quitz in der chromosomenbandenanalyse. Übersicht 1.externes karyotyp-review zur studie aml...
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QUITZin der
Chromosomenbandenanalyse
Übersicht
1. externes Karyotyp-Review zur Studie AML Intergroup Standardarm
Voraussetzung
Einrichtung einer Koodinierungsstelle zur zentralen Karyotypbegutachtung in Marburg (Leitung HD Dr. Rieder, Ausführung Dipl.-Biol. J. Bradtke)
1. externes Karyotyp-Review zur Studie AML Intergroup Standardarm
Zeitrahmen: Beginn Sommer 2003
Aufgabe: zytogenet. Befund + 3 Karyogramme/ Mitosen pro aberranten Klon soll
extern begutachtet werden, online-Versand
Untersuchungsorte: bis dato 11
Studiengruppen: 4
Gutachter: 3 (von AML Studienleitung festgelegt)
Patientenkohorte: bis dato 77 Patienten
fehlende Befunde: 3
1. externes Karyotyp-Review zur Studie AML Intergroup Standardarm
Ergebnisse:
• Befunde von 74 Patienten eingeholt und versendet
• bis dato 56 zytogenetische Befunde komplett begutachtet
• 45 Befunde von allen Gutachtern akzeptiert
• 11 Befunde zweifelhaft bzw. kein Bewertungskonsens=> online Konferenz
• Kritik der Gutachter an Karyogrammen und Befunden
1. externes Karyotyp-Review zur Studie AML Intergroup Standardarm
Probleme:
• Ermittlung der Patienten aus anonymiserten Listen teilweise sehr zeitaufwändig
• Karyogramme und Befunde z.T. nur im Printformat erhalten => Qualitätsverlust und erhöhter Zeitaufwand durch
Einscannen
• z.T. nur 2 Karyogramme eingereicht
• von Studienleitung festgelegte Gutachter nicht gleichzeitig G- und R-Banden Spezialisten
• zeitliche Kapazität der 3 Gutachter stark limitiert => Begutachtungsdauer von 5 Tagen nie erreicht (i.d.R.
eher 5 Wochen)
Übersicht
1. externes Karyotyp-Review zur Studie AML Intergroup Standardarm
2. erster Pilot-Ringversuch zur Karyotypbegutachtung
2. erster Pilot-Ringversuch zur Karyotypbegutachtung
Zeitrahmen: Anforderung von Befunden/Karyogrammen am 11.12 2003 (Deadline 31.12.2003 erw. 28.02.2004)
Aufgabe: zytogenet. Befund + 3 Karyogramme/Mitosen pro aberranten Klon des 1. CML-Falles d. II. Quartals 2003
Nachzügler: 3 (Schweizer erst nach Deadline in RV aufgenommen, spätere Begutachtungsrunde)
Gutachter: pro Fall 3 unabhängige, frei wählbar (rekrutiert auf der 16.TZA), Spezialisten für G- oder R-Bänderung
2. erster Pilot-Ringversuch zur Karyotypbegutachtung
Verfahren:
• Anpassung des bei AML-Studie erprobten Begutachtungverfahrens
• Erstellung von Datenbank und Protokollen
• Einholen von Karyogrammen und Befunden
• ev. Anonymisierung der Befunde und Umwandlung in einheitliches versandfähiges Format
• Erstellung v. Protokollbögen und Versand an 8 verschiedene Gutachter per eMail
• Auswertung der Begutachtungsergebnisse
2. erster Pilot-Ringversuch zur Karyotypbegutachtung
Ergebnisse:
• 14/23 angeschriebenen Instituten (61%) haben Befunde geschickt (CML ED und VL), die zur Begutachtung weitergeleitet wurden
• erste Rückmeldungen nach 8 Tagen
• alle 14 zytogenetischen Befunde komplett begutachtet
• Begutachtung überwiegend innerhalb 5 Werktagen
• 93% (13) der Befunde akzeptiert (5 uneinheitlich bewertet), 7% (1) ohne Konsens => online Konferenz
Auswahl Karyogramme 1. Pilot Ringversuch
2. erster Pilot-Ringversuch zur Karyotypbegutachtung
Kritik der Gutachter:
• teilweise zu wenige Metaphasen ausgewertet (Goldstandard 25)
• Chromosomen im Karyogramm falsch positioniert
• Anzahl der Metaphasen in ISCN-Formel fehlt
• Bandenauflösung fehlt oder zu hoch angegeben
• „unscharfe“ Formulierungen im Befund, formale Fehler
2. erster Pilot-Ringversuch zur Karyotypbegutachtung
Probleme:
• hohe Rate an Rücksendungen in Printform
=> Qualitätsverlust durch Einscannen
• manchen RV-Teilnehmern ist die Übermittlung der Karyogramme und Befunde nur in Printform möglich
• nur 1 Institut hat lediglich 2 Karyogramme eingereicht
• zögerliche Einsendung der Befunde (Verlängerung der Deadline vom 31.12.2003 auf 28.02.2004)
• 3 Nachzügler nicht mit in 1. Begutachtungsrunde
• sollte eine online-Konferenz durchgeführt werden, wenn von 1 gefordert und Befund von 2 akzeptiert?
2. erster Pilot-Ringversuch zur Karyotypbegutachtung
Fazit:
• externe Begutachtung zur Bewertung der Qualität von Metaphasechromosomen und Befunden in der Leukämiezytogenetik ist prinzipiell durchführbar
• Qualität der digitalisierten Karyogramme zur Begutachtung ausreichend
• Veröffentlichung der Karyogramme auf TP5 Homepage zum Vergleich und Selbsteinschätzung (PW geschützt)
• Schaffung von Bewertungskriterien z.B. für bphs (Punktesystem) nötig, da es für Befunde i. d. Leukämiediagnostik noch keine gibt
Übersicht
1. externes Karyotyp-Review zur Studie AML Intergroup Standardarm
2. erster Pilot-Ringversuch zur Karyotypbegutachtung
3. erster Pilot-Ringversuch zur Kultivierung, Bänderung und Befunderstellung
3. erster Pilot-Ringversuch zur Kultivierung, Bänderung und
Befunderstellung
Zeitrahmen: Planung ab 02/04, Anzucht geeigneter Zelllinien, Proben-Aussendung 13.04.2004, Deadline
30.04.2004
Probe: 1ml PB, männlicher Spender + kultivierte Zellen (LCL, w, normale Hämatopoese; RS 4;11, w,
aberrant mit -X, t(4;11) und i(7)(q10)) in Li-Hep. Monovette
Aufgabe: -Kultivierung, Bänderung, CBA und Befunderstellung wie in der Routinediagnostik
-Rücksendung der Befunde und Karyogramme möglichst als Dateien
Teilnehmer: 19
Begutachtung: noch nicht eingeleitet
3. erster Pilot-Ringversuch zur Kultivierung, Bänderung und
Befunderstellung
Verfahren:• Rekrutierung von Teilnehmern, Erstellung von DB
• Erstellung vorläufiger Bewertungskriterien
• Herstellung von geeignetem Probenmaterial
• Versand der Proben per Express ÜN
• Erstellung und Versand eines Fragebogens zum RV und zur Erhebung von Diagnostik-Daten
• Erfassung der Rücksendungen in DB
• Begutachtung der Karyogramme und Befunde wie bei 1. RV
3. erster Pilot-Ringversuch zur Kultivierung, Bänderung und
Befunderstellung
Ergebnisse:
• Teilnahme von 19/25 angeschriebenen Laboren (76%)
• Rücksendung von allen Befunden bis zum 04.05.2004
• erste Rücksendung am 16.04.2004 (n. 2 Tagen)
• 68% (13 Teilnehmer) haben die Fragebögen ausgefüllt
3. erster Pilot-Ringversuch zur Kultivierung, Bänderung und
Befunderstellung
46,XX,t(4;11)(q21;q23),i(7)(q10): 95%
45,X,-X,t(4;11)(q21;q23),i(7)(q10): 70%
46,XX: 95%
----------------------------------------------------------------
46,XY (FISH): 10%
46,XY (CBA): 10%
----------------------------------------------------------------
weitere „nicht klonale“ Aberrationen: 20%
3. erster Pilot-Ringversuch zur Kultivierung, Bänderung und
Befunderstellung
46,XX,del(16q)[2]/46,XX,i(7)(q10),t(4;11)(q21;q23)[8]/ 45,X,-X,i(7)(q10),t(4;11)(q21;q23)[7]
46,XX[9]/46,XX,t(4;11)(q21;q23)i(7)(q)[12]/45,X,t(4;11)(q21;q23)i(7)(q10)[4]
46,XX(48)/46,XX,i(7)(q10),t(4;11)(q21;q23)(4)/
92,XXXX(2)=?Artefakt/...47,XX,i(7)(q10),t(4;11)(q21;q23)+15(1)=Artefakt
3. erster Pilot-Ringversuch zur Kultivierung, Bänderung und
Befunderstellung
46,XX,?+4,t(4;11)(q21;q23).ish t(4;11)(q21;q23)(MLL+;MLL+),tas(7;20)(p22;q13.3)[cp2]/ 46,X,tas(X;22)(p22;p13)[1] 46,XX,tas(2;21)(q37;q22)[1]/46,XX,tas(5;15)(p15;p13)[1]/ 46,XX,tas(17;21)(q25;q22)[1]45,XX,der(13;15)(q10;q10[1]
-------------------------------------------------------------------------
46,XX,t(4;11)(q21;q23),i(7)(q10)[24]/45,idem,-X[6]/46-92,XX,tas(2;17)(q37.3;q25.3)[cp2]/46,XX,tas (2;21)(q37.3;q22.3)[2]/..../46,XX,add(21)(q22)[2]
Auswahl Karyogramme Ringversuch 1
3. erster Pilot-Ringversuch zur Kultivierung, Bänderung und
Befunderstellung
Ergebnisse:• FISH auf MLL (25%), ATM (5%)
• teilweise FISH bei ev. klonalen Zusatzaberrationen (-X, +4, TEL/AML)
• Anzahl ausgewerteter Metaphasen: 23 - 82 (Median 33)
• keine Angabe v. Entnahmedatum: 70%
• keine bphs angegeben: 20%
• Bandenauflösung: 100 - 450 bphs
• Färbemethode nicht angegeben: 15%
3. erster Pilot-Ringversuch zur Kultivierung, Bänderung und
Befunderstellung
Ergebnisse Fragebogen:
Versanddauer: 15 x 1 Tag, 4 x 2 Tage
Probe brauchbar? 100% ja
Probe geronnen? 8% ja / 92% nein
Menge ausreichend? 69% ja / 31% nein
mit Versand zufrieden? 100% ja
Klin. Ang. ausreichend? 92% ja / 8% nein
3. erster Pilot-Ringversuch zur Kultivierung, Bänderung und
Befunderstellung
Ergebnisse Fragebogen:4h unstim. 8% ja 92% nein
4h stim. 0% ja 100% nein
24h unstim. 54% ja 46% nein
24h. stim. 15% ja 85% nein
48h unstim. 54% ja 46% nein
48h stim. 31% ja 69% nein
72h unstim. 0% ja 100% nein
72h stim. 8% ja 92% nein
Andere Kulturen* 31% ja 69% nein
* Langzeit-Colcemid; Direktpräparation
3. erster Pilot-Ringversuch zur Kultivierung, Bänderung und
Befunderstellung
Ergebnisse Fragebogen:verwendete Zytokine: IL1,2,3,6,7, Erythropetin, G-CSF, GM-CSF,
SCF, GCT Medium, TPA, 5637 CM und PT- LCM, (PHA)
verwendetes Medium: 85% RPMI bzw. RPMI/FCS; 23% kommerzielles Medium
PHA-Stimulation: 15%
Colcemidzeit: < 2h 77% (30 - 90min)> 2h 46% (5 - 24h)
Colcemid-Temperatur: 37°C
3. erster Pilot-Ringversuch zur Kultivierung, Bänderung und
Befunderstellung
Ergebnisse Fragebogen:
Metaphasen-ausbeute
Chromosomen-spreitung*
Chromosomen-bänderung*
sehr gut 69% 54% 38%
gut 31% 54% 62%
weniger gut - - 15%
schlecht - 8% -
* Doppelnennung, nach Kultur unterschieden
3. erster Pilot-Ringversuch zur Kultivierung, Bänderung und
Befunderstellung Probleme:
• Versanddauer per Express-Versand nicht einheitlich
• Materialmenge teilweise nicht ausreichend für Routinediagnostik, bzw. war < 1ml
• hoher Anteil an nicht-digitalen Befunden zurückgesendet: 25%
• nicht nur Karyogramme v. aberranten Klon, sondern auch von der Normal-Zelllinie eingesendet
• Blut v. männlichem Probanden bei weiblichen Zielzellen führte zu Irritationen bei Befundbeurteilung
bei routinemäßiger XY-FISH o. PHA-Stimulation
Zusammenfassung
Ringversuche sowohl zur Karyotypbegutachtung als auch zur CBA sind prinzipiell durchführbar
hohe Resonanz, Motivation und Zufriedenheit der Teilnehmer
2. RV zur Kultivierung, Bänderung und Befunderhebung geplant in ca. 6 Monaten
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