oliver stojković, phd · 2020. 12. 11. · dnk dnk kvantifikacija pcr amplifikacija višestrukih...

Identifikacija ljudi na osnovu bioloških tragova

Oliver Stojković, PhDsudskomedicinski genetičar

DNK laboratorija Instituta za sudsku medicinu, Medicinski fakultet

O čemu ćemo danasrazgovarati

◼Osnove forenzičke genetike

◼ Istorijat razvoja tehnologije

◼Tehnologija DNK analize:(State of the art)

◼ Interpretacija rezultata

Forenzička primena DNK analiza

◼ Kriminalistika (ubistva, silovanja, pljačke)

◼ Sporni paternitet (Iv Montan, Keba)

◼ Istorijske dileme(Tomas Jefferson, carska porodica Romanov, Despot Stefan Lazarević)

◼ Nestala lica (ICMP)◼ Identifikacija žrtava masovnih

nesreća (RTS, Bliznakinje u Njujorku)

◼ Vojne ogrlice (“Dog Tags”)◼ DNK registri osuđenika (Zakon o

nacionalnom DNK registru)

Rođenje forenzičke genetike22. Nov. 1983. Lynda Mann pronađena mrtva

FSS: Napasnik ima A krvnu grupu (kao i 10 % populacije)

31. Jul 1986. Dawn Ashworth ubijena

FSS: Napasnik takođe ima A krvnu grupu

Richard Buckland uhapšen (i priznao)

Ali ima krvnu grupu 0!

Sir Alec Jeffreys sprovodi DNK analize

Buckland je bio NEVIN

Svi muškarci iz Leicestershire su tipizirani, ni

jedan profil se ne poklapa sa tragovima

Kafanske priče mogu biti opasne: Ian Kelly

priznao da je dao krv umesto Collina

Pitchforka

Slučaj Helge Čevari

Sudbina Romanovih

Carska familija Romanov: Velika knjeginja Tatjana, Anastazija, Marija,

Olga, Car Nikolaj II, Carica Aleksandra, Princ Aleksej (1916)

„ Porodica Romanovih je pogubljena bez buržoaskih formalnosti, u skladu sa

našim novim demokratskim principima “ (“Moskovska vremena”, 1918).

Tela u grobnici

1. Demidova,

2. Dr. Botkin,

2. Olga,

4. Nikolai,

5. Maria,

6. Tatiana,

7, Alexandra,

8. Karitonov,

9. Trup

Ali: Aleksej i Anastasia

nedostaju

Bivši srpski predsednik Ivan Stambolić, pronađen mrtav u šumi na Fruškoj Gori

Odakle biološki tragovi

◼ Lokardov princip transfera:

– Kad god dva objekta dođu u kontakt, dolazi do razmene materije između njih

– Kada dve osobe (ili osoba i objekat) dođu u kontakt dolazi do transfera biološke materije

Gde se mogu naći biološki tragovi

Odakle biološki tragovi na mestu zločina?

◼ Od počinioca

◼ Od žrtve

◼ Od ostalih učesnika

◼ Od slučajnih prolaznika

◼ Od osoba koje su tu boravile ranije

◼ Od osoba koje su tu došle kasnije

Biološki trag sa mesta zločinaili

Referentni uzorakBiologija

Izolovanje DNK

DNK kvantifikacija

PCR amplifikacija višestrukih STR markera

Tehnologija

Separacija i detekcija PCR produkata

Genotipizacija

GenetikaPoređenje genotipa sa drugim referentnim

genotipovima

Ukoliko se poklope genotipovi, utvrđivanje učestalosti

genotipa u populaciji

Prezentacija nalaza

Koraci u obradi DNK uzorka

Malo bazične genetike

✓ DNK nasleđujemo po pola od svakog roditelja

✓Naša DNK je identična u svim tkivima

✓DNK se ne menja tokom života(ni nakon smrti)

Svi smo genetički jedinstveni

◼ Humani genom je dugačak 3.2 milijarde nukleotida

◼ 99.9% DNK je identična među ljudima

◼ Malo matematike0.1% od 3 mldrd ≈ nekoliko miliona nukleotida

Geni su smešteni u hromozomima

1013 ćelija7 pikograma DNK po ćeliji

Humani genom23 para hromozoma + mtDNA

Polni hromozomi

mtDNA

16,569 bp

MitohondrijskaDNK

Hromozomi se nalaze u jedru

I u mitohondrijama postoji DNK

Autozomi u po dve kopije po ćeliji

DNK ulazi u sastav hromozoma

DNK: gradja molekula

◼ Nukleotidi – Dezoksiriboza

– Fosfatna grupa

– Azotna baza:◼ Adenin

◼ Timin

◼ Guanin

◼ Citozin

◼ A-T

◼ G-C

DNK: polimorfizmi

Polimorfizam sekvence

adenin

timin

guanin

citozin

DNK polimorfizmi: nastavak

UzastopnoPonovljene Sekvence2-7 bp=STR10-100=VNTRPolimorfizam broja ponovaka

FBI CODIS DNA Database

Combined DNA Index System

◼ Povezivanje serijskih zločina

◼ Slučajevi sa počiniocima-povratnicima

◼ Započelo oktobra1998

◼ Povezuje svih 50 država

◼ Zahteva 13 STR markera

13 CODIS standardnih STR lokusa i njihove pozicije na hromozomima

CSF1PO

D5S818

D21S11

TH01

TPOX

D13S317

D7S820

D16S539 D18S51

D8S1179

D3S1358

FGA

VWA

AMEL

AMEL

Nije cela DNK informativna

Podaci

• Cela DNK =7pg=4x3,2 milijarde nukleotida

• Ciljni region 300 nukleotida (desetomilioniti deo)=7x10-18 grama

Problem

• Donja granica detektabilnosti: milijarditi deo grama

Rešenje

• umnožavanje genetičke informacije pre analize: kloniranje, PCR

◼ U svakom ciklusu, broj kopija se udvostručuje

◼ Za 28-35 ciklusa DNK se amplifikuje milion do milijardu puta

PCR- molekularno fotokopiranje

Multiplex PCR

◼ Simultano umnožavanje većeg broja gena (kraće vreme)

◼ Osetljivost velika (manje od 1 ng)(manje uzorka)

◼ Mogućnost analize mešanih i degradovanih uzoraka

Fragmenti DNK generisani PCRomse razdvajaju elektroforetski

Automatski sekvenatori

Kapilarni sekvenatori

ABI 310

1 kapilara

30 uzoraka na dan

ABI 3100

16 kapilara

500 uzoraka/dan

ABI 3730xl96 kapilara

8000 uzoraka/dan

Sirovi podaci iz elektroforeze

PP16 Promega

CSF1PO

D5S818

D21S11

TH01

TPOX

D13S317

D7S820

D16S539 D18S51

D8S1179

D3S1358

FGA

VWA

AMEL

AMEL

D3S1358

TH01

D21S11

Amel

AmelD18S51

D5S818

D13S317

D7S820

D16S539

CSF1PO

vWAD8S1179

TPOX

Penta E

Penta D

FGA

Poređenjem sa ladderom dobija se DNK profil

1 ng DNK

0,5 ng DNK

0,25 ng DNK

0,125 ng DNK

0,06 ng DNK

0,03 ng DNK

PCR amplifikacija

Elektroforeza

Upoređivanje

Zaključivanje

Korišćenje forenzički validiranih hemikalija

Utvrđivanje dužine amplifikovanih fragmenata

Imenovanje alela

Sa referentnim uzorkom ili

bazom

Frekvencionistički i probabilistički pristup

Genotipizacija

Izolacija DNK

Dobijanje velike količine čiste DNK