probes and polymerase chain reaction for detection of food-borne bacterial pathogens. j.e. olsen a*...

Probes and polymerase chain reaction for detection of

food-borne bacterial pathogens.J.E. Olsen a* * , S. Aabo b, W. Hill ‘, S. Notermans d, K. Wernars,

P.E. Granum e, T. Popovic f, H.N. Rasmussen a, 0. Olsvik

Microbiología de Alimentos.

226259 Sánchez García Yanira Ivonne

Métodos rápidos de identificación.

Hibridación de ADN PCR

Técnicas de ADN

Cultivo Microbiológico

Directamente de la comida

Introducción• En 1980, Mosley et al.

Esch

eric

hia

coli

ente

roto

xigé

nica

En muestras clínicas en crudo por hibridación de colonias.

Usando fragmentos clonados de los genes que codifican las toxinas LT y ST.

Hibridación• Proceso más común para detectar un gen particular

o un segmento de un ácido nucleico. La variante que mas se utiliza es el uso sondas.

Sondas moleculares• Fragmentos cortos y de una sola cadena de ADN o

ARN, marcados con átomos radioactivos. Las sondas se aparean con secuencias específicas, que permiten la identificación de un fragmento determinado de ADN que forma parte de una molécula mucho mayor.

Técnica de hibridación de colonias.

Metodos de ADN para la detección

de bacterias No se aplican en alimentos.

• Puede deberse a…

• Dependen de los procedimientos tradicionales de cultivo. • Dependen del uso de marcadores radioactivos.

• Sin embargo, estos métodos son cada vez más utilizados.

• Presencia de enzimas inhibitorias• Accesibilidad del organismo diana.• Número de patógenos suele ser reducido y viene acompañado de

un elevado número de microorganismos banales• La normativa

Ensayos de diagnóstico.

El principio esencial de los métodos de detección basados en

ácidos nucleicos es la específica formación de moléculas de ácidos nucleicos de doble cadena a partir

de dos moléculas complementarias de cadena

sencilla en las condiciones físicas y químicas definidas.

Hibridación.

In vitro HibridaciónUna de las cadenas

se produce en el laboratorio

Sonda (H)

Mientras que la otra hebra la

proporciona el organismo diana.

La sonda y el ácido nucleico objetivo.

Si se forman híbridos entre:

Hibridación de fase sencilla

Hibridación de colonias

Reacción en cadena de la polimerasa.Un fragmento de ADN específico se amplifica durante un proceso cíclico de 3 pasos…

El ADN diana se desnaturaliza a alta temperatura.

2 oligonucleótidos sintéticos (primers) son reconocidos por cadenas opuestas (hibridación)

La polimerización se realiza con el oligonucleótido como cebador y el ADN como diana.

Especificidad.

Bacterias patógenas específicas.

Salmonella.

Salmonella

Familia Enterobacteriaceae

Método de cultivo estandarCultivo

Pruebas bioquímicas

Sondas de poli y oligonucleótidos para la detección de Salmonella.

La falta de genes

específicos para las toxinas u

otros factores de virulencia.

Se han seleccionado y

estudiado al aza fragmentos

cromosómicos clonados.

Entre 1983 y 1992, se han publicado 6 diferentes

sondas.

5 de las cuales son fragmentos de ADN críptico.

ADN críptico.• Cuando no se tiene evidencia de que tipo de función realizan

los genes que lleva un plásmido.• En muchos casos si se puede asignar una función:

Plásmidos

Codificación a factores de virulencia.

Plásmidos inv

Plásmidos ent

Codificación a factores de resistencia a

antibióticos

Β- lactamasas plasmídicas.

Codificación a plásmidos sexuales

• Gopo et al. (1988) aislaron 1.8 kb de una sonda marcada de biotina.• Confirmó la presencia de 40 seritopos sin reacciones cruzadas a

15 sepas no-Salmonella.• Era tan sensible como la marcada con Radio.

Salmonella Pares de bases Radio

Un fragmento de 1.8 kp identificó 327 cepas de Salmonella sin hibridación a 59 cepas no-Salmonella

Una sonda de 2.3 kb hibridizó 396 cepas de Salmonella pertenecientes a 214 serotiposNo hibridizó con 178 cepas no-Salmonella de 52 especies ertenecientes a 23 géneros

Sonda marcada con digoxigenina

Sonda marcada con S35

Técn

icas

no-

isot

ópic

as o

co

lorim

étric

asTécnicas isotrópicas.

Estudios comparativos sobre los ensayos con sondas de hibridación.

Métodos basados en ADN.

Sondas desarrolladas por Fits et al. (1983) Cultivo estándar.

• Wilson et al. (1990).• Hibridación colorimétrica.• 48 horas.• Ha remplazado el jit de sondas de Fitss et al.

• Brailey et al. (1991)

Salmonella- Tek

99.6%

I-2- TEST

92.8%

Hibridación colorimétrica

97.5%

Método de cultivo

91.2%

Reacción en cadena de la polimerasa

(PCR) para la detección de Salmonella.• 7 ensayos de PCR.

• Widjojoatmodjo et al. (1991).• Primers aislados de genes de replicación• Partículas magnéticas cubiertas de anticuerpos específicos.• Magnetic Inmuno- Polymerase chain reaction Assay (MIPA)• Lisados bacterianos centrifugados

• 25 cepas de Salmonella y 19 cepas de no- Salmonella fueron identificados correctamente.

• PCR limite de detección de 10 7 UFC7 g• MIPA limite de detección de 10 5 UFC7 g

• Rahn et al (1992) • Utilizó cebadores seleccionados de la secuencia del ge de Inv A

Salmonella • 630 cepas de Salmonella.• 575 pertenecían a 102 serotipos específicos• 142 cepas de no- Salmonella de 21 géneros.• Dos cepas de cada una de las subespecies Iserotipos: S.

Senftenberg y S. litchfield dieron resultados negativos falsos.

• Way et al. (1993)• Cebadores creados a partir de H-li y el gen Hin flagelin• Salmonela móvil.

Mic

robi

olog

ía

de a

limen

tos

E. coli

Vibrio

Yersinia enterocolitica

Campylobacter

Listeria monocytogenes

Staphylococcus aureus

Baciluis cereus

Clostridium perfinges

Clostridium botulinum

CONCLUSIONES.