D/Vdel SNC e, di conseguenza, la suddivisione del prosencefalo in telencefalo ediencefalo, per la formazione dei due emisferi del telencefalo, per la formazionedei bulbi nasali e delle vescicole ottiche

Mutazione di SHH nel topo, o sindromi umane dovute a mutazione dicomponenti della pathway di SHH, causano perciò anomalie dello sviluppocome la oloprosencefalia (nei casi estremi: una unica vescicola prosencefalica,occhio ciclopico, proboscide)

human SHH mutant

Famiglie con mutazione ereditaria del gene Shh

Solitary median maxillary Central Incisor (SCI) Holoprosencephaly (HPE)

I segnali HH hanno un ruolo anche nello sviluppo dell’arto

Shh è il fattore responsabile della polarizzazione Antero-Posteriore dell’arto (identità e numero delle dita, radio/ulna)

Mutazioni di Shh o di componenti della pathway provocanomalformazioni dell’arto (polidattilia-sindattilia)

GreigCephalo-polysyndactyly

(allele nullo Gli3)Pallister-Hall

(Gli3 solo repressorio) Topi Gli3-/-

Il ligando Hedgehog vienesintetizzato come unprecursore in grado diautocatalisi (proteolisi)

HH-N viene modificato peraggiunta di un colesterolo e diun palmitato

Disturbi nel metabolismo delcolesterolo hanno effetto sulsignaling di HH (sia a livellodel ligando che del recettorePatched)

Il ruolo del colesterolo nel signaling da Hedgehog

Mutazione in enzimi della via biosinteticadel colesterolo nell’uomo (sindromeSLOS, gene della 7-dehydrocholesterol-reduttasi) causano oloprosencefalia emalformazioni degli arti

Sostanze che interferiscono con labiosintesi del colesterolo (alcaloidicome jervine e cyclopamine) hannoeffetti teratogeni dovuti alla perdita diSHH signaling

VeratrumCalifornicum

Nelle cellule adulte, i segnali HH promuovono laproliferazione cellulare

Patched funziona quindi come tumor-suppressor(loss di Ptc = attivazione costitutiva di Smo =proliferazione incontrollata)

Mutazioni inattivanti di Patched (o altre mutazioniattivanti della pathway) sono all’origine deicarcinomi delle cellule basali della pelle (tra i piùfrequenti tumori alla pelle) e si trovano in moltialtri tumori (medulloblastoma, glioma, tumorigastrici, carcinomi squamosi della pelle etc.)

Mutazioni ereditarie di Patched causano la “basalcell nevus syndrome”, che predisponeall’insorgenza di carcinomi basali, oltre apresentare numerose anomalie dello sviluppo(fusione delle dita, anomalie facciali)

Shh dall’embriologia ai tumoriInattivazione PTC

attivazionecostitutiva

GLI

iperproliferazione