plagiat merupakan tindakan tidak terpuji · validasi metode analisis residu azoxystrobin dalam buah...
Post on 13-Jul-2020
11 Views
Preview:
TRANSCRIPT
VALIDASI METODE ANALISIS RESIDU AZOXYSTROBIN DALAM
BUAH MELON (Cucumis melo L.)
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh :
Rizki Seviana Puspitasari
NIM : 118114167
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2016
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
VALIDASI METODE ANALISIS RESIDU AZOXYSTROBIN DALAM
BUAH MELON (Cucumis melo L.)
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh :
Rizki Seviana Puspitasari
NIM : 118114167
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2016
i
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
HALAMAN PERSEMBAHAN
What ever you do, do it well. Do it so well that when people see you do it they
will want to come back and see you do it again and they will want to bring
others and show them how well you do what you do.
Do it for people who want to see you fail.
Bukan bahagia yang menjadikan kita bersyukur tetapi dengan bersyukur
akan menjadikan hidup kita bahagia.
“Cintailah pekerjaan mu, lakukanlah dengan hati gembira maka kamu akan menerima hasil yang kamu inginkan” ~Ibu.
Sebuah karya sederhana ini, saya persembahkan kepada semua harta ku yang tak ternilai:
Allah SWT Ayah dan Ibu ku tercinta
Almarhum Mbah Mo tersayang my beloved sister Herlin Indah Noviandika
Serta Sahabat & Kekasih Ku
iv
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
v
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PRAKATA
Puji syukur penulispanjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa karena
penyertaan dan kasih karunia-Nya, sehingga penulisdapat menyelesaikan skripsi
yang berjudul “Validasi Metode Analisis Residu Azoxystrobin dalam Buah
Melon (Cucumis melo L.) ” dengan baik. Skripsi ini disusun untuk memenuhi
persyaratan memperoleh gelar Sarjana Strata Satu Program Studi Farmasi
Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.
Keberhasilan dalam menyelesaikan skripsi ini tidak terlepas dari berbagai
pihak yang selalu mendukung pada proses penyusunan skripsi ini. Maka dalam
kesempatan ini dengan kerendahan hati saya mengucapkan terimakasih kepada :
1. Ibu Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt., selaku dosen pembimbing yang amat luar
biasa, yang dengan sabar telah membimbing kami, memberikan saran,
pengarahan, kritikan dan semangat dari awal, selama berproses hingga
terselesaikannya skripsi ini.
2. Bapak Sanjayadi, M.Si. yang ikut berperan dalam penentuan kondisi
optimum sistem GC-ECD dalam menganalisis residu azoxysstrobin dalam
buah melon serta selaku ‘pembimbing hati nurani’ yang telah meluangkan
waktu, tenaga dan fikiran untuk membantu menyelesaikannya skripsi ini serta
selalu memberikan motivasi hidup untuk menjadi orang yang lebih baik
disetiap harinya.
3. Ibu Aris Widayati, M.Si., Apt., PhD selaku Dekan Fakultas Farmasi Sanata
Dharma Yogyakarta.
vii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
4. Bapak Jeffry Julianus, M.Si selaku dosen penguji atas semua saran, kritik dan
bimbingannya.
5. Bapak F. Dika Octa Riswanto, M.Sc. selaku dosen penguji atas semua saran,
kritik dan bimbingannya.
6. Ibu Agustina Setyawati M.Sc. Apt., selaku kepala laboratorium yang telah
memberikan izin menggunakan laboratorium selama proses penulisan
7. Ayah & Ibu ku tersayang, adik tercinta Herlin Indah Noviandika yang selalu
sabar menanti penulis dalam menyelesaikan skripsi ini.
8. Almarhum Mbah Mo dan Mbah Harjo yang sangat ku sayang, beserta seluruh
keluarga yang tidak dapat saya sebutkan satu-persatu terimakasih atas kasih
sayang, semangat dan doa untuk penulis.
9. Teman-teman seperjuangan geng melon Florentina Silviana Devi, Serlika
Rostiana dan Rushadi Jatmiko atas kebersamaan dan kerjasamanya dalam
menjalani jatuh bangunnya skripsi ini.
10. Tidar Pangestu sosok penyemangat dalam mewujudkan harapan atau impian,
dan sosok yang selalu menenangkan fikiran penulis mulai dari berawalnya
skripsi ini hingga terselesaikannya skripsi ini.
11. Anak-anak ‘Alumnus Kost Putri Ayu‘ Vivin, Tata, Kristrin, Mela, Lia, Indah,
Betrik dan Iyah, yang bersama dengan kalian penulistidak merasa sendirian di
Sanata Dharma, karena sudah 4 tahun kita bersama layaknya sebuah keluarga.
12. Fajar Risda Astuti, Margareta Tri Nova, Wirna Niki Suprobo, yang selalu
memberikan dukungan dan semangat di saat penulis lelah dan jenuh dalam
mengerjakan skripsi.
viii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
13. Teman yang jauh dimata tapi dekat di hati Nuriyati, Sekar Permata Sari, Rina
Setyaningrum terimakasih atas semua kecerewetan yang masih terngiang
sampai saat ini, semua itu membangun diri saya menjadi lebih baik.
14. Teman-teman seperjuangan dilantai 4; Teresa Devina, Sophia Sari, Yolanda,
Adit makasih atas canda tawa kalian yang menghidupkan suasana penat kami
disetiap pagi hingga sore.
15. Teman-teman satu keluarga bimbingan Ibu Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt.,
Verni, Shiro, Canly, Erita, Yolanda, Adit, Yolana, Eva dan Meli atas bantuan
dan dukungan dalam terselesaikannya skripsi ini.
16. Mas Bimo, Pak Parlan, Pak Kunto, Pak Kethul, Pak Mus dan seluruh staf
laboratorium Fakultas Farmasi serta Staf Keamanan dan Kebersihan
Universitas Sanata Dharma Yogyakarta atas canda tawanya, kerjasama dan
bantuannya selama ini.
17. Seluruh dosen, laboran, karyawan dan teman-teman angkatan 2011 yang
sudah membantu dan mendukung dalam proses perkuliahan maupun
praktikum selama ini.
18. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu dalam proses
perkuliahan dan penyusunan skripsi.
Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan
sehingga segala bentuk masukan, kritik dan saran yang bersifat membangun
sangat penulis harapkan. Penulis juga berharap kiranya karya tulis ilmiah ini dapat
bermanfaat bagi pembaca sekalian. Salam sehat sejahtera, terima kasih.
Penulis
ix
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ............................................................................................ i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................................. ii
HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................ iii
HALAMAN PERSEMBAHAN ....................................................................... iv
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ............................................................. v
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI............................. vi
PRAKATA ........................................................................................................ vii
DAFTAR ISI ...................................................................................................... x
DAFTAR TABEL ........................................................................................... xiv
DAFTAR GAMBAR ....................................................................................... xv
DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................... xvi
INTISARI ....................................................................................................... xvii
ABSTRACT ................................................................................................... xviii
BAB I. PENGANTAR ....................................................................................... 1
A. Latar Belakang . ............................................................................................. 1
1. Permasalahan ............................................................................................. 5
2. Keaslian Penelitian ..................................................................................... 5
3. Manfaat Penelitian ...................................................................................... 5
B. Tujuan Penelitian ........................................................................................... 6
BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA................................................................. 8
A. Fungisida ........................................................................................................ 8
1. Pengertian Fungisida ................................................................................. 8
2. Efek Buruk Fungisida ............................................................................... 9
3. Fungisida Sistemik .................................................................................. 11
B. Azoxystrobin ................................................................................................ 13
1. Mekanisme Aksi Azoxystrobin ............................................................... 13
2. Sifat Fisika Kimia Azoxystrobin ............................................................. 14
C. Buah Melon .................................................................................................. 15
x
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
1. Pengertian Melon ..................................................................................... 15
2. Taksonomi Tanaman Melon .................................................................... 15
3. Kandungan Buah Melon .......................................................................... 16
D. Ekstraksi ....................................................................................................... 16
1. Pengertian dan Prinsip Ekstraksi ............................................................. 19
2. Pemilihan Pelarut ..................................................................................... 19
E. Sentrifugasi .................................................................................................. 20
F. Solid Phase Extraction (SPE) ....................................................................... 21
G. Kromatografi Gas ......................................................................................... 23
1. Pengertian ................................................................................................ 23
2. Prinsip Pemisahan ................................................................................... 24
3. Performance GC ...................................................................................... 26
4. Instrumentasi............................................................................................ 27
H. Metode Kuantifikasi .................................................................................... 33
1. Metode Standar Eksternal ........................................................................ 34
2. Metode Standar Internal .......................................................................... 34
3. Metode Standar Adisi .............................................................................. 35
I. Validasi Metode Analisis ............................................................................ 35
1. Akurasi .................................................................................................... 36
2. Presisi ....................................................................................................... 36
3. Linearitas dan Rentang ........................................................................... 36
4. Limit of Quantitation (LOQ) .................................................................. 37
J. Landasan Teori ............................................................................................. 37
K. Hipotesis ..................................................................................................... 38
BAB III. METODE PENELITIAN................................................................... 39
A. Jenis dan Rancangan Penelitian .................................................................. 39
B. Variabel Penelitian ...................................................................................... 39
1. Variabel Bebas ...................................................................................... 39
2. Variabel Tergantung ............................................................................... 39
3. Variabel Pengacau Terkendali ................................................................ 39
C. Definisi Operasional ..................................................................................... 40
xi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
D. Bahan Penelitian .......................................................................................... 41
E. Alat Penelitian ............................................................................................. 41
F. Tata Cara Penelitian ................................................................................... 41
1. Prosedur Pencucian Alat-alat Gelas .................................................... 42
2. Pembuatan Larutan Stok Azoxystrobin dan DCB ............................... 42
3. Pembuatan Larutan Intermediet Azoxystrobin ................................... 42
4. Uji Kesesuaian Sistem GC-ECD ........................................................ 43
5. Preparasi Sampel Melon .................................................................... 46
6. Optimasi Clean-up Menggunakan SPE C18 ....................................... 46
7. Validasi Metoe Analisis Residu Azoxystrobin dalam Buah
Melon .................................................................................................. 50
G. Analisis Hasil .............................................................................................. 50
1. Analisis Kualitatif GC-ECD ............................................................... 51
2. Analisis Kuantitatif GC-ECD ............................................................. 52
3. Pengukuran Kadar Air dalam Sampel Melon .................................... 53
4. Validasi Metode Analisis Residu Azoxystrobin dalam Buah
Melon ................................................................................................. 54
H. Rancangan Penelitian .................................................................................. 55
1. Optimasi Washing SPE ....................................................................... 55
2. Fraksinasi Metanol untuk Menarik Analit .......................................... 57
3. Validasi Metode Analisis .................................................................... 59
4. Preparasi Sampel Buah Melon ............................................................ 60
5. Uji Kelayakan SPE ............................................................................. 62
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ......................................................... 64
A. Uji Kesesuaian Sistem GC-ECD untuk Menganalisis
Azoxystrobin ................................................................................................. 66
1. Optimasi Sistem GC-ECD ................................................................. 66
2. Kinerja Kualitatif GC-ECD ................................................................ 67
3. Kinerja Kuantitatif GC-ECD .............................................................. 69
B. Preparasi Sampel Melon .............................................................................. 73
1. Homogenisasi ...................................................................................... 73
xii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2. Ekstraksi dengan Metode QuEChERS ................................................ 74
3. Optimasi Clean-up .............................................................................. 78
C. Validasi Metode Analisis ............................................................................. 82
1. Kinerja GC-ECD dalam Mendeteksi Azoxystrobin pada
Matriks Ekstrak Melon Bersih (Jalur C) ............................................. 83
2. Kinerja Clean-up dengan Kolom SPE C18 (Jalur B) .......................... 87
3. Akurasi dan Presisi Metode Analisis Teroptimasi (Jalur A) .............. 89
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ........................................................... 94
A. Kesimpulan .................................................................................................. 94
B. Saran ............................................................................................................ 95
DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................... 96
LAMPIRAN .................................................................................................... 100
BIOGRAFI PENULIS ................................................................................... 114
xiii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel I. Sifat Fisika Kimia Azoxystrobin ...................................................... 14
Tabel II. Kandungan Buah Melon ................................................................. 16
Tabel III. Kriteria % RSD Validasi Metode Analisis ...................................... 52
Tabel IV. Hasil Optimasi GC-ECD Sanjayadi (2014) ..................................... 66
Tabel V. Hasil Performance GC-ECD ........................................................... 68
Tabel VI. Hasil Keajegan Sistem GC-ECD ..................................................... 68
Tabel VII. Hasil %RSD RF Analisis Kuantitatif GC-ECD ............................... 69
Tabel VIII. Hasil Uji Sensitivitas GC-ECD .................................................... 71
Tabel IX. Hasil % D Analisis Kuantitatif GC-ECD ..................................... 73
Tabel X. Kadar Air dalam Buah Melon .......................................................... 74
Tabel XI. Hasil Optimasi Clean-up ................................................................. 78
Tabel XII. Hasil Presisi dan Akurasi Kelayakan SPE ....................................... 80
Tabel XIII. Kinerja GC ECD dalam Mendeteksi Azoxystrobin
dalam Buah Melon ........................................................................... 84
Tabel XIV. Hasil Presisi Jalur C ......................................................................... 85
Tabel XV. Hasil Akurasi Jalur C ....................................................................... 85
Tabel XVI. Hasil % D Jalur C ............................................................................ 86
Tabel XVII. Hasil Presisi Jalur B ......................................................................... 86
Tabel XVIII. Hasil Akurasi Jalur B ....................................................................... 86
Tabel XIX Hasil % D Jalur B ........................................................................... 85
Tabel XX Hasil Presisi Kurva Adisi ................................................................. 90
Tabel XXI. Hasil Akurasi Kurva Adisi ............................................................... 91
Tabel XXII Hasil % D Validasi Metode Analisis ............................................... 92
xiv
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Stuktur Azoxystrobin ................................................................... 13
Gambar 2. Kandungan Buah Melon .............................................................. 16
Gambar 3. Tahapan SPE ............................................................................... 23
Gambar 4. Diagram Skematik Kromatografi Gas ......................................... 27
Gambar 5. Gas yang Digunakan dalam Kromatografi Gas .......................... 28
Gambar 6. Pemisahan Standar Internal, Difenoconazole
dan Azoxystrobin .......................................................................... 67
Gambar 7. Kurva Hubungan Kadar Azoxystrobin Vs Rasio AUC Azoxystrobin/DCB ................................................................... 70
Gambar 8. Pengaruh Ph Terhadap Jumlah Co-Extractant ............................ 75
Gambar 9. Hasil Optimasi Lama Waktu Sentrifugasi ................................... 77
Gambar 10. Jenis-jenis SPE dan Kapasitasnya................................................ 79
Gambar 11. Hasil Eluat Metanol Setelah Washing 5% Metanol dan 100%
Aquabidest ................................................................................... 80
Gambar 12. Hasil Tampungan Washing Menggunakan 100% Aquabidest ..... 81
Gambar 13. Fraksinasi Elusi Metanol untuk Menarik Analit .......................... 81
Gambar 14. Blangko Matriks Melon (a) dan Blanko yang
Diadisi Standar Azoxystrobin (b) ................................................. 83
Gambar 15. Kurva Baku vs Kurva Adisi C ..................................................... 86
Gambar 16. Kurva Baku vs Kurva Adisi B ..................................................... 88
Gambar 17. Linearitas Kurva Baku Adisi ....................................................... 89
Gambar 18. Kurva Baku vs Kurva Adisi A ..................................................... 91
xv
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Daftar Lampiran
Halaman
Lampiran 1. Perhitungan Sensitivitas Alat .................................................. 101
Lampiran 2. Kurva Adisi Azoxystrobin pada Sampel Buah Melon ............ 103
Lampiran 3. Perhitungan Resolusi (Rs) dan Resolusi DCB ........................ 104
Lampiran 4. Certificate of Anaylisis DCB ................................................... 105
Lampiran 5. Certificate of Anaylisis NaCl ................................................... 106
Lampiran 6. Certificate of Anaylisis MgSO4 ............................................... 107
Lampiran 7. Certificate of Anaylisis Na2HCitr ............................................ 108
Lampiran 8. Certificate of Anaylisis Na3Citr ............................................... 109
Lampiran 9. Certificate of Anaylisis Acetonitrile ........................................ 110
Lampiran 10. Certificate of Anaylisis Hexane ............................................... 111
Lampiran 11. Certificate of Anaylisis Methanol ............................................ 112
Lampiran 12. Certificate of Analysis Azoxystrobin Donasi
dari PT Syngenta ..................................................................... 113
xvi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
INTISARI
Indonesia yang berada dalam iklim tropis dengan suhu dan kelembaban yang mendukung penyebaran dari penyakit anthracnose (Colletotrichum gloesporioides) menyebabkan kerusakan yang signifikan terhadap tanaman melon (Cucumis melo L.). Pengontrolan penyakit anthracnose oleh para petani dilakukan dengan menggunakan Azoxystrobin (methyl(E)-2-{2-[6-(2-cyanophenoxy) pyrimidin-4-yloxy]phenyl}-3-methoxyacrylate). Berdasarkan alasan tersebut, untuk memastikan keamanan konsumen, jumlah residu Azoxystrobin dalam buah melon harus dipantau. Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan suatu metode analisis yang valid dalam penetapan kadar residu Azoxystrobin dalam buah melon yang dapat dilakukan di laboratorium pestisida di Indonesia.
Prosedur baku dalam analisis residu azoxystrobin menggunakan cara ekstraksi dan clean-up QuEChERS diikuti dengan penetapan kadar LC/MS/MS. Dalam penelitian ini dilakukan modifikasi clean-up dengan kolom SPE C18 agar dapat di deteksi dengan GC-ECD, oleh karena itu harus dilakukan validasi penuh. Uji kesesuaian instrumen pada kondisi GC yang optimum menunjukkan efisiensi, kesetimbangan sistem dan selektivitas yang bagus, % RSD ratio area dan tR, RF dan rata-rata %D <20%, linearitas 0,9913-0,9997 pada kisaran linearitas 0,0456 ng - 0,912 ng, dengan IDL 0,003 µg/ml – 0,01 µg/ml dan IQL 0,047 µg/ml.
Validasi metode analisis dilakukan pada sampel blanko dan sampel yang di fortifikasi. Recovery fortifikasi 0,137-0,730 ng pada ekstrak sampel blanko sebelum di injeksikan ke GC-ECD 93-117% dan kesalahan determinasi sebesar 3,8%, sedangkan fortifikasi sebelum clean-up dengan kolom SPE C18 sebesar 84-107%, dan kesalahan clean-up 3,1%. Recovery fortifikasi 0,091 ng – 0,684 ng pada buah melon berkisar antara 84-119% dan kesalahan ekstraksi sebesar 9,1%. Linearity range 0,002 µg/g – 0,014 µg/g dengan LOQ 0,0008 µg/g dan LLMV sebesar 0,005 µg/g. Dengan demikian validasi metode ini memenuhi persyaratan untuk memantau kadar Azoxystrobin dalam buah melon dibawah positif list sebesar 0,01 µg/g.
Kata kunci : azoxystrobin, melon, QuEChERS, SPE C18, GC-ECD, validasi
metode
xvii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ABSTRACT
Indonesian tropical climate which is warm and humid promote the development and spread of anthracnose (Colletotrichum gloesporioides) causing significant damage in melon (Cucumis melo L.). To control the anthracnose, farmers used Azoxystrobin (methyl (E)-2-{2-[6-(2-cyanophenoxy)pyrimidin-4-yloxy]phenyl}-3-methoxyacrylate). For that reason, to assure the safety of the consumer, the level of Azoxystrobin residue in melon should be monitored. The purpose of this study is to develop a valid analytical method for Azoxystrobin residue in melon which can be done in common pesticide residue laboratory in Indonesia.
The extraction process of the developed method was done following the assisted LLE method of QuEChERS, while the clean up process was done using C18 SPE catridge and determined by GC-ECD and quantified by internal standardization using decachlorobiphenyl (DCB) as internal standard. The performance of GC-ECD shows precision of ratio area, retention time less than 20%, while. the standard integrity shows % RSD of response factor and % difference < 20%. Linearity range was 0.0456 ng – 0.912 ng with r value 0.9913-0.9997. Range of Instrumental Detection Limit (IDL) was 0.003 µg/ml- 0.01 µg/ml and Instrumental Quantitation Limit (IQL) was 0.047 µg/mL. Recovery of fortified blank extract at 0.14 - 0.73 ng was 93-117% and no matrix effect was observed. The error at extraction step, clean up step and determination step were 9.1%, 3.1%, and 3.8% respectively. The recovery of fortified sample at 0.09 ng – 0.68 ng was 84-119%. The LOQ was 0.0008 µg/g and the LLMV 0.005 µg/g, therefore this method is fit for monitoring Azoxystrobin in melon, which has a positive list of 0.01 mg/kg.
Keywords: azoxystrobin, melon, QuEChERS, SPE C18, GC-ECD, method validation
xviii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
BAB I
PENGANTAR
A. Latar Belakang
Bidang pertanian saat ini berkembang semakin pesat dengan adanya
banyak penelitian serta usaha yang dilakukan untuk mendapatkan produk-produk
pertanian yang melimpah, berkualitas dan unggul. Produk pertanian di Indonesia
yang semakin meningkat daya tariknya adalah melon (Cucumis melo L.) (Nuryanto,
2000).
Indonesian Tropical Fruit Festival yang digelar di Expo Shanghai pada 1
Oktober 2010 lalu, telah menghadirkan beragam buah-buahan tropis asal
Indonesia yang unik dan eksotis. Keadaan lingkungan Indonesia yang unik,
mempunyai potensi besar dalam produk buah-buahan eksotis salah satunya adalah
buah melon. Menteri Pertanian mengatakan bahwa agrobisnis Indonesia dengan
keunikan produknya mempunyai potensi yang sangat besar untuk menembus
pasar Tiongkok atau ekspor ke negara-negara lain (CRI, 2010).
Berdasarkan Dirjen Budidaya dan Pascapanen Buah Ditjen Hortikultura
Kementerian Pertanian, (2012) Indonesia saat ini hanya mampu mengekspor buah
melon setiap satu bulan sekali, hal ini dikarenakan pasokan melon yang belum
mencukupi pasar dalam negeri karena semakin meningkatnya permintaan di
dalam negeri. Oleh sebab itulah ketersediaan buah melon perlu untuk ditingkatkan
guna memenuhi permintaan pasar baik dalam negeri maupun luar negeri.
1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2
Tanaman melon tidak terlepas dari adanya kendala serangan jamur yang
menyebabkan melon cepat membusuk. Serangan jamur yang berat dapat
menurunkan produktivitas tanaman atau bahkan menyebabkan kegagalan panen,
oleh karena itu usaha pengendalian dan pemberantasan hama dan penyakit harus
mendapatkan perhatian secara khusus (Samadi, 2007). Jules (2012) menyatakan
bahwa melon dan semangka merupakan tanaman jenis cucurbitaceae yang sering
terkena penyakit jamur. Kondisi iklim Indonesia yang berada di daerah tropis
menjadi faktor tumbuhnya penyakit jamur dengan baik. Kelembaban yang tinggi
menjadi pemicu tingginya penyakit jamur di Indonesia. Salah satu jenis jamur
yang sering menyerang tanaman buah melon adalah anthracnose. Kondisi inilah
yang menyebabkan kurangnya penyediaan buah melon. Tidak jarang kita temukan
penggunaan fungisida yang berlebihan guna memberantas penyakit jamur
tersebut. Hal inilah yang menjadi poin penting bagi Indonesia agar saat buah
tersebut berada di pasar dalam negeri maupun saat di ekspor, telah memenuhi
persyaratan keamanan bagi konsumen.
Pestisida secara harfiah berarti hama (pest: hama dan cide: membunuh).
Pestisida sebenarnya telah lama digunakan orang sebagai bahan pembunuh hama
atau sebagai pelindung tanaman. Mengingat peranannya yang sangat besar,
perdagangan pestisida dewasa ini semakin ramai. Berdasarkan data pencatatan
dari Badan Proteksi Lingkungan Amerika Serikat, saat ini lebih dari 2.600 bahan
aktif pestisida yang beredar di pasaran (Sudarmo, 1991). Pestisida memiliki
berbagai dampak bagi keselamatan pengguna, konsumen dan cemaran lingkungan
(Djojosumarto, 2008).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
3
Beberapa produk fungisida yang baru gencar di pasaran menonjolkan
kombinasi antara zat aktif azoxystrobin dengan difenoconazole, fenpropimorph,
cyproconazole, propiconazole, maupun chlorothalonil dengan pesentase yang
berbeda-beda. Produk ini untuk mengatasi penyakit jamur yang menyerang
tanaman melon. Aksi kerja dari azoxystrobin ini adalah menginhibisi respirasi
mitokondrial di dalam jamur (Mastovska, 2008). Fungisida yang populer
digunakan oleh petani saat ini adalah AMISTARTOP yang mengandung
azoxystrobin 200 g/L dan difenoconazole 125 g/L. Penggunaannya menurut
INDOGAP sesuai label adalah maksimum tiga kali aplikasi dengan konsentrasi
0,5 mL/L.
Berdasarkan standar prosedur operasional Syngenta RAM 305/03,
mendiskripsikan secara garis besar bahwa determinasi residu pestisida dilakukan
dengan cara mengekstraksi sampel dengan asetonitril:air secara LLE kemudian
dilakukan sentrifugasi dan clean-up menggunakan SPE (Solid Phase Extraction)
C18 dan final determinasi menggunakan high performance liquid chromatography
dengan triple quadrupole mass spectrometer (LC-MS/MS) (RAM 305/03, 2004).
AOAC Official Method 2007 menyatakan bahwa cara menganalisis
residu pestisida dengan menggunakan metode ekstraksi single-step buffered
asetonitril (MeCN) dan clean-up menggunakan dispersive-solid-phase extraction
(dispersive-SPE) yang berkombinasi dengan Primary Secondary Amine (PSA)
sorbent dan MgSO4. Kemudian dianalisis menggunakan mass spectrometry (MS)
setelah dipisahkan menggunakan kromatografi (AOAC, 2007).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
4
Metode European menggunakan sodium chloride untuk mengurangi
interfensi dari senyawa polar dan menggunakan buffer asam sitrat untuk
mengawetkan analit yang sensitif terhadap basa. Ekstraksi pada metode ini
menggunakan magnesium sulfate anhydrous, sodium chloride, sodium citrate
tribasic dihydrate dan sodium citrate dibasic sesquihydrate yang kemudian
menggunakan sentrifuge dan clean-up menggunakan PSA, MgSO4 dan GCB.
Analisis menggunakan GC-MS atau LC-MS/MS dalam 5% formic acid dalam
asetonitril (Anonim1).
Beberapa metode QuEChERS yang disajikan diatas di determinasi
menggunakan instrumen yang selektif dan spesifik dengan menggunakan GC-
MS/MS atau LC-MS/MS. Keterbatasan GC-MS/MS atau LC-MS/MS di
laboratorium Indonesia, memotivasi peneliti untuk mengembangkan metode
analisis residu azoxystrobin pada matriks buah melon yang memang belum
tersedia di Indonesia agar tetap dapat memantau keamanan menggunakan GC-
ECD yang lebih mudah ditemukan di laboratorium Indonesia. GC-ECD yang
kurang selektif jika dibandingkan dengan GC-MS/MS atau LC-MS/MS
mengakibatkan perlunya dilakukan pengembangan metode QuEChERS dan
clean-up yang sesuai dengan menggunakan Sholid Phase Extraction (SPE) C18.
Melalui kesetimbangan yang berulang di dalam kolom diharapkan hasil ekstraksi
yang diperoleh akan menjadi lebih bersih sehingga mampu dideterminasi dengan
GC-ECD. Validasi yang dilakukan meliputi akurasi, presisi, linearitas, kisaran/
range linearitas. limit of detection (LOD), dan limit of quantification (LOQ).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
5
Oleh sebab itulah peneliti bermaksud untuk menetapkan sebuah metode
yang valid dalam mendeteksi baik secara kualitatif maupun kuantitatif kadar
residu fungisida azoxystrobin dalam buah melon setelah pengaplikasian saat
budidaya agar tidak melebihi kadar maksimum yang diperbolehkan guna
melindungi kesehatan konsumen dalam negeri dan luar negeri karena Maximum
Residue Limit (MRL) atau Batas Maksimum Residu (BMR) azoxystrobin dalam
buah melon yang belum tercantum dalam codex.
1. Permasalahan
Berdasarkan latar belakang tersebut, maka dirumuskan permasalahan
penelitian sebagai berikut :
a. Bagaimana pengembangan metode QuEChERS dalam analisis penetapan
kadar residu fungisida azoxystrobin dalam buah melon hingga didapatkan
hasil yang valid?
b. Bagaimana validasi metode analisis pengukuran residu fungisida
azoxystrobin dalam kulit dan daging buah melon dengan menggunakan
instrumen GC-ECD?
2. Keaslian Penelitian
Berdasarkan penelusuran literatur yang dilakukan, belum pernah ada
penelitian mengenai “Validasi Metode Analisis Residu Azoxystrobin dalam Buah
Melon (Cucumis melo L).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
6
3. Manfaat Penelitian
a. Manfaat metodologis. Penelitian ini dapat memberikan tambahan
pengetahuan terhadap perkembangan metode QuEChERS dalam analisis residu
fungisida azoxystrobin dengan menggunakan Gas Chromatography Electron
Capture Detector pada sampel buah melon.
b. Manfaat praktis. Penelitian ini dapat digunakan sebagai prosedur
analisis penetapan kadar residu fungisida azoxystrobin dalam buah melon dengan
hasil yang akurat dengan menggunakan Gas Chromatography Electron Capture
Detector (GC-ECD).
B. Tujuan Penelitian
1. Tujuan umum dari penelitian
a. Dapat mengembangkan metode QuEChERS dalam analisis penetapan kadar
residu fungisida Azoxystrobin dalam buah melon hingga didapatkan hasil yang
valid.
b. Mampu melakukan validasi metode analisis residu fungisida Azoxystrobin pada
buah melon (Cucumis melo L.) dengan instrumen Gas Chromatography
Electron Capture Detector (GC-ECD).
2. Tujuan khusus penelitian
a. Mengetahui proses ekstraksi QuEChERS serta pelarut yang cocok untuk
menyari azoxystrobin dari buah melon (Cucumis melo L.)
b. Mendapatkan proses clean-up yang optimum menggunakan SPE C18.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
7
c. Mampu menetapkan kadar residu fungisida azoxystrobin dengan kondisi Gas
Chromatography Electron Capture Detector (GC-ECD) yang optimal.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Fungisida
1. Pengertian Fungisida
Fungisida merupakan bahan kimia yang digunakan untuk mengontrol
penyakit tanaman yang disebabkan oleh jamur. Jamur merupakan tanaman tidak
berklorofil. Mereka bersifat parasit untuk tanaman lainnya (Burton, 2010).
Fungisida azoxystrobin memiliki sifat sebagai protective fungicide dan
curative fungicide yang dapat digunakan pada daun, biji atau perawatan tanah.
Azoxystrobin sama efektifnya dengan atau lebih dari standar industri mancozeb
(Martha, 2012).
Berdasarkan SK Menteri Pertanian RI Nomor 434.1/Kpts/TP.270/7/2001,
tentang Syarat dan Tata Cara Pendaftaran Pestisida, yang dimaksud dengan
pestisida adalah semua zat kimia dan bahan lain serta jasad renik dan virus yang
dipergunakan untuk :
a. Memberantas atau mencegah hama-hama dan penyakit-penyakit yang
merusak tanaman, bagian-bagian tanaman atau hasil-hasil pertanian.
b. Memberantas rerumputan.
c. Mematikan daun dan mencegah pertumbuhan yang tidak diinginkan.
d. Mengatur dan merangsang pertumbuhan tanaman atau bagian-bagian
tanaman tidak termasuk pupuk.
8
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
9
e. Memberantas atau mencegah hama-hama luar pada hewan-hewan piaraan dan
ternak.
f. Memberantas atau mencegah hama-hama air.
g. Memberantas atau mencegah binatang-binatang dan jasad-jasad renik dalam
rumah tangga, bangunan dan dalam alat-atat pengangkutan.
h. Memberantas atau mencegah binatang-binatang yang dapat menyebabkan
penyakit pada manusia atau binatang yang perlu dilindungi dengan
penggunaan pada tanaman, tanah atau air (Djojosumarto, 2008).
Menurut The United States Environmental Control Act pestisida
didefinisikan sebagai berikut.
a. Pestisida merupakan semua zat atau campuran zat yang khusus digunakan
untuk mengendalikan, mencegah, atau menangkis gangguan serangga,
binatang pengerat, nematode, gulma, virus, bakteri, atau jasad renik lain yang
terdapat pada hewan dan manusia.
b. Pestisida merupakan semua zat atau campuran zat yang digunakan untuk
mengatur pertumbuhan atau mengeringkan tanaman (Djojosumarto, 2008).
2. Efek Buruk Fungisida
Beberapa fungisida mengandung logam berat dalam struktur kimianya.
Apabila dipakai secara membabi buta, fungisida ini menimbulkan pencemaran
lingkungan oleh logam-logam berat yang terkandung dalam fungisida tersebut
(Sumardjo, 2009).
Masalah utama yang sering ditimbulkan oleh pestisida ini adalah sifat
racunnya yang dapat mengenai manusia, hewan piaraan, serangga penyerbuk,
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
10
musuh alami hama dan tanaman serta dapat mencemari lingkungan. Bahkan
penggunaan pestisida dengan dosis yang tidak tepat dapat menyebabkan hama
menjadi kebal atau resisten (Wudianto, 1992).
Beberapa paparan yang kemungkinan terjadi meliputi:
a. Pengaruh terhadap lingkungan. Fungisida mengandung racun yang
disamping dapat mengendalikan jamur juga mempunyai pengaruh racun terhadap
lingkungan. Tiap jenis fungisida mempunyai pengaruh yang berbeda terhadap
lingkungan. Pengaruh terhadap lingkungan tergantung dari daya racun (toksisitas),
cara dan kekerapan aplikasi, serta persistensi (Sumardiyono, 2013).
Dalam praktik penyemprotan tanaman dengan fungisida, sebagian
fungisida ada yang jatuh ke atas tanah sekitar tanaman. Hal ini menyebabkan
tanah sekitar tanaman terpapar fungisida, sehingga dapat mempengaruhi kualitas
air tanah yang berbahaya bagi kesehatan manusia. Pada keadaan cuaca yang
beranging kencang, sebagian bahan semprot akan memberikan drift (cipratan) ke
tempat bukan sasaran yang dapat menyebabkan pencemaran lingkungan berupa
kontaminasi akibat cipratan misalnya akan mencemari sekitar lahan pertanian.
Kontaminasi pada lingkungan juga terjadi akibat dari pencucian alat semprot
setelah aplikasi. Pencucian sprayer tidak boleh dilakukan pada saluran air irigasi,
sungai kecil atau sumber air lain. Pencucian dilakukan dengan sisa dibuang jauh
dari pemukiman atau tempat bermain anak-anak (Sumardiyono, 2013).
b. Pengaruh terhadap organisme tanah. Pestisida yang persisten termasuk
didalamnya fungisida yang persisten, sangat berbahaya bagi tanah dan air tanah.
Klasifikasi pestisida yang berbahaya di dalam tanah didasarkan atas
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
11
persistensinya. Makin persisten suatu pestisida, maka semakin berbahaya.
Umumnya fungisida tidak berbahaya, kecuali PCP dan golongan merkuri
(Sumardiyono, 2013).
c. Pengaruh terhadap manusia. Pengaruh terhadap manusia dapat bersifat
langsung atau tidak langsung. Bersifat langsung adalah pengaruh terhadap
kesehatan pekerja. Para pekerja dan pemakai fungisida tentu akan terpapar
fungisida sewaktu melakukan aplikasi. Bila fungisida yang diaplikasikan berdaya
racun tinggi, akibat terhadap para pekerja menjadi sangat berbahaya. Para pekerja
akan terpapar fungisida melalui udara yang terhirup karena sebagian bahan yang
disemprotkan akan terbawa angin dan masuk ke dalam saluran pernafasan. Para
pekerja juga rentan terpapar fungisida bila terjadi kecelakaan atau tumpahan yang
mengenai tangan atau kulit (Sumardiyono, 2013).
Secara tidak langsung, manusia mendapatkan kontaminasi fungisida
melalui makanan yang kita makan. Manusia mengkonsumsi daging, ikan, sayur,
beras, atau produk-produk pertanian yang lain. Bila produk tersebut mengandung
residu pestisida maka manusialah yang akan mendapatkan residu yang paling
banyak (Sumardiyono, 2013).
3. Fungisida Sistemik
Fungisida sistemik adalah fungisida yang dapat masuk melewati kutikula
dan terserap oleh tanaman, bersifat mobile (bergerak) atau ditranslokasikan dari
tempat aplikasi ke bagian tanaman yang lain, atau bergerak dari akar melalui
xilem ke daun. Fungisida sistemik dapat diaplikasikan sebagai fungisida protektan
atau terapeutan. Fungisida jenis ini berfungsi mencegah perkembangan penyakit
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
12
sehingga dapat menyembuhkan (cure) tanaman yang sudah sakit atau
menghambat perkembangan penyakit atau disebut juga fungisida kemoterapeutan.
Fungisida sistemik yang baik harus memenuhi beberapa kriteria :
a. Senyawa tersebut harus bersifat fungisidal atau dapat diubah menjadi
senyawa yang beracun dalam tanaman.
b. Senyawa tersebut harus mempunyai fitotoksisitas yang sangat rendah karena
terserap oleh tanaman.
c. Senyawa tersebut harus dapat terserap oleh akar, daun atau biji sebelum dapat
ditranslokasikan ke bagian tanaman yang lain (Sumardiyono, 2013).
Fungisida sistemik dapat diaplikasikan dengan cara perlakuan benih,
penyuntikan batang, penyemprotan pada permukaan tanaman, pembasahan tanah
sekitar perakaran. Setelah perlakuan dengan fungisida ini akan terjadi penetrasi ke
dalam jaringan tanaman, kemudia di translokasikan ke bagian tanaman yang lain.
Fungisida sistemik bekerja sampai jarak yang jauh dari tempat aplikasi
dan dapat menyembuhkan tanaman yang sudah sakit. Fungisida sitemik bekerja
bersama dengan proses metabolisme tanaman. Fungisida sistemik hanya bekerja
pada satu tempat dari bagian sel jamur, sehingga disebut mempunyai cara kerja
single site action atau spesifik. Jenis-jenis fungisida sistemik diantaranya
golongan oksatin, metalaksil, benzimidazol, fosfat organik, pirimidin, triazol dan
strobilurin (Sumardiyono, 2013).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
13
B. Azoxystrobin
1. Mekanisme Aksi Azoxystrobin
Azoxystrobin (Methyl (E) – 2 - { 2[ 6 - ( 2 – cyanophenoxy ) pyrimidin –
4 –yloxy ]phenyl } – 3 - methoxyacrylate) merupakan fungisida turunan strobulin
yang bekerja secara sistemik dan termasuk dalam golongan methoxyacrylates.
Mekanisme aksi azoxystrobin adalah menginhibisi respirasi mitokondria jamur.
Azoxystrobin memiliki stuktur seperti Gambar 1.
Gambar 1. Stuktur Azoxystrobin (Mastovska, 2008)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
14
2. Sifat Fisika Kimia Azoxystrobin
Sifat fisika kimia senyawa azoxystrobin dapat dilihat dalam tabel berikut:
Tabel 1. Sifat Fisika Kimia Azoxystrobin
Nama umum Azoxystrobin Nama kimia (IUPAC) Methyl (E)-2-{2 [6-(2-
cyanophenoxy)pyrimidin-4-yloxy]phenyl}-3- Methoxyacrylate
Nama kimia (CA) Methyl (E)-2-[[6-(2-cyanophenoxy)-4-pyrimidinyl]oxy]-α- (methoxymethylene)benzeneacetate
Rumus molekul C22H17N3O5 Bobot molekul 403,4 g/mol Pemerian Serbuk putih, tidak berbau Tekanan uap pada 20°C 1,1 x 10-10 Pa Titik lebur 116°C Koefisien partisi Log Pow = 2,5 ( 20°C, pH 7) Kelarutan dalam air 20°C 6 mg/L pada purified water Berat jenis 1,34 g/cm3
Volatilitas Henry’s Law constant = 7,3 x 10-9 Pa m3/mol
Kelarutan di air 20°C 6,7 mg/L pada buffer pH 5,2 6,7 mg/L pada buffer pH 7 5,9 mg/L pada buffer pH 9,2
Kelarutan pada pelarut organic 20°C
Hexane = 0,057 g/L Octanol = 1,4 g/L Metanol = 20 g/L Toluene = 55 g/L Acetone = 86 g/L Ethyl acetate = 130 g/L Asetonitril = 340 g/L Dicholomethane = 400 g/L
(Mastovska, 2008)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
15
C. Buah Melon
1. Pengertian Melon
Melon merupakan tanaman semusim yang tumbuh menjalar, berbatang
lunak, dari setiap pangkal tangkai daun pada batang utama tumbuh tunas lateral.
Pada tunas lateral inilah muncul bunga betina (bakal buah) yang rata-rata mampu
menghasilkan satu sampai dua calon buah. Namun, tidak semuanya menjadi buah.
Calon buah yang tidak sempat diserbuki akan gugur. Oleh karena itu, perempelan
tunas lateral harus dilakukan, kecuali tunas lateral yang bakal buahnya dipilih
untuk dijadikan buah. Budi daya tanaman melon dapat pula dirambatkan pada
turus bamboo (ajir). Buah melon umumnya berbentuk bulat dengan jarring-jaring
(net) yang tampak jelas pada permukaan kulit buahnya. Akan tetapi ada beberapa
varietas melon yang tidak memiliki net pada permukaan kulitnya, misalnya Silver
Light, Sun Lady, Snow Charm dan beberapa yang lainnya (Samadi, 2007).
2. Taksonomi Tanaman Melon
Tanaman melon (Cucumis melo L.) termasuk famili Cucurbitaceae.
Klasifikasi tanaman melon dalam ilmu tumbuha-tumbuhan atau taksonomi
disebutkan dengan urutan sebagai berikut:
Kingdom : Platae / Tumbuh-tumbuhan
Divisio : Spematophyta / Tumbuhan berbiji
Sub-divisio : Angiospremae / Tumbuhan Berbiji tertutup
Kelas : Dicotyledonae / Biji berkeping dua
Ordo : Cucurbitaceae (Compositae)
Famili : Cucurbitaceae
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
16
Genus : Cucumis
Spesies : Cucumis melo L. ( Nuryanto, 2000).
3. Kandungan Buah Melon
Tabel II. Kandungan Buah Melon (Samadi, 2007).
No Unsur Gizi Jumlah 1 Energi (kalori) 23 2 Protein (g) 0,6 3 Kalsium (mg) 17 4 Vitamin A (IU) 2,400 5 Vitamin C (mg) 30 6 Thiamin (mg) 0,045 7 Riboflavin (mg) 0,065 8 Niacin (mg) 1,0 9 Karbohidrat (g) 6,0 10 Besi (mg) 0,5 11 Nicotinamida (mg) 0,5 12 Air (mL) 93,0 13 Serat (g) 0,4
D. Ekstraksi
1. Pengertian dan Prinsip Ekstraksi
Liquid-liquid Extraction (LLE) merupakan salah satu ekstraksi yang
sering digunakan untuk memisahkan suatu analit dari komponen lain yang tidak
diharapkan. LLE adalah suatu metode pemisahan dengan menggunakan dua fase
pelarut yang saling tidak bercampur dengan memperhatikan nilai P-nya. Metode
ini digunakan dengan menggunakan tabung sentrifuge dimana hanya memerlukan
sampel yang lebih sedikit (Cairns, 2004).
Ekstraksi cair-cair digunakan sebagai cara untuk praperlakuan sampel
atau clean-up sampel untuk memisahkan analit-analit dari komponen-komponen
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
17
matriks yang mungkin mengganggu pada saat kuantifikasi atau deteksi analit. Di
samping itu, ekstraksi pelarut juga digunakan untuk memekatkan analit yang ada
dalam sampel dengan jumlah kecil sehingga tidak memungkinkan atau
menyulitkan untuk deteksi atau kuantifikasinya (Gandjar dan Rohman, 2007).
Dalam bentuk paling sederhana, suatu alikuot larutan air digojog dengan
pelarut organik yang tidak campur dengan air. Kebanyakan prosedur ekstraksi
cair-cair melibatkan ekstraksi analit dari fase air ke dalam pelarut organik yang
bersifat non polar atau agak polar seperti heksana, metilbenzen, atau
diklorometan. Meskipun demikian, proses sebaliknya (ekstraksi analit dari pelarut
organik non polar ke dalam air) juga mungkin terjadi (Gandjar dan Rohman,
2007).
Analit-analit yang mudah terekstraksi dalam pelarut organik adalah
molekul-molekul netral yang berikatan secara kovalen dengan substituen yang
bersifat non polar atau agak polar. Sementara itu, senyawa-senyawa polar dan
senyawa-senyawa yang mudah mengalami ionisasi akan tertahan dalam fase air
(Gandjar dan Rohman, 2007).
Ekstraksi cair-cair ditentukan oleh distribusi Nerst atau hukum partisi
yang menyatakan bahwa “pada konsentrasi dan tekanan yang konstan, analit akan
terdistribusi dalam proporsi yang selalu sama diantara dua pelarut yang saling
tidak campur”. Perbandingan konsentrasi pada keadaan setimbang di dalam dua
fase disebut dengan koefisien distribusi atau koefisien partisi (KD) dan
dirumuskan sebagai berikut:
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
18
KD = (S)org (S)aq
Keterangan:
KD = koefisien partisi
[S]org = konsentrasi analit dalam fase organik
[S]aq = konsentrasi analit dalam fase air
Dalam prakteknya, analit seringkali berada dalam bentuk kimia yang
berbeda karena adanya disosiasi (ionisasi), protonasi, dan juga kompleksasi atau
polimerasi karenanya ekspresi yang lebih berguna adalah rasio distribusi atau
rasio partisi (D). Persamaannya adalah sebagai berikut:
D = (Cs)org (Cs)aq
Keterangan:
D = rasio partisi
(Cs)org = konsentrasi total analit (dalam segala bentuk) dalam fase organik
(Cs)aq = konsentrasi total analit (dalam segala bentuk) dalam fase air
Analit yang mempunyai rasio distribusi besar (104 atau lebih) akan
mudah terekstraksi ke dalam pelarut organik meskipun proses kesetimbangan
(yang berarti 100% solut terekstraksi atau tertahan) tidak pernah terjadi.
Kebanyakan ekstraksi dilakukan dengan menggunakan corong pisah dalam waktu
beberapa menit. Akan tetapi untuk efektivitas ekstraksi analit dengan rasio
distribusi yang kecil (<1), ekstraksi hanya dapat dicapai dengan mengenakan
pelarut baru pada larutan sampel secara terus menerus (Gandjar dan Rohman,
2007).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
19
2. Pemilihan Pelarut
Pelarut organik yang dipilih untuk ekstraksi pelarut adalah pelarut yang
mempunyai kelarutan yang rendah dalam air (< 10%), dapat menguap sehingga
memudahkan penghilangan pelarut organik setelah dilakukan ekstraksi, dan
mempunyai kemurnian yang tinggi untuk meminimalkan adanya kontaminasi
sampel (Gandjar dan Rohman, 2007).
Beberapa masalah yang sering dijumpai ketika melakukan ekstraksi
pelarut yaitu: terbentuknya emulsi, analit terikat kuat pada partikulat, analit
terserap oleh partikulat yang mungkin ada, analit terikat pada senyawa yang
mempunyai berat molekul tinggi, dan adanya kelarutan analit secara bersama-
sama dalam kedua fase. Terjadinya emulsi merupakan hal yang paling sering
dijumpai. Oleh karena itu, jika emulsi antara kedua fase ini tidak dirusak maka
recovery yang diperoleh kurang baik. Emulsi dapat dipecah dengan cara:
a. Penambahan garam ke dalam fase air
b. Pemanasan atau pendinginan corong pisah yang digunakan
c. Penyaringan melalui glass-wool
d. Penyaringan dengan menggunakan kertas saring
e. Penambahan sedikit pelarut organik yang berbeda
f. Sentrifugasi (Gandjar dan Rohman, 2007).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
20
E. Sentrifugasi
Sentrifugasi merupakan suatu tekhnik pemisahan suatu partikel saat
diberikan gaya terapan sentrifugal. Metode ini didasarkan pada perbedaan tingkat
sedimentasi partikel ukuran yang berbeda dan berat jenis (Wilson, 2001).
Sentrifugasi adalah nama umum yang diberikan untuk metode pemisahan
yang melibatkan rotasi sumbu tetap untuk menghasilkan gaya sentrifugal (g).
Kekuatan gaya sentrifugal ini mengakibatkan zat turun melalui media cair dan
jatuh atau mengalami sedimentasi yang bervariasi terutama sesuai dengan densitas
zat dan ukuran. Kepadatan zat yang berbeda atau ukuran sedimen pada tingkat
yang berbeda dan di beberapa titik tertentu secara fisik akan terpisah satu sama
lain. Sedimentasi zat dapat di gambarkan dengan persamaan Stokes untuk
penyelesaian partikel di medan gravitasi.
dimana v = laju sedimentasi atau kecepatan partikel; d = diameter partikel; ℮p =
kepadatan partikel; ℮L = densitas zat cair; n = viskositas medium cair; g = gaya
gravitasi. dari persamaan stoke dapat dilihat bahwa:
a. Laju sedimentasi partikel sebanding dengan ukuran partikel
b. Tingkat sedimentasi sebanding dengan perbedaan kepadatan antara partikel
dan cairan
c. Tingkat sedimentasi adalah nol ketika kepadatan partikel adalah sama dengan
densitas cairan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
21
d. Penurunan tingkat sedimentasi sebagai viskositas meningkat cair
e. Peningkatan laju sedimentasi sebagai kekuatan peningkatan gravitasi (Sharpe,
1998).
F. Solid Phase Extraction (SPE)
Solid Phase Extaction (SPE) merupakan salah satu kemungkinan dalam
persiapan sampel dengan berdasarkan metode penjebakan analit. Menggunakan
metode ini analit terjebak dalam adsorben, dan kemudian dicuci dengan volume
minimal pelarut (Nollet, 2005).
Tahapan pertama menggunakan SPE adalah dengan mengkondisikan
penjerap menggunakan pelarut yang sesuai. Penjerap nonpolar seperti C18 dan
penjerap penukar ion dikondisikan dengan mengalirinya menggunakan metanol
lalu aquadest. Pencucian yang berlebih menggunakan air akan mengurangi
recovery analit. Penjerap-penjerap polar seperti diol, sianol, amino, dan silika
harus dibilas dengan menggunakan pelarut nonpolar seperti metilen klorida
(Rohman, 2009).
Solid Phase Exraction (SPE) merupakan teknik yang relatif baru dan
cepat berkembang sebagai alat utama yang digunakan untuk pra perlakuan sampel
atau clean-up sampel yang kotor. Keunggulan SPE dibandingkan dengan ekstraksi
cair-cair adalah:
a. Proses ekstraksi lebih sempurna
b. Pemisahan analit dari pengganggu yang mungkin ada menjadi lebih efisien
c. Mengurangi pelarut organik yang digunakan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
22
d. Fraksi analit yang diperoleh lebih mudah dikumpulkan
e. Mampu menghilangkan partikulat
f. Lebih mudah diotomatisasi (Rohman, 2009).
Empat tahapan dalam prosedur SPE, yaitu:
a. Pengkondisian. Catridge (penjerap) dialiri dengan menggunakan
pelarut sampel untuk membasahi permukaan penjerap dan untuk menciptakan
nilai pH yang sama, sehingga perubahan-perubahan kimia yang tidak diharapkan
ketika sampel dimasukan dapat dihindari.
b. Retensi (tertahannya) sampel. Larutan sampel dilewatkan ke catridge
baik untuk menahan analit yang dituju, sementara komponen lain terelusi atau
untuk menahan komponen yang tidak diharapkan sementara analit yang dituju
terelusi.
c. Pembilasan. Tahap ini penting untuk menghilangkan seluruh
komponen yang tidak tertahan oleh penjerap selama tahap retensi.
d. Elusi. Tahap ini merupakan tahap akhir untuk mengambil analit yang
dituju, jika analit tersebut tertahan pada penjerap (Rohman, 2009).
Strategi pertama adalah dengan memilih pelarut yang mampu menahan
semua analit yang dituju pada penjerap yang digunakan, sementara itu senyawa-
senyawa yang lain akan terelusi. Analit yang dituju selanjutnya dielusi dengan
menggunakan sejumlah kecil pelarut organik yang akan mengambil analit yang
tertahan pada penjerap. Strategi ini bermanfaat jika analit yang dituju berkadar
rendah. Strategi yang lainnya adalah dengan mengusahakan supaya analit yang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
23
dituju keluar (terelusi), sementara senyawa pengganggu tertahan pada penjerap
(Gandjar dan Rohman, 2007).
Gambar 3. Tahapan SPE (Nollet, 2005).
G. Kromatografi Gas
1. Pengertian
Kromaografi adalah suatu metode pemisahan campuran yang didasarkan
pada perbedaan distribusi dari komponen-komponen campuran tersebut diantara
dua fase, yaitu fase diam dan fase gerak. Berdasarkan fase gerak yang digunakan,
kromatografi dibedakan menjadi dua golongan besar yaitu kromatografi gas dan
kromatografi cair (McNair & Miller, 1998).
Kromatografi gas adalah teknik pemisahan yang mana solut-solut yang
mudah menguap dan stabil dengan pemanasan bermigrasi melalui kolom yang
mengandung fase diam dengan suatu kecepatan yang tergantung pada rasio
distribusinya (Gandjar dan Rohman, 2007).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
24
Kromatografi gas pada dasarnya merupakan metode pemisahan yang
tidak dapat digunakan untuk mengidentifikasi senyawa tanpa menggunakan baku
pembanding. Optimasi kromatografi gas antara lain sensitivitas dan
selekstivitas/spesifitas instrument terhadap analit yang dianalisis. Polaritas dan
volatilitas dari komponen yang akan dipisahkan menjadi pertimbangan untuk
memilih fase diam yang cocok (Grob, 1995).
Kromatografi Gas merupakan teknik analisis yang cepat, memiliki hasil
yang baik untuk analisis pestisida multikomponen, memiliki sensitifitas tinggi
dengan detektor yang spesifik (Nollet, 2004). Kromatografi gas dapat digunakan
untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. Analisis kualitatif dilakukan dengan cara
membandingkan waktu retensi dari komponen yang kita analisis dengan waktu
retensi zat baku pembanding (standar) pada kondisi analisis yang sama. Analisis
kuantitatif diakukan dengan cara perhitungan relatif dari tinggi atau luas puncak
kromatogram komponen yang dianalisis terhadap zat baku pembanding (standar)
yang dianalisis (Johnson & Stevenson, 1991).
Komponen-komponen yang akan dipisahkan didistribusikan di antara
fase diam dan fase gerak. Suatu kromatografi gas yang baik terdiri dari
komponen-komponen penting yaitu gas pembawa dan regulator tekanan, injektor,
kolom, oven, detektor, dan pencatat signal (Rouessac dan Annick, 2007).
2. Prinsip Pemisahan
Pemisahan pada kromatografi gas di dasarkan pada titik didih suatu
senyawa dikurangi dengan interaksi yang mungkin terjadi antara solut dengan fase
diam. Fase gerak yang berupa gas akan mengelusi solut dari ujung kolom lalu
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
25
menghantarkannya ke detektor. Fase gerak dalam kromatografi gas juga biasa
disebut sebagai gas pembawa. Syarat gas pembawa adalah tidak reaktif, dan
murni/kering karena kalau tidak murni akan berpengaruh pada detektor (Gandjar
dan Rohman, 2007).
Pada kromatografi gas, fase diam selalu di tempatkan di dalam sebuah
kolom. Fase diam ini dapat berupa suatu padatan (Kromatografi Gas-Padat/Gas
Solid Chromatography). Cara penyerapan komponen pada kromatografi gas padat
(GSC) merupakan proses adsorpsi pada permukaan, sedangkan Kromatografi Gas
Cair (GLC) dinamakan kromatografi partisi (Soeryadi, 1997).
Pemisahan pada kromatografi gas dapat di lakukan pada suhu tetap yang
biasanya disebut dengan pemisahan isotermal dan dapat dilakukan dengan
menggunakan suhu yang berubah secara terkendali yang disebut dengan
pemisahan suhu terprogram. Pemisahan isotermal paling baik dipakai pada
analisis rutin atau jika kita mengetahui agak banyak sifat sampel yang akan
dipisahkan. Pilihan awal pada pemisahan isotermal ini adalah suhu yang
digunakan beberapa derajat di bawah titik didih komponen campuran utama. Ada
dua hal yang perlu diperhatikan terkait dengan penggunaan pemisahan isotemal
ini, yaitu: (1) terkait dengan pemilihan suhu. Jika suhu yang digunakan terlalu
tinggi maka komponen akan terelusi tanpa terpisah, sementara jika suhu terlalu
rendah maka komponen yang bertitik didih tinggi akan keluar sangat lambat atau
bahkan tetap dalam kolom sehingga akan mengacaukan proses kromatografi
selanjutnya, dan (2) terkait dengan proses kromatografi, karena makin lama suatu
sampel dalam kolom maka semakin lebar alas puncaknya. Kedua hal ini dapat
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
26
diatasi jika digunakan pemisahan dengan suhu terprogram (Gandjar & Rohman,
2007).
Pemisahan dengan suhu terprogram mempunyai keuntungan, yakni
mampu meningkatkan resolusi komponen-komponen dalam suatu campuran yang
mempunyai titik didih pada kisaran yang luas. Disamping itu, pada suhu
terprogram juga mampu mempercepat keseluruhan waktu analisis, karena
senyawa-senyawa dengan titik didih tinggi akan terelusi lebih cepat (Gandjar &
Rohman, 2007).
3. Performance GC
Pemisahan yang terjadi pada analisis dengan kromatografi gas
dipengaruhi oleh efisiensi kolom dan efisiensi pelarut. Efisiensi kolom
menentukan pelebaran puncak kromatogram. Efisiensi kolom dapat diukur dengan
menghitung jumlah lempeng teoritis (N) dan panjang kolom yang sesuai dengan
plat teoritis (Height Equivalent to a Theoritical Plate, HETP). HETP adalah
panjang kolom yang diperlukan untuk mencapai kesetimbangan komponen
cuplikan diantara fase gerak yang bergerak dan fase diam yang diam. Semakin
banyak jumlah lempeng teoritis, semakin kecil HETP, maka efisiensi kolom
meningkat dan pemisahan yang terjadi akan semakin baik (Jennings, et all., 1987).
Faktor ikutan didefinisikan sebagai perbandingan antara jarak tepi muka
sampai tepi belakang puncak dibagi dua kali jarak dari maksimum puncak sampai
tepi muka puncak, jarak-jarak tersebut diukur pada titik yang ketinggiannya 5%
dari tinggi puncak di atas garis dasar. Untuk suatu puncak yang simetris, factor
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
27
ikutan (Tf) besarnya satu, dan besarnya harga Tf ini akan bertambah jika
kromatogram semakin tambah berekor (Jennings, et all., 1987).
Pemisahan yang sebenarnya dari dua puncak yang berurutan diukur
dengan resolusi atau daya pisah. Resolusi merupakan suatu ukuran keefisienan
kolom dan pelarut yang dapat menerangkan sempitnya puncak dan juga
pemisahan antara dua maksimum puncak. Resolusi didefinisikan sebagai jarak
antara dua puncak dibagi dengan jumlah lebar masing-masing puncak dengan
diukur dari alas puncak. Bila nilai resolusi adalah satu maka kesempurnaan
pemisahan dua puncak adalah 99,7%. Umumnya dalam praktek, nilai resolusi satu
tidak cukup baik karena derajat overlap. Pemisahan yang baik dicapai pada
resolusi sekitar 1,5 atau lebih (Wittkowski & Matissek, 1990).
4. Instrumentasi
Gambar 4. Diagram Skematik Kromatografi Gas (Nagel, 2004)
a. Gas pembawa. Fase gerak dalam kromatografi gas disebut gas
pembawa dan harus murni dan inert secara kimia. Gas pembawa yang umumnya
digunakan adalah helium, nitrogen, argon, dan hidrogen (Skoog, West, Holler,and
Crouch, 2004).
Pemilihan gas pembawa tergantung pada penggunaan spesifik dan jenis
detektor yang digunakan. Gas pembawa untuk detektor ECD biasanya adalah N2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
28
dengan kecepatan alir 30-60 ml/menit. Untuk setiap pemisahan dengan
kromatografi gas terdapat kecepatan optimum gas pembawa yang tergantung pada
diameter kolom. Kolom kapiler menggunakan kecepatan alir gas yang rendah,
yakni antara 0,2 – 2 mL/menit. Karena kecepatan alir gas pembawa pada kolom
kapiler sangat rendah, maka pada kebanyakan detektor ditambah gas tambahan
yang ditambahkan ke dalam efluen setelah keluar dari kolom tetapi belum
mencapai detektor. Gas tambahan umumnya sama dengan gas pembawa,
meskipun kadangkala digunakan helium. Gas pembawa bekerja paling efisien
pada kecepatan alir tertentu. Gas nitrogen akan efisien jika digunakan dengan
kecepatan alir ± 10 ml/menit, sementara helium akan efisien pada kecepatan alir
40 ml/menit (Gandjar dan Rohman, 2007).
Gambar 5. Gas yang Digunakan dalam Kromatografi Gas (Grob, 1995)
b. Sample Injector. Ruang injektor atau inlet berfungsi untuk
menghantarkan sampel ke dalam aliran gas pembawa. Sampel yang akan
dikromatografi di masukkan ke dalam ruang suntik melalui gerbang suntik yang
biasanya berupa lubang yang ditutupi dengan septum atau pemisah karet. Ruang
suntik harus dipanaskan tersendiri (terpisah dari kolom) dan umumnya 10 – 15ºC
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
29
lebih tinggi daripada suhu kolom maksimum. Jadi seluruh sampel akan menguap
segera setelah sampel disuntikkan (Gandjar dan Rohman, 2007).
Pada kolom kapiler, sampel yang diperlukan sangat sedikit bahkan
sampai 0,01 μL, berbeda dengan kolom kemas yang memerlukan 1 – 100 μL
sampel. Karena pengukuran secara akurat sulit dilakukan jika sampel yang
disuntikkan terlalu kecil (pada kolom kapiler), maka ditempuh suatu cara untuk
mengecilkan ukuran sampel setelah penyuntikan. Salah satu cara yang dilakukan
adalah dengan menggunakan teknik pemecah suntikan (split injection). Dengan
menggunakan pemecah suntikan ini, sampel yang banyaknya diketahui,
disuntikkan ke dalam aliran gas pembawa dan sebelum masuk ke kolom, gas
pembawa ini dibagi menjadi dua aliran. Satu aliran masuk ke dalam kolom dan
satunya lagi akan dibuang. Aliran relatif dalam kedua aliran ini dikendalikan
dengan sejenis penghambat seperti katup jarum pada aliran yang dibuang. Laju
alir di dalam kedua aliran diukur dan ditentukan nisbah (rasio) pemecahannya.
Jika 1 μL sampel dimasukkan ke dalam pemecah aliran yang mempunyai nisbah
pemecahan 1:100, maka sebanyak 0,01 μL sampel masuk ke dalam kolom dan
sisanya akan dibuang (Gandjar dan Rohman, 2007).
c. Kolom. Kolom merupakan tempat terjadinya proses pemisahan karena
di dalamnya terdapat fase diam. Oleh karena itu, kolom merupakan komponen
sentral pada kromatografi gas. Terdapat dua jenis tipe kolom yang digunakan
dalam gas kromatografi, yaitu kolom kemas dan kolom kapiler atau sering disebut
open tubular columns. Pada masa lalu, lebih banyak digunakan kolom kemas
untuk melakukan analisis menggunakan gas kromatografi. Untuk aplikasi masa
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
30
kini, kolom kemas digantikan dengan kolom kapiler karena lebih efisien dan lebih
cepat (Skoog, West, Holler, and Crouch, 2004). Semakin sempit diameter kolom,
maka efisiensi pemisahan kolom semakin besar atau puncak kromatogram yang
dihasilkan semakin tajam. Pada umumnya, seorang analis akan memilih kolom
dengan diameter 0,2 mm atau yang lebih kecil ketika menganalisis sampel dengan
konsentrasi sekelumit atau ketika seorang analis akan memisahkan komponen
yang sangat kompleks (Gandjar dan Rohman, 2007).
Kolom kapiler terbuat dari silica (SiO2) dan dilapisi dengan polymide
(plastik yang mampu menahan suhu 350ºC). Pada bagian dalam terdapat rongga
yang menyerupai pipa, oleh karena itu kolom kapiler juga disebut Open Tubular
Columns. Fase diam melekat mengelilingi dinding dalam kolom. Terdapat 4
macam jenis lapisan pada kolom kapiler ini, yaitu: WCOT (Wall Coated Open
Tubular Column), SCOT (Support Coated Open Tubular Column), PLOT (Porous
Layer Open Tubular Column), dan FSOT (Fused Silica Open Tubular Column).
WCOT (Wall Coated Open Tubular Column) memiliki 0,1 – 5 μm lapisan tipis
fase diam cair yang terdapat pada dinding bagian dalam kolom. SCOT (Support
Coated Open Tubular Column) memiliki partikel solid yang dilapisi dengan fase
diam cair yang terdapat pada bagian dalam dinding. Pada PLOT (Porous Layer
Open Tubular Column) partikel padat sebagai fase diam aktif. Dengan besarnya
luas area yang dimiliki, SCOT dapat menampung sampel lebih besar daripada
WCOT. Performa SCOT berada diantara WCOT dan kolom kemas. Diameter
dalam kolom kapiler memiliki ukuran 0,10 – 0,53 mm dengan panjang 15 sampai
100 m, umumnya adalah 30 m. Menurut Moffat, Osselton, and Widdop (2011)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
31
kolom kapiler menghasilkan resolusi, sensitivitas, daya tahan yang lebih baik
daripada kolom kemas (Harris, 2010).
Kolom kapiler sangat banyak dipakai atau lebih disukai oleh para
ilmuwan. Salah satu penyebabnya adalah kemampuan kolom kapiler memberikan
harga jumlah plat teori yang sangat besar (> 300.000 plat). Fase diam yang
dipakai pada kolom kapiler dapat bersifat non polar, polar, atau semi polar. Fase
diam non polar yang paling banyak digunakan adalah metil polisiloksan (HP-1;
DB-1; SE- 30; CPSIL-5) dan fenil 5% - metilpolisiloksan 95% (HP-5; DB-5; SE-
52; CPSIL- 8). Fase diam semi polar adalah seperti fenil 50% - metilpolisiloksan
50% (HP-17; DB-17; CPSIL-19), sementara itu fase diam yang polar adalah
seperti polietilenglikol (HP-20M; DB-WAX; CP-WAX; Carbowax-20M). Jenis
fase diam akan menentukan urutan elusi komponen-komponen dalam campuran.
Seorang analis harus memilih fase diam yang mampu memisahkan komponen-
komponen dalam sampel (Gandjar dan Rohman, 2007).
Efisiensi kolom akan meningkat dengan semakin bertambah halusnya
partikel fase diam ini. Semakin kecil diameter partikel fase diam, maka
efisiensinya akan meningkat. Ukuran partikel fase diam biasanya berkisar antara
60 – 80 mesh (250 – 170 μm) (Gandjar dan Rohman, 2007).
d. Detektor penangkap electron (Electron capture detector/ECD).
Detektor penangkap elektron (ECD) merupakan detektor yang dilengkapi dengan
sumber radioaktif yaitu tritium (3H) atau nikel (63Ni) yang menghasilkan partikel-
β. Partikel radioaktif ini bertubrukan dan mengioniasi gas pembawa (make up) gas
(Grob, 1995). Tegangan listrik yang dipasang antara katoda dan anoda tidak
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
32
terlalu tinggi, antara 2-100 volt. Dasar kerja detektor ini adalah: penangkapan
elektron oleh senyawa yang memiliki afinitas terhadap elektron bebas, yaitu
senyawa yang mempunyai unsur-unsur elektronegatif. Bila fase gerak (gas
pembawa N2) masuk ke dalam detektor maka sinar β akan mengionisasi molekul
N2 menjadi ion-ion N2+ dan menghasilkan elektron bebas yang akan bergerak ke
anoda dengan lambat. Dengan demikian, di dalam ruangan detektor terdapat
semacam awan elektron bebas yang dengan lambat menuju anoda. Elektron-
elektron yang terkumpul pada anoda akan menghasilkan arus garis dasar (baseline
curent) yang steady dan memberikan garis dasar pada kromatogram. Bila
komponen sampel (senyawa dengan unsur elektronegatif) dibawa fase gerak
masuk ke ruang detektor yang dipenuhi awan elektron, maka senyawa ini akan
menangkap elektron sehingga membentuk ion molekul negatif. Ion molekul ini
akan dibawa oleh fase gerak (carrier gas). Akibatnya setiap partikel negatif
dibawa keluar detektor, berarti menyingkirkan satu elektron dari sistem sehingga
arus listrik yang steady tadi akan berkurang. Pengurangan arus ini akan dicatat
oleh rekorder sebagai puncak pada kromatogram (Gandjar & Rohman, 2007).
Detektor merupakan perangkat yang di letakkan pada ujung kolom
tempat keluar fase gerak (gas pembawa) yang membawa komponen hasil
pemisahan. Detektor pada kromatografi adalah suatu sensor elektronik yang
berfungsi mengubah sinyal gas pembawa gan komponen-komponen di dalamnya
menjadi sinyal elektronik (Gandjar dan Rohman, 2007).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
33
e. Oven. Pemilihan temperatur pada kromatografi gas tergantung pada
beberapa faktor. Temperatur injeksi harus relatif tinggi yang memberikan
kecepatan penguapan yang paling tinggi sehingga memberikan resolusi yang baik.
Temperatur injeksi terlalu tinggi dapat menyebabkan karet septum menjadi rusak
dan menyebabkan tempat injeksi menjadi kotor. Temperatur kolom berhubungan
dengan kecepatan, sensitivitas, dan resolusi. Pada temperatur kolom yang tinggi,
komponen sampel lebih banyak berada pada fase gas sehingga akan cepat terelusi
tetapi resolusi nya menjadi buruk. Pada temperatur rendah, komponen sampel
akan memiliki lebih banyak waktu untuk berada pada fase diam dan terelusi
secara perlahan, resolusi menjadi meningkat tetapi sensitivitas menurun karena
puncak yang dihasilkan akan melebar. Temperatur detektor harus cukup tinggi
untuk mencegah kondensasi sampel (Christian, 2004).
H. Metode Kuantifikasi
Metode kuantifikasi dan proses kalibrasi adalah sama digunakan pada
suatu teknik instrumental untuk analisis senyawa organic seperti contohnya pada
insteumen kromatografi gas. Determinasi kuantitatif suatu komponen organic
didasarkan pada perbandingan respons instrumental dari suatu senyawa yang tidak
diketahui dengan kalibran. Kalibran disiapkan dengan referensi standar yang
diketahui memiliki kemurnian yang tinggi. Beberapa pendekatan untuk
kuantifikasi yaitu dengan menggunakan metode standar eksternal, metode standar
internal dan metode standar adisi (Czichos, 2006).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
34
1. Metode Standar Eksternal
Metode standar eksternal merupakan metode yang digunakan untuk
menetapkan konsentrasi senyawa yang tidak diketahui konsentrasinya dalam suatu
sampel dengan menggunakan plot kalibrasi kurva baku eksternal. Larutan-larutan
kurva baku eksternal disiapkan dan dianalisis secara terpisah dari kromatogram
senyawa tertentu yang ada dalam sampel. Sampel yang mengandung senyawa
tertentu yang akan ditetapkan konsentrasinya dan telah disiapkan, selanjutnya
diinjeksikan dan dianalisis dengan cara yang sama. Konsentrasi senyawa tersebut
ditentukan dengan metode grafik dari plot kalibrasi atau secara numerik (Rohman,
2009).
2. Metode Standar Internal
Metode standar internal berdasarkan pada perbandingan respon relatif
dari analit terhadap respon satu atau lebih suatu senyawa. Standar internal di
tambahkan ke dalam sampel dan kalibran. Baku standar internal merupakan
senyawa yang berbeda dengan analit, meskipun demikian senyawa ini harus
terpisah dengan baik selama proses pemisahan. Baku internal dapat
menghilangkan pengaruh karena adanya perubahan-perubahan pada ukuran
sampel atau konsentrasi karena adanya perubahan-perubahan pada ukuran sampel
atau konsentrasi karena variasi instrument. Suatu baku internal digunakan jika
suatu sampel memerlukan perlakuan sampel yang sangat signifikan. Perlakuan
yang dimaksud adalah tahapan-tahapan yang meliputi derivatisasi, ekstraksi,
filtrasi, dan sebagainya yang mengakibatkan sampel berkurang. Jika baku internal
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
35
ditambahkan pada sampel sebelum dilakukan preparasi sampel, maka baku
internal dapat menjadi faktor koreksi hilangnya sampel.
3. Metode Standar Adisi
Metode standar adisi didasarkan pada adisi suatu senyawa kalibran yang
diketahui kuantitas atau konsentrasinya kemudian ditambahkan pada sampel yang
tidak diketahui jumlah/konsentrasinya (dengan atau tanpa penambahan standar
internal). Dengan menambahkan paling sedikit dua atau lebih alikuot standar,
suatu kurva dapat disiapkan. Konsentrasi analit dalam sampel dapat ditentukan
dengan ekstrapolasi kurva kalibrasi. Respon analit harus linier pada kisaran
konsentrasi yang digunakan dalam kurva baku kalibrasi. Suatu pendekatan dalam
standar adisi adalah dengan membagi sampel ke dalam beberapa bagian yang
sama kemudian diadisi dengan konsentrasi standar adisi yang meningkat.
Selanjutnya dianalisis antara respon analit dengan konsentrasi yang dinjeksikan
(Rohman, 2009).
I. Validasi Metode Analisis
Metode analisis merupakan serangkaian prosedur yang dapat diterima
dalam mendapatkan hasil analisis suatu sampel. Validasi merupakan proses
verifikasi metode yang sesuai dengan tujuan analisis. Metode dapat berupa hasil
pengembangan metode lain, di dapat dari suatu literatur atau bahkan dari pihak
ketiga lainnya. Suatu metode mungkin diadaptasikan atau dimodifikasi untuk
dapat memenuhi persyaratan dan kemampuan dari sebuah laboratorium dan atau
untuk tujuan metode yang akan digunakan. Beberapa garis besar kriteria validasi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
36
metode residu fungisida meliputi akurasi, presisi, kisaran linearitas, linearitas, dan
LOQ (CCPR, 2003).
1. Akurasi
Akurasi merupakan kedekatan nilai antara hasil uji dan hasil referensi
yang diketahui. Akurasi dapat ditetapkan dari hasil perolehan kembali (%
recovery). Recovery merupakan fraksi atau persentase dari perolehan kembali
suatu analit setelah ekstraksi dan analisis sampel kosong yang telah ditambahkan
analit dengan konsentrasi yang diketahui (adisi menggunakan reference material).
Suatu % recovery yang dikatakan memenuhi parameter validasi metode residu
fungisida jika berada pada rentang 70 % - 125% untuk konsentrasi 10 µg/kg
(ppb) (AOAC, 2002).
2. Presisi
Presisi adalah Kedekatan antara hasil uji yang diperoleh di bawah kondisi
yang ditetapkan. Presisi dapat ditentukan dengan ≥ 3 replikasi pada ≥ 5 level.
Presisi dapat ditetapkan dengan melihat % RSD. Suatu metode dikatakan
memiliki repeatability yang baik jika % RSD ≤ 20 % (CCPR, 2014) atau kurang
dari 32% pada konsentrasi 10 µg/kg (ppb) (AOAC, 2002). .
3. Linearitas dan Rentang
Linearitas adalah kemampuan metode analisis yang memberikan respon
yang secara langsung atau dengan bantuan transformasi matematik yang baik,
proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel (Harmita, 2004). Suatu
linearitas metode analisis reidu fungisida dapat dikatakan baik jika ≥ 0,990
(CCPR, 2003).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
37
4. Limit of Quantitation (LOQ)
LOQ merupakan konsentrasi terkecil analit yang dapat diukur. Umumnya
didefinisikan sebagai konsentrasi minimum analit dalam sampel uji yang dapat
ditentukan dengan presisi yang dapat diterima (pengulangan) dan akurasi di
bawah kondisi yang dinyatakan dalam hasil uji. LOQ dapat diterima jika kurang
dari ½ MRL dan positive list sebesar 0,01 µg/g (CCPR, 2003).
J. Landasan Teori
Azoxystrobin merupakan fungisida turunan strobulin yang bekerja secara
sistemik dan termasuk dalam golongan methoxyacrylates. Mekanisme aksi
azoxystrobin adalah menginhibisi respirasi mitokondria jamur. Intrumen GC-ECD
dapat dikatakan sudah dalam kondisi yang optimum jika mendapatkan N, Rs dan
Tf yang memenuhi persyaratan. Setelah didapatkan konsidi yang dapat
memisahkan analit dengan berbagai impurities maka dilakukan pengujian
keajegan dari sistem GC-ECD dengan menginjeksikan enam kali konsentrasi yang
sama pada kondisi yang sama. Kemudian dilanjutkan dengan menentukan analisis
kuantitatif dari GC-ECD yang meliputi % RSD RF, % D, linearitas, kisaran
linearitas, IDL dan IQL. Ekstraksi azoxystrobin dilakukan dengan metode
QuEChERS dan pengendapan menggunakan sentrifugasi. Clean-up dilakukan
dengan menggunakan kolom SPE C18 dimana bagian nonpolar dari azoxystrobin
akan terjerab dalam fase diam. Determinasi menggunakan GC-ECD. Hasil
validasi metode analisis dikatakan baik jika memenuhi persyaratan akurasi,
presisi, kisaran linearitas, linearitas dan LOQ.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
38
K. Hipotesis
1. Pelarut dengan polaritas yang mendekati azoxystrobin dapat digunakan
sebagai pelarut ekstraksi azoxystrobin pada kulit dan daging buah melon
secara kuantitatif
2. SPE C18 dapat digunakan sebagai sarana clean-up untuk memisahkan matriks
dengan azoxystrobin dengan fase gerak yang sesuai
3. Azoxystrobin dapat dipisahkan dengan matriks dengan GC dan ditetapkan
dengan detector ECD
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Jenis penelitian ini adalah eksperimental murni karena terdapat perlakuan
terhadap subjek uji.
B. Variabel Penelitian
1. Variabel Bebas
Variabel bebas dalam penelitian ini adalah konsentrasi standar
azoxystobin yang ditambahkan, volume fase gerak saat clean-up, lama
sentrifugasi, kecepatan sentrifugasi.
2. Variabel Tergantung
Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah hasil fraksi elusi metanol
saat clean-up, jumlah supernatan yang diperoleh, lama sentrifugasi, kecepatan
sentrifugasi, resolusi (Rs), jumlah lempeng (N), tailing factor (Tf), waktu retensi
(tR), koefisien korelasi, limit of detection (LOD) atau IDL, IQL, limit of
quantification (LOQ), LLMV, presisi, dan hasil % recovery validasi metode
analisis.
3. Variabel Pengacau Terkendali
Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah kemurnian
pelarut yang digunakan. Hal tersebut diatasi dengan menggunakan pelarut pro
39
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
40
analysis (p.a.) yang memiliki kemurnian tinggi, berat sampel melon, jumlah
garam, conditioning SPE, volume pencucian SPE dan waktu alir SPE.
C. Definisi Operasional
a. Azoxystrobin adalah fungisida golongan strobulin yang dianalisis dalam
penelitian ini
b. QuEChERS adalah cara cepat dan mudah dalam penentuan multiresidu
pestisida dengan menggunakan ekstraksi asetonitril dan garam MgSO4, NaCl,
Natrium sitrat, disodium sitrat sesquihidrat dilanjut dengan partisi dispersive-
SPE.
c. Conditioning SPE adalah proses mengaliri SPE dengan menggunakan 3 mL
metanol dan 3 mL aquabidest secara berurutan hingga catrid SPE C18 benar-
benar terbuka sempurna
d. GC-ECD adalah seperangkat sistem Gas Chromatography yang dilengkapi
dengan Electron Capture Detector (ECD)
e. Parameter validasi metode analisis adalah semua parameter yang
dipersyaratkan agar diperoleh metode analisis yang valid diantaranya akurasi,
presisi, koefisien korelasi, LOD dan LOQ
f. Standar internal adalah standar dekachlorobifenil (DCB) yang ditambahkan
untuk mengoreksi kesalahan saat proses berlangsung
g. Homogenisasi sampel adalah proses menghomogenisasi melon tanpa adanya
penambahan air
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
41
D. Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah baku azoxystrobin
99,7% (Syngenta), standar dekachlorobifenil (DCB) (Sigma Aldrich) , asetonitril,
metanol, MgSO4, NaCl, Natrium sitrat, disodium sitrat hydrogenate sesquihydrate
dengan kualitas pro analysis (E. Merck), aquadest (Laboratorium Kimia Analisis
Instrumental Farmasi USD), aquabidest (Laboratorium Kimia Analisis
Instrumental Farmasi USD), dan sampel melon dari pedagang buah di beberapa
Pasar Yogyakarta.
E. Alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah kromatografi gas HP
5890 series II dengan dilengkapi detektor ECD 63Ni dan kolom kapiler non polar
(5%-phenyl)-methylpolysiloxane, 12–50 m, i.d 0,20–0,32 mm, d.f. 0,11–0,52 µm,
neraca analitik (OHAUS Carat Series PAJ 1003, max 60/120 g, min 0,001 g, d =
0,01/0,1 mg, e = 1 mg), kolom SPE C18 400 mg, homogeniser sample, vortex, hot
plate, termometer, sentrifuse, botol plastik sentrifugasi 15 ml, ultrasonifikasi,
syringe, mikropipet, pisau, sarung tangan, seperangkat komputer dengan CBM-
102 (Shimadzu), perangkat lunak Shimadzu Labsolutions: GC Solution versi
2.30.00SU4, perangkat lunak Powerfit v.6.05 dan alat-alat gelas yang lazim
digunakan di laboratorium analisis.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
42
F. Tata Cara Penelitian
Garis besar dari penelitian ini dibagi menjadi uji kesesuaian sistem GC-
ECD, preparasi sampel melon, optimasi clean-up, validasi metode analisis residu
azoxystrobin dalam buah melon. Metode dikatakan valid jika dapat memenuhi
parameter validitas yang meliputi akurasi, presisi, koefisien korelasi, LOD dan
LOQ.
1. Prosedur Pencucian Alat-Alat Gelas
Cuci alat dengan menggunakan aquadest sebanyak tiga kali dan ditunggu
hingga kering. Cuci kembali alat menggunakan aceton tiga kali kemudian
keringkan. Terakhir cuci alat menggunakan metanol dengan tiga kali pengulangan
dan keringkan.
2. Pembuatan Larutan Stok Azoxystrobin dan DCB
a. Pembuatan stok azoxystrobin. Ditimbang sejumlah lebih kurang 11,4
mg baku azoxystrobin dan larutkan dalam 1mL toluen sehingga didapatkan
konsentrasi stok induk sebesar 11,4 mg/mL.
b. Pembuatan stok DCB. Timbang 10mg DCB dan larutkan dalam 100
mL pelarut. Ambil 10 uL dan add hingga volume 1000 uL.
3. Pembuatan Larutan Intermediet Azoxystrobin
a. Pembuatan larutan intermediet A. Ambil 40 µL dari stok induk dan
larutkan dalam 1000 µL heksan sehingga didapatkan larutan intermediet A
dengan konsentrasi 0,456 µg/µL.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
43
b. Pembuatan larutan intermediet B. Ambil 10 µL larutan intermediet A
diencerkan hingga volume 1000 µL heksan, sehingga didapatkan konsentrasi
0,456 x 10-2 µg/ µL.
4. Uji Kesesuaian Sistem GC-ECD
Uji kesesuaian sistem perlu dilakukan sebelum metode analisis terpilih
dilaksanakan. Secara normal terdapat variasi dalam peralatan dan teknik analisis,
maka uji kesesuaian system perlu dilakukan untuk memastikan sistem operasional
akhir adalah efektif dan memberikan hasil yang sesuai dengan tujuan analisis.
Kelayakan sistem dilihat dari beberapa parameter yaitu presisi, linearitas dan
sensitivitas sistem GC-ECD.
a. Optimasi sistem GC-ECD. Optimasi terhadap sistem GC-ECD
dilakukan dalam uji kesesuaian sistem. Optimasi instrumen GC-ECD dilakukan
sesuai dengan prosedur yang ditetapkan dalam petunjuk operasional alat yang
dilakukan oleh Sanjayadi (2014).
b. Kinerja kualitatif GC-ECD. Kinerja GC-ECD meliputi pemisahan
standar azoxystrobin pada sistem atau performa GC-ECD, dan keajegan sistem.
Dilakukan dengan menginjeksikan larutan intermediet B dengan kadar 0,137 ng
pada GC-ECD yang sudah dioptimasi sebanyak enam kali dibawah kondisi sistem
yang sama.
c. Kinerja kuantitatif GC-ECD. Dalam analisis kuantitatif GC-ECD
meliputi parameter-parameter presisi, linearitas, rentang linearitas, sensitivitas
LOD/ IDL dan IQL, akurasi.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
44
1) Presisi sistem GC-ECD. Repeatability sistem dilihat dari nilai % RSD. Nilai
% RSD ditetapkan dengan cara menginjeksikan sebanyak tiga kali larutan
intermediet B dengan jumlah volume pengambilan 20 µL; 10 µL; 7 µL; 5
µL; ; 4 µL, 3 µL, 2 µL yang mana masing-masing ditambahkan 2 µL standar
internal dan diencerkan menggunakan heksan hingga volume 200 µL.
Injeksikan pada GC-ECD dengan menggunakan volume injeksi 2 µL
sehingga didapatkan massa berturut-turut sebesar 0,912 ng; 0,456 ng; 0,319
ng; 0,228 ng; 0,182 ng, 0,137 ng dan 0,091 ng. Diperoleh respon sistem yang
berupa luas puncak azoxystrobin pada tiap kadar, sehingga dapat dihitung
nilai rata-rata respon factor (RF) , standar deviasi RF dan % RSD RF.
2) Linearitas hubungan kadar baku azoxystrobin dengan respon sistem GC-
ECD. Koefisien korelasi (r) digunakan sebagai penentu linearitas hubungan
kadar baku azoxystrobin dengan respon yang berupa luas puncak
azoxystrobin/standar internal. Nilai parameter (r) dapat ditetapkan dengan
menginjeksikan sebanyak tiga kali larutan intermediet B dengan volume
pengambilan 20 µL; 10 µL; 7 µL; 5 µL; ; 4 µL; 3 µL dan 2 µL yang masing-
masing ditambahkan 2 µL standar internal dan diencerkan menggunakan
heksan hingga volume 200 µL. Injeksikan pada GC-ECD dengan
menggunakan volume injeksi 2 µL sehingga didapatkan massa berturut-turut
sebesar 0,912 ng; 0,456 ng; 0,319 ng; 0,228 ng; 0,182 ng; 0,137 ng; dan
0,091 ng. Lakukan perhitungan dengan menggunakan program statistik
powerfit hingga didapatkan hubungan antara kadar azoxystrobin dengan rasio
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
45
puncak azoxystrobin/luas puncak DCB serta nilai statistik lain seperti
intersep (a) dan slope (b).
3) Sensitivitas sistem GC-ECD. Beberapa parameter sensitivitas adalah nilai
LOD/ IDL, IQL dan slope. Parameter ini dapat ditetapkan dengan cara
menginjeksikan sebanyak tiga kali larutan intermediet B dengan volume
pengambilan 20 µL; 10 µL; 7 µL; 5 µL; ; 4 µL; 3 µL; 2 µL; 1 µL yang
masing-masing ditambahkan 2 µL standar internal dan diencerkan
menggunakan heksan hingga volume 200 µL. Injeksikan pada GC-ECD
dengan menggunakan volume injeksi 2 µL sehingga didapatkan massa
berturut-turut sebesar 0,912 ng; 0,684 ng; 0,456 ng; 0,319 ng; 0,228 ng; 0,182
ng; 0,137 ng; 0,091 ng; 0,046 ng. Lakukan perhitungan dengan menggunakan
program statistik powerfit hingga didapatkan hubungan antara kadar
azoxystrobin dengan rasio puncak azoxystrobin/luas puncak DCB serta nilai
statistik lain seperti LOD/IDL, IQL dan slope (b).
4) Akurasi. Pengukuran kedekatan antara nilai yang sebenarnya dengan nilai
yang terukur dapat ditetapkan dengan menggunakan % D. Semakin kecil % D
maka kedekatan semakin baik. Parameter ini dapat ditetapkan dengan cara
menginjeksikan larutan intermediet B dengan volume pengambilan 20 µL; 15
µL; 10 µL; 7 µL; 5 µL; ; 4 µL; 3 µL; 2 µL; 1 µL yang masing-masing
ditambahkan 2 µL standar internal dan diencerkan menggunakan heksan
hingga volume 200 µL. Injeksikan pada GC-ECD dengan menggunakan
volume injeksi 2 µL sehingga didapatkan massa berturut-turut sebesar 0,912
ng; 0,684 ng; 0,456 ng; 0,319 ng; 0,228 ng; 0,182 ng; 0,137 ng; 0,091 ng;
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
46
0,046 ng. Lakukan perhitungan dengan menggunakan program statistik
powerfit hingga didapatkan persamaan y=bx+a untuk dapat menghitung % D.
5. Preparasi Sampel Melon
a. Penetapan kadar air dalam buah melon. Homogenisasi kulit, daging
dan whole melon secara terpisah tanpa penambahan air. Timbang masing-masing
sampel 10 gram. Letakan dalam cawan petri kemudian oven hingga bobot tetap
dalam suhu 65°C.
b. Optimasi lama sentrifugasi. Homogenisasi sampel. Timbang sebanyak
kurang lebih 5 gram sampel yang telah homogen dan masukan dalam tabung
sentrifugasi 15mL. Tambahkan 2 g MgSO4 ; 0,5 g NaCl ; 0,5 g Na3 citrate 2H2O ;
0,25 g Na2H citrate 1.5H2O dan 5 mL asetonitril. Gojog dengan kuat selama 1
menit kemudian vortex selama 2 menit. Sentrifugasi dengan kecepatan 5000rpm
selama 5 menit ; 10 menit dan 15 menit. Bandingkan hasil supernatan yang
diperoleh.
6. Optimasi Clean-Up Menggunakan SPE C18
a. Penentuan kapasitas berat SPE. Homogenisasi melon hingga
homogen. Timbang 10 gram sampel dan masukan dalam tabung sentrifugasi 50
mL. Tambahkan 2 g MgSO4 ; 0,5 g NaCl ; 0,5 g Na3 citrate 2H2O ; 0,25 g Na2H
citrate 1.5H2O dan 10 ml asetonitril dan kemudian gojok dengan kuat selama 1
menit. Vortex selama 2 menit dan sentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan
5000 rpm. Ambil 1 mL supernatan dan masukan dalam flakon. Kemudian oven
hingga beratnya tetap. Timbang berat sampel yang telah kering, kemudian hitung
kapasitas berat SPE dengan rumus:
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
47
Berat sampel = Kapasitas SPE x 5%
b. Optimasi tahap washing saat clean up SPE. Timbang 5 gram sampel
yang telah dihomogenkan, tambahkan 2 g MgSO4 ; 0,5 g NaCl ; 0,5 g Na3 citrate
2H2O ; 0,25 g Na2H citrate 1.5H2O dan 5 ml asetonitril. Gojog dengan kuat
selama 1 menit, vortex selama 2 menit dan sentrifugasi 5 menit dengan kecepatan
5000rpm. Ambil 3 mL supernatan kemudian adisi dengan 2 µL standart
intermediet A. Keringkan lalu tambahkan 1 mL aquabidest dan ultrasonifikasi
selama 5 menit. Loading sampel ke SPE dengan kecepatan alir maksimal 1
ml/menit. Washing dengan berbagai macam komposisi pelarut, antara lain: 5 mL
aquabidest dan 5 mL metanol 5%. Elusikan 3 ml metanol dan tampung dalam
flakon. Keringkan hasil elusi dan hasil washing kemudian larutkan dalam 100 µL
heksan. Masing-masing hasil eluat metanol setelah diwashing menggunakan 5 %
metanol dan 100% aquabidest, diinjeksikan dalam GC-ECD dengan volume
injeksi 2 µL.
c. Optimasi tahap elusi untuk dapat menarik analit. Penarikan analit
dilakukan dengan memfraksinasi jumlah elusi metanol. Timbang 2 sampel yang
telah dihomogenkan dengan berat masing-masing 5 gram dan masukan dalam
tabung sentrifugasi 15 mL. Tambahkan 2 g MgSO4 ; 0,5 g NaCl ; 0,5 g Na3 citrate
2H2O ; 0,25 g Na2H citrate 1.5H2O dan 5 mL asetonitril. Gojog dengan kuat
selama satu menit dan vortex selama dua menit. Lakukan sentrifugasi dengan
kecepatan 5000rpm selama 5 menit. Ambil 3 mL supernatan dan masukan dalam
flakon. Adisi menggunakan larutan intermediet A dengan volume 50 µL.
Kemudian keringkan menggunakan gas nitrogen diatas waterbath. Larutkan hasil
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
48
pengeringan dalam 1 mL aquabidest dan lakukan ultrasonifikasi selama 5 menit.
Loading sampel pada SPE yang telah di conditioning. Washing dengan 5 mL
aquabidest dan tunggu hingga kering dengan bantuan gas nitrogen. Lakukan 5
kali fraksinasi metanol secara kuantitatif, dimana penggunaan metanol pada tiap
fraksi sebanyak 1 mL. Tampung hasil fraksinasi dalam flakon yang berbeda-beda.
Kemudian keringkan dengan menggunakan gas nitrogen diatas waterbath.
Larutkan dengan menggunakan heksan 100 µL dan injekan pada GC-ECD yang
telah teroptimasi.
d. Optimasi kelayakan SPE untuk digunakan lebih dari satu kali.
Homogenisasi melon hingga homogen, timbang tiga sampel masing-masing
sebanyak 5 gram dan masukan dalam tiga tabung sentrifugasi 15mL. Adisi
menggunakan 15 µL larutan intermediet B. Tambahkan pada masing-masing
tabung 2 g MgSO4 ; 0,5 g NaCl ; 0,5 g Na3 citrate 2H2O ; 0,25 g Na2H citrate
1.5H2O dan 5 ml asetonitril. Gojog dengan kuat selama 1 menit dan vortex selama
2 menit. Sentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 5 menit. Ambil 3 ml
supernatan dan masukan dalam flakon. Uapkan dengan menggunakan gas nitogen
hingga kering. Larutkan hasil pengeringan dalam 500 µL aquabidest dan
ultrasonifikasi selama 5 menit. Elusikan ketiga sampel yang diadisi menggunakan
15 µL larutan intermediet B kedalam satu SPE yang sama (SPE A), dengan tiap
kali pencucian menggunakan 30 ml metanol dan 10 ml aquabidest. Atur
kecepatan alir SPE maksimal adalah 1 ml/menit. Washing dengan menggunakan 5
ml aquabidest. Elusi dengan 3 ml metanol kemudian tampung hasil elusi
menggunakan flakon. Uapkan tiga eluat yang dihasilkan hingga kering dalam
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
49
flakon yang berbeda-beda, kemudian larutkan dalam 100 µL heksan untuk siap
diinjek ke GC.
7. Validasi Metode Analisis Residu Azoxystrobin dalam Buah Melon
Parameter validasi yang akan dievaluasi dalam metode ini adalah akurasi,
presisi, linearitas, kisaran linearitas dan limit of quantification (LOQ) dengan
menggunakan metode adisi.
Proses validasi ini menggunakan 81 sampel dibagi menjadi tiga
perlakuan adisi. Adisi standar azoxystrobin yang dilakukan pada awal sebelum
ekstraksi (Jalur A), sebelum clean up (Jalur B), dan sebelum determinasi GC
(Jalur C). Tiap jalur diadisi dengan 9 tingkat konsentrasi azoxystrobin yang dibuat
dari 1 µL, 2 µL, 3 µL, 5 µL, 7 µL, 10 µL, 13 µL, 16 µL,20 µL larutan intermediet
B. Tiap konsentrasi pada masing-masing jalur direplikasi 3 kali. dan satu sampel
blanko untuk semua keseluruhan proses. Adapun yang dimaksud proses ekstraksi,
clean up dan determinasi adalah sebagai berikut:
a. Ekstraksi QuEChERS. Timbang sampel sebanyak 81 sampel melon
yang telah dihomogenkan dengan berat masing masing sampel 5 gram, masukan
dalam tabung sentrifugasi 15mL. Tambahkan 2 g MgSO4 ; 0,5 g NaCl ; 0,5 g Na3
citrate 2H2O ; 0,25 g Na2H citrate 1.5H2O dan 5 ml asetonitril. Gojog selama
satu menit dengan kuat lalu vortex selama 2 menit. Sentrifugasi dengan kecepatan
5000 rpm selama 5 menit. Ambil semua supernatan dan lakukan kembali
reekstraksi dengan menambahkan 5 ml asetonitril. Campurkan kedua hasil
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
50
supernatan yang diperoleh ±10 ml kemudian masukan dalam flakon dan
keringkan menggunakan gas nitrogen diatas waterbath.
b. Clean-up menggunakan SPE. Conditioning SPE dengan mengaliri
5ml metanol dan 5 ml aquabidest secara berurutan. Larutkan supernatan hasil
ekstraksi yang telah dikeringkan ke dalam 500 µL aquabidest dan ultrasonifikasi
selama 5 menit. Masukan hasil ultrasonifikasi ke dalam SPE yang telah
diconditioning. Washing dengan mengaliri 5 ml aquabidest dan tunggu hingga
kering. Elusi dengan 3 ml metanol dan tampung hasil menggunakan flakon
kemudian keringkan. Tambahkan 2 µL DCB dan larutkan dalam 200 µL hexan
kemudian injek ke GC dengan volume 2 µL.
c. Determinasi GC-ECD. Tambahkan 2 µL DCB pada hasil pengeringan
clean-up dan larutkan dalam 200 µL hexan kemudian injek ke GC dengan volume
2 µL.Akurasi dapat didapatkan dari hasil perolehan kembali pada tiap seri kadar
kurva baku adisi. Presisi ditentukan dari hasil perhitungan simpangan baku
(standard deviation). Linearitas dan limit of detection (LOD) diperoleh melalui
kurva baku solven. Limit of quantification (LOQ) didapatkan dengan
menggunakan kurva baku adisi.
G. Analisis Hasil Penulisan
1. Analisis Kualitatif GC-ECD
Optimasi kromatografi gas dilihat melalui kecepatan alir gas pembawa,
initial temperature, suhu injektor, suhu kolom, suhu oven, dan suhu detektor yang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
51
menghasilkan pemisahan optimum. Parameter pemisahan telah optimum antara
lain resolusi (Rs), tailing factor (Tf), dan jumlah plate (N).
a. Resolusi (Rs). Pemisahan peak dapat dikatakan baik jika terjadi
pemisahan 6σ atau Rs ≥ 1,5 (Grob,1995).
(Grob, 1995).
Keterangan :
tR = waktu retensi
w1 dan w2 = lebar area
b. Jumlah plate (N). Nilai N yang dipersyaratkan secara umum > 7000
(Grob,1995).
(Grob, 1995).
Keterangan :
tR = waktu retensi
w = lebar dasar puncak
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
52
c. Tailing factor (Tf). Nilai Tf yang masih dapat diterima adalah ≤ 1,2.
Jika Tf lebih besar dari 1,2 maka kromatrogram tersebut mengalami pengekoran
(tailing) (Dolan et al, 2002).
d. Keajegan. Ratio tR standar/standar internal dan rasio luas area
standar/DCB dari penginjekan 6 kali. Keajegkannya dihitung dengan melihat nilai
% RSD yang tidak boleh lebih dari 20% (Sanco, 2013). Dengan rumus
% RSD = 𝑠𝑖𝑚𝑝𝑎𝑛𝑔𝑎𝑛 𝑏𝑎𝑘𝑢ℎ𝑎𝑟𝑔𝑎 𝑟𝑎𝑡𝑎−𝑟𝑎𝑡𝑎
𝑥 100%
(Harmita, 2004).
2. Analisis Kuantitatif GC-ECD
a. Presisi. Presisi diperoleh dengan cara melihat kedekatan antara
penginjekan rasio luas area azoxystrobin/standar internal. Presisi diperoleh dari
perhitungan secara matematis terhadap besarnya simpangan baku data.
% RSD = 𝑠𝑖𝑚𝑝𝑎𝑛𝑔𝑎𝑛 𝑏𝑎𝑘𝑢ℎ𝑎𝑟𝑔𝑎 𝑟𝑎𝑡𝑎−𝑟𝑎𝑡𝑎
𝑥 100%
Tabel III. Kriteria % RSD Validasi Metode Analisis
(AOAC, 2012).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
53
b. Linearitas. Linearitas ditentukan dari koefisien korelasi (r) yang
diperoleh dari mengeplotkan kadar azoxystrobin dengan rasio luas puncak
azoxystrobin/standar internal dari data kurva baku dalam regresi linear yang dapat
diolah secara statistik menggunakan program Powerfit (Utrech University
FacµLteit Scheikunde). Nilai R2 ≥0,99 (AOAC, 2002).
c. Sensitivitas. Sensitivitas GC-ECD dapat ditentukan dengan
menghitung LOD dengan rumus:
LOD = 3 𝑥 𝑆𝑎𝑏
(USDA/AMS PDP, 2015).
d. Respon Faktor (RF) adalah rasio antara sinyal yang dihasilkan oleh
suatu analit, dan kuantitas analit yang menghasilkan sinyal.
RF = 𝑅𝑎𝑡𝑖𝑜 𝑠𝑖𝑛𝑦𝑎𝑙 𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑎𝑚𝑏𝑎ℎ𝑘𝑎𝑛
(USDA/AMS PDP, 2015).
e. Percent difference (% D). %D diterima jika ≤ 20 % dengan rumus:
(USDA/AMS PDP, 2015).
Keterangan :
c1 = konsentrasi standar yang diketahui yang dapat dikuantifikasi
c2 = konsentrasi yang dihitung dari kurva kalibrasi
3. Pengukuran Kadar Air dalam Sampel Melon
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
54
Dilakukan dengan menghitung kadar air konstan pada tiap sampel kulit,
daging dan whole melalui rumus
Kadar air = 𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑡𝑒𝑡𝑎𝑝 𝑠𝑒𝑡𝑒𝑙𝑎ℎ 𝑑𝑖𝑜𝑣𝑒𝑛𝑟𝑎𝑡𝑎−𝑟𝑎𝑡𝑎 𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑠𝑒𝑏𝑒𝑙𝑢𝑚 𝑑𝑖𝑜𝑣𝑒𝑛
𝑥 100%
4. Validasi Metode Analisis Residu Azoxystrobin dalam Buah Melon
a. Akurasi. Akurasi diperoleh dengan menghitung perolehan kembali
(percent recovery) dari azoxystrobin. Akurasi dihitung dengan rumus:
Perolehan kembali (recovery) = 𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑡𝑒𝑟𝑢𝑘𝑢𝑟𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑑𝑖𝑘𝑒𝑡𝑎ℎ𝑢𝑖
𝑥 100%
b. Presisi. Presisi diperoleh dari perhitungan secara matematis terhadap
besarnya simpangan baku (standard deviation) data.
Kesalahan Acak (% KV) = 𝑠𝑖𝑚𝑝𝑎𝑛𝑔𝑎𝑛 𝑏𝑎𝑘𝑢ℎ𝑎𝑟𝑔𝑎 𝑟𝑎𝑡𝑎−𝑟𝑎𝑡𝑎
𝑥 100%
c. Linearitas. Linearitas ditentukan dari koefisien korelasi (r) yang
diperoleh dari mengeplotkan kadar azoxystrobin dengan rasio luas puncak
azoxystrobin/standar internal DCB dari data kurva baku dalam regresi linear yang
dapat diolah secara statistik menggunakan program Powerfit (Utrech University
Faculteit Scheikunde). Didapatkan persamaan y =bx + a.
d. Limit of Quantification (LOQ). LOQ diperoleh dengan menghitung
simpangan baku dari intercept kurva baku adisi dan diolah menggunakan
persamaan matematis secara statistik menggunakan program Powerfit (Utrech
University Faculteit Scheikunde). LOQ dihitung dengan menggunakan rumus:
LOQ = 3 𝑥 𝑆𝑎𝑏
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
55
H. Rancangan Penelitian
1. Optimasi Washing SPE
Homogenisasi melon
Timbang 5 gram
Tambahkan :
2 gram MgSO4
0,5 gram NaCl
0,5 gram Na3CitR
0,25 gram Na2HCitR
Tambahkan 5 mL asetonitril
Gojog 1 menit dan vortex 2 menit
Sentrifuge dengan kec. 5000rpm selama 5 menit
Ambil 3 mL supernatant dan adisi dg 2uL intermediet A
Ultrasonifikasi selama 5 menit
Loading sampel dalam SPE
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
56
Keringkan dan larutkan dalam 200 uL
Tampung hasil eluat
Washing dengan 5%MeOH Washing dengan 100%
Elusikan dengan 3 mL MeOH Tampung hasil
Elusikan dengan 3 mL MeOH
A B
Injeksikan tampungan eluat & tampungan
PEMBUKTIAN HIPOTESIS 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
57
2. Fraksinasi Metanol untuk Menarik Analit
Homogenisasi melon
Timbang 5 gram
Tambahkan :
2 gram MgSO4
0,5 gram NaCl
0,5 gram Na3CitR
0,25 gram Na2HCitR
Tambahkan 5 mL asetonitril
Gojog 1 menit dan vortex 2 menit
Sentrifugasi dengan kec. 5000 rpm selama 5 menit
Ambil 3 mL supernatant
Tambahkan 1 ml aquabidest
Tambahkan 50 µL standar larutan A
Uapkan dengan gas N2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
58
Ultrasonifikasi selama 5 menit
Loading pada SPE yang telah di conditioning
Washing dengan 5 mL aquabidest
Fraksinasi MeOH masing-masing 1mL sebanyak 5x
1 2 3 4 5
Keringkan
Larutkan dengan 100 µL metanol
Injeksikan pada GC-ECD
Pembuktian Hipotesis 2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
59
3. Validasi Metode Analisis
Ekstraksi
Clean up
Determinasi
*Dilakukan melalui tiga jalur adisi standart (A; B; C).
PEMBUKTIAN HIPOTESIS 1-2-3
Sampel + standart
Sampel + standart
Sampel + standart
Kesalahan ekstraksi + clean up + determinasi
Kesalahan clean up + determinasi
Kesalahan determinasi
Sampel blanko
Sampel sesungguhnya
A
B
C
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
60
4. Preparasi Sampel Buah Melon Step 1 – Extraction Processes
Tambahkan campuran garam :
• 2 g MgSO4 • 0,5 g NaCl • 0,5 g Na3 citrate 2H2O • 0,25 g Na2H citrate 1.5H2O
Homogenisasi melon hingga homogen
Masukan 5 gram sampel yang telah dihomogenkan dalam tabung sentrifugasi 15 mL
Tambahkan 5 mL asetonitril
Gojog dengan kuat selama 1 menit & vortex selama 2 menit
Sentrifugasiselama 5 menit dengan kecepatan 5000 rpm
Tampung semua hasil supernatan dalam flakon
Reekstrasi dengan menambahkan kembali 5 mL asetonitril dalam tabung sentrifugasi
Tampung kembali hasil supernatan dalam flakon yang sama
Uapkan diatas waterbath dengan bantuan gas nitrogen
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
61
Step 2 – Clean up Processes
Coditioning :
• 5 ml metanol • 5 ml aquabidest
Larutkan dalam 500 µL aquabidest dan ultrasonifikasi selama 5 menit
Loading ekstrak kedalam SPE C18 yang telah diconditioning
Washing menggunakan 5 mL aquabidest
Tampung hasil clean-up dan keringkan
Elusi sampel menggunakan 3 mL metanol
Larutkan dalam 200 µL heksan dan injekkan ke GC dengan volume 2 µL
Pembuktian Hipotesis 2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
62
5. Uji Kelayakan SPE Apabila digunakan Lebih dari satu kali
Homogenisasi melon
Timbang 3 sampel masing-masing 5 gram
Adisi dengan 15 uL intermediet B
Tambahkan 5 mL asetonitril
Gojog 1 menit dan vortex 2 menit
Sentrifuge dengan kec. 5000rpm selama 5 menit
Ambil 3 mL supernatant
Tambahkan 1 mL aquabidest
Ultrasonifikasi selama 5 menit
Masukan dalam SPE yang telah di conditioning
Tambahkan :
2 gram MgSO4
0,5 gram NaCl
0,5 gram Na3CitR
0,25 gram Na2HCitR
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
63
Washing menggunakan 3 mL aquabidest
Elusikan dengan 3 mL metanol
Tampung dan keringkan
Cuci SPE dengan 30 mL metanol dan 10 mL aquabidest
Loading sampel ke-2 dengan langkah seperti diatas
Tamping dan keringkan semua hasil ekstrak bersih
Larutkan dalam 200 uL heksan
Injeksikan pada GC-ECD
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penetapan kadar residu azoxystrobin dilakukan menggunakan GC-ECD
karena GC-ECD memiliki sensitivitas yang cukup tinggi dan waktu analisis yang
relatif cepat (Day and Underwood, 2002).
Detector ECD dipilih dalam penelitian ini berdasarkan struktur dari
azoxystrobin yang mengandung atom elektronegatif seperti N dan O yang
mempunyai afinitas terhadap elektron bebas yang berasal dari sumber radio aktif
nikel (63Ni) pada detektor. Gugus elektronegatif tersebut akan menangkap
elektron bebas untuk dibawa keluar ke detektor, sehingga terjadilah pengurangan
jumlah elektron dari sistem. Pengurangan arus akan direkam dan diangggap
sebagai respon kromatogram. Semakin banyak jumlah atom elektronegatif dalam
suatu senyawa maka akan semakin tinggi respon pada GC-ECD (Grob, 1995).
Sensitivitas ECD biasanya ditunjukan melalui deteksi lindan yang dapat mencapai
10 fg per injeksi dikarenakan struktur lindan yang terdiri dari benzene yang
dikelilingi empat Cl yang bersifat elektronegatif (Kenndler, 2004).
Dalam gas liquid chromatography analit akan terdistribusi antara fase
diam cair dan fase gerak gas ideal. Volatilitas suatu senyawa dapat dinyatakan
dalam Henry’s Law constant, dimana semakin besar nilai konstanta henry maka
semakin cepat senyawa tersebut menguap dan menghasilkan tR yang cepat
(Kenndler,2004). Azoxystrobin memiliki konstanta henry yaitu sebesar 7,3 x 10-9
64
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
65
Pa m3/mol sehingga dapat dianalisis menggunakan GC dengan tR sekitar 30-32
menit.
Melon memiliki kandungan vitamin C yang cukup tinggi, adanya gugus
COOH ini dapat mempengaruhi respon detektor ECD yang digunakan dalam GC.
Mengingat bahwa GC-ECD kurang selektif jika dibandingkan dengan LC-
MS/MS, maka diperlukan modifikasi untuk mendapatkan ekstrak bersih yaitu
dengan adanya proses clean-up menggunakan SPE C18. Diharapkan dengan
adanya clean-up senyawa pengganggu respon detektor tersebut dapat berkurang
sehingga meningkatkan selektifitas dan sensitifitas metode analisis GC-ECD.
Pada metode QuEChERS yang menggunakan sistem dispersive SPE,
kesetimbangan yang terjadi dalam sistem clean-up hanya satu kali, sedangkan
pada kolom SPE kesetimbangan dalam sistem dapat terjadi berulang-ulang
sehingga efisiensi pemisahan semakin meningkat. Hal ini perlu dilakukan karena
detektor ECD sangat sensitif tetapi kurang selektif.
Beberapa optimasi yang penulis lakukan diantaranya adalah uji
kesesuaian sistem GC-ECD, preparasi sampel melon, optimasi clean-up dan
validasi metode analisis residu azoxystrobin dalam buah melon.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
66
A. Uji Kesesuaian Sistem GC-ECD untuk Menganalisis Azoxystrobin
Uji kesesuaian sistem perlu dilakukan sebelum metode analisis terpilih
dilaksanakan. Secara normal terdapat variasi dalam peralatan dan teknik analisis,
maka uji kesesuaian sistem perlu dilakukan untuk memastikan sistem operasional
akhir adalah efektif dan memberikan hasil yang sesuai dengan tujuan analisis.
1. Optimasi Sistem GC-ECD
Dari hasil optimasi, didapatkan kondisi GC-ECD yang optimum, dengan
spesifikasi sebagai berikut pada Tabel IV
Tabel IV. Hasil Optimasi GC-ECD
Parameter Kondisi optimum 1. Injektor (split) Suhu Injektor 230°C Volume injeksi 2 µL 2. Oven Panjang kolom 25 m Fase diam 5%-phenyl-methylpolysiloxane Temperatur Terprogram: 100°C (3 menit),
30°C/menit, 245°C (30 menit), 30°C/menit, 260°C ( 15 menit)
3. Detektor Detektor ECD 63Ni Suhu detector 295°C 4. Gas Gas N2 UHP flow rate gas 1 ml/menit
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
67
2. Kinerja Kualitatif GC-ECD
a. Pemisahan standar azoxystrobin pada sistem GC-ECD. Sistem GC-
ECD harus dipastikan performanya dalam memisahkan analit sebelum dilakukan
analisa kualitatif sistem. Azoxystrobin muncul pada tR ±30,024 menit sedangkan
standar internal muncul pada tR ±20,724 menit. Gambar 6 merupakan hasil dari
pemisahan GC-ECD dalam kondisi yang telah optimum.
Gambar 6. Pemisahan Standar Internal, Difenoconazole dan Azoxystrobin
Pemisahan azoxystrobin menggunakan sistem GC-ECD yang telah
dioptimasi dengan kondisi seperti diatas menghasilkan hasil yang cukup baik.
Rata-rata nilai jumlah plate teoritis (N) yang diperoleh kurang lebih 53138,561.
Nilai N ini menyatakan jumlah plate yang terbentuk di dalam kolom (fase diam).
Semakin banyak jumlah N, semakin banyak jumlah kesetimbangan yang berjalan
dalam kolom dan hasil pemisahan akan semakin baik. Rata-rata nilai resolusi (Rs)
dari hasil uji kesesuain sistem GC-ECD diatas sebesar 8,638 dan tailing factor (tf)
sebesar 0,711. Kondisi tersebut telah memenuhi persyaratan bahwa pemisahan
yang baik karena Rs yang dihasilkan telah lebih dari 1,5 dan tailing factor kurang
DCB
Difenoconazole
Azoxystrobin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
68
dari satu (Snyder et al., 2010). Tabel dibawah ini menunjukan performace dari
GC-ECD setelah dilakukan penginjekan enam kali pada satu konsentrasi yang
sama.
Tabel V. Hasil Performance GC-ECD
Massa (ng)
No Injek Rs N Tf
0,137
1 8,082 38853,338 0,600 2 9,393 68522,486 1,000 3 10,246 68363,772 0,500 4 4,422 29227,458 0,667 5 10,639 78610,328 1,000 6 9,044 35253,984 0,500
Rata-rata 8,638 53138,561 0,711
b. Keajegan sistem GC-ECD. Pengamatan keajegan sistem dilihat dari
hasil penginjekan enam kali standar dengan kadar 0,137 ng pada kondisi sistem
yang sama. Parameter yang ditetapkan adalah nilai % RSD dari ratio tR dan luas
area standar azoxistobin/standar internal.
Tabel VI. Keajegan Sistem GC-ECD
Massa (ng) Ratio tR azox/DCB Ratio AUC azox/DCB
0,137
1,450 0,533 1,451 0,526 1,452 0,536 1,425 0,526 1,426 0,442 1,426 0,759
Rata-rata 1,438 0,553 SD 0,014 0,107 % RSD 0,959 19,271
Baik CCPR (2014) maupun Sanco (2013) menyatakan bahwa %RSD
masih dapat diterima jika kurang dari 20%. Sehingga dapat disimpulkan bahwa
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
69
kinerja GC-ECD dalam kondisi yang telah ditetapkan, dapat digunakan untuk
analisis residu azoxystrobin.
3. Kinerja Kuantitatif GC-ECD.
Uji ini dilakukan dengan membuat kurva baku standar azoxystrobin
sembilan konsentrasi dengan masing-masing tiga replikasi. Tujuan penggunaan
kurva baku adalah untuk mengetahui presisi, nilai linearitas, kisaran linearitas,
slope, sensitivitas yang berupa LOD, dan akurasi.
a. Presisi. Kriteria presisi yang harus dipenuhi adalah % RSD RF yang
merupakan perbandingan antara respon GC-ECD yang dihasilkan dibagi
konsentrasi yang ditambahkan. Hasil dari analisis dapat dilihat di Tabel VII.
Tabel VII . Hasil %RSD RF Analisis Kuantitatif GC-ECD
Kadar (ng)
RF Kurva Baku
1 Kurva Baku
2 Kurva baku
3 0,091 3,127 7,217 6,879 0,137 3,228 7,647 6,943 0,182 3,389 8,018 6,193 0,228 2,909 8,327 5,662 0,319 2,846 8,958 5,673 0,456 2,628 8,963 5,196 0,912 2,265 9,076 4,624
Rata-rata 2,913 8,315 5,881 SD 0,382 0,725 0,853
% RSD 13,127 8,716 14,496
Dari data diatas dapat dinyatakan bahwa kinerja GC-ECD sudah
memenuhi kriteria repeatability, karena % RSD yang diperoleh < 20 % yaitu
berkisar antara 8,7%-14,5% (CCPR, 2014).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
70
b. Linearitas. Linearitas atau koefisien korelasi diperoleh dari kurva
baku solven. Kurva ini menghubungkan antara kadar azoxystrobin dengan tingkat
respon yang berupa ratio luas puncak azoxystrobin/standar internal. Standar
internal yang digunakan dalam penelitian ini adalah dekaklorobifenil (DCB).
DCB dengan konsentrasi 0,0001 mg/mL dimasukan pada sampel sebelum
diinjeksikan ke GC-ECD dengan jumlah yang konstan yaitu 1 µL dalam setiap
100 µL pelarut. Tujuan dari standar internal ini adalah untuk mengoreksi
kesalahan yang terjadi dalam sistem GC-ECD dan mengoreksi efek matrik jika
dilakukan pada kurva baku adisi. DCB dipilih sebagai standar internal karena
dapat dideteksi menggunakan GC-ECD. Kurva baku yang dihasilkan dalam
penelitian ini ditunjukan pada Gambar 7 berikut:
Gambar 7 Kurva Hubungan Kadar Azoxystrobin Vs Rasio AUC
Azoxystrobin/DCB
Linearitas merupakan kemampuan (dalam rentang tertentu) untuk
mendapatkan hasil penelitian yang proporsional terhadap konsentrasi analit
dalam sampel. Pada kurva baku diatas menunjukan hubungan yang linier pada
y = 9.3251x - 0.1996 R² = 0.9997
02468
10
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
Rat
io A
UC
Azo
x/D
CB
Kadar (ng)
Kurva hubungan kadar azoxystrobin vs rasio AUC azoxystrobin/DCB
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
71
rentang kadar azoxystrobin 0,0456 ng - 0,091 ng dengan nilai koefisien korelasi
(R2) sebesar 0,9913-0,9997. Persyaratan nilai koefiien korelasi (R2) untuk uji
kategori impurity, yaitu R2 ≥0.990 (AOAC,2002). Sehingga metode ini
dinyatakan memiliki linearitas yang baik.
c. Sensitivitas. Limit of detection (LOD) atau Instrumental Detection
Limit (IDL) merupakan salah satu parameter sensitivitas sistem. LOD adalah
konsentrasi yang menghasilkan sinyal instrumen yang berbeda signifikan
dengan sinyal blanko (Miller and Miller, 2010). Sinyal yang berbeda signifikan
dari blanko adalah intersep + 3 S intersep, oleh karena itu LOD adalah
konsentrasi azoxystrobin yang memberikan sinyal sebesar intersep+ 3 S
intersep. Semakin kecil nilai LOD maka semakin sensitif suatu instrumen. LOD
dalam penelitian ini ditentukan dari penggabungan tiga kurva baku dengan
tujuh konsentrasi terkecil yang memiliki linearitas cukup baik. Kisaran
linearitas yang dipakai antara 0,046 ng – 0,137 ng. LOD yang didapatkan
seperti dalam tabel dibawah ini
Tabel VIII. Hasil Uji Sensitivitas GC-ECD
Kurva Baku Linearitas Persamaan a0 B LOD
(ng/ul) 1 0,99966 F(x) = -0,05730 + 3,69561 x 0,008 3,696 0,003
2 0,99977 F(x) = -0,17440 + 8,98156 x 0,017 8,982 0,003
3 0,99174 F(x) = 0,21263 + 5,09538 x 0,058 5,095 0,017
Berdasarkan data diatas didapatkan nilai LOD antara 0,003 ng/µL –
0,017 ng/µL. Sensitivitas dari suatu prosedur analisis merupakan perubahan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
72
besaran respon sebagai akibat perubahan besaran konsentrasi. Dalam sebuah
fungsi kalibrasi sensitivitas dinyatakan sebagai kemiringan kurva (slope).
Semakin besar nilai kemiringan kurva maka dikatakan metode semakin sensitif.
Hal ini dikarenakan dengan adanya sedikit saja perubahan konsentrasi analit
maka akan menimbulkan respon yang signifikan pada sistem. Nilai slope dari
persamaan regresi linier sebesar 3,696 – 8,982.
Instrumental Quantitation Limit (IQL) merupakan kadar terkecil dari
seri kurva baku yang masih dapat diterima keterulangannya dengan maksimal
% RSD, % D < 20%. IQL merupakan salah satu parameter bahwa pada kadar
tersebut dapat dikuantifikasikan sistem dengan kondisi yang digunakan. Nilai
IQL yang didapat dalam penelitian ini sebesar 2 µL larutan standar intermediet
B yang dilarutkan dalam 200 µL heksan atau sama dengan kadar sebesar 0,091
ng.
d. Akurasi. Percent difference (%D) digunakan untuk mengetahui
kedekatan hasil injeksi larutan standar kurva baku pada GC-ECD dengan kadar
sesungguhnya larutan tersebut. Menurut USDA (2015) % D dapat diterima jika
nilainya ≤ 20%. Adapun hasil % D untuk tiga replikasi kurva baku adalah
sebagai berikut:
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
73
Tabel IX. Hasil % D Analisis Kuantitatif GC-ECD
Kadar (ng) C1 C1' % D 0,046 0,046 0,046 1,066 0,091 0,091 0,092 0,708 0,137 0,137 0,133 2,442 0,182 0,182 0,178 2,348 0,228 0,228 0,225 1,362 0,319 0,319 0,328 2,750 0,456 0,456 0,460 0,798 0,912 0,912 0,909 0,313
Rata-rata 1,473
Disimpulkan berdasarkan presisi, akurasi, kisaran dan linearitas kurva
baku serta LOD yang dicapai GC-ECD dapat digunakan untuk menetapkan
residu azoxystrobin.
B. Preparasi Sampel Melon
1. Homogenisasi
Metode homogenisasi yang tepat sangat diperlukan untuk mendapatkan
sampel yang homogen. Sampling analytical portion untuk melon dilakukan
dengan metode kuartering agar diperoleh sampel yang representatif. Dalam
preparasi sampel, dilakukan penetapan kadar air di dalam buah melon, untuk
mengetahui perlu tidaknya penambahan air saat preparasi sampel. Hasil penelitian
yang dilakukan menyatakan bahwa kandungan kadar air di dalam buah melon
adalah berkisar 92,224% untuk bagian daging 93,782% untuk bagian whole, dan
93,050% untuk bagian kulit, sehingga untuk preparasi sampel dengan metode
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
74
QuEChERS yang mempersyaratkan kadar air lebih dari 80% (Anastasiades, 2006)
tidak diperlukan penambahan air.
Tabel X. Kadar Air Dalam Buah Melon
2. Ekstraksi dengan Metode QuEChERS
Prinsip dari QuEChERS dalam penelitian ini adalah melakukan ekstraksi
analit menggunakan pelarut (asetonitril) dan 2 g MgSO4 ; 0,5 g NaCl ; 0,5 g Na3
citrate 2H2O ; 0,25 g Na2H citrate 1.5H2O untuk mengurangi kadar air yang
berlebih dalam sampel dengan tetap mengatur kondisi pH agar sampel dalam
kondisi stabil dalam bentuk molekul dan diperoleh recovery yang baik dan di
lanjutkan dengan sentrifugasi untuk dapat memisahkan senyawa berdasarkan
ukuran partikel dan berat jenis. Kemudian dilakukan clean-up dan di determinasi
menggunakan GC-ECD. Peneliti memilih menggunakan metode Buffer
QuEChERS karena dengan menjaga pH sampel antara 4-5 diharapkan
azoxystrobin dalam keadaan stabil dalam bentuk molekul dan co-ekstraktan
minimal. Sesuai dengan literatur dibawah ini:
Kategori
Replikasi I Replikasi II Kadar air Rata-rata
Kadar air
Berat Awal Zat
Berat Akhir
Zat Selisih
Berat Awal Zat
Berat Akhir Zat
Selisih Replikasi I
Replikasi II
Kulit 10,052 0,559 9,493 10,001 0,834 9,167 94,439 91,661 93,050 Whole 10,068 0,402 9,666 10,007 0,845 9,162 96,007 91,556 93,782 Daging 10,030 0,690 9,340 10,009 0,868 9,141 93,121 91,328 92,224
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
75
Gambar 8. Pengaruh pH terhadap Jumlah Co-Extractant (Anastassiades, 2006)
Citrate buffer pada pH 4-5 memberikan jumlah co-ektraktan dalam hasil
ekstraksi yang lebih sedikit jika dibangingkan dengan jumlah co ektraktan pada
raw material original QuEChERS maupun acetate buffer. Pemilihan metode
QuEChERS ini dilakukan dengan melihat jumlah co-ektraktan yang paling sedikit
didalam pelarut yang memiliki kelarutan paling baik. Asetonitril merupakan
pelarut yang umum digunakan dalam metode QuEChERS. Buffer QuEChERS
menggunakan empat jenis garam antara lain: Magnesium sulfate anhidrate,
natrium klorida, natrium sitrat dan disodium sitrat hydrogenate sesquihydrate.
Magnesium sulfate anhidrate digunakan untuk menginduksi pemisahan antara
asetonitril dengan air dalam sistem LLE dan meningkatkan recovery analit polar.
Natrium klorida berfungsi sebagai garam penyangga dan mengurangi interfensi
senyawa polar, natrium sitrat dan disodium sitrat hydrogenate sesquihydrate
ditambahkan untuk mengontrol pH, mempertahankan tingkat pH antara 4 dan 6,
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
76
dan untuk stabilitas dasar pestisida yang sensitif. Setelah dilakukan ekstraksi,
larutan organik asetonitril yang mengandung azoxystrobin akan berada dilapisan
atas (Leung, 2012).
Keunggulannya dari citrat buffer QuEChERS ini adalah nilai recovery
yang bagus bahkan untuk pestisida paling asam, recovery dapat diterima pada
pestisida yang sensitif terhadap asam maupun basa, mampu meningkatkan
selektifitas, dan tidak memberikan efek negatif jika menggunakan clean-up PSA,
tidak seperti asetat buffer (Anastassiades, 2006).
Penggojokan dilakukan dengan kuat selama satu menit untuk memecah
gumpalan matriks sampel. Semakin kecil gumpalan matriks, maka luas
permukaan akan semakin meningkat sehingga kesetimbangan yang optimum akan
lebih cepat dicapai. Optimasi lama sentrifugasi dilakukan dengan berbagai macam
waktu yaitu 5, 10, 15 menit dengan kecepatan tetap yaitu 5000 rpm. Dengan
waktu 5 menit didapatkan hasil yang efektif, yaitu dengan waktu yang relatif
pendek sudah mampu mendapatkan supernatan dengan jumlah yang cukup.
Penambahan waktu dalam variabel diatas tidak terlalu mempengaruhi jumlah
supernatan yang dihasilkan, yaitu hanya berkisar 4 mL.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
77
Gambar 9. Hasil Optimasi Lama Waktu Sentrifugasi
Hasil sentrifugasi menunjukan bahwa asetonitril berada di bagian atas
dan air berada dibagian bawah karena massa jenis air lebih besar dari asetonitril.
Tingkat kelarutan azoxystrobin didalam asetonitril sebesar 340 g/L, sedangkan
kelarutannya di dalam air hanya 6,7 mg/L. Oleh sebab inilah diperlukan
penambahan garam NaCl untuk salting out effect mengurangi kelarutan
azoxystrobin dalam air, dan memaksa masuk kedalam lapisan asetonitril.
Reekstraksi dilakukan dalam penelitian ini agar diperoleh % recovery
yang lebih baik, dan meminimalisir analit yang masih tertinggal didalam matriks.
Kesetimbangan akan lebih banyak tercapai saat dilakukan reekstraksi. Hasil
supernatan diambil semua agar dapat merepresentasikan jumlah azoxystrobin
yang terekstrak dalam tiap 5 gram sampel melon.
00.5
11.5
22.5
33.5
44.5
5
5 menit 10 menit 15 menit
jum
lah
supe
rnat
an
waktu
Optimasi Lama Sentrifugasi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
78
3. Optimasi clean-up
Clean-up merupakan salah satu proses yang penting untuk mendapatkan
ekstrak bersih saat akan dideterminasi meggunakan GC-ECD. Azoxystrobin
memiliki log POW sebesar 2,71 at 20 °C sehingga pada pH 5,03 tidak mengalami
disosiasi dan dapat terjerab pada fasa diam C18. Sistem yang digunakan dalam
clean-up pada penelitian ini adalah sistem reverse-phase SPE. Peneliti memilih
pelarut yang mampu menahan semua analit yang dituju pada penjerap yang
digunakan (C18), dengan ikatan lemah agar dapat terelusi. Senyawa yang lebih
polar akan terelusi dengan fasa gerak air . Sehingga terpilihlah aquabidest sebagai
pelarut pertama karena hanya memiliki kelarutan sebesar 6,7 mg/L. Analit yang
dituju selanjutnya dielusi dengan menggunakan metanol yang akan mengambil
analit yang tertahan pada penjerap karena kelarutan analit didalam metanol kurang
lebih 20 g/L. Strategi ini bermanfaat jika analit yang dituju berkadar rendah
(Gandjar dan Rohman, 2007). Beberapa optimasi clean-up yang dilakukan dalam
penelitian ini adalah kapasitas berat SPE, washing dan fraksinasi elusi metanol
untuk mengelusi analit
Tabel XI. Hasil Optimasi Clean-up
Optimasi Hasil
Kapasitas SPE ≥ 50 mg, yang digunakan 400 mg
Pencucian SPE 30 mL metanol dilanjut 10 mL aquabidest
Kelayakan SPE Dapat digunakan 3x
Washing SPE 5 mL aquabidest
Elusi SPE 3 mL metanol
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
79
a. Kapasitas berat SPE. Jenis berat SPE ada banyak sekali antara lain 30
mg, 50 mg, 60 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 500 mg, 1 g, 2 g, 5 g, 20 g dll.
Berat sorben SPE menentukan jumlah maksimum analit untuk dapat tetap tertahan
(Anonim2).
Gambar 10. Jenis-jenis SPE dan Kapasitasnya (Sigma aldrich)
Kapasitas SPE ditentukan dengan menimbang berat 1 mL ekstrak. Berat
1 mL sampel per gramnya tidak boleh melebihi 5% dari berat catride SPE. Hasil
perhitungan tiap 1 mL sampel kering sebesar 2,5 mg, oleh karena itu SPE yang
boleh digunakan harus lebih dai 50 mg. Peneliti menggunakan SPE C18 dengan
berat 400 mg.
b. Optimasi kelayakan SPE untuk digunakan lebih dari satu kali. Dalam
penelitian ini SPE C18 digunakan lebih dari satu kali dan tidak lebih dari tiga kali.
Optimasi ini dilakukan dengan menginjekan 15uL standar intermediet B
menggunakan SPE yang sama. Pencucian SPE dilakukan dengan menggunakan
30 mL metanol dan 10 mL aquabidest . SPE masih dapat dikatakan layak
digunakan apabila % RSD kurang dari 20% (CCPR,2014) yang artinya masih
memiliki keterulangan yang baik dan hasil % recovery yang diharapkan masih
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
80
dalam kisaran 80-120%. Adapun data presisi dan % recovery dari penggunaan
SPE secara berulang sebagai berikut:
Tabel XII. Hasil Preisi dan Akurasi Kelayakan SPE
Massa (ng) AUC DCB
AUC azox Ratio
% Recovery
% Kesalahan
0,684 25368,2 51682,4 2,037 110.666 10.666 0,684 16110,5 33144,7 2,057 105.428 5.428 0,684 20158,1 40942,2 2,031 86.878 13.122
Rata-Rata 2,042 100,991 9,739 SD 0,014
% RSD 0,672
Dari data diatas menyatakan bahwa SPE masih layak digunakan
sebanyak tiga kali pemakaian dengan tiap kali pencucian menggunakan 30 mL
metanol dan dilanjutkan dengan 10 mL aquabidest.
c. Optimasi washing. Hasil injeksi eluat metanol setelah washing
menggunakan 5% MeOH dan 100% aquabidest dipresentasikan pada gambar
berikut:
Gambar 11. Hasil Eluat Metanol Setelah Washing 5% MeOH dan 100% Aquabidest
Eluat metanol setelah washing menggunakan 100% aquabidest
menghasilkan luas puncak standar yang lebih besar jika dibandingkan dengan
0
1000000
2000000
washing 5% Metanol washing 100% UPW
AUC
Azox
ystr
obin
AUC Azoxystrobin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
81
eluat metanol setelah washing menggunakan 5% metanol. Terbukti pada
kromatogram aquabidest hasil wahing yang ditampung, tidak menunjukan
terdeteksinya azoxystrobin yang terikut pada cairan washing.
Gambar 12. Hasil Tampungan Washing Menggunakan 100% Aquabidest
d. Fraksinasi jumlah metanol untuk menarik analit. Fraksinasi penarikan
analit menggunakan metanol dengan konsentrasi adisi 50uL stok A didapatkan
lima fraksi dengan grafik seperti dibawah ini:
Gambar 13. Fraksinasi Elusi Metanol untuk Menarik Analit
0
500000
1000000
1500000
2000000
Fraksi I Fraksi II Fraksi III Fraksi IV Fraksi VAUC
Azox
ystr
obin
Jumlah Fraksi
Fraksinasi Elusi Metanol
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
82
Hasil fraksinasi ke-3 menyatakan bahwa dengan mengelusikan 3 mL
metanol sudah cukup untuk menarik analit yang diharapkan yaitu sebesar
99,830%.
C. Validasi Metode Analisis
Kriteria validasi metode analisis residu pestisida meliputi recovery
ekstraksi, recovery clean-up, pengukuran determinasi, calibration range dari
determinasi analit, LOD dan LOQ (CCPR, 2014).
Untuk menguji kinerja clean-up dengan kolom SPE C18, adisi dilakukan
pada ekstrak blanko melon sebelum dilakukan SPE. Sedangkan untuk menguji
kinerja GC-ECD saat menetapkan kadar azoxystrobin dalam matriks ekstrak
melon bersih (setelah melalui clean-up SPE C18) dilakukan adisi standar pada
ekstrak bersih. Apabila kedua uji ini memenuhi persyaratan revovery mencapai
70% - 120% (CCPR, 2014), maka dilakukan penetapan akurasi metode analisis
yang baru dikembangkan ini. LOQ/LCL/LLMV metode teroptimasi ini ditetapkan
pada konsentrasi terendah yang telah memenuhi kriteria akurasi dan presisi.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
83
1. Kinerja GC-ECD dalam Mendeteksi Azoxystrobin pada Matriks Ekstrak
Melon Bersih (Jalur C)
a.
b.
Gambar 14. Blangko Matriks Melon (a) dan Blanko yang Diadisi Standar
Azoxystobin (b)
Selektifitas merupakan kemampuan untuk mengukur analit yang dituju
secara tepat dan spesifik dengan adanya komponen-komponen lain dalam matriks
sampel seperti ketidakmurnian, produk degradasi dan komponen matriks. Dapat
dilihat pada gambar 14a. bahwa tidak adanya peak pengganggu dalam waktu tR
Azoxystrobin
Blank
DCB
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
84
azoxystrobin (32,294 menit). Hal ini membuktikan bahwa berbagai impurities dari
matriks tidak mempengaruhi selektifitas metode. Hal ini juga ditunjukan dengan
nilai resolusi yang ≥ 1,2 seperti tabel dibawah ini:
Tabel XIII. Kinerja GC ECD dalam Mendeteksi Azoxystrobin dalam Buah Melon
No Rs awal
Rs Akhir N Tf Keajegan
Tr 1 2,975 3,584 112472,232 0,667 1,423 2 2,994 5,444 186626,592 0,333 1,428 3 2,541 3,009 57551,187 0,750 1,424 4 2,534 4,254 82830,375 0,500 1,429 5 2,123 3,564 82207,976 0,500 1,483 6 2,884 3,240 77907,230 0,500 1,423
Penelitian ini memiliki tiga kurva baku adisi yaitu penambahan standar
sebelum ekstraksi (Jalur A); penambahan standar sebelum clean-up (Jalur B);
dan penambahan standar sebelum diinjeksikan ke GC-ECD (Jalur C). Peneliti
memulai dengan Jalur C untuk memastikan bahwa penambahan standar pada
matriks tetap dapat memberikan % recovery yang baik yaitu berkisar antara 80-
120%.
Parameter-parameter yang telah dipenuhi saat penambahan standar
sebelum diinjeksikan ke GC-ECD (Jalur C) meliputi akurasi dan presisi yang
ditunjukan dalam tabel dibawah ini:
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
85
Tabel XIV. Hasil Presisi Jalur C
Massa (ng) Respon factor
R1 R2 0,137 0,151 0,064 0,228 0,119 0,075 0,319 0,158 0,078 0,456 0,207 0,089 0,593 0,215 0,086 0,730 0,207 0,093 0,912 0,187 0,093
Rata-rata 0,178 0,082 SD 0,036 0,011 %RSD 20 13
Tabel XV. Hasil Akurasi Jalur C
Massa (ng)
Recovery 1
Recovery 2
Recovery 3 Rata-rata Recovery
0,137 61,691 98,174 134,010 97,958 0,228 77,110 156,359 120,064 117,844 0,319 80,826 114,100 119,695 104,874 0,456 81,079 91,776 107,902 93,585 0,593 83,640 90,992 113,767 96,133 0,730 88,984 97,238 105,450 97,224
Repeatability Jalur C dapat dikatakan optimum karena nilai %RSD 13-20%.
Rentang kadar 0,137 ng- 0,730 ng memiliki recovery berkisar antara 93-117%.
Nilai recovery didapatkan dengan memasukan hasil respon GC-ECD pada
persamaan kurva baku dengan kriteria kurva baku yang mendekati tanggal
penginjekan sampel validasi. Peneliti menggunakan kurva baku karena
berdasarkan hasil uji signifikansi antara kurva baku dengan kurva adisi tidak
berbeda signifikan secara statistik. Dimana didapatkan hasil nilai t thitung sebesar
1,513771 dan t tabel sebesar 2,14 , yang mana jika t hitung lebih kecil dari t tabel
maka nilai yang diujikan tidak berbeda signifikan.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
86
Gambar 15. Kurva Baku vs Kurva Adisi C
Dalam penelitian ini didapatkan nilai % D atas kedekatan nilai yang
didapat dengan yang ditambahkan berkisar antara 1,7-14,8%, maka prosedur
analisis Jalur C dapat disimpulkan telah optimum dilihat dari kriteria presisi dan
akurasi baik dari nilai recovery yang dapat berkisar antara 70-125% atau nilai %
D yang mampu ≤ 20 %.
Tabel XVI. Hasil %D Jalur C
Massa (ng) % D 0,137 14,896 0,228 6,329 0,319 7,945 0,456 1,701 0,593 4,622 0,730 2,724
y = 4.4245x + 0.5503 R² = 0.9942
y = 4.5508x + 0.2963 R² = 0.989
00.5
11.5
22.5
33.5
44.5
5
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
Ratio
AU
C Az
ox/D
CB
Massa (ng)
Kurva Baku vs Kurva Adisi C
Kurva Adisi C
Kurva Baku
Linear (Kurva Adisi C)
Linear (Kurva Baku)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
87
2. Kinerja Clean-up dengan Kolom SPE C18 (Jalur B)
Jalur B digunakan untuk mengetahui kelayakan dari prosedur analisis
proses clean-up menggunakan SPE C18 dengan melihat akurasi dan presisi seperti
pada tabel dibawah ini:
Tabel XVII. Hasil Presisi Jalur B
Massa (ng) Respon factor
R1 R2 R3 0,137 8,340 3,190 8,367 0,228 8,141
9,170
0,319 7,018 2,855 8,156 0,456 6,664 2,745 8,129 0,593 7,102 2,887 7,972 0,730 7,198 2,706 8,176 0,912 5,271 2,770 8,807
rata-rata 7,105 2,859 8,397 SD 1,014 0,176 0,433
%RSD 14,276 6,158 5,160
Tabel XVIII. Hasil Akurasi Jalur B
Massa (ng)
Recovery 1
Recovery 2
Recovery 3 Rata-rata Recovery
0,091 116,342 84,359 85,575 95,425 0,137 93,119 65,722 95,425 84,755 0,228 101,652
117,819 109,735
0,319 90,159 96,201 107,596 97,985 0,456 88,675 101,462 110,633 100,257 0,593 97,044 113,507 110,190 106,914 0,730 99,680 108,699 114,317 107,565
Repeatability Jalur B dapat dikatakan optimum karena nilai %RSD yang
didapatkan kurang dari 20% (CCPR, 2014) yaitu sebesar 5-14%. Recovery pada
rentang kadar 0,091 ng- 0,912 ng berkisar antara 84-109%. Seperti halnya jalur
C, recovery didapatkan dengan menggunkan kurva baku yang memiliki kedekatan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
88
waktu dalam penginjekan dengan sampel validasi, hal ini dikarenakan kedua
kurva baku dan kurva adisi tidak berbeda signifikan seperti Gambar 16 dibawah
ini:
Gambar 16. Kurva Baku vs Kurva Adisi B
Dalam penelitian ini akurasi juga ditentukan dengan nilai % D, jika % D
≤20% maka metode dikatakan akurat, karena nilai yang didapatkan dengan nilai
yang ditambahkan memiliki kedekatan seperti yang ada pada Tabel XIX:
Tabel XIX. Hasil %D Jalur C
Massa (ng) % D 0,137 0,633 0,228 9,521 0,319 2,752 0,456 3,271 0,593 5,238 0,730 2,893
y = 6.567x + 0.2915 R² = 0.9927
y = 6.852x + 0.2681 R² = 0.9963
0
1
2
3
4
5
6
7
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
Ratio
AU
C Az
ox/D
CB
Massa (ng)
Kurva Baku vs Kurva Adisi B
Kurva Adisi B
Kurva Baku
Linear (Kurva Adisi B)
Linear (Kurva Baku)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
89
Berdasarkan hasil diatas, dapat dinyatakan bahwa proses clean-up sudah
optimum dengan telah memenuhi persyaratan yang dipersyaratkan. Sehingga
dapat dilakukan validasi metode analisis secara penuh.
3. Akurasi dan Presisi Metode Analisis Teroptimasi (Jalur A)
Tujuan dilakukannya Jalur A adalah untuk mendapatkan hasil validasi
metode secara keseluruhan. Jalur A inilah yang dinamakan kurva baku adisi yang
akan dibuat dalam kesimpulan, untuk menentukan apakah metode ini dapat
diguanakn untuk analisis residu fungisida azoxystrobin atau tidak.
a. Linearitas. Linearitas merupakan suatu parameter analisis yang
menggambarkan kemampuan suatu alat untuk memperoleh hasil pengujian yang
sebanding dengan kadar analit dalam zat uji pada rentang kadar tertentu yang
dinyatakan dalam koefisien korelasi (R2).
Persamaan linear yang diperoleh dari hasil penelitian yaitu y = 2,485x +
0,3382 dengan koefisien korelasi R² = 0,9832. Persamaan tersebut memiliki slope
sebesar 2,485 pada kisaran linearitas 0,0912 ng – 0,684 ng.
Gambar 17. Linearitas Kurva Baku Adisi
y = 2.485x + 0.3382 R² = 0.9832
0
1
2
3
0 0.2 0.4 0.6 0.8
Ratio
AU
C Az
o/DC
B
Kadar (ng)
Kurva Baku Adisi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
90
Menurut Association of Official Analytical Chemist (AOAC, 2005) suatu
metode akan dikatakan linear apabila menghasilkan nilai koefisien korelaasi (R2)
≥0,990. Hal ini menunjukan bahwa metode ini dengan rentang 0,0912 ng - 0,684
ng kurang linear. Namun untuk kategori impurity menurut Ahuja and Dong
(2005) suatu metode dikatakan linear jika nilai r ≥ 0,98, sehingga metode
penentapan kadar residu pestisida azoxystrobin dalam buah melon telah
memenuhi persyartan yang ditentukan.
b. Presisi. Presisi dilakukan untuk melihat kedekatan antara hasil uji
yang diperoleh pada sampel yang homogen pada kondisi tertentu. Presisi dapat
ditentukan dengan keterulangan. Keterulangan metode analisis residu fungisida
azoxytrobin dapat ditetapkan dengan melihat nilai %RSD Rf. Respon factor
merupakan perbandingan antara respon GC-ECD dengan konsentrasi analit.
Menurut USDA (2015), jika %RSD RF ≤ 20 % maka keterulangan metode
tersebut dikatakan baik. Berikut merupakan hasil keterulangan kurva adisi validasi
metode analisis secara keseluruhan:
Tabel XX. Hasil Presisi Kurva Adisi
Massa (ng)
Respon factor Replikasi 1 Replikasi 2
0,137 3,448 4,045 0,228 4,186 4,319 0,319 4,040 3,790 0,456 3,319 3,160 0,593 2,583 2,573 0,684 2,969 3,008
Rata-rata 3,424 3,483 SD 0,614 0,673
%RSD 17,930 19,338
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
91
Nilai % RSD Rf dalam validasi penelitian secara keseluruhan (Jalur A)
sebesar 17-19% yang mana telah memenuhi kriteria keterulangan yang baik.
c. Akurasi, dilakukan untuk melihat ketepatan atau kecermatan metode
analisis. Kecermatan dinyatakan dalam persen perolehan kembali (% recovery)
yang didapatkan dari memasukan respon yang berupa ratio AUC
azoxystrobin/DCB pada kurva baku yang terdekat.
Gambar 18. Kurva Baku vs Kurva Adisi A
Hasil uji akurasi yang meliputi % recovery dan % D dalam penelitian ini
dapat dilihat pada tabel:
Tabel XXI. Hasil Akurasi Kurva Adisi
Massa (ng)
Recovery 1
Recovery 2
Recovery 3
Rata-rata Recovery
0,091 115,266 103,078 81,392 99,912 0,137 89,536 102,471 124,696 105,568 0,319 134,078 120,708 104,903 119,896 0,456 112,211 103,424 94,530 103,389 0,593 87,441 84,897 79,751 84,030 0,684 103,062 102,619 97,009 100,897
y = 2.6852x + 0.2555 R² = 0.9802
y = 2.6773x - 0.0774 R² = 0.985
0
0.5
1
1.5
2
2.5
0 0.2 0.4 0.6 0.8
Ratio
AU
C Az
ox/D
CB
Massa (ng)
Kurva Baku vs Kurva Adisi A
Kurva Adisi A
Kurva Baku
Linear (Kurva Adisi A)
Linear (Kurva Baku )
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
92
Berdasarkan Tabel XXI. terlihat bahwa nilai persen perolehan kembali
(% Recovery) yang diperoleh pada penelitian ini telah memenuhi persyaratan
karena berada pada rentang 70-120% (CCPR 2014) yaitu sebesar 84-119%,
dengan nilai % RSD kurang dari 20 % dan % D berkisar antara 0,038-19,332%
sebagai berikut:
Tabel XXII. Hasil % D Validasi Metode Analisis
Massa (ng) % D 0,137 11,578 0,228 17,146 0,319 3,263 0,456 4,985 0,593 19,332 0,684 0,038
Dari penelitian ini akurasi dan presisi metode analisis dinyatakan
memenuhi parameter yang dipersyaratkan.
d. Sensitivitas (LOQ). Batas kuantisasi merupakan parameter yang
diartikan sebagai konsentrasi terkecil analit dalam sampel yang masih dapat
memenuhi kriteria cermat dan seksama (Harmita, 2004). Berdasarkan hasil
pengukuran LOQ untuk azoxystrobin diperoleh nilai batas kuantitasi sebesar
0,0008 µg/g. nilai ini telah mencapai yang dipersyaratkan yaitu lebih kecil dari
positif list sebesar 0,01 µg/g.
e. LLMV. Tingkat konsentrasi terendah di mana metode analisis
sebenarnya telah mampu divalidasi di laboratorium (CCPR, 2014). Dari hasil
perhitungan didapatkan LLMV sebesar 0,005 µg/g. Berdasarkan metode ini
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
93
diketahui bahwa % kesalahan dalam ekstraksi, clean-up dan determinasi secara
berturut-turut adalah 3,87%, 3,05%, 9,1%.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
1. Asetonitril mampu menjadi pelarut organik dalam proses ekstraksi
azoxystrobin dalam buah melon, dengan kesalahan ekstraksi 9,1%.
2. SPE C18 merupakan metode clean-up yang baik dalam memisahkan
azoxystrobin pada matriks buah melon. Recovery fortifikasi sebelum clean-up
dengan kolom SPE C18 sebesar 84-107%, % RSD 5-14%, % D sebesar
0,633-9,521% dengan kesalahan clean-up sebesar 3,05%.
3. Validasi metode analisis dilakukan pada sampel blanko dan sampel yang di
fortifikasi dilakukan pada instrument yang teroptimasi.
a. Kinerja kuantitatif GC teroptimasi adalah rata-rata %D <20%, linearitas
0,9913-0,9997 pada kisaran linearitas 0,0456 ng- 0,912 ng, dengan IDL
0,003 µg/mL - 0,01 µg/mL dan IQL 0,047 µg/mL.
b. Kinerja GC pada ekstrak sampel blanko yang di fortifikasi 0,137 ng-
0,730 ng sebelum di injeksikan memberoleh recovery 93%-117% dan %
RSD sebesar 13-20%, % D 1,7-14,8% dengan kesalahan determinasi
sebesar 3,87%.
c. Kinerja metode analisis melalui fortifikasi 0,091 ng – 0,684 ng pada buah
melon memberikan recovery berkisar antara 84 % - 119% dengan %
RSD 17-19%, %D sebesar 0,03-17,1%. Linearity range 0,002 µg/g –
0,014 µg/g dengan LOQ 0,0008 µg/g dan LLMV 0,005 µg/g. Dengan
94
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
95
demikian validasi metode ini memenuhi persyaratan untuk memantau
kadar Azoxystrobin dalam buah melon dibawah positif list sebesar 0,01
µg/g.
B. Saran
Perlu adanya pembandingan lebih lanjut suatu hasil proses ekstraksi jika
menggunakan PSA.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
96
DAFTAR PUSTAKA
Ahuja, S., and Dong, M.W., 2005, Handbook of Pharmaceutical Analysis by HPLC, volume 6, Elsevier, Inc., USA, p. 192.
Anastassiades, Michelangelo, 2006, The QuEChERS Method –Background Informationand Recent Developments, Community Reference LaboratoryPesticide Residuesusing Single Residue Methods, Stuttgart, p.50,66.
Anonim1, Pesticide Residue Analysis: QuEChERS Informational Booklet, Enviro, USA, diunduh pada tanggal 03 Oktober 2014.
Anonim2,Strata, Extraction Method Development, phenomenex, https://www.brechbuehler.ch/fileadmin/redacteur/pdf/columns-sampleprep/sample-prep/z007.pdf, diakses tanggal 10 Oktober 2015.
AOAC, 2002. AOAC Guidelines for Single Laboratory Validation of Chemical Methods for dietary Supplements and Botanicals. Diakses dari www.aoac.org/Official_Methods/slv_guidelines.pdf, pada tanggal 16 Januari 2014.
AOAC, 2007, Pesticide Residues in Foods by Acetonitrile Extraction and Partitioning with Magnesium Sulfate Gas Chromatography/Mass Spectrometry and Liquid Chromatography/Tandem Mass Spectrometry, AOAC International, diakses pada tanggal 03 Oktober 2014.
AOAC, 2012, Appendix F: Guidelines for Standard Method Performance Requirements, AOAC Official Methods Of Analysis, Pp 1-17.
Burton, L. DeVere., 2010, Agriscience Fundamentals and Applications, Edisi kelima, Delmar Cengage Learning, USA, p.286.
Cairns, Donald., 2004, Intisari Kimia Farmasi, EGC, Jakarta, hal 31.
CCPR, 2003, Joint Fao/Who Food Standards Programme, Codex Alimentarius Commission, Twenty-Fifth Session, Fao-Who, Italy, P 1-106
CCPR, 2014, Joint Fao/Who Food Standards Programme Codex Alimentarius Commission: Report Of The 46th Session Of The Codex Committee On Pesticide Residues, Switzerland
Christian, G.D., 2004, Analytical Chemistry, 6th edition, John Wiley & Sons, Inc., USA, p. 128, 585-588.
Codexalimentarius,http://www.codexalimentarius.org/standards/pestres/commodities-detail/en/?c_id=285 , diakses tanggal 10 Oktober 2015.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
97
CRI, 2010, Menjual Potensi dan Kendala Agrobisnis Indonesia, Beijing, http://indonesian.cri.cn/201/2010/10/04/1s113232.htm, diakses tanggal 11/2/2015
Czichos Horst,Tetsuy Saito, and Leslie Smith, 2006, Handbook of Material Measurement Methods,CRC Press, New York.pp.160-163.
Day RA dan Al Underwood. 2006. Analisis Kimia Kuantitatif, Edisi Keenam. Sopyan Iis, penerjemah. Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Quantitative Analysis.
DEPTAN. 2006. Penggunaan Pestisida secara Bijaksana. Jakarta: Direktorat Jenderal Tanaman Pangan dan Holtikultura.
Djojosumarto, Panut, 2008, Panduan Lengkap Pestisida & Aplikasinya, Agromedia Pustaka, Jakarta, hal 1-11.
Dolan, John W., LC Resources Inc., Walnut Creek, 2002, Peak Tailing and Resolution California, USA, LC•GC Europe
Gandjar, I. G. dan Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, cetakan kedua, Penerbit Pustaka Pelajar, Yogyakarta, pp. 378, 389-390, 429,430, 437-438.
Grob, L.R., 1995, Modern Practice of Gas Chromatography, John Wiley and Sons Inc., New York. p. 291-295
Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya, Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol. I, No.3, Farmasi FMIPA-UI, hal 117 – 135.
Harris, D.C., 2010, Quantitative Chemical Analysis, 8th edition, W. H. Freeman and Company, New York, pp. 566-567.
Horwitz, W., 1984, Official Methods of Analysis of AOAC Interational, 13rd Edition, AOAC International, USA, p.16
Jules., Janick, 2012, Horticultural Reviews, Volume 39, John Willey & Sons, New Jersey.
Jennings, E. L., Mittlehldt, E., & Stremple, P., 1987, Analytical Gas Chromatography, 2nd Edition, California, Academic Press, pp 37-61.
Johnson, E. L., & Stevenson, R., 1991, Dasar Kromatografi Cair (Kosasih Padmawinata, Penerbit ITB, Bandung.
Kenndler, Ernst, 2004, Gas Chromatography, Institute for Analytical Chemistry, University of Vienna, pp. 1-33.
Leung, Sueki H, Monika M. Kansal, Carl Sanchez, Art Dixon, and Erica Pike, 2012, Phenomenex, Inc., 411 Madrid Ave., Torrance, CA 90501 USA,
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
98
Analyzing Pesticide Residues in Lettuce by the EN 15662 Method using Phenomenex roQ™ QuEChERS Kits Followed by LC/MS/MS and GC/MS Analysis, TN-0052, APPLICATIONS, p. 1
McNair, H. M. & Miller, J. M., 1998, Basic Gas Chromatography, New York, John Willey & Sons.
Mastovska, Katerina., 2008, Azoxystrobin (229): Agricultural Research Service, United State Departement of Agriculture, Wyndmoor, PA, USA, p. 4.
Martha, Hincapie., 2012, Baseline Sensitivity Of Guignardia citricarpa, The Causal Agent Of Citrus Black Spot To Azoxystrobin, Pyraclostrobin And Fenbuconazole,Ufdcimages.uflib.ufl.edu/UF/E0/04/50/72/00001/HINCAPIE_CAPUTO_M.pdf hal 33, diakses tanggal 14 Mei 2015
Nagel, Macherey, 2004, Gas Chromatography Application Guide / Technical Handbook, MN, German, pp. 2-3.
Nuryanto, Hery., 2000, Budi Daya Melon, Jakarta, Ganeca Exact, hal 1-5.
Nollet, Leo., et all., 2005,Chromatographic Analysis of the Environment, Third Edition, Volume 93, CRC Press (Taylor & Francis Group), New York, p. 46-49.
RAM 305/03, 2004, Standard Operating Procedure Residue Analytical Method for the Determination of Residue of Azoxystrobin (ICI5504) and R230310 in Crop Samples Final Determination by LC-MS/MS, Syngenta, p.6.
Rohman,A., 2009, Kromatografi untuk Analisis Obat, Penerbit Graha Ilmu, Yogyakarta, pp. 217-230.
Rouessac F & R Annick, 2007. Chemical Analysis. Paris: John Wiley & Sons, Ltd
Samadi, Budi., 2007, Melon Usaha Tani Dan Penanganan Pasca Panen, kanisius, Yogyakarta, hal. 12, 18, 85.
Sanco, 2013, Guidance Document on Analytical Quality Control and Validation Procedures for Pesticide Residues Analysis in Food and Feed, European, pp 3-36.
Sharpe. P.T., 1998, Laboratory Techniques in biochemistry and molecular biology: Methods of cell Separation, Elsevier Science Publishers, New York, p 18-19.
Sigma, Aldrich,http://www.sigmaaldrich.com/analytical-chromatography/sample-preparation/spe/tube-configuration-guide.html, diakses tanggal 10 Oktober 2015.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
99
Skoog, D.A., West, D.M., Holler F.J., and Crouch S.R., 2004, Fundamental of Analytical Chemistry, 8th edition, Thomson learning, Inc., USA, pp. 948-950, 959.
Snyder, L.R., Kirkland, J.J., and Dolan, J.W., 2010, Introduction to Modern Liquid Chromatography, 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, pp. 20,813.
Sudarmo, Subiyakto., 1991, Pestisida, Kanisius, Yogyakarta, hal 5-10.
Sumardjo, Damin, 2009, Pengantar Kimia: Buku Panduan kuliah Mahasiswa Kedokteran dan Program Strata I Fakultas bioeksakta, Buku Kedokteran EGC, Jakarta, hal. 472, 482
Sumardiyono, C., 2013, Pengantar Toksikologi Fungisida, Gajah Mada University Press, Yogyakarta, pp. 6-9, 29, 32, 54-60, 88-91, 94-96.
Soeryadi, I., 1997, Kromatografi, Warta Insinyur Kimia, 17-19.
USDA/AMS PDP, 2015, United States Department of Agriculture Agricultural Marketing Service, Science & Technology, Pesticide Data Program, US, pp 2-29.
Wilson, Keith and John Walker, 2001, Principles and Techniques of Practical Biochemistry, fifth edition, United Kingdom, Cambridge, p 262-264.
Wittkowski, R., & Matissek, R..,1990, Cappilary Gas Chromatography in Food Control and Research, Pennsylvania: Technomic Publishing.
Wudianto, R., 1992, Petunjuk Penggunaan Pestisida, Penebar Swadaya, Jakarta.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
100
LAMPIRAN
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
101
Lampiran 1. Perhitungan Sensitivitas Alat
Sensitivitas alat ditentukan dengan menghitung LOD dari:
a. Kurva baku 1
Kadar azoxystrobin
(ng)
Rasio AUC azoxystrobin/DCB
0,046 0,111 0,091 0,285 0,137 0,442
F(x) = -0,05730 + 3,69561 x R2 = 0,99966
Setelah data tersebut diatas diolah menggunakan program powerfit didapatkan: POLYNOMIAL : F(x) = -0.05730 + 3.69561 x
Dihitung menggunakan rumus :
𝐿𝑂𝐷 = 3 𝑥 𝑆𝑎𝑏
= 3 𝑥 0,00843,695
= 0,003 ng/µL
b. Kurva baku 2
Kadar azoxystrobin
(ng)
Rasio AUC azoxystrobin/DCB
0,046 0,232 0,091 0,658 0,137 1,046
F(x) = -0,17440 + 8,98156 x R2 = 0,99977
Coefficient Std Dev. Min. Limit Max. Limit a0 -5,73E-02 8,48E-03 -9,38E-02 -2,08E-02 a1 3,70E+00 6,79E-02 3,40E+00 3,99E+00
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
102
Setelah data tersebut diatas diolah menggunakan program powerfit didapatkan: POLYNOMIAL : F(x) = -0,17440 + 8,98156 x
Coefficient Std Dev. Min. Limit Max. Limit a0 -1,74E-01 1,69E-02 -2,47E-01 -1,02E-01 a1 8,98E+00 1,35E-01 8,40E+00 9,56E+00
Dihitung menggunakan rumus :
𝐿𝑂𝐷 = 3 𝑥 𝑆𝑎𝑏
= 3 𝑥 0,0168,981
= 0,003 ng/µL
c. Kurva baku 3
Kadar azoxystrobin
(ng)
Rasio AUC azoxystrobin/DCB
0,046 0,467 0,091 0,627 0,137 0,950
F(x) = 0,21263 + 5,09538 x R2 = 0,99174
Setelah data tersebut diatas diolah menggunakan program powerfit didapatkan: POLYNOMIAL : F(x) = 0.21263 + 5.09538 x
Dihitung menggunakan rumus :
𝐿𝑂𝐷 = 3 𝑥 𝑆𝑎𝑏
Coefficient Std Dev. Min. Limit
Max. Limit
a0 2,13E-01 5,81E-02 -3.75E-02 4.63E-01 a1 5,10E+00 4,66E-01 3.09E+00 7.10E+00
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
103
= 3𝑥 0,0585,095
= 0,018 ng/µL
Lampiran 2. Kurva Adisi Azoxystrobin pada sampel buah melon
Setelah data tersebut diatas diolah menggunakan program powerfit didapatkan: POLYNOMIAL : F(x) = 0,29934 + 2,60032x
Coefficient Std Dev. Min. Limit
Max. Limit
a0 2,99E-01 3,71E-02 2,21E-01 3,78E-01 a1 2,60E+00 9,82E-02 2,39E+00 2,81E+00
Dihitung menggunakan rumus :
𝐿𝑂𝑄 = 3 𝑥 𝑆𝑎𝑏
= 3𝑥 0,0372,600
= 0,042 ng
= 0,021 ng/µL
= 0,856 ng/g
= 0,0008 µg/g
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
104
Lampiran 3. Perhitungan Resolusi (Rs) dan Resolusi DCB
Rs = 2∆𝑡𝑅𝑊1+𝑤2
Rs Awal = 2(33,914−32,294)0,538 𝑐𝑚+1.384 𝑐𝑚
= 2,540
Rs Akhir = 2(33,914−32,294)0,538 𝑐𝑚+0,538𝑚
= 3,07
Besar Resolusi (Rs) DCB:
No Rs awal Rs Akhir N Tf Keajegan
Ratio azo/DCB
1 1.274 2.015 91472.978 1.667 1.428 2 2.198 5.858 55581.646 1.000 1.423 3 1.002 5.808 55175.379 0.667 1.422 4 1.097 4.631 38482.669 1.000 1.423 5 1.097 1.142 28290.471 1.333 1.423
x 1.424
SD 0.003
RSD 0.189
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
105
Lampiran 4. Certificate of Analysis DCB
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
106
Lampiran 5. Certificate of Analysis NaCl
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
107
Lampiran 6. Certificate of Analysis MgSO4
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
108
Lampiran 7. Certificate of Analysis Na2HCitr
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
109
Lampiran 8. Certificate of Analysis Na3Citr
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
110
Lampiran 9. Certificate of Analysis Acetonitrile
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
111
Lampiran 10. Certificate of Analysis Hexane
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
112
Lampiran 11. Certificate of Analysis Methanol
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
113
Lampiran 12. Certificate of Analysis Azoxystrobin Donasi dari PT Syngenta
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
114
BIOGRAFI PENULIS
Penulis skripsi dengan judul “Validasi Metode Analisis Residu Azoxystrobin dalam Buah Melon (Cucumis melo L.)” memiliki nama lengkap Rizki Seviana Puspitasari. Penulis dilahirkan di Kulon Progo pada tanggal 07 September 1993 sebagai anak pertama dari dua bersaudara, dari pasangan Suhadi dan Warningsih. Pendidikan formal yang pernah ditempuh penulisyaitu TK Seruni IV Glagah Kulon Progo (1997 – 1999), SD Negeri Glagah I Kulon Progo (1999 – 2005), SMP Negeri 1 Temon Kulon Progo (2005 – 2008),
SMA Negeri 1 Wates Kulon Progo(2008 – 2011) dan pada tahun 2011 melanjutkan pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Selama kuliah, penulis aktif dalam berbagai kegiatan dan organisasi antara lain Wakil Ketua Dewan Perwakilan Mahasiswa Fakultas Farmasi (DPMF) periode (2014-2015); peserta Program Kreativitas Mahasiswa yang lolos seleksi dan didanai Hibah Direktorat Pendidikan Tinggi (Dikti) tahun (2014) dengan judul “Crackers Mentri Mbah Kusang (Mengkudu Bernutrisi Limbah Kulit Pisang)”; Sekertaris Event Donor Darah Unit Kegiatan Fakultas Farmasi Islam Sanata Dharma (Fistara) pada tanggal (2013); anggota Divisi Quality Control Dewan Perwakilan Mahasiswa Fakultas Farmasi periode (2012-2013); Koordinator Sie Acara Komisi Pemilihan Umum Gubernur Badan Eksekutif Mahasiswa dan Ketua Dewan Perwakilan Mahasiswa Fakultas Farmasi periode (2012-2013); Panitia Pharmacy Performance dan Pharmacy Road to School (2013) sebagai anggota divisi dana dan usaha; peserta perkuliahan “Guest Lecture on Medical Chemistry by Prof. Dr. Rob Leurs (Vrije Universiteit, The Netherlands) (2013) di Universitas Gadjah Mada; peserta Seminar Nasional “Pemberdayaan Pasien Dalam Self Management Diabetes Melitus untuk Meningkatkan Kualitas Hidup” (2011); peserta makrab Jaringan Makasiswa Kesehatan Indonesia (JMKI) (2012); peserta Seminar “Motivasi dan Inspirasi utuk Meningkatkan Leadership Competencies” (2014); volunteer kegiatan Desa Mitra “Penyuluhan Sikat Gigi dan Cuci Tangan yang Baik di SD N Sumberadi 1 Sleman” (2012); anggota dalam memperingati Hari HIV Aids Jaringan Mahasiswa Kesehatan Indonesia (JMKI) Fakultas Farmasi USD (2012).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
top related