oncogeni ed oncosoppressori. cellula tumorale cellula normale e una malattia genetica? e una...

Oncogeni ed Oncosoppressori

Cellula Tumorale

Cellula Normale

E’ una malattia genetica?

E’ una malattia ereditaria?

Cosa causa il cancro?

Radiazioni

Virus

Cancerogenichimici

Cellula Normale

Cellula Tumorale

UV

Cancro

• Accumulo abnorme di cellule causato da alterazioni nella:

• Proliferazione• Apoptosi• Riparazione del DNA• Differenziazione

Alterata proliferazione cellulare e cancro

• Ogni cellula contiene ~ 30-40,000 geni

• Alcuni geni sono responsabili del controllo della proliferazione cellulare

• Se in questi geni avviene una mutazione, la proliferazione diventa anomala

• L’anomala proliferazione è una caratteristica del cancro

Cancerogenichimici

UV

Cellula Normale

Cellula Tumorale

Radiazioni

Virus

Errori di replicazione

Danno al DNA

Mutazionipuntiformi

Riarrangiamenti(traslocazioni, delezioni,

Amplificazione)

Alterazioni al DNA di geniche controllano la proliferazione

1. Cellula somatica normale

2.Espansione clonale con mutazione iniziale

4.Ulteriore espansione di un subclone con mutazione addizionle

3. Espansione di un subclone A con una nuova mutazione e la mutazione iniziale

Nelle cellule normali il controllo della proliferazione avviene in specifiche fasi del ciclo

cellulare

Segnali proliferativinegativi

Segnali proliferativipositivi

attività metabolica e crescita cellulare

attività metabolica e crescita cellulare

Come è controllata la proliferazione cellulare?

• Il ciclo cellulare e la divisione cellulare sono controllati dalla regolata espressione di geni

• L’integrità genomica di tutte le cellule dipende dall’attenta attività dei geni riparativi soprattutto in cellule più esposte all’azione di genotossici

• Coinvolge l’equilibrio tra l’espressione di geni responsabili per la regolazione positiva della proliferazione e l’espressione di geni responsabili per la regolazione negativa della proliferazione

Cellula Normale

Cellula Tumorale

Perdita di funzione di uno o più geni oncosoppressori

Abnorme espressione di uno o più oncogeni

Proto-oncogeni conosciuti. Mutazioni nei proto-oncogeni causano il cancro.

Proteine codificate dagli oncogeni

Cancerogenichimici

UV

Cellula Normale

Cellula Tumorale

Radiazioni

Virus

Errori di replicazione

Danno al DNA

Mutazionipuntiformi

Riarrangiamenti(traslocazioni, delezioni,

Amplificazione)

Alterazioni al DNA di geni che controllano la proliferazione (oncogeni e geni oncosoppressori)- Proliferazione sregolata

La scoperta dei “geni del cancro” nasce da due osservazioni (fine anni ‘70)

• Sequenze geniche di retrovirus oncògeni (v-onc) sono omologhe a sequenze di normali geni cellulari (c-onc) da questi “catturati”

• Segmenti genici estratti da tumori trasformano cellule normali in cellule neoplastiche

Trasformazione cellulare da parte di un virus del sarcoma Rous (RSV) e di un avian leukosis virus (ALV). Entrambi i virus infettano e si replicano nei fibroblasti di pollo, ma solo i RSV inducono trasformazione cellulare

Il genoma del retrovirus contiene un gene addizionale, l’src, che non è presente nell’AVL e codifica una protein-tyrosine kinase p60src

Isolamento del virus della leucemia di Abelson. Il virus altamente oncogeno Ab-MuLV fu isolato da un raro tumore che si sviluppava in un topo in cui era stato inoculato un virus non trasformante (Moloney murine leukemia virus, or MuLV), contente solo i geni gag, pol, and env necessari per la replicazione virale. Invece, Ab-MuLV aveva acquisito un nuovo oncogene (abl), responsabile della sua capacità trasformante. L’oncogene abl rimpiazza alcuni geni replicativi ed è fuso con un gene gag parzialmente deleto (Δgag) nel genoma Ab-MuLV.

Questo scenario suggeriva l’ipotesi che gli oncogeni retrovirali derivano da geni della cellula ospite, e che occasionalmente tale gene cellulare viene incorporato in un genoma virale, producendo un nuovo virus altamente oncogenico come prodotto di un evento di ricombinazione virus-ospite

Le cellule normali contengono geni che sono strettamente correlati agli oncogeni retrovirali

• I geni delle cellule normali da cui originano gli oncogeni retrovirali sono i proto-oncogeni. Sono importanti geni regolatori, codificanti proteine coinvolte nei pathways di trasduzione del segnale che controllano la normale proliferazione cellulare (es.: src, ras, and raf).

• Gli oncogeni sono espressi in maniera

abnorme o sono forme mutate dei corrispondenti proto-oncogeni.

• Come conseguenza di tali alterazioni gli oncogeni inducono l’ abnorme proliferazione cellulare e lo sviluppo tumorale.

Proteine che partecipano al controllo della crescita cellulare. Il cancro può essere causato dall’espressione di forme mutate di queste proteine: fattori di crescita (I), recettori per fattori di crescita (II), proteine del segnale (III), fattori di trascrizione (IV), proteine pro- o anti-apoptotiche (V), proteine che controllano il ciclo cellulare (VI), e proteine che riparano il DNA (VII). Mutazioni delle proteine di classe I – IV danno origine ad oncogeni dominanti attivi. Le proteine di VI classe sono tumor suppressors, mutazioni in questi geni causano la perdita del controllo della proliferazione della cellula. Mutazioni della Classe VII aumenta la probabilità di mutazioni nelle altre classi.

Proto-oncogeni conosciuti. Mutazioni nei proto-oncogeni che causano il cancro.

Studio di un oncogene tumorale umano mediante transfezione di DNA estratto da un carcinoma della vescica umano in cellule murine; esso induce la trasformazione delle cellule murine. La transformazione è causata dall’integrazione ed espressione di un oncogene derivato dal tumore umano

Principali meccanismi per cui un proto-oncogene può diventare un

oncogene

Traslocazione:Un gene si trova in un nuovo

locus, sotto un nuovo controllo

Amplificazione genica:Copie multiple di un gene

Mutazionepuntiforme

Proteina in eccesso Proteina in eccesso Proteina iperattiva

NuovoPromoter

Attivazione di un oncogene per mutazione puntiforme

Mutazione puntiforme nell’ oncogene ras. Un singolo nucleotide cambiato, che altera il codone 12 da GGC (Gly) a GTC (Val), è responsabile dell’attività transformante del oncogene ras

Il ciclo della proteina Ras tra la forma inattiva legata al GDP e la forma attiva legata al GTP avviene in 4 fasi. Il legame dei fattori di crescita ai loro recettori induce la formazione del complesso attivo Ras/GTP. Fase 1: Guanine nucleotide – exchange factor (GEF) facilita la dissociazione del GDP dal Ras. Fase 2: GTP si lega spontaneamente, e il GEF si dissocia lasciando Ras /GTP in forma attiva. Fase 3 e 4: Idrolosi di GTP per generare la forma Ras/GDP inattiva, accelerata da GTPase-activating protein (GAP) o SOS.

Mutazione puntiformeL’effetto di questa mutazione missenso crea un oncoproteina Ras che non idrolizza GTP a GDP. L’oncoproteina Ras rimane nel complesso Ras–GTP attivo ed attiva continuamente la serine/threonine kinase downstream

Regolazione dell’attività di Src e sua attivazione per mutazione.

(a) Struttura del dominio di c-Src e v-Src. La fosforilazione nella tirosina 527 da parte di Csk, un’altra tyrosine kinase, inattiva l’attività Src kinase. L’oncoproteina transformante v-Src codificata dal Rous sarcoma virus manca di 18 amino acidi C-terminal compresa la tirosina 527 e così è constitutivamente attiva.

(b) Effetto della fosforilazione sulla conformazione di c-Src. Il legame della fosfotirosina 527 al dominio SH2 induce cambiamenti conformazionali sui domini SH3 e kinase, con distorsione il sito attivo della kinase sicchè è cataliticamente inattivo. L’attività della kinase di c-Src è normalmente attivato con la rimozione del fosfato sulla tirosina 527.

Attivazione di un oncogene per delezione

Effetti di mutazione in proto-oncogeni che codificano recettori di superficie. Una mutazione che altera un singolo aminoacido, nella regione transmembrana del recettore Her2R causa la dimerizzazione di due recettori in assenza del ligando correlata all’EGF e rende la proteina costitutivemente attiva.Una delezione che causa la perdita del ligand binding domain extracellulare nel recettore EGF porta all’ attivazione costitutiva della proteina kinasi

La proteina del proto-oncogene Raf è formata da amino-terminal regulatory domain ed un carboxy-terminal protein kinase domain. Nella proteina dell’ oncogene virale Raf, il regulatory domain è deleto e rimpiazzato dalle sequenze virali Gag. Come risultato, il Raf kinase domain è constitutivamente attivo, causando transformazione cellulare.

Attivazione di un oncogene per traslocazione

Translocazione del c-myc. Nel linfoma di Burkitt il protoncogene c-myc è traslocato dal cromosome 8 al locus delle catene pesanti delle immunoglobuline (IgH) sul cromosome 14, che causa un’abnorme espressione del c-myc

Traslocazione di abl. Nella LMC l’ oncogene abl è traslocato dal cromosoma 9 al cromosoma 22, formando il cromosome Ph. Il protoncogene abl, che contiene due primi esoni alternativi (1A e 1B), si congiunge a metà del gene bcr sul cromosome 22. L’esone 1B è deleto come risultato della translocazione. La trascrizione del gene fuso inizia sul promoter bcr e continua verso abl. Lo splicing genera un mRNA Bcr/Abl, in cui le sequenze dell’esone 1A abl sono delete e le sequenze bcr sono congiunte all’esone 2 di abl.

Riarriangemento cromosomico nel lifoma follicolare. La traslocazione fonde gli elementi trascrizionali enhancer di un gene, sul cromosoma 14, all’unità trascizionale di un’altro gene, sul cromosoma 18, che codifica Bcl2, La proteina Bcl2 così viene prodotta dalle plamsma -cellule

Attivazione di un oncogene per inserzione

Attivazione di c-myc proto-oncogene per inserzione di promoter retrovirale o di un enhancer.

(a) Il promoter può essere attivato quando il retrovirus si inserisce upstream (5′) degli esoni di c-myc. Il LTR di destra può agire da promoter.

(b) Il gene c-myc può anche essere attivato quando un retrovirus inserisce upstream del gene c-myc nella direzione trascrizionale opposta; un LTR virale agisce da enhancer, activando la trascrizione dalla sequenza del promoter di c-myc.

Oncogene Type of cancer Activation mechanism

abl Chronic myelogenous leukemia, acute lymphocytic leukemia Translocation

akt Ovarian and pancreatic carcinomas Amplification

bcl-2 Follicular B-cell lymphoma Translocation

D1 Parathyroid adenoma, B-cell lymphoma Translocation

D1 Squamous cell, bladder, breast, esophageal, liver, and lung carcinomas

Amplification

E2A/pbx1 Acute lymphocytic leukemia Translocation

erbB-2 Breast and ovarian carcinomas Amplification

gip Adrenal cortical and ovarian carcinomas Point mutation

gli Glioblastoma Amplification

gsp Pituitary and thyroid tumors Point mutation

hox-11 Acute T-cell leukemia Translocation

lyl Acute T-cell leukemia Translocation

c-myc Burkitt's lymphoma Translocation

c-myc Breast and lung carcinomas Amplification

L-myc Lung carcinoma Amplification

N-myc Neuroblastoma, lung carcinoma Amplification

PDGFR Chronic myelomonocytic leukemia Translocation

PML/RARα Acute promyelocytic leukemia Translocation

rasH Thyroid carcinoma Point mutation

rasK Colon, lung, pancreatic, and thyroid carcinomas Point mutation

rasN Acute myelogenous and lymphocytic leukemias, thyroid carcinoma

Point mutation

ret Multiple endocrine neoplasia types 2A and 2B Point mutation

ret Thyroid carcinoma DNA rearrangement

SMO Basal cell carcinoma Point mutation

Oncogeni che codificano per fattori di crescita

Stimolazione di crescita autocrina. Una cellula produce un fattore di crescita al quale risponde, con il risultato di una continua stimolazione della proliferazione cellulare

Meccanismo dell’attivazione dell’oncogene Tel/PDGFR.Il PDGFR normale è attivato dalla dimerizzazione indotta dal legame con PDGF. L’ oncogene Tel/PDGFR codifica una proteina nella quale il dominio extracellulare normale del PDGFR e rimpiazzato da una sequenza N-terminale del fattore di trascrizione Tel. Queste sequenze dimerizzano in assenza di PDGF, con attivazione costitutiva della protein-kinase.

Oncogeni che codificano per recettori di membrana

Molecole del segnale extracellulare si possono legare sia a recettori extracellulari che intracellulari. Molte molecole del segnale sono idrofile e non possono attraversare la membrana cellulare e si legano ai recettori di superficie cellulare, che generano segnali all’interno della cellula target. Alcune molecole del segnale, diffondono attraverso la membrana plasmatica e si legano a recettori all’interno della cellula target nel cytosol o nel nucleo. Molte di queste molecole sono idrofobiche; sono trasportate dal flusso sanguigno e altri fluidi legate a proteine carrier, dai quali si dissociano prima di entrare nella cellula target.

Sei famiglie di recettori tyrosin- kinasi. In alcune sottofamiglie il dominio tyrosin-kinasi e interrotto da una "kinase insert region".

Recettori tirosin-kinasi

Auto-fosforilazione dei recettori tirosin-chinasi

Tre classi di recettori di superficie cellulare

Recettori Enzyme-linked• (1) recettori guanilil cyclasi, che catalizzano la

produzione del cGMP nel cytosol;

• (2) recettori tirosin- kinasi, che fosforilano specifici residui tirosina su un piccolo gruppo di proteine del segnale intracellulari;

• (3) recettori tirosin-kinasi-associati, che sono associati a proteine con attività tyrosin-kinasi;

• (4) recettori tirosin- fosfatasi, che rimuovono i gruppi fosfato dai residui di tirosina di specifiche proteine del segnale intracellulari;

• (5) recettori serine/treonine kinasi, che fosforilano specifici residui di serina o treonina da alcune proteine intracellulari.

I due principali meccanismi intracellulari del segnale hanno caratteristiche comuni. In entrambi I casi una proteina del segnale è attivata all’ addizione di un gruppo fosfato e inattivato dalla rimozione del fosfato.

(A)Il P è aggiunto covalentemente alla proteina del segnale da una protein kinase;

(B)La proteina del segnale è indotta a cambiare il suo legame GDP a GTP.

Recettori con 7 domini transmembranacei accoppiati alle proteine G eterodimeriche.- Accoppiati all’adenil ciclasi- Accoppiati a canali ionici- Accoppiati a PLC

Schema dei recettori legandi a G-protein. The parts of the intracellular domains that are mainly responsible for binding to trimeric G proteins are shown in orange, while those that become phosphorylated during receptor desensitization (discussed later) are shown in red.

Pathways principali mediante I quali i recettori di superficie legati alle G-protein generano mediatori intracellulari. In entrambi I casi il legame ad un ligando extracellulare altera la conformazione del dominio citoplasmatico del recettore, che si lega alla G-protein e attiva (o inattiva) un enzima della plasma membrana. Nel pathway del cAMP l’enzima produce direttamente cAMP. Nel pathway Ca2+ l’enzima produce un mediatore solubile (IP3) che rilascia Ca2+ dal reticolo endoplasmico. Entrambi cAMP e Ca2+ inducono il segnale legandosi a proteine specifiche, e alterando la loro conformazione e quindi la loro attività

Oncogeni e segnale di trasduzione. Gli oncogeni agiscono da fattori di crescita (es. EGF), recettori di fattori di crescita (es. ErbB), e molecole del segnale intracellulari (Ras and Raf). Ras e Raf attivano il pathway ERK MAP kinase, inducendo geni addizionali (e.g., fos) che codificano potenzialmente proteine oncogeniche che sono regolatori trascrizionali. Le proteine con potenziale oncogenico sono evidenziate in giallo

Azione dell’ oncogene PML/RAR α PML/RARα blocca la differenziazione da promielociti a granulociti.

Oncogeni e sopravvivenza cellulare. Gli oncogeni che segnalano la sopravvivenza cellulare sono fattori di crescita, recettori per fattori di crescita , PI 3-kinase, and Akt. Il segnale del pathway PI 3-kinase/Akt regola membri della famiglia di Bcl-2, che promuove la sopravvivenza cellulare inibendo il rilascio del citocrome c dai mitocondri. Proteine con potenziale oncogenico sono in giallo

Il Cancro è una malattia ereditaria?

-15% dei casi di tumore hanno una componente ereditaria

Geni adibiti al riparo del DNA (caretakers)

1. La loro mutazione è spesso alla base di sindromi neoplastiche familiari

2. Prototipo sono i geni hMLH1, hPMS1e hPMS2, mutati nell’Hereditary Non Polyposis Colon Cancer (HNPCC); i geni BRCA-1 e BRCA-2, mutati nel carcinoma della mammella; il gene ATM (atassia-teleangectasia)

3. La mutazione di questi geni non influenza direttamente la crescita cellulare né l’apoptosi ma favorisce la trasformazione e accelera la progressione neoplastica.

4. Gli individui affetti presentano instabilità di particolari regioni del DNA (coppie ripetute di 1-6 nucleotidi) denominate microsatelliti

Cancro Familiare

• L’ereditarietà di una mutazione predisponente in un oncogene:

- RET sindromi tumorali – Carcinoma Familiare della Midollare della tiroide (FMTC) e Neoplasia Endocrina Multipla Tipo 2A (MEN 2A)

- MET nel cancro ereditario papillare renale - CDK4 nel melanoma familiare

• L’ereditarietà di una mutazione predisponente in un gene oncosoppressore

• L’ereditarietà di una mutazione predisponente in un gene che ripara il DNA

Cancro Familiare

• Una singola mutazione è insufficiente a causare il cancro

• Ulteriori alterazioni in altri geni sono necessarie all’insorgenza del cancro

Cancerogenichimici

UV

Cellula Normale

Cellula Tumorale

Radiazioni

Virus

Errori di replicazione

Danno al DNA

Mutazionipuntiformi

Riarrangiamenti(traslocazioni, delezioni,

Amplificazione)

Alterazioni al DNA di(0ncogeni e geni oncosoppressori)- Quando avviene un’alterazione in un gene della linea germinale

Insorge un cancro familiare- Proliferazione sregolata

Geni Tipi di cancro

APC Carcinoma colon/retto

BRCA1 Carcinomas ovarico e della mammella

BRCA2 Carcinomas della mammella

DPC4 Carcinoma pancreatico

INK4 Melanoma; ca del polmone, tumori del cervello, leucemie, linfomi

MADR2 Carcinoma colon/retto

NF1 Neurofibrosarcoma

NF2 Meningioma

p53 Tumori del cervello; Ca della mammella, colon/retto, esofageo, fegato, e polmone; sarcomi; leucemie e lymfomi

PTC Carcinoma cellule basali

PTEN Tumori del cervello; melanoma; Ca della prostata, endometrio, rene, e polmone

Rb Retinoblastoma; sarcomi; ca della vescica, mammella, e polmone

VHL Carcinoma cellule renali

WT1 Tumore del Wilms

Ereditarietà del retinoblastoma

La suscettibilità al retinoblastoma è trasmessa al 50% dei discendenti.

Forma ereditaria Mutazioni somatiche

Retinoblastoma e ciclo cellulare

La cellula decide se Proseguire nel ciclo cellulare

o arrestarsi

Punto di restrizione

Rb è il principale gene che controlla il punto RQuindi è un target (diretto o indiretto) del processo di cancerogenesi

Ruolo di p53 nel Controllo del ciclo

cellulare

Il Retinoblastoma inibisce la trascrizione di geni contenenti siti di legame per i fattori di trascrizione E2F

G1 S

G2

M

p16ARFpRbp53p21ATM

Rb

p21ATM

In loro assenza, le cellule con DNA danneggiato continuano a generare nuove cellule senza riparare il danno

La maggior parte dei geni oncosoppressorisono regolatori del ciclo cellulareAlcuni oncosoppressoribloccano il ciclo cellularein presenza di danno al DNAo incompleta Rip. del DNA

Alcuni oncosoppressori sono responsabili dellariparazione del DNA danneggiato

Geni che riparano il DNA

• Il cancro insorge anche per difettiva riparazione del DNA

• Mutazioni nei geni (BRCA1, BRCA2) induce suscettibilità per il Ca della mammella

• Geni (MSH2, MLH1, PMS1, PMS2, MSH6) nella suscettibilità del Hereditary Non-polyposis Colon Cancer (HPNCC)

P16 (Hereditary Melanoma)

• p16 è mutato o deleto nelle leucemie e nel cancro della testa e del collo. E’ mutato nel melanoma comprese le forme familiari della malattia.

• p16 è un membro della famiglia INK4 degli inibitori cyclin dependent kinase inhibitor

• p16 protegge l’ Rb dall’iperfosforilazione ed inattivazione da parte di cyclin D1/CDK4

• Quando p16 è mutato o deleto non è capace di eseguire questa funzione

Conclusioni

• Il Cancro è una malattia multifattoriale, fattori ambientali e genetici contribuiscono allo sviluppo dei tumori

• Alterazioni nei proto-oncogeni e nei geni oncosoppressori causano la predisposizione all’insorgenza di tumori. Ma non causano il cancro

• Lo sviluppo del cancro è un processo multifasico: Addizionali mutazioni sono necessarie affinché si possa sviluppare un tumore

• Possono essere necessari fino a 6-12 mutazioni per lo sviluppo del cancro

• I cambiamenti genici possono avvenire negli oncogeni, nei geni oncosoppressori, nei geni che regolano l’apoptosi che riparano il DNA e che controllano la differenziazione

• La predisposizione ereditaria avviene circa nel 15% dei tumori per mutazioni ereditarie in:

• Geni oncosoppressori• Geni che riparano il DNA• Raramente oncogeni

Oncogeni: Attivati da Mutazioni Dominanti (GOF) Oncosoppressori: Inattivati da Mutazioni Recessive (LOF)

Cellule proliferanti in modo abnorme

Mutazione attivante permette l’oncogene a stimolare la proliferazione cellulare

Cellula normale

Una singola mutazione

crea l’oncogene

Due mutazioni inattivanti eliminano la funzionalmente il gene oncosoppressore, stimolando la proliferazione cellulare

Cellula normale

Una mutazione

Inattiva un gene oncosoppressore

La mutazione di una singola copia del gene non ha effetto

La 2°mutazione

Inattiva un gene oncosoppressoreInattiva il gene oncosoppressore

Loss of Heterozygosity (LOH)

Perdita di EterozigosiLa seconda mutazioneinattivante di una normale copia del gene

può avvenire mediante alcuni meccanismi

SecondMutation

La natura multifasica del cancro

• •Lo sviluppo del cancro è un processo multifasico che coinvolge 6-12 cambiamenti in geni regolatori.

• Lo sviluppo del cancro dipende da alterazioni in vari pathways della trasduzione del segnale nella cellula. Esempio: il cancro Colon-rettale.

• Lo sviluppo del cancro dipende dall’alterazione di molti geni in un pathway di transduzione. In molti casi queste alterazioni possono essere ridondanti.

p53 p53

MDM2

p21

GADD45

BAX

FAS

IGF-BP3

Cdk4/6

cyclin D

+

Espressione di Geni in S-fase

pRB inattiva

E2F ATTIVO

PCNADNA pol a

Apoptosi

Arresto in G1

Targets Trascrizionali di p53

Attivazione di p53- incremento dei livelli di proteina- modificazione (Fosforilazione)

Danno al DNA

ATM/R

http://www.cineca.it/networking/streaming/sestri/courses/cancgen/Bernards.htm

http://www.cineca.it/networking/streaming/sestri/courses/cancgen/Bernards.htm