rôle du récepteur purinergique p2x4r et de l'il-1 dans la moelle
Post on 02-Jan-2017
222 Views
Preview:
TRANSCRIPT
Rôle du récepteur purinergique P2X4R et de l’IL-1 dans la moelle épinière lésée
Thèse
Dominic Bastien
Doctorat en biologie cellulaire et moléculaire
Philosophiae doctor (Ph.D.)
Québec, Canada
© Dominic Bastien, 2015
iii
Résumé Les lésions de la moelle épinière (LME) entraînent l’activation de mécanismes
inflammatoires impliquant les cellules gliales et les cytokines. Les travaux présentés dans
cette thèse avaient pour but d’identifier les cellules et molécules responsables de l’initiation
de ces mécanismes pouvant entraîner des dommages tissulaires ou stimuler la réparation.
Nous avons donc examiné le rôle du récepteur purinergique P2X4R et des cytokines IL-1α
et IL-1β dans le recrutement des cellules immunitaires innées, l’étendue de la lésion et la
récupération locomotrice suite à une LME. Dans un premier temps, nous avons démontré
que P2X4R est exprimé par les neurones de la moelle épinière et que l’activation de ce
récepteur suite à une LME entraîne le clivage de la caspase-1 en sa forme active et la
production de la forme mature de l’IL-1β. Ainsi, l’absence de P2X4R chez la souris a
provoqué une diminution des niveaux d’IL-1β, réduisant par le fait même le nombre de
neutrophiles et monocytes pro-inflammatoires, dits M1, au site de lésion. Les souris
P2X4R-KO ont aussi présenté une meilleure récupération locomotrice lors des tests
comportementaux effectués, suggérant que P2X4R joue un rôle essentiel dans la
neurodégénérescence suite à une LME. De plus, nous avons démontré que l’IL-1α est
exprimée rapidement chez la microglie suite à la lésion et qu’il s’en suit l’expression de
l’IL-1β par les neutrophiles et les monocytes M1 infiltrants. Malgré le fait que ces 2
cytokines semblent déclencher des effets inflammatoires similaires, les souris IL-1α-KO
ont présenté de meilleures fonctions locomotrices aussitôt qu’à 1 jour post-lésion
comparativement aux souris sauvages et IL-1β-KO. L’analyse du transcriptome par
micropuces à ADN a permis d’identifier plusieurs gènes régulés significativement chez les
souris IL-1α-KO tel que le facteur de survie neuronale TOX3. Nous avons confirmé par
immunofluorescence que TOX3 est surexprimé chez les oligodendrocytes CC1+ des souris
IL-1α-KO. Ces résultats suggèrent que les oligodendrocytes de ces souris seraient moins
sensibles à la mort cellulaire suite à la lésion, entraînant ainsi une meilleure récupération
locomotrice ainsi que la préservation de la matière blanche de la moelle épinière.
v
Abstract Spinal cord injury (SCI) leads to neuroinflammation-mediated damage and repair. The
work presented in this thesis studied the cells and molecules initiating the inflammatory
response in the injured spinal cord, in particular glial cells and cytokines. We investigated
the role of purinergic receptor P2X4R and cytokines of the IL-1 family, IL-1α and IL-1β, in
neutrophil and proinflammatory (M1) monocyte recruitment, tissue damage and locomotor
function recovery after SCI. First, we showed that P2X4R is expressed in neurons of the
normal spinal cord, and that activation of this receptor after SCI induces caspase-1 cleavage
and production of mature IL-1β. We provided evidence that P2X4R-KO mice have
impaired caspase-1 activation, resulting in decreased IL-1β levels and reduced neutrophil
and M1 monocyte infiltration. Importantly, P2X4R-KO mice exhibited significant
improvements in tissue sparing and locomotor behavior. These results suggest that P2X4R
plays an essentiel role in neurodegeneration after SCI. Next, we showed that IL-1α is
rapidly produced by microglia after SCI, and that this is followed by production of IL-1β
by infiltrating neutrophils and monocyte-derived M1 macrophages. Despite the fact that the
infiltration of these immune cell types was equally reduced in IL-1α-KO, IL-1β-KO and
WT mice, IL-1α-KO mice exhibited significantly better locomotor recovery as early as day
1 post-SCI compared to the other two mouse lines. Transcriptome analysis of SCI tissue
identifed transcripts that were specifically regulated in IL-1α-KO mice exclusively,
including the neuronal survival factor TOX3. We confirmed by immunofluorescence that
TOX3 is overexpressed by CC1+ oligodendrocytes from IL-1α-KO mice. These results
suggest that oligodendrocytes from these mice would be less sensitive to cell death after
injury, thus leading to sparing of spinal cord white matter and better functional recovery.
vii
Table des matières
RÉSUMÉ ....................................................................................................................................................... III ABSTRACT .................................................................................................................................................... V TABLE DES MATIÈRES ........................................................................................................................... VII LISTE DES TABLEAUX .............................................................................................................................. XI LISTE DES FIGURES ............................................................................................................................... XIII LISTE DES ABRÉVIATIONS ................................................................................................................... XV REMERCIEMENTS .................................................................................................................................. XIX AVANT-‐PROPOS ..................................................................................................................................... XXI CHAPITRE 1: INTRODUCTION ............................................................................................................... 1
1.1. LA MOELLE ÉPINIÈRE ............................................................................................................................................ 1 1.1.1. Anatomie de la moelle épinière .............................................................................................................. 3
1.2. LES CELLULES GLIALES ......................................................................................................................................... 6 1.2.1. Les microglies ................................................................................................................................................. 7 1.2.2. Les astrocytes ................................................................................................................................................. 8 1.2.3. Les oligodendrocytes ................................................................................................................................ 11
1.3. NEUROPATHOLOGIE DES LME ......................................................................................................................... 14 1.3.1. La lésion primaire ...................................................................................................................................... 14 1.3.2. Dégénérescence secondaire ................................................................................................................... 15
1.4. SIGNALISATION INTRACELLULAIRE DE L’INITIATION DE L’INFLAMMATION ............................................ 17 1.4.1. Les TLRs ......................................................................................................................................................... 18 1.4.2. Les NLRs ......................................................................................................................................................... 21
1.4.2.1. L’inflammasome NLRP1 ............................................................................. 23 1.4.2.2. NLRP3 (NALP3) ......................................................................................... 26 1.4.2.3. L’inflammasome AIM2 ............................................................................... 28
1.4.3. Les récepteurs purinergiques ............................................................................................................... 29 1.4.3.1. Les récepteurs P2X4 ..................................................................................... 30 1.4.3.2. Les récepteurs P2X7 ..................................................................................... 31
1.5. RÔLES DES CYTOKINES ET CHIMIOKINES SUITE À UN TRAUMA DU SNC ................................................... 33 1.5.1. La famille de l’interleukine-‐1 (IL-‐1) .................................................................................................. 33
1.5.1.1. L’IL-1-α ....................................................................................................... 34 1.5.1.2. L’IL-1β ........................................................................................................ 36 1.5.1.3. Les récepteurs de l’IL-1 (IL-1Rs), leurs protéines accessoires et l’antagoniste, l’IL-1Ra .............................................................................................. 38 1.5.1.4. L’interleukine-18 (IL-18) et son récepteur IL-18R ..................................... 41 1.5.1.5. L’Interleukine-33 (IL-33) ............................................................................ 44
1.5.2. Le facteur nécrosant des tumeurs (TNF) ......................................................................................... 46 1.6. RECRUTEMENT DES CELLULES IMMUNITAIRES ............................................................................................. 48 1.6.1. Neutrophiles ................................................................................................................................................. 48
viii
1.6.2. Monocytes/Macrophages ....................................................................................................................... 51 1.7. PROTECTION ET RÉGÉNÉRATION DU SNC ...................................................................................................... 53 1.8. HYPOTHÈSE ET OBJECTIFS GÉNÉRAUX ............................................................................................................ 55 1.8.1. Étude du rôle du récepteur P2X4R ...................................................................................................... 55 1.8.2. Étude des effets de l’IL-‐1α et IL-‐1β ..................................................................................................... 56
CHAPITRE 2 .............................................................................................................................................. 59 2.1. RÉSUMÉ ................................................................................................................................................................ 60 2.2. ABSTRACT ............................................................................................................................................................ 61 2.3. INTRODUCTION .................................................................................................................................................... 62 2.4. CYTOKINES RELEASED AFTER NEURAL INJURY: PRODUCTION, RECEPTOR SIGNALLING PATHWAYS AND IMMUNE RESPONSES ................................................................................................................ 65 2.4.1. IL-1 FAMILY MEMBERS ............................................................................................................................... 65 2.4.1.1. Interleukin-‐1α (IL-‐1α) ......................................................................................................................... 66 2.4.1.2. Interleukin-1β (IL-1β) .......................................................................................................................... 68 2.4.1.3. Interleukin-1 receptor type 1 (IL-1R1) ........................................................................................... 70 2.4.1.4. Interleukin-1 receptor antagonist (IL-1RA) ................................................................................. 72 2.4.1.5. Interleukin-18 (IL-18) ........................................................................................................................... 72
2.4.2. TNF FAMILY MEMBERS .............................................................................................................................. 75 2.4.2.1. Tumor necrosis factor (TNF) ............................................................................................................. 75 2.4.2.2. Fas ligand (FasL) ................................................................................................................................... 77 2.4.3. Interleukin-6 (IL-6) .................................................................................................................................... 78 2.4.4. TGF-β family members ............................................................................................................................ 79 2.4.5. IL-10 family members ............................................................................................................................... 80 2.4.5.1. Interleukin-10 (IL-10) ........................................................................................................................... 81
2.5. CYTOKINE EFFECTS ON GLIA, ENDOTHELIAL CELLS AND LEUKOCYTES AND CONTRIBUTION OF THESE CELLS TO TISSUE DAMAGE, GLIAL SCARRING AND REGENERATION .................................................................... 84
2.5.1. Glial cells ...................................................................................................................................................... 84 2.5.2. Endothelial cells of the neurovascular unit ..................................................................................... 87 2.5.3. Innate immune cells ................................................................................................................................... 90
2.6. DIFFERENCES BETWEEN THE INJURED SPINAL CORD AND PERIPHERAL NERVE .......................... 92 2.7. CONCLUSION ..................................................................................................................................................... 96 2.8. ACKNOWLEDMENTS ........................................................................................................................................ 96 2.9. REFERENCES ...................................................................................................................................................... 97
CHAPITRE 3 ........................................................................................................................................... 133 P2X4 RECEPTORS INFLUENCE INFLAMMASOME ACTIVATION FOLLOWING SPINAL CORD INJURY ....................................................................................................................................................... 133
3.1. RÉSUMÉ ............................................................................................................................................................. 134 3.2. ABSTRACT ......................................................................................................................................................... 135 3.3. INTRODUCTION ................................................................................................................................................. 136 3.4. MATERIALS AND METHODS ........................................................................................................................... 137 3.4.1. Animals ......................................................................................................................................................... 137 3.4.2. Spinal cord injury ..................................................................................................................................... 137 3.4.3. Immunoblotting ....................................................................................................................................... 138 3.4.4. Flow cytometry ......................................................................................................................................... 138 3.4.5. Tissue processing and histology ........................................................................................................ 139 3.4.6. Immunohistochemistry and quantification of immunolabeling ......................................... 140 3.4.7. Behavioral analyses ................................................................................................................................ 141 3.4.8. Statistical analysis ................................................................................................................................... 141
ix
3.5. RESULTS ............................................................................................................................................................. 142 3.5.1. Caspase-‐1 and IL-‐1β responses are decreased in P2X4-‐KO mice following SCI ........... 142 3.5.2. P2X4 is expressed in neurons of the dorsal horn and medial grey ..................................... 144 3.5.3. P2X4 deficiency in neural cells reduces inflammation at sites of SCI ............................... 146 3.5.4. P2X4-‐KO mice show improved histopathological outcomes when compared to wild type mice .................................................................................................................................................................. 150 3.5.5. Functional recovery after SCI is improved in P2X4-‐KO mice when compared to wild type mice .................................................................................................................................................................. 152
3.6. DISCUSSION ....................................................................................................................................................... 152 3.7. REFERENCES ..................................................................................................................................................... 155
CHAPITRE 4 ............................................................................................................................................ 161
IL-‐1α GENE DELETION PROTECTS OLIGODENDROCYTES AFTER SPINAL CORD INJURY THROUGH UPREGULATION OF SURVIVAL FACTOR TOX3 ............................................................ 161
4.1. RÉSUMÉ .............................................................................................................................................................. 162 4.2. ABSTRACT .......................................................................................................................................................... 163 4.3. INTRODUCTION ................................................................................................................................................. 164 4.4. MATERIALS AND METHODS ............................................................................................................................ 165
4.4.1. Animal ........................................................................................................................................................... 165 4.4.2. Spinal cord injury ..................................................................................................................................... 166 4.4.3. Flow cytometry .......................................................................................................................................... 166 4.4.4. Tissue processing and histology ......................................................................................................... 167 4.4.5. Immunohistochemistry and quantification ..................................................................................... 168 4.4.6. In situ hybridization (ISH) .................................................................................................................... 170 4.4.7. Lesion volume analysis .......................................................................................................................... 170 4.4.8. Microarray analysis ................................................................................................................................ 171 4.4.9. Real time quantitative RT-PCR (qRT-PCR) .................................................................................. 172 4.4.10. Behavioral analysis ............................................................................................................................... 173 4.4.11. Statistical analysis ................................................................................................................................. 173
4.5. RESULTS ............................................................................................................................................................. 173 4.5.1. Il-1α protein expression in the injured spinal cord precedes IL-1β and is localized in microglia at the site of injury ........................................................................................................................... 173 4.5.2. Infiltration of neutrophils and proinflammatory “M1” macrophages is equally reduced in the injured spinal cord of IL-1α- and IL-1β-KO mice ...................................................................... 177 4.5.3. Mice harboring deletion of the IL-1α gene exhibit improved functional recovery and histopathological outcome compared to IL-1β-KO and WR mice after SCI ................................. 179 4.5.4. IL-1β-KO mice have reduced IL-1α levels in their spinal cord compared to WT mice whereas IL-1α-KO mice express IL-1β normally .................................................................................... 180 4.5.5. Increase expression of TOX3 in the injured spinal cord of IL-1α-KO mice ..................... 182 4.5.6. Oligodendrocytes from mice lacking IL-1α upregulate the survival factor TOX3 and are protected from SCI-induced death ................................................................................................................. 185 4.5.7. Tox3 overexpression in oligodendrocytes of IL-1α-/- mice occurs at early at an early stage of the myelination process and persists through adulthood. .................................................... 189
4.6. DISCUSSION ....................................................................................................................................................... 191 4.7. REFERENCES ..................................................................................................................................................... 195
CHAPITRE 5 : DISCUSSION & CONCLUSION ................................................................................. 205 5.1. ÉTUDE DU RÔLE DE P2X4R ............................................................................................................................ 206 5.2. ÉTUDE DES EFFETS DES CYTOKINES DE LA FAMILLE DE L’IL-‐1 : L’IL-‐1α ET L’IL-‐1β ........................ 211
x
5.3. CONCLUSION ..................................................................................................................................................... 217 CHAPITRE 6 : BIBLIOGRAPHIE DE L’INTRODUCTION ET LA DISCUSSION ......................... 219
xi
Liste des tableaux Tableau 2.1 Cytokine effects on glia, endothelial cells, leukocytes and neurons in the pathogenesis of spinal cord injury………………………………………………………….83
Tableau 4.1 Transcripts found to be differentially regulated exclusively in IL-1α ko mice after SCI.………………………………………………………………………………….183
Tableau 4.2 Transcripts found to be differentially regulated simultaneously in IL-1α and IL-1β-KO mice after SCI.………………… …………………..………………………...184
xiii
Liste des figures Figure 1.1 Divisions et composantes de la moelle épinière .................................................... 2 Figure 1.2 Structure de la moelle épinière .............................................................................. 4 Figure 1.3 Méninges ............................................................................................................... 5 Figure 1.4 Vascularisation de la moelle épinière .................................................................... 6 Figure 1.5: La cicatrice gliale ............................................................................................... 16 Figure 1.6: Structure des inflammasomes ............................................................................. 23 Figure 2.1 Microglia rapidly shield the site of a spinal cord lesion by first extending their cellular processes and then their cell bodies. ........................................................................ 64 Figure 2.2 Cytokine signalling pathways relevant to spinal cord and peripheral nerve injury.. ................................................................................................................................... 74 Figure 3.1 P2X4 and P2X7 expression in the normal and injured mouse spinal cord. . .... 142 Figure 3.2 Increased expression of bioactive caspase-1 and IL-1ß is reduced in the injured spinal cord of P2X4-knockout mice. .................................................................................. 143 Figure 3.3 ß-galactosidase staining is localized in neurons in the normal and injured spinal cord of P2X4-KO mice ....................................................................................................... 145 Figure 3.4 P2X4 deficiency in neural cells reduces neutrophil and M1 monocyte infiltration at sites of SCI. ..................................................................................................................... 147 Figure 3.5 P2X4 deficiency attenuates microglial/macrophage activation after SCI. A, ... 149 Figure 3.6 Spinal cord lesion volume and recovery of locomotor function are improved in P2X4-KO mice ................................................................................................................... 151 Figure 4.1 IL-1α protein expression in the injured spinal cord precedes IL-1β and is localized in microglia at the site of injury. ......................................................................... 175 Figure 4.2 IL-1deficiency reduces neutrophil and M1 monocyte infiltration in the injured spinal cord. .......................................................................................................................... 178 Figure 4.3 Recovery of locomotor function and spinal cord lesion volume are improved in IL-1-KO mice.. ................................................................................................................... 180 Figure 4.4 IL-1α and IL-1b mRNA expression levels in the spinal cord of naive and injured mice at 1 day post-SCI ........................................................................................................ 182 Figure 4.5 Expression of the survival factor TOX3 is increased in the injured spinal cord of IL-1α-KO mice ................................................................................................................... 185 Figure 4.6 IL-1α deficiency upregulates expression of the survival factor TOX3 in oligodendrocytes and protects these cells from death after SCI.. ....................................... 188 Figure 4.7 Increased mRNA expression levels of IL-1α, but not IL-1β, between postnatal day 5 and 10, coinciding with a critical period of microglial activation and the beginning of myelination ......................................................................................................................... 190
xv
Liste des abréviations 5-BDBD 5-(3-bromophenyl)-1,3-dihydro-2H-benzofurol[3,2-e]-1,4-diazepin-1-one ACV accident cérébrovasculaire ADN Acide désoxyribonucléique ADNc Acide désoxyribonucliéque complémentaire AIM2 Absent in melanoma 2 AP-1 Protéine activatrice 1 ARN Acide ribonucléique ARNm Acide ribonucléique messager ASC Apoptosis-associated speck-like protein containing a carboxy terminal ATP Adénosine 5’-triphosphate BCL-2 B-cell lymphoma 2 BCL-XL B-cell lymphoma-extra large BDA Biotinylated dextran amine BDNF Facteur neurotrophique dérivé du cerveau BHE Barrière hématoencéphalique BHS Barrière hématospinale BMP Protéine morphogénétique osseuse BMS Basso Mouse Scale BrdU Bromodeoxyuridine Bz-ATP 2’(3’)-O-(4-Benzoylbenzoyl) adenosine 5’-triphosphate CARD Domaine de recrutement de la caspase Cdk5 Kinase dépendante de la cycline 5 CITED1 Transactivateur interragissant avec Cbp/p300 CLR Récepteur de type lectine CNTF Facteur neurotrophique ciliaire COX2 Cyclooxygénase-2 CREB Protéine se liant à l’élément de réponse cAMP CSPGs Protéoglycanes de type chondroïtine sulfate CST Faisceau corticospinal DA Dégénérescence axonale DAMPs Molécules associées aux dommages DW Dégénérescence Wallérienne EAE Encéphalomyélite autoimmunitaire expérimentale ERK Extracellular-signal-regulated kinases EtBr Bromure d’éthidium FADD Protéine associée à FAS avec un domaine de mort cellulaire FGF Facteur de croissance des fibroblastes GABA Acide γ-aminobutyrique Gal-3 Galectine-3 GCV Ganciclovir GFAP Protéine gliale fibrillaire acide GM-CSF Facteur stimulant les granulocytes et macrophages
xvi
GPI Glycosylphosphatidylinositol H2O2 Peroxyde d’hydrogène HIN Hématopoietic interferon inducible nuclear protein HMGB1 High-mobility group protein B1 HSP Protéine de choc thermique ICAM Protéine d’adhésion intracellulaire IL Interleukine IL-1AcP Protéine accessoire du récepteur de l’IL-1 IL-1R Récepteur de l’IL-1 IL-1Ra Antagoniste de l’IL-1 IL-18BP Protéine de liaison à l’IL-18 IFN Interféron IGF Facteur de croissance ressemblant à l’insuline IRAK Kinase associée au récepteur de l’IL IRF Facteur régulant l’IFN JNK Kinase c-jun N-terminale kDa Kilo dalton LCS Liquide cérébrospinal LPS Lipopolysaccharide LME Lésion de la moelle épinière LNP Lésion du nerf périphérique LRR Répétition riche en leucine MAG Glycoprotéine associée à la myéline MAPk Mitogen-activated protein kinase MCAO Occlusion de l’artère cérébrale moyenne MOG Glycoprotéine de la myéline d’oligodendrocytes MPO Myéloperoxydase MMP Métalloprotéinase MyD88 Gène de réponse primaire de différenciation de cellules myéloïdes 88 NF-κB Facteur nucléaire kappa B NgR Récepteur Nogo NK Cellules NK (natural killer) NMDA Acide N-méthyl-D-aspartique NOD Récepteur à domaine d’oligomérisation de nucléotides NLR Récepteur de type NOD NLRP Récepteur ressemblant à NOD (NOD-like receptor) NPC Cellules progénitrices neuronales NT-3 Neurotrophine 3 NTP Nucléoside triphosphate NTR Récepteur de neurotrophine OHDA Hydroxydopamine OL Oligodendrocyte Olig Facteur de transcription d’oligodendrocyte OPC Cellules progénitrices des oligodendrocytes OX-ATP ATP oxydé p38 MAPK protéine kinase associée à la mitogène p38 PAMPs Motif moléculaire associé aux pathogènes
xvii
PANX1 Pannexine-1 PDGFαR Récepteur du facteur de croissance dérivé des plaquettes PPADS Acide pyridoxalphosphate-6-azophenyl-2',4'-disulfonic PRRs Récepteur de reconnaissance de motifs moléculaires PYD Domaine à pyrine RLR Récepteur ressemblant à RIG-I Shh Sonic hedgehog SLA Sclérose latérale amyotrophique SNC Système nerveux central Tg Transgénique TIR Récepteur Toll/IL-1 TK Tymidine Kinase TLR Récepteur ressemblant à Toll (Toll-like receptor) TNF Facteur de nécrose tumorale TNFR Récepteur du TNF TOX3 TOX high mobility group box family member 3 TRADD Protéine de domaine de mort associée au récepteur du TNF TRAF Facteur associé au récepteur TNF TRIF Domaine TIR induisant l’IFN-β TRPV4 Récepteur potentiel transitoire vanilloide de type 1 UDP Uridine di-phosphate UV Ultraviolet VCAM Molécule d’adhésion cellulaire vasculaire VEGF Facteur de croissance de l’endothélium vasculaire XIAP Protéine inhibitrice de l’apoptose liée au chromosome X
xix
Remerciements Lorsque j’ai débuté mes études doctorales, jamais je n’aurais imaginé accomplir autant au
cours des années suivantes. Comme tout bon projet de recherche, il y a eu beaucoup de
hauts et de bas autant au point de vue scientifique que personnel. Les raisons pour
abandonner et convoiter le marché du travail se sont additionnées à plusieurs occasions.
J’ai donc dû apprendre à persévérer et à ne pas lâcher face aux embûches qui se présentent.
Malgré cela, une personne m’a encouragé et guidé dans les tous les aspects de mes projets
incluant la gestion, la réflexion scientifique et sans oublier, la rédaction. Je tiens donc à
remercier mon directeur de recherche, Steve Lacroix, pour m’avoir fait confiance dès le
début. Il m’a permis d’acquérir une expérience et des compétences que je n’aurai jamais pu
obtenir sans son aide et son support. Il m’a surtout permis de grandir et d’obtenir une
maturité scientifique et personnelle.
Je tiens également à remercier tous les membres présents et passés de mon équipe. Nadia
Fortin, qui sans elle, je n’aurais pas survécu les centaines chirurgies réalisées, les études
comportementales et la coupe de tissus au cryostat. Nicolas Vallières pour son support
technique et son aide pour des analyses de tissus au microscope. Martine Lessard pour son
efficacité et sa productivité extraordinaire. Sébastien Lévesque pour avoir contribué à
plusieurs discussions scientifiques et diverti mes temps libres avec des annecdotes
coccasses de sa petite fille. Linda Xiang Wang pour son amitié, son oreille attentive et ses
péripéties rocambolesques divertissantes. Alexandre Paré pour ses qualités de caméraman
très appréciées lors des études comportementales. Et sans oublier Jorge Barreto-Reyes,
Benoit Mailhot et Victor Bellver qui sont arrivés dans notre équipe au cours de la dernière
année. Je tiens également à remercier Isabelle Pineau qui m’a transmis tout ce qu’elle savait
sur les lésions du SNC et tous les stagiaires qui m’ont aidé à réaliser mes projets.
Finalement, je veux remercier mes parents, mon frère et sa petite famile qui ont toujours été
présents pour moi et qui m’ont encouragé dans tout ce que j’entreprenais. Enfin, mon
xx
conjoint, Yannick, que j’aime beaucoup et qui a tenté de comprendre du mieux qu’il
pouvait l’ampleur de mes travaux et qui m’a soutenu tout au long de mes études.
xxi
Avant-Propos Cette thèse est rédigée sous la forme d’articles scientifiques. Elle présente les travaux
effectués lors de mon doctorat en biologie cellulaire et moléculaire au Centre de recherche
du Centre hospitalier de l’Université Laval sous la supervision du Dr Steve Lacroix. Le
chapitre 1 consiste à l’introduction des différents sujets traités dans cet ouvrage tandis que
le chapitre 5 consiste à la discussion générale des résultats obtenus et des perspectives
relatives à la suite des projets entamés. Le chapitre 2 correspond à une revue publiée dans
le journal Experimental Neurology et traite des différentes cytokines, de leurs récepteurs et
de leurs voies de signalisation dans les cellules gliales et immunitaires suite à une lésion de
la moelle épinière ou du nerf périphérique. Le chapitre 3 discute du rôle du récepteur
purinergique P2X4 dans l’activation de l’IL-1β, le recrutement des cellules immunitaires
innées et la récupération locomotrice suite à une LME. Cet article fut publié dans The
Journal of Neuroscience. Finalement, le chapitre 4 discute de l’effet des cytokines IL-1α et
IL-1β sur les dommages tissulaires et la récupération locomotrice suite à une LME. Ces 3
chapitres ont été rédigés en anglais, mais un résumé en langue française a été introduit au
début de chaque chapitre.
Le travail de rédaction du chapitre 2 a été effectué par moi-même ainsi que par Dr Steve
Lacroix. La figure 1 a été conçue par Nicolas Vallières tandis que j’ai créé le tableau 1. J’ai
aussi participé à la conception de la figure 2. L’article présenté dans le chapitre 3 a été
rédigé par Juan Pablo de Rivero Vaccari et par Dr Steve Lacroix tandis que j’ai participé à
la correction de l’ensemble du texte. Les figures 1 et 2 ont été entièrement conçues par
l’équipe de Juan Pablo de Rivero Vaccari et de Robert Keane, tandis que j’ai réalisé
l’ensemble des expériences réalisées dans les autres figures à l’exception de
l’immunofluorescence présentée dans la figure 3 qui a été effectuée par Isabelle Pineau.
L’article présenté dans le chapitre 4 a été rédigé par moi-même et Dr Steve Lacroix. J’ai
réalisé l’ensemble des expériences effectuées à l’exception de la quantification de la figure
1b et de la figure 5 qui a nécessité la participation de Martine Lessard et de Nicolas
xxii
Vallières. Toutes les expériences de culture cellulaire ont été effectuées conjointement par
moi-même et Martine Lessard. Il faut aussi noter que toutes les chirurgies et les études de
comportement de BMS ont été réalisées par Nadia Fortin tandis que j’ai réalisé l’intégralité
des tests de Grip Walk.
1
Chapitre 1: Introduction Les lésions de la moelle épinière (LME) ont affecté environ 86 000 et 273 000 personnes
au Canada (Institut Rick Hansen) et aux États-Unis (National Spinal Cord Injury Statistical
Center) respectivement en 2013. Il a été reporté qu’il se produit près de 4300 nouvelles
lésions chaque année au Canada. Les coûts associés à ces lésions représentent environ 3,6
billions $ par année en soins de santé et équipements de toutes sortes, ce qui équivaudrait à
environ 1,6 à 3,0 millions $ pour chaque individu atteint d’un handicap. Les LME sont
divisées selon 2 classes: traumatiques et non-traumatiques. Les lésions traumatiques
surviennent lorsqu’il y a un impact physique externe sur la moelle épinière. Les hommes
âgés entre 16 et 34 ans sont le groupe qui est le plus touché par ce type de lésion. Les
causes les plus fréquentes sont les accidents de véhicules motorisés, les chutes, la violence
et les accidents de sport. Les lésions non-traumatiques apparaissent quant à elles suite à une
maladie, une infection ou une tumeur. Contrairement aux lésions traumatiques, les patients
atteints de lésions non-traumatiques sont surtout des femmes âgées de plus de 40 ans. Ces
personnes sont souvent atteintes de dommages neurologiques moins sévères. Les
conséquences d’une LME peuvent être séparées en 2 classes : tétraplégie (quadraplégie) et
paraplégie. La tétraplégie consiste en une perte de fonction des membres inférieurs et
supérieurs. Les dommages tissulaires sont souvent situés au niveau des vertèbres cervicales.
La paraplégie affecte les fonctions des membres inférieurs, les dommages se situant plutôt
en dessous de la vertèbre thoracique T8. La sévérité d’une LME est évaluée par un examen
neurologique et peut être incomplète ou complète dépendamment des déficits sensoriels et
moteurs du patient. Les conséquences des dommages ne se situent pas seulement au niveau
des fonctions motrices ou sensorielles, mais des complications des systèmes urinaire,
respiratoire et sexuel peuvent aussi survenir.
1.1. La moelle épinière
Le système nerveux central (SNC) comprend l’encéphale (cerveau, cervelet et tronc
cérébral) et la moelle épinière. La moelle épinière a comme fonction de transmettre les
2
influx nerveux entre le cerveau et les différents organes et tissus du corps. Elle s’étend du
bulbe rachidien en dessous du tronc cérébral jusqu’au niveau de la vertèbre lombaire L1. La
colonne vertébrale ainsi que la moelle épinière sont divisées en 5 régions (Figure 1.1). La
région cervicale est formée de 8 paires de nerfs cervicaux (C1-C8), la région thoracique de
12 paires de nerfs thoraciques (T1-T12), la région lombaire de 5 paires de nerfs lombaires
(L1-L5), la région sacrée de 5 paires de nerfs sacrés (S1-S5) et la région coccygienne a une
paire de nerfs coccygiens (C1).
Figure 1.1 Divisions et composantes de la moelle épinière
3
Au niveau des vertèbres lombaires et sacrées, la moelle forme un paquet de racines
nerveuses appelé queue de cheval. Cette structure devient importante d’un point de vue
clinique puisque cette région permet une intervention médicale, la ponction lombaire, qui
permet de prélever le liquide cérébrospinal (LCS) dans le but d’effectuer son analyse.
Puisque cette structure présente une interruption de la moelle, les risques d’endommager le
tissu nerveux sont grandement réduits. Il est aussi possible de réaliser une anesthésie
extradurale en y injectant un médicament anesthésique qui diffuse dans l’espace
subarachnoïdien et anesthésie les racines nerveuses.
D’un point de vue purement morphologique, il est aussi possible de remarquer que la
moelle épinière ne possède pas un diamètre constant sur sa pleine longueur en raison de
l’augmentation du nombre de cellules nerveuses et de connexions qui sont présentes pour le
traitement des influx nerveux voyageant dans les membres supérieurs et inférieurs. Au
niveau des vertèbres C5-T1, il est possible d’observer un renflement cervical tandis qu’au
niveau des vertèbres L2-S3, il y a présence du renflement lombaire (Figure 1.1).
1.1.1. Anatomie de la moelle épinière
La moelle épinière comporte à son centre un canal central entouré de la substance grise et
de la substance blanche. La substance grise est constituée des corps cellulaires des
neurones. Elle est divisée en cornes dorsales, latérales et ventrales. Les neurones des
cornes dorsales sont responsables de la transmission des influx sensoriels qui entrent dans
la moelle (Figure 1.2). Les cornes latérales comprennent les motoneurones autonomes qui
innervent les organes viscéraux et pelviens. Les cornes ventrales contiennent les corps
cellulaires des neurones moteurs qui projettent vers les muscles striés.
La substance blanche est constituée des axones et entoure la substance grise. Elle est
divisée en colonnes dorsales, latérales et ventrales. Les axones de la substance blanche
empruntent des trajets descendants ou ascendants pour voyager aux différents niveaux de la
moelle. Les fibres nerveuses des voies ascendantes émergent des neurones localisés dans
4
les ganglions spinaux. Les voies ascendantes sont entre autres situées dans la colonne
dorsale et sont responsables de transporter les influx nerveux sensoriels provenant de la
périphérie (Figure 1.2). La colonne latérale comprend les fibres responsables de la
transmission des influx régulant les différents organes internes, la température et aussi la
douleur. Les voies descendantes se situent surtout dans la colonne ventrale et proviennent
des différentes aires cérébrales. La colonne ventrale véhicule donc les influx moteurs
essentiels aux mouvements des muscles.
Figure 1.2 Structure de la moelle épinière
Le tissu nerveux est entouré de trois couches de tissus protecteurs qui couvrent en totalité le
cerveau et la moelle épinière. Ces couches forment les méninges qui sont constitués de la
dure-mère, la couche la plus externe, l’arachnoïde, la couche intermédiaire, et finalement de
la pie-mère, la couche la plus interne. L’espace compris entre l’arachnoïde et la pie-mère
est l’espace subarachnoïdien et contient le LCS (Figure 1.3). Le LCS contribue entre autre à
évacuer les molécules et les déchets provenant du SNC et à protéger le cerveau et la moelle
épinière contre les chocs et les infections de par son rôle immunologique. Le cerveau et la
moelle épinière sont également irrigués par plusieurs vaisseaux sanguins. Toute l’irrigation
sanguine de la moelle épinière est assurée par les artères vertébrales provenant de
ramifications de l’aorte (Figure 1.4). Ces artères se divisent à tous les niveaux vertébraux
pour donner naissance aux artères radiculaires antérieures et postérieures et ensuite aux
5
artères spinales antérieures et postérieures. Évidemment, si l’une des ces artères est
endommagée, la circulation sanguine à travers des régions spécifiques de la moelle épinière
peut être compromise, résultant ainsi en des dommages neurologiques importants tels que
la perte de fonctions sensorielles et motrices.
Figure 1.3 Méninges
6
Figure 1.4 Vascularisation de la moelle épinière
1.2. Les cellules gliales Les cellules gliales sont les cellules de soutien du système nerveux et forment donc
l’environnement des neurones. Elles possèdent comme fonctions de maintenir
l’homéostasie, de protéger le tissu nerveux, de maintenir et réguler les connexions
synaptiques entre les neurones et d’apporter des facteurs nécessaires à la croissance et la
survie neuronale. Dans le SNC, les cellules gliales sont les microglies, les astrocytes et les
oligodendrocytes (OLs). Les prochaines sections discuteront des principales
caractéristiques de chacune de ces cellules et de leur importance dans certaines
neuropathologies.
7
1.2.1. Les microglies
La microglie, communément appelée macrophage résident du SNC, est la principale
population cellulaire possédant des propriétés inflammatoires dans le SNC. Bien que les
macrophages soient présents dans tous les organes périphériques de l’organisme, la
microglie n’est présente que dans le CNS. Les cellules microgliales sont dérivées de
cellules précurseures myéloïdes qui entrent dans le SNC au cours de l’embryogenèse
(Ginhoux et al., 2010, Schulz et al., 2012, Kierdorf et al., 2013). Au cours de cette étape, la
microglie adopte une forme plutôt améboïde (Hirasawa et al., 2005), tandis que leur forme
devient ramifiée lors des premières semaines post-natales (Ignácio et al., 2005). Dans un
cerveau adulte sain, il a été démontré que la population microgliale est maintenue
indépendamment de la contribution des progéniteurs provenant de la moelle osseuse. En
effet, la population microgliale est capable de division cellulaire autant dans des conditions
normales que pathologiques par division cellulaire de ses cellules résidentes du SNC
(Ajami et al., 2007) (Elmore et al., 2014). En utilisant l’imagerie in vivo à 2 photons, il a
été démontré que les cellules microgliales sont actives et hautement dynamiques sous leur
forme physiologique normale. Elles sont capables de surveiller leur environnement et
répondre à des changements subtils via leurs récepteurs membranaires tels que les
récepteurs purinergiques et les récepteurs de la fractalkine et des cytokines (Kreutzberg,
1996, Davalos et al., 2005, Nimmerjahn et al., 2005). Plus récemment, des analyses par
microscopie électronique ont révélé que plus de 90% des prolongements microgliaux
présentent des contacts directs avec une synapse ou une composante de la synapse. De plus,
près de 70% de ces prolongements contacte plus d’un élément synaptique (Tremblay et al.,
2010).
La microglie joue un rôle important dans plusieurs pathologies telles que l’ischémie
cérébrale, l’Alzheimer, la maladie de Parkinson et la sclérose latérale amyotrophique (SLA)
(Perry et al., 2010). Leur habileté à répondre sélectivement aux molécules environnantes ou
à un changement extracellulaire leur permet de réagir rapidement suite à une condition
pathologique. Le récepteur de la fractalkine, CX3CR1, fortement exprimé chez la microglie
(Mildner et al., 2007), et son ligand, CX3CL1, sont des molécules très importantes pour la
8
maintenance des fonctions microgliales dans un tissu sain et malade (Zujovic et al., 2000,
Mizuno et al., 2003). Donnelly et al. ont démontré que CX3CR1 et son ligand sont
hautement régulés suite à une LME (Donnelly et al., 2011). La déficience de CX3CR1 chez
la souris favorise la récupération locomotrice par rapport aux souris sauvages. En effet,
62% des souris CX3CR1-knockout (KO) ont obtenu un score de 6 au test locomoteur Basso
Mouse Scale (BMS) comparativement à 13% chez les souris sauvages au temps 28 jours
post-LME. Fait intéressant, un score BMS de 6 correspond au rétablissement de la
coordination des membres postérieurs et fut corrélé dans cette même étude avec une
expression intraspinale plus accrue de CX3CR1 et une modification du phénotype des
macrophages présents au site de lésion, c’est-à-dire davantage de macrophages Ly6Clow
iNOS+ MHCII+ CD11c- chez les souris contrôles vs. plus de macrophages CCR2+ Ly6Chigh
MCHII+ CD11c+ chez les souris CX3CR1-KO. De plus, il fut observé que l’absence de ce
récepteur a pour effet de réduire les effets potentiellement neurotoxiques des microglies,
permettant ainsi de réduire les dommages tissulaires et l’inflammation suite à une ischémie
cérébrale (Dénes et al., 2008). Ces résultats suggèrent que le blocage de la voie de
signalisation CX3CR1 représenterait une thérapie sélective intéressante pour promouvoir la
neuroprotection et diminuer l’inflammation suite à une LME. Cependant, l’inhibition de
CX3CR1 chez la microglie peut aussi occasionner des effets neurotoxiques dans des
modèles de maladies neurodégénératives. En utilisant 3 différents modèles in vivo chez la
souris, soient l’injection de LPS, la maladie de Parkinson et la SLA, Cardona et al. ont
démontré qu’une déficience en CX3CR1 engendre des dommages neuronaux induits du
moins en partie par la microglie (Cardona et al., 2006), confirmant ainsi l’hypothèse
voulant que ce récepteur puisse participer au maintien de la survie neuronale (Meucci et al.,
2000) et à l’inhibition de l’apoptose induite par FasL (Boehme et al., 2000).
1.2.2. Les astrocytes
Les astrocytes sont les cellules gliales les plus abondantes du SNC. La astrocytes possèdent
plusieurs fonctions essentielles à l’activité neuronale incluant la relâche de glutamate, la
régulation des ions hydrogène et potassium et la modulation de la dynamique des cônes de
croissance (Chen and Swanson, 2003). Les astrocytes jouent aussi un rôle important dans la
9
survie des neurones et des autres cellules gliales en absence de lésion traumatique en
synthétisant des facteurs neurotrophiques comme le facteur neurotrophique dérivé du
cerveau (BDNF) et la neurotrophine-3 (NT-3) (Dreyfus et al., 1999). De plus, ils
interagissent étroitement avec les cellules endothéliales et les péricytes pour conférer à la
barrière hémato-encéphalique toute son étanchéité (Abbott et al., 2006). Comme les
microglies, les astrocytes possèdent plusieurs récepteurs de reconnaissance d’agents
pathogènes ou de signaux de dangers (PRRs) (Jack et al., 2005). D’ailleurs, ces cellules
jouent un rôle important dans l’activation et la régulation de la neuroinflammation
(Brambilla et al., 2005, Van Loo et al., 2006). Effectivement, les astrocytes réactifs
(activés) expriment et relâchent plusieurs cytokines et chimiokines (John et al., 2005).
L’activation des astrocytes est associée à leur prolifération, la propagation de leurs
prolongements ainsi que la surexpression de la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP), des
protéoglycanes de type chondroïtine sulfate (CSPGs) et de facteurs de croissances.
D’ailleurs, la protéine GFAP est couramment utilisée comme marqueur des astrocytes (Eng
et al., 2000). L’activation de ces cellules peut mener à la formation d’une cicatrice gliale,
un phénomène largement présent suite à un traumatisme du SNC comme les LME. Cette
cicatrice est reconnue pour présenter des effets bénéfiques de même que néfastes pour le
tissu nerveux. En effet, plusieurs études ont démontré que la cicatrice gliale présente suite à
une LME peut restreindre l’étendue des dommages tissulaires en entourant la région
lésée/nécrotique, en restaurant l’intégrité de la barrière hémato-spinale (BHS) et en limitant
l’infiltration des cellules immunitaires au site lésionel (Eddleston and Mucke, 1993,
Faulkner et al., 2004). Les effets bénéfiques et néfastes de la cicatrice gliale sont plus
amplement détaillés dans les paragraphes qui suivent.
Faulkner et al. ont utilisé un modèle de souris transgéniques (Tg) dans lesquelles le gène de
la thymidine kinase (TK) est exprimé par les astrocytes sous le contrôle du promoteur du
gène GFAP (Faulkner et al., 2004). Chez les souris GFAP-TK, l’injection de ganciclovir
(GCV) permet de dépléter sélectivement les astrocytes réactifs en division. Cette équipe a
tout d’abord évalué les fonctions de la BHS et le recrutement des cellules immunitaires 14
jours suite à une LME. Ils ont aussi montré que l’absence d’astrocytes réactifs engendre
10
une déficience dans la réparation de la BHS, tel que démontré par la diffusion massive dans
le parenchyme nerveux à proximité de la LME d’un dextran injecté par voie intraveineuse
(i.v.) chez les souris GFAP-TK traitées au GCV comparativement aux souris sauvages. De
plus, l’étude a rapporté un nombre de macrophages CD45+ sept fois plus élevé chez les
souris Tg traitées au GCV. Les souris sauvages étaient quant à elles caractérisées par la
présence de microglie CD45dim mais peu de macrophages. Faulkner et al. ont aussi examiné
l’effet de l’ablation des astrocytes sur la survie des neurones et des oligodendrocytes. Les
souris sauvages présentaient de nombreux neurones en santé dans la région qui entoure la
lésion, là où de nombreux astrocytes sont normalement présents. Par contre, les souris
GFAP-TK traitées au GCV possédaient beaucoup moins de neurones NeuN+ à proximité de
la lésion. L’absence d’astrocytes réactifs fut aussi corrélée avec une diminution de plus de
90% du nombre d’oligodendrocytes dans la matière blanche chez les souris Tg traitées au
GCV comparativement à 24% chez les souris sauvages. Parallèlement, une plus grande
zone de démyélinisation fut observée chez les souris GFAP-TK ayant reçu le GCV. Ainsi,
ces résultats démontrent que l’activation des astrocytes est essentielle à la survie des
neurones et des oligodendrocytes, minimisant du même coup l’envergure des déficits
fonctionnels. Les effets bénéfiques de la présence des astrocytes ont aussi été démontrés
dans le cadre du modèle murin de la sclérose en plaques (SP), l’encéphalite autoimmune
expérimentale (EAE) (Voskuhl et al., 2009), et d’un modèle de lésion au cerveau (Myer et
al., 2006). Toutefois, il est important de mentionner que ce modèle ne permet pas d’étudier
une voie de signalisation spécifique chez les astrocytes ce qui pourrait expliquer ces
résultats.
Paradoxalement, les astrocytes sont aussi reconnus pour exhiber des propriétés néfastes
suite à une LME. Brambilla et al. ont proposé que l’inhibition de la voie de signalisation
NF-κB chez les astrocytes pourrait être une stratégie thérapeutique intéressante pour le
traitement des LME et même de l’EAE. Afin d’étudier la contribution de cette composante
chez les astrocytes, cette équipe a généré une lignée de souris Tg chez laquelle NF-κB est
sélectivement inactivé chez les astrocytes en ciblant la forme du dominant négatif de
l’inhibiteur de κBα (IκBα) exprimé sous le contrôle du promoteur GFAP (souris GFAP-
11
IκBα-dn) (Brambilla et al., 2005). L’inactivation de NF-κB chez les astrocytes a permis
d’augmenter la récupération fonctionnelle chez les souris Tg comparativement aux souris
sauvages jusqu’à au moins 8 semaines post-lésion, ce qui correspond au dernier temps
évalué dans cette étude. Histologiquement, ceci s’est traduit par une diminution du volume
de la lésion chez les souris Tg ainsi qu’une plus faible perte de matière blanche.
L’inactivation de NF-κB a également réduit l’expression de quelques modulateurs de
l’inflammation tels que les chimiokines CXCL10 et CCL2, en plus d’augmenter
l’expression de la cytokine IL-6. Une seconde étude de Brambilla et al. a voulu pousser
encore plus loin l’investigation de l’effet de l’inactivation de NF-κB chez les astrocytes
(Brambilla et al., 2009). Ils ont donc effectué des marquages rétrogrades au Fluoro-Gold
(FG) et antérogrades à la biotine dextran-amine (BDA) afin de pouvoir visualiser les
neurones et leurs axones au temps 8 semaines post-LME. Ils ont alors démontré que le
nombre de cellules FG+ était significativement supérieur chez les souris Tg. Le nombre
d’axones corticospinaux BDA+ situés du côté caudal à la LME était également supérieur
chez les souris Tg comparativement aux souris sauvages chez qui les axones avaient
pratiquement tous dégénérés. Il est important de noter qu’une partie de ces axones co-
localisaient avec le marqueur GAP-43, une protéine présente chez les axones qui tendent à
régénérer. Ces résultats indiquent que l’inhibition de NF-κB dans les astrocytes permet
d’établir un environnement plus favorable à la survie des axones impliqués dans les
fonctions locomotrices. Plus récemment, l’inactivation de NF-κB chez les astrocytes a
permis de démontrer que l’oligodendrogenèse est favorisée chez les souris Tg, une réponse
qui fut associée à une plus grande expression des protéolipides de la myéline et du
récepteur de chimiokine CXCR4. Rappelons qu’un rôle pour CXCR4 fut démontré dans la
migration des précurseurs neuronaux, la croissance des axones ainsi que dans le maintien
des progéniteurs des oligodendrocytes (OPCs) et la remyélinisation (Bracchi-Ricard et al.,
2013).
1.2.3. Les oligodendrocytes La myélinisation des axones est un processus qui est essentiel à la bonne conduction de
l’influx nerveux. Dans le SNC, la myélinisation est possible grâce à un type de cellules
12
gliales, les oligodendrocytes. Dans le SNC adulte normal, les OLs matures sont
majoritairement situés dans la matière blanche où ils exécutent leur principal rôle. Dans la
moelle épinière, les OLs proviennent de progéniteurs neuroépithéliaux situés dans la corne
ventrale et pouvant donner naissance à la fois aux neurones et aux OLs (Mctigue and
Tripathi, 2008, Mitew et al., 2013). C’est au cours du développement que ces progéniteurs
quittent la zone progénitrice pour se différencier en précurseurs neuronaux ou
oligodendrocytaires. Les précurseurs d’OLs, appelés OPCs, se retrouvent principalement
dans la matière blanche. Dans le cerveau, il semble que la source majeure des OLs soit le
prosencéphale. Dans la moelle épinière, la migration des précurseurs des OLs est influencée
par la présence de 2 protéines, la Sonic hedgehog (SHh) produite dans la corne ventrale et
la protéine morphogénétique osseuse (BMP) provenant de la corne dorsale (Orentas et al.,
1999, Mekki-Dauriac et al., 2002, Miller, 2002, Nicolay et al., 2007). Suite à leur migration
au bon endroit, ces cellules se différencient et régulent de façon négative les marqueurs de
précurseurs tels que le récepteur du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFαR)
et CSPG4, aussi appelé antigène neurone-glie 2 (NG2). Les OLs nouvellement différenciés
produisent alors de la myéline qui leur permettra d’entourer et myéliniser les axones
environnants. Dans le cerveau du rat, la myélinisation active des axones débute autour du
jour 7 post-natal, bien qu’il soit possible d’observer un faible nombre d’axones myélinisés
à des temps plus tôt après la naissance. La vitesse de myélinisation augmente ensuite
légèrement pour atteindre son maximum vers les jours 14 à 18 post-nataux. Vingt-quatre
jours après à la naissance, pratiquement toutes les régions du cerveau du rat sont
complètement myélinisées (Downes and Mullins, 2013). Suite à une LME chez la souris, le
nombre d’OLs diminue rapidement au cours des 24 premières heures pour atteindre son
niveau le plus bas à 7 jours post-lésion (Lytle and Wrathall, 2007). La mort des OLs reste
détectable pour au moins 3 semaines suivant une LME (Li et al., 1999, Casha et al., 2001).
L’apoptose et la nécrose sont les mécanismes de mort cellulaire les plus susceptibles d’être
responsables de la destruction des OLs. Une des conséquences directes de la mort des OLs
serait la démyélinisation des axones, ce qui affecte grandement la conduction de l’influx
nerveux à travers les neurones endommagés et par conséquent, les fonctions motrices et
sensorielles. Plusieurs conditions nuisibles à la survie cellulaire apparaitraient suite à une
LME et seraient responsables de la mort des OLs, comme entre autre la présence de
13
molécules oxydantes provoquant le stress oxydatif, la relâche de glutamate par les neurones
et les cellules gliales ainsi que la relâche de plusieurs cytokines pro-inflammatoires pouvant
activer différentes voies de signalisation menant à la mort cellulaire, telles que le TNF-α,
l’IL-2 et l’IFN-γ (Mctigue and Tripathi, 2008).
Dans le but de repeupler le tissu nerveux d’OLs myélinisants et favoriser la remyélinisation
des axones endommagés ou nouvellement formés, les OPC doivent être activés par les
cellules gliales. Les astrocytes et les microglies sont des sources majeures de facteurs de
croissance, comme par exemple PDGF et FGF, induisant la prolifération rapide des OPCs
suite à une lésion. La régulation de la transcription joue aussi un rôle important dans la
différenciation des OPCs en OLs myélinisants. Les facteurs de transcription possédant un
domaine hélice-boucle-hélice, comme par exemple Olig1 et Olig2, ont été démontrés
comme étant essentiels à la production des OLs et mêmes des neurones au cours du
développement (Lu et al., 2000, Zhou et al., 2000, Takebayashi et al., 2002). Étonnamment,
les cellules progénitrices des souris se développant en absence d’Olig1 et d’Olig2 (souris
Olig1/2-/-), et qui en temps normaux devraient produire des motoneurones et des OLs,
génèrent plutôt des interneurones et des astrocytes (Zhou and Anderson, 2002). Une autre
étude a démontré qu’Olig1 n’est pas requis pour le développement des neurones moteurs
mais favorise plutôt la formation et la maturation des OLs dans le cerveau, tandis qu’Olig2
est essentiel à la formation des neurones moteurs (Lu et al., 2002). Plus récemment, Hughes
et al. ont généré des souris NG2-mEGFP pour démontrer par microscopie in vivo à 2-
photons le dynamisme des OLs dans un cerveau adulte (Hughes et al., 2013). Les analyses
par microscopie ont révélé que les prolongements des cellules NG2+ sont constamment en
mouvement dans le but de surveiller leur environnement dans le cerveau sain. De plus, ces
cellules migrent de façon continue dans le cortex adulte en réorientant leurs prolongements
en direction opposée des péricytes qui eux demeurent presque toujours stationnaires.
Hughes et al. ont aussi démontré que la densité de la population d’OLs NG2+ est maintenue
par la perte cellulaire (mort ou différenciation) et l’addition continue de nouvelles cellules
(prolifération). Ensemble, ces résultats signifient que les cellules précurseurs sont
disponibles pour remplacer les OLs endommagés ou morts suite à une lésion du SNC et que
ceux-ci participent à la réparation tissulaire en favorisant la production d’OLs myélinisants.
14
1.3. Neuropathologie des LME
1.3.1. La lésion primaire Les LME sont divisées en 2 grands évènements pathologiques: la lésion primaire et la
lésion secondaire. Chez l’humain, la LME survient dans la majorité des cas suite à un
impact ou une compression prolongée sur la colonne vertébrale pouvant endommager la
moelle épinière. La force mécanique de l’impact peut aussi résulter en fracture des os,
dislocation ou rupture des disques intervertébraux risquant d’entraîner des dommages à la
moelle. Plus précisément, la lésion primaire consiste en la destruction locale des neurones
et de cellules de support de toutes sortes (ex. : cellules endothéliales, cellules gliales, etc.),
causant ainsi l’apparition d’une zone dite nécrotique (Tator, 1995). La rupture des
vaisseaux sanguins qui irriguent la moelle épinière est donc une conséquence directe d’une
LME. L’amplitude de l’hémorragie, tout comme l’ampleur des dommages tissulaires,
dépendent évidemment de la sévérité de l’impact initial survenu sur le tissu. À l’épicentre,
l’écoulement sanguin maximal se retrouve majoritairement dans la matière grise tandis qu’à
l’extérieur de l’épicentre, il se situe surtout dans la matière blanche de la corne dorsale où il
est beaucoup moindre (Mautes et al., 2000). Les changements à la structure et aux fonctions
des vaisseaux sanguins incluent la perte d’apport sanguin à la moelle épinière, l'absence
d'apport en oxygène et nutriments indispensables, la mort des cellules endothéliales et la
rupture de la BHS (Tator and Koyanagi, 1997). En effet, la rupture de la BHS survient très
tôt suite à une LME, aussitôt que 1 heure post-lésion, pour un atteindre un maximum au
temps 24 heures. L’étanchéité de la BHS se rétablit partiellement par la suite (Figley et al.,
2013). En effet, la perméabilité de la barrière à des colorants tel que Evans Blue est revenue
à un niveau basal dès 14 jours post-LME. Il a aussi été démontré par Figley et al. que
l’angiogenèse débute au troisième jour post-lésion et ce jusqu’au dixième jour, avec un
maximum à 5 jours post-LME au cours duquel il y a environ 15% des vaisseaux qui sont
Ki67+ (Ki67 est un marqueur de prolifération cellulaire). Enfin, la rupture de la BHS a pour
effet de faciliter l’influx de cellulaires immunitaires au site lésionnel. Des analyses par
immunohistochimie ont permis de déterminer que la réponse inflammatoire suite à une
lésion est significativement plus grande dans la moelle épinière que dans le cortex cérébral
(Schnell et al., 1999). L’aire de rupture de la BHS est également plus large et les dommages
15
vasculaires persistent plus longtemps dans la moelle épinière, corrélant ainsi avec une
présence soutenue des cellules immunitaires autour de l’aire de rupture.
1.3.2. Dégénérescence secondaire Suivant la lésion, les axones lésés entreprennent un processus de dégénérescence rapide qui
se déclenche en moins de 30 min et qui est caractérisé par la fragmentation de l’axone à
proximité du site lésionel (Kerschensteiner et al., 2005). Ce phénomène appelé
dégénérescence axonale aigüe (DAA) affecte principalement les segments axonaux du côté
proximal à la lésion, c.-à-d. les axones qui demeurent connectés aux corps cellulaires
neuronaux. La DAA s’apparente à la dégénérescence Wallérienne (DW). Par contre, au
cours de la DW, ce sont plutôt les segments axonaux qui sont situés du côté distal à la
lésion, et donc déconnectés de leur corps cellulaire, qui dégénèrent. La DW est caractérisée
par la désintégration du cytosquelette présent dans les axones et de la gaine de myéline. De
plus, une des étapes très importantes de ce processus est l’élimination des débris de myéline
par les cellules phagocytaires présentes dans le système nerveux (Kerschensteiner et al.,
2005). Suite à la lésion d’un nerf périphérique (LNP), l’élimination des débris de myéline
est largement complétée au cours des 14 jours suivant la lésion. Par contre, suite à une
lésion du SNC, cette élimination peut prendre plusieurs semaines voire même des années. Il
pourrait d’ailleurs s’agir de l’une des principales raisons pour laquelle la régénérescence
des axones est compromise dans le SNC suite à une lésion (Vargas and Barres, 2007). Il est
aussi important de mentionner que les OLs possèdent très peu de capacité de phagocytose,
contrairement aux cellules de Schwann, les cellules myélinisantes du SNP.
De plus, les lésions secondaires survenant après la lésion primaire peuvent être causées par
le déclenchement de différents mécanismes moléculaires et cellulaires qui entrainent
ultimement la mort des neurones et des cellules gliales, des réponses qui sont à l’origine
d’une partie des dommages tissulaires. Ces dommages secondaires contribuent à une plus
grande perte des fonctions locomotrices et contreviennent donc à la récupération et la
réadaptation d’un patient atteint d’une LME. Les cellules gliales sont impliquées de très
près dans l’évolution de ces mécanismes. Un des phénomènes reliés à l’activation des
16
astrocytes, appelé astrogliose, est la formation de la cicatrice gliale constituant une cause
majeure de l’échec de la régénérescence axonale suite à une lésion du SNC. Les
conséquences plus exactes de l’activation des astrocytes et de la formation de cette cicatrice
ont été discutées plus en détails à la section 1.2.2 qui porte sur le rôle des astrocytes dans
un modèle de LME. En plus des astrocytes, la cicatrice gliale est formée d’une population
hétérogène de cellules interagissant ensemble au cœur de la lésion (Figure 1.5). Le site
lésionnel est notamment envahi par des OPCs NG2+, des fibroblastes, des microglies de
même que des cellules immunitaires pro-inflammatoires telles que les macrophages (Cregg
et al., 2014). La région la plus externe de la cicatrice est quant à elle majoritairement
composée d’astrocytes réactifs.
Figure 1.5: La cicatrice gliale
Les axones tentant de se régénérer en pénétrant la cicatrice gliale et la lésion semblent avoir
un peu plus de difficulté à repousser. La présence d’une grande quantité de CSPGs, une
famille de protéines de la matrice extracellulaire comprenant notamment NG2, neurocane,
aggrécane, brévicane, versicane et phosphacane, y jouerait un rôle clé puisque ces
molécules sont maintenant reconnues comme étant de puissants inhibiteurs de la repousse
axonale (Silver and Miller, 2004). En effet, la dégradation de la chaîne de
17
glycosaminoglycane contenue dans les CSPGs par la chondroitinase ABC a permis de
promouvoir la régénération d’axones projetant dans les voies sensorielles ascendantes et
corticospinales descendantes (Bradbury et al., 2002). Plusieurs protéines associées aux OLs
et contenues dans la myéline ont aussi été identifiées comme étant des inhibiteurs de la
croissance axonale: la glycoprotéine associée à la myéline (MAG), la glycoprotéine
d’oligodendrocytes (OMgp), Nogo (David et Lacroix, 2003), l’éphrine (Benson et al. ,
2005) et la sémaphorine (Moreau-Fauvarque et al., 2003) (Yiu and He, 2006) (Shim et al.,
2012). Trois de ces molécules se lient au même récepteur, le récepteur Nogo (NgR), présent
sur les neurones. NgR est une protéine liée au GPI (glycosylphosphatidylinositol) qui
nécessite la formation d’un complexe avec une protéine transmembranaire comme p75NTR,
Troy ou Lingo1 pour assurer la transmission du signal inhibiteur de ces ligands, menant
ainsi à l’échec de la croissance axonale (David et Lacroix, 2003, Schwab et Strittmatter,
2014). L’inhibition de cette voie de signalisation pourrait représenter une thérapie
intéressante pour favoriser la régénérescence axonale suite à une lésion du SNC
(Domeniconi et al., 2002, Lee and Zheng, 2012, Schwab and Strittmatter, 2014). En effet,
plusieurs études ont rapporté que l’injection d’un anticorps dirigé contre Nogo-A (anti-
Nogo-A) chez le rongeur a pour effet d’améliorer la récupération des fonctions
locomotrices de l’animal suite à une LME (Zörner and Schwab, 2010, Pernet and Schwab,
2012). De même, des singes ayant subi une lésion cervicale et traités avec cet anticorps ont
récupéré une plus grand dextérité et habileté de leur mains que les sujets contrôles non
traités (Freund et al., 2009). De plus, il a été démontré que la combinaison du traitement de
l’anti-Nogo-A avec la chondroitinase ABC serait encore plus efficace qu’une simple
injection d’anti-Nogo-A pour améliorer la récupération suite à la lésion (Zhao et al., 2013).
1.4. Signalisation intracellulaire de l’initiation de l’inflammation L’inflammation est très importante pour la régulation des phénomènes de dégénérescence
et de régénérescence discutés dans les sections précédentes (e.g. formation de la cicatrice
gliale, maintien de la BHS, prolifération des oligodendrocytes et activation des microglies).
En effet, le système immunitaire effectue une surveillance permanente dans le SNC où
l’initiation de l’inflammation prend place en réponse à différents stimuli. La reconnaissance
18
des antigènes des micro-organismes pathogènes (PAMPs; pathogen-associated molecular
patterns) ou de molécules endogènes associées au danger (DAMPs; damage-associated
molecular patterns) est essentielle pour l’induction d’une réponse immunaire efficace. Les
mécanismes de reconnaissance sont médiés par une série de récepteurs membranaires ou
intracellulaires qui permettent l’activation de l’inflammation. Ces récepteurs sont appelés
récepteurs de reconnaissance de motifs moléculaires (PRRs; pattern recognition receptors).
Ces récepteurs incluent les récepteurs de type Toll (TLRs; Toll-like receptors) et les
récepteurs de type NOD (NLRs; NOD-like receptors). Les prochaines sections discuteront
de ces différents récepteurs ainsi qu’un autre type de récepteur impliqué dans l’initiation de
l’inflammation, les récepteurs purinergiques de type P2X (P2XRs). D’autres PRRs ont
aussi été identifiés tels que les RIG-like helicases (RLRs) et les C-type lectin receptors
(CLRs) mais ceux-ci ne seront pas décris dans cette thèse étant donné leur rôle moins
prédominant suite à une LME.
1.4.1. Les TLRs Les membres de la famille des TLRs sont responsables de la détection des pathogènes
présents à l’extérieur ou à l’intérieur de la cellule (Akira et al., 2006). Les TLRs sont
caractérisés par la présence d’une extrémité N-terminale riche en leucine (LRR) et d’un
domaine cytoplasmique Toll/IL-1R (TIR) présentant une grande similarité avec le récepteur
de type 1 de l’IL-1 (IL-1R1). Dix et douze TLRs ont été identifiés chez l’humain et la
souris respectivement. Les différents TLRs sont capables de reconnaître différents motifs
présents chez les microorganismes ou les composantes du soi. Les TLRs 1, 2 et 6 semblent
détecter les lipides tandis que les TLRs 7, 8 et 9 reconnaissent plutôt les acides nucléiques.
D’autres TLRs sont capables de détecter une panoplie de ligands. Par exemple, le TLR4
reconnaît aussi bien l’endotoxine bactérienne lipopolysaccharide (LPS) et le taxol que des
molécules du soi telles que les protéines de choc thermique (HSPs), le fibrinogène et les
oligosaccharides d’acide hyaluronique (Takeda and Akira, 2005). La liaison d’un PAMP
par les TLRs conduit rapidement à la transcription de différents gènes pro-inflammatoires.
En effet, les TLRs sont capables d’activer différentes voies signalétiques via des molécules
adaptatrices se liant au domaine TIR du récepteur (Takeuchi and Akira, 2010). Les 2
19
principales voies sont régulées par des molécules adaptatrices comme le gène de réponse
primaire de différenciation de cellules myéloïdes 88 (MyD88 ; myeloid differentiation
primary 88) et le domaine TIR induisant l’IFN-β (TRIF ; TIR domain-containing adaptor
inducing IFN-β). Ces molécules adaptatrices activent des facteurs de transcription comme
le facteur nucléaire NF-κB (NF-κB ; nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of
activated B cells), les MAP-kinases (MAPK) et les facteurs régulant l’IFN (IRFs ; IFN-
regulatory factors), entraînant du même coup la transcription de cytokines telles que l’IL-1,
l’IL-6, le TNF-α et l’IFN-β (Casanova et al., 2011).
Les TLRs sont exprimés sur la majorité des cellules du système immunitaire incluant les
lymphocytes B (Gerondakis et al., 2007) et T (Sutmuller et al., 2007), les neutrophiles
(Sabroe and Whyte, 2007), les monocytes, les macrophages et les cellules dendritiques
(Kaisho and Akira, 2006). Ils sont également exprimés par les cellules gliales et les
neurones du SNC et peuvent donc reconnaître des ligands endogènes et déclencher
l’inflammation (Lee et al., 2013). Étant donné que la microglie est l’une des premières
cellules à répondre à un pathogène dans le SNC, il va de soit que cette population cellulaire
exprime une panoplie de TLRs de toutes sortes qui sont nécessaires à l’activation de la
réponse immunitaire (Lehnardt, 2010). Toutefois, dans certains contextes, les réponses
engendrées par l’activation des TLRs semblent aller au-delà de la réponse inflammatoire, et
ce bien qu’il soit parfois difficile d’évaluer les conséquences indirectes de l’inflammation.
Par exemple, l’activation de TLR4 par la LPS peut entrainer la mort des neurones corticaux
par un mécanisme qui dépend de la microglie (Lehnardt et al., 2003). En effet, en absence
de microglies, la LPS n’a aucun effet sur la mort de neurones en culture puisque ceux-ci
n’expriment pas le TLR4. Par contre, l’ajout de microglies purifiées puis traitées à la LPS
provoque la mort neuronale. Il fut aussi démontré que l’ARNm codant pour le TLR2 est
exprimé dans certaines cellules du SNC, principalement dans les microglies (Laflamme et
al., 2001). Une étude plus récente a confirmé que le streptocoque de groupe B (GBS) peut
causer des dommages aux neurones via un mécanisme dépendant du TLR2 exprimé chez la
microglie (Lehnardt et al., 2006). Ces résultats suggèrent donc que les TLR peuvent exercer
des effets neurotoxiques dans des cas d’infection du SNC, comme lors d’une méningite par
20
exemple. La plupart des TLRs furent aussi détectés dans des cultures primaires d’astrocytes
murins ou humains (Lee et al., 2013). Par contre, l’expression des TLRs dans ces mêmes
cellules in vivo est plutôt limitée. Dans le cerveau de rats naïfs, la présence de TLR2 et
TLR4 dans les astrocytes est indétectable, suggérant que ces récepteurs ne sont pas
exprimés chez les astrocytes non-réactifs. Au contraire, le TLR4 fut détecté chez les
astrocytes situés à l’intérieur de lésions cérébrales chez des patients atteints de SP mais pas
dans les régions non-atteintes de la matière blanche, démontrant du même coup que TLR4
est seulement exprimé chez les astrocytes activés (Bsibsi et al., 2002). Ces résultats
suggèrent que les TLRs pourraient être des médiateurs importants de l’activation des
astrocytes. Supportant cette possibilité sont les travaux montrant que la stimulation
d’astrocytes en culture à la LPS, un activateur de TLR4, déclenche l’astrogliose et la
relâche de cytokines pro-inflammatoires (IL-1β, IL-6 et TNF) via un mécanisme dépendant
de la voie de signalisation NF-κB (Maezawa et al., 2006).
Les TLRs sont impliqués dans le développement et dans plusieurs maladies du système
nerveux. Par exemple, les TLRs jouent un rôle important au cours de l’embryogenèse plus
précisément dans le développement et la formation neuronale. En effet, les cellules
progénitrices neurales (NPCs) expriment les TLRs 2, 3 et 4 et ceux-ci seraient
vraisemblablement impliqués dans la prolifération et la différenciation des NPCs. Ces
récepteurs semblent donc influencer plusieurs aspects de la physiologie neuronale chez
l’adulte comme la neurogenèse et la plasticité, suggérant que les TLRs pourraient moduler
les fonctions cognitives (Okun et al., 2011). Paradoxalement, des études ont démontré
l’effet néfaste de l’activation des TLRs dans des modèles de maladies neurodégénératives
ou suite à une lésion du SNC (Bell et al., 2013) (Li et al., 2014). En effet, l’expression de
TLR 4 et la présence de microglies activées furent observées près des zones hémorragiques
suite à une contusion de la moelle corrélant avec une sur-régulation de NF-κB, une
présence accrue de cellules apoptotiques et la rupture de la BHS (Zhang et al., 2013). Bien
que les microglies ont été identifiées comme étant un type cellulaire contribuant à la
neurotoxicité suite à une stimulation des TLR 2 et 4 en augmentant la relâche de glutamate
et de cytokines pro-inflammatoires (Lehnardt et al., 2002), Stirling et al. ont rapporté que la
21
microglie activée via le TLR 2 est bénéfique suite à une LME (Stirling et al., 2013). En
effet, le traitement de la moelle épinière lésée, maintenue viable ex vivo, avec un
antagoniste de TLR 2, Pam2CSK4, a permis d’augmenter l’activation microgliale et de
réduire la dégénérescence axonale favorisant ainsi la formation d’un cône de croissance et
la régénérescence axonale. L’ajout d’agonistes de TLR 4, tels que la LPS et le zymosan, ne
fut pas en mesure de reproduire ces effets. L’étude du mécanisme sous-jacent les effets
bénéfique du traitement au Pam2CSK4 a démontré que cet agoniste de TLR2 provoque une
activation alternative de la population microgliale, suggérant du même coup que le
phénotype de la cellule immunitaire puisse réguler la fine balance entre dommages
tissulaires et réparation tissulaire. De plus, Kigerl et al. ont démontré que la délétion des
gènes codant pour TLR 2 et 4 entraîne des déficits locomoteurs suite à une LME qui sont
associés avec une augmentation de la démyélinisation, de l’activation des astrocytes et des
macrophages et une expression accrue de l’ARNm de l’IL-1β (Kigerl et al., 2007).
Ensemble, ces résultats suggèrent que la régulation spécifique de l’activation des cellules
gliales composant le SNC peut présenter autant des effets neuroprotecteurs que néfastes
suite à une LME.
1.4.2. Les NLRs
Les NLRs font partie d’une famille de récepteurs intracellulaires parmi lesquels on retrouve
pas moins de 34 membres chez la souris et 23 membres chez l’humain. La fonction
principale connue pour ces récepteurs consiste à procéder au clivage de l’interleukine-1β
(IL-1β), de l’interleukine-18 (IL-18) et de l’interleukine-33 (IL-33) grâce à l’activation de
la caspase-1. De façon générale, les NLRs possèdent à l’extrémité N-terminale un domaine
effecteur pyrine (PYD) ou caspase activation and recruitment domain (CARD),
responsable il va s’en dire du recrutement et de l’activation de la caspase. On retrouve à
l’extrémité C-terminale un domaine LRR tandis que la section intermédiaire (centre)
dispose d’un site de liaison aux nucléotides et d’oligomérisation (domaine NOD ou
NACHT). Le domaine LRR semble interagir avec les ligands et jouer un rôle dans
l’autorégulation de la protéine, tandis que le domaine NACHT lie les nucléotides et par le
fait même régule l’oligomérisation et l’assemblage d’un complexe protéique appelé
22
inflammasome responsable de l’activation de la caspase-1 et de la caspase-11 (souris) ou
caspase-5 (humain). Les domaines PYD et CARD N-terminaux médient les interactions
protéine-protéine de ce complexe (Latz, 2010, Schroder and Tschopp, 2010).
L’analyse des membres de la famille des NLRs permet la distinction de 3 sous-familles:
NODs, NLRPs (ou NALPs) et IPAF. Le domaine effecteur N-terminal PYD ou CARD
permet de différencier les membres de chacune de ces familles. Ces domaines font partie
d’une superfamille incluant, en plus de PYD et CARD, le domaine de mort cellulaire (DD;
death domain) et le domaine effecteur de mort cellulaire (DED; death effector domain)
(Park et al., 2007). Dans la majorité des cas, un domaine DD interagit avec un autre
domaine DD, CARD avec CARD, DED avec DED et PYD avec PYD. De cette manière,
ces domaines recrutent d’autres molécules dans le but d’activer une cascade signalétique.
La molécule adaptatrice apoptosis-associated speck-like protein containing a carboxy-
terminal domain (ASC ou Pycard) s’ajoute à ce complexe et lie le NLR à la caspase-1
grâce à ses domaines PYD et CARD situés à chacune de ses extrémités N- et C- terminales.
La molécule adaptatrice ASC régule donc l’activation de la caspase-1 et la formation de
l’inflammasome (Masumoto et al., 1999, Martinon et al., 2002, Mariathasan et al., 2004).
ASC possède un rôle spécifique dans le clivage et la relâche de l’IL-1β, l’IL-18 et l’IL-33,
mais n’affecte pas la sécrétion d’autres cytokines pro-inflammatoires telles que le TNF et
l’IL-6 (Mariathasan et al., 2004). En effet, des macrophages déficients en ASC stimulés
avec la LPS et l’ATP produisent une quantité normale de TNF et d’IL-6, mais moins d’IL-
1β. À ce jour, 4 NLRs sont connus pour être capable de former, in vivo, un inflammasome
dit fonctionnel (Kanneganti, 2010)(Lamkanfi and Dixit, 2009). L’équipe de Tschopp a été
la première à mentionner l’existence de ce type de complexe multi-protéique d’environ 700
kDa (Martinon et al., 2002).
La Figure 1.6 (Schroder and Tschopp, 2010) illustre ces 4 différents inflammasomes :
NACHT domain-, LRR-, and PYD-containing protein 1 (NLRP1), NLRP3 (aussi connu
sous le nom de cryopyrine), IL-1β-converting enzyme protease-activating factor (IPAF) et
23
absent in melanoma 2 (AIM2; un récepteur de la famille hematopoietic interferon-inducible
nuclear protein ou HIN). Les sections suivantes discuteront de façon plus détaillée de ces 4
inflammasomes ainsi que du rôle de la molécule adaptatrice ASC à l’intérieur de ces
complexes.
Figure 1.6: Structure des inflammasomes
1.4.2.1. L’inflammasome NLRP1 Le premier inflammasome identifié fut NLRP1 (NALP1). En plus de contenir les domaines
PYD, NACHT et LRR, NLRP1 contient à son extrémité C-terminale un domaine CARD
supplémentaire. La formation de l’inflammasome NLRP1 recrute la molécule adaptatrice
24
ASC, la caspase-1 ainsi que la caspase-5 (humain) ou caspase-11 (souris) via son domaine
CARD (Martinon et al., 2002). En effet, il a été démontré, par immunoprécipitation dans un
système libre de cellules (cell-free system) que NLRP1 interagit faiblement avec la caspase-
5, entraînant malgré tout le clivage et l’activation de cette caspase. De plus, l’étude à
démontré qu’ASC interagit fortement avec la caspase-1 via son domaine CARD, produisant
ainsi le clivage et l’activation de la caspase-1 et par le fait même, le clivage de l’IL-1ββ .
ASC est indispensable dans ce mécanisme puisque les cellules exprimant seulement le
domaine PYD d’ASC, c.-à-d. un dominant négatif Pycard capable d’interagir seulement
avec NLRP1 et agissant comme un inhibiteur du recrutement de la caspase-1, produisent de
très faibles niveaux d’IL-1β clivée. Dans une étude plus récente, Faustin et al. ont suggéré
qu’ASC n’est pas requise pour le clivage et l’activation de la caspase-1, mais que sa
présence en combinaison avec NLRP1 a pour effet de doubler l’activité catalytique de
caspase-1 (Faustin et al., 2007). Le domaine CARD supplémentaire à l’extrémité C-
terminale de NLRP1 lui confère donc la possibilité de lier et activer la caspase-1 par lui-
même sans l’aide d’ASC. Faustin et al. ont aussi mis de l’avant un mécanisme en 2 étapes
au cours duquel un activateur de NLRP1, tel que le cofacteur bactérien muramyl dipeptide
(MDP), induirait un changement conformationel de NLRP1 qui permettrait la liaison d’un
nucléotide à trois phosphates (NTP), tel que l’ATP, et l’oligomérisation de l’inflammasome
menant à l’activation des caspases 1 et 5.
L’inflammasome NLRP1 semble aussi interagir avec 2 molécules anti-apoptotiques
importantes, Bcl-2 et Bcl-XL (Bruey et al., 2007, Faustin et al., 2009). La 1ière étude a tout
d’abord démontré que NLRP1, mais pas NLRP2, -3 et -4, est capable de lier Bcl-2 et BCL-
XL chez des macrophages in vitro. Lorsque NLRP1 est lié à Bcl-2 et BCL-XL, NLRP1 est
incapable de s’associer à ASC, résultant alors à une diminution de l’activation de la
caspase-1 et de l’IL-1β mature. Bien que ces 2 molécules anti-apoptotiques empêchent
l’assemblage fonctionnel de l’inflammasome, elles ne modifient pas les niveaux
d’expression de ses composantes. La seconde étude a mis en évidence un mécanisme
d’inhibition plus détaillé. Cette équipe a démontré que Bcl-2 et BCL-XL inhibent, via un
court domaine en boucle (loop domain), la liaison de l’ATP à NLRP1 nécessaire à son
oligomérisation et son activation. La délétion de cette région en boucle n’a toutefois pas
25
permis à ces protéines de procéder à l’inhibition de l’inflammasome et, par conséquent,
l’inhibition de caspase-1. Bcl-2 et BCL-XL agissent donc comme inhibiteurs compétitifs
directs de NLRP1 puisque leur action est dépendante de leur concentration, un résultat
observé à l’aide d’une analyse de leur activité enzymatique. Ces résultats suggèrent que les
mécanismes impliqués dans l’inflammation et l’apoptose pourraient être fortement inter-
reliés.
NOD2, un NLR répondant à MDP, tout comme NLRP1, est capable de s’associer à NLRP1
et de former un complexe menant à l’activation de la caspase-1 et au clivage de l’IL-1ββ
(Hsu et al., 2008). Hsu et al. ont démontré que NOD2 est requis pour la sécrétion de l’IL-
1β par les macrophages péritonéaux suite à une induction au MDP. Bien que NLRP1
augmente la capacité de NOD2 à stimuler la sécrétion d’IL-1β et que NOD2 augmente la
liaison de NLRP1 à la caspase-1, NOD2 est aussi capable d’interagir directement avec la
caspase-1 et de procéder à son activation via son domaine N-terminal CARD. Enfin, le rôle
de NOD2 dans la maturation de l’IL-1β fut démontré in vivo chez des souris infectées avec
la toxine de Bacillus anthracis, une bactérie responsable du développement de l’anthrax,
puisque les souris Nod2-/- relâchent des niveaux plus faibles d’IL-1β.
En plus de l’expression de NLRP1 dans les cellules immunitaires, il a été rapporté que
certains types de neurones du SNC expriment NLRP1 et qu’une LME a pour effet de
stimuler la formation de cet inflammasome (de Rivero Vaccari et al., 2008, Abulafia et al.,
2009, de Rivero Vaccari et al., 2009). En effet, il a été démontré que les différentes
composantes de l’inflammasome NLRP1, comprenant la caspase-1, caspase-11, ASC,
NLRP1 et XIAP, sont exprimées dans les neurones moteurs de la moelle épinière de rats
naïfs et lésés (de Rivero Vaccari et al., 2008). Suite à une LME, ces composantes sont
rapidement sur-exprimées sauf pour NLRP1 dont les niveaux d’expression demeurent
inchangés. L’assemblage de l’inflammasome NLRP1 suite à une LME entraîne l’activation
de la caspase-1 et de XIAP ainsi que le clivage de l’IL-1β et l’IL-18. L’injection d’un
anticorps neutralisant spécifique à ASC chez des rats ayant subi une LME provoque une
diminution du clivage de la caspase-1 et de XIAP ainsi qu’une diminution du clivage de
l’IL-1β et de l’IL-18. Fait intéressant, ce traitement causant la réduction de l’activité des
26
inflammasomes ASC-dépendants a permis de réduire le volume des dommages tissulaires
se traduisant par une préservation de la matière blanche et une préservation de la
morphologie des neurones moteurs. L’injection d’anti-ASC a aussi facilité la récupération
des fonctions locomotrices suite à la LME. Ces résultats ont été plus tard confirmés par le
même groupe dans un modèle de lésion traumatique du cerveau (de Rivero Vaccari et al.,
2009) et dans un modèle d’accident vasculaire cérébral (AVC) (Abulafia et al., 2009). Dans
ce dernier article, il fut démontré que les composantes de l’inflammasome NLRP1 sont
aussi présentes dans les macrophages, les microglies, les astrocytes et les neurones suite à
l’AVC. La neutralisation de NLRP1 avec un anti-NLRP1 a permis de réduire l’activation
de la caspase-1, l’assemblage de l’inflammasome et par le fait même de diminuer les
dommages tissulaires causés par ce type de lésion du cerveau. Les altérations des niveaux
intracellulaires d’ATP et de la concentration en potassium et autres composants cellulaires
(ATP, ARN, ROS) pourraient avoir contribué à l’activation de l’inflammasome, tel que
discuté dans d’autres articles (Mariathasan and Monack, 2007, Pétrilli et al., 2007).
Ensemble, ces résultats suggèrent que les inflammasomes ne sont pas seulement impliqués
dans les fonctions pro-inflammatoires des cellules immunitaires mais aussi dans celles des
cellules du SNC. Les inflammasomes semblent également jouer un rôle important dans les
dommages infligés au tissu nerveux suite à une lésion.
1.4.2.2. NLRP3 (NALP3) L’inflammasome NLRP3 est sans contredit celui qui a été le plus étudié. NLRP3 est
fortement exprimé par la plupart des cellules myéloïdes, tandis que les cellules lymphoïdes,
éosinophiles et dendritiques plasmacytoïdes expriment faiblement cet inflammasome
(Guarda et al., 2011). Son expression génique peut être sur-régulée chez les monocytes
humains ou macrophages murins en présence de molécules inductrices qui seront discutées
plus bas (O'Connor et al., 2003, Guarda et al., 2011). Son gène code pour un domaine PYR,
un domaine central nucleotide binding domain (NBD) ainsi qu’un domaine C-terminal
LRR (Hoffman et al., 2001). NLRP3 interagit avec la molécule adaptatrice ASC via une
interaction avec le domaine PYR. Cet oligomère nouvellement formé recrute par la suite la
pro-caspase-1 via les domaines CARD situés sur les molécules ASC et pro-caspase-1,
causant ainsi le clivage et l’activation de la caspase-1 (Gross et al., 2011).
27
Bien qu’on retrouve une expression basale de NLRP3 chez des cellules immunitaires non-
stimulées ou au repos, cela n’est pas suffisant pour la formation du complexe protéique
(Bauernfeind et al., 2009). Deux stimuli semblent nécessaires pour l’activation et la
formation de l’inflammasome NLRP3 (Franchi et al., 2009, Latz, 2010). D’abord, les
récepteurs appartenant à la famille des récepteurs TLR/IL-1R doivent lier leur ligand et
ensuite recruter la molécule adaptatrice MyD88, entraînant du même coup la synthèse de
différents médiateurs pro-inflammatoires dont la pro-forme de l’IL-1β. Le deuxième signal
consiste en l’activation d’un récepteur purinergique tel que P2X7R (Mariathasan et al.,
2006). Mariathasan et al. ont démontré dans un modèle in vitro de macrophages stimulés à
la LPS, un agoniste du TLR4, et à l’ATP, un ligand de P2X7R, que l’absence de NLRP3
entraîne une plus faible activation de la caspase-1 et de la relâche de l’IL-1β. La stimulation
du P2X7R induit aussi un efflux de K+ nécessaire à l’activation de l’inflammasome. Par
contre, cette baisse de potassium intracellulaire occasionnée par la présence d’ATP n’est
pas suffisante en soi pour conduire au clivage et à la relâche de l’IL-1β. La stimulation à
l’ATP sans LPS n’entraîne pas non plus l’activation de la caspase-1, démontrant encore une
fois la nécessité des deux signaux pour l’obtention d’une réponse IL-1β adéquate. De plus,
la présence de fortes concentrations extracellulaires en potassium (130 mM) a pour effet
d’abolir la relâche d’IL-1β chez des macrophages humains et murins (Pétrilli et al., 2007).
L’inflammasome NLRP3 peut être activé par une panoplie de molécules différentes comme
les PAMPs, DAMPs, l’acide urique, la silice, l’ATP, l’alun et les radiations UV (Lamkanfi
and Dixit, 2012). Par conséquence, cet inflammasome a été décrit comme étant impliqué
dans le développement de diverses maladies telles que l’arthrite, la goutte, le syndrome
Muckle-Wells, l’amiantose et la SP (Agostini et al., 2004, Martinon et al., 2006, Dostert et
al., 2008, Gris et al., 2010). Dans le cas de la goutte, ce serait les dépôts de cristaux d’acide
urique que nous retrouvons dans certaines articulations qui stimuleraient l’inflammasome
NLRP3, l’activation de la caspase-1 et la production d’IL-1β et d’IL-18 (Martinon et al.,
2006). Ce mécanisme entraînerait un influx de cellules immunitaires innées telles que les
neutrophiles et macrophages au site inflammatoire, causant ainsi des dommages tissulaires
aux articulations. Ceci fut d’ailleurs démontré chez des souris Asc-/- où l’absence de la
28
molécule adaptatrice ASC cause une diminution du recrutement en neutrophiles en réponse
à la présence de cristaux d’acide urique. Les niveaux d’expression de l’ARNm codant pour
NLRP3 sont également fortement induits dans le modèle murin de la SP, l’EAE (Gris et al.,
2010). Les souris Nlrp3-/- présentent une réduction de l’infiltration de cellules immunitaires
telles que les macrophages, cellules dendritiques et cellules T CD4+ et CD8+ dans leur
moelle épinière. Les coupes histologiques de moelles épinières provenant de ces animaux
montrent d’ailleurs une plus faible démyélinisation et une plus forte astrogliose. Les souris
Nlrp3-/- exhibent aussi un délai dans l’apparition de la maladie et une réduction dans la
sévérité des symptômes. Ce mécanisme semble être dépendant de la production d’IL-18
puisque l’absence de NLRP3 entraîne une plus faible synthèse de cette cytokine et que les
souris Il-18-/- développent l’EAE de façon identique aux souris Nlrp3-/-.
1.4.2.3. L’inflammasome AIM2 L’inflammasome AIM2 est un membre de la famille hematopoietic interferon-inducible
nuclear protein with a 200-amino acid repeat (HIN-200). Il est le seul inflammasome à ne
pas faire partie de la famille des NRLs. Bien que les membres de la famille HIN-200 soient
principalement considérés comme étant des régulateurs de la transcription lors de la
proliferation et de la différenciation cellulaire, AIM2 est localisé dans le cytoplasme de la
cellule et reconnaît l’ADN cytosolique double brin via son domaine HIN-200.
L’inflammasome AIM2 est composé des protéines AIM2, ASC et caspase-1 et est capable
d’induire la maturation de l’IL-β via un mécanisme dépendant de caspase-1. AIM2 est
d’ailleurs le seul membre de la famille HIN-200 à se lier à ASC (Hornung and Latz, 2010).
La structure de AIM2 possède un domaine PYD qui se lie à ASC via une interaction PYD-
PYD, ce qui permet à ASC de recruter la pro-caspase-1 via le domaine de liaison CARD.
Le rôle de AIM2 dans la reconnaissance de l’ADN double brin a été démontré grâce aux
souris Aim2-/-. Il a été démontré que les macrophages de souris Aim2-/- présentent des
déficits dans l’activation de la caspase-1 et la sécrétion d’IL-1β en réponse à une infection à
la bactérie Francisella tularensis ou en présence d’ADN cytoplasmique d’origine virale
(Rathinam et al., 2010) (Fernandes-Alnemri et al., 2010). L’inflammasome AIM2 a aussi
29
été impliqué dans les mécanismes de mort cellulaire comme l’apoptose et la pyroptose
(Sagulenko et al., 2013, Adamczak et al., 2014). Dans ce cas, AIM2 est capable d’activer la
caspase-8 via le recrutement de la molécule adaptatrice ASC. Des analyses par
immunofluorescence et co-immunoprécipitation ont démontré qu’ASC se lie à la caspase-8
grâce à son domaine PYD suite à une stimulation à la nigéricine.
1.4.3. Les récepteurs purinergiques Les nucléotides jouent un rôle très important dans plusieurs fonctions physiologiques de
l’organisme, comme par exemple lors de la régulation de l’inflammation (Ferrari et al.,
2006), des fonctions musculosquelettiques (Burnstock et al., 2013), des fonctions
neuronales et gliales (Fields and Burnstock, 2006, Del Puerto et al., 2013) et des fonctions
rénales (Craigie et al., 2013). Le nucléotide le plus important dans la régulation des
fonctions du système nerveux est l’ATP. Dans des conditions physiologiques, la
concentration extracellulaire d’ATP est de l’ordre du micromolaire (Köles et al., 2011). Par
contre, dans des conditions pathologiques telles que l’ischémie cérébrale ou les LME, sa
concentration peut atteindre l’ordre du millimolaire. Suite à une lésion, la principale source
d’ATP provient des cellules endommagées ou nécrotiques, exposant ainsi les cellules
environnantes à des concentrations élevées de ce nucléotide. L’ATP et les autres
nucléotides extracellulaires (ex. : ADP, adénosine, UDP, UTP) exercent leurs fonctions
biologiques via 2 types de récepteurs membranaires purinergiques (P2R). Ces récepteurs
sont divisés en 2 grandes classes : les récepteurs purinergiques couplés à une protéine G
(P2YRs) et les récepteurs ionotropes (P2XRs). Il existe 8 différentes sous-classes de P2YRs
(P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y6, P2Y11-14; (Abbracchio et al., 2006) et 7 sous-classes de P2XRs
(P2X1-7; (North, 2002). Les P2YRs et les P2XRs sont connus pour exister sous forme
d’oligomères (homomères ou hétéromères) (Burnstock, 2007).
Les P2XRs présentent une homologie de séquence protéique de 30% à 50% et possèdent 2
régions transmembranaires (TM1 et TM2) impliquées dans l’ouverture du pore ionique et
le passage des ions à travers la membrane cellulaire, 2 régions C- et N-terminales, une
boucle de 10 résidus de cystéines formant une série de ponts disulfures ainsi qu’un site de
liaison à l’ATP (Burnstock, 2007). Toutes les sous-classes de P2XRs possèdent une
30
séquence pour la glycosylation qui semble être essentielle à leur trafic vers la membrane
cellulaire (North, 2002).
Les 2 prochaines sections de cet ouvrage discuteront des 2 principaux récepteurs
purinergiques, P2X4R et P2X7R, puisque ceux-ci semblent jouer un rôle prédominant dans
les pathologies du SNC.
1.4.3.1. Les récepteurs P2X4 Le récepteur P2X4 est connu pour être un important modulateur de la douleur
neuropathique (Tsuda et al., 2003, Ulmann et al., 2008, Beggs et al., 2012). Tsuda et al.
furent les premiers à démontrer que bloquer P2X4R avec un inhibiteur (TNP-ATP) a pour
effet de diminuer l’allodynie causée par une lésion du nerf périphérique (LNP) (Tsuda et
al., 2003). Des études effectuées par la même équipe ont aussi révélé que l’expression de
P2X4R est augmentée suite à une LNP et que les microglies OX42+ sont exclusivement
responsables de son expression (Tsuda et al., 2003). Un mécanisme possible voudrait que le
développement de la douleur soit médié par la relâche du facteur neurotrophique brain-
derived neurotrophic factor (BDNF) par les microglies suite à leur stimulation par l’ATP,
entraînant ainsi une dépolarisation dans le potentiel d’inversion (Eanion) des neurones
spinaux et une désinhibition des récepteurs GABA (Coull et al., 2005). De plus récentes
études ont démontré une implication de P2X4R dans la relâche du BDNF suite à une LNP
(Ulmann et al., 2008), un effet qui dépendrait semble-t-il de l’activation de la p38-MAPK
(Trang et al., 2009). En effet, la délétion du gène P2X4R chez les souris P2x4r-/- a pour
conséquence d’augmenter les niveaux intracellulaires en BDNF chez les microglies et
d’inhiber la relâche de la neurotrophine. Malgré l’absence de P2X4R, le seuil d’activation
des microglies semble inchangé chez les souris P2x4r-/- suite à une LNP, tel que suggéré
par la détection de forts niveaux d’expression du marqueur microglial Iba-1, possiblement
en raison de mécanismes compensatoires résultant en l’augmentation de l’expression de
P2X7R (Ulmann et al., 2008). P2X4R est également sur-exprimé à la suite d’une LME chez
le rat (Schwab et al., 2005). Dans ce modèle expérimental, les cellules P2X4R+
s’accumulent dès les premières 24 heures pour atteindre un maximum à 7 jours post-lésion.
31
Celles-ci sont principalement localisées au site lésionnel et dans les régions adjacentes où la
mort neuronale est à son maximum. Les analyses en immunofluorescence ont révélé que les
macrophages et les microglies de même que les neurones sont les cellules qui expriment
P2X4R. Dans de rares occasions, ce récepteur fut aussi détecté dans les vaisseaux sanguins.
Ces résultats démontrent que P2X4R est induit et sur-exprimé suite à un dommage tissulaire
infligé au SNC ou au SNP et qu’il est capable de réguler l’inflammation de par ses effets
directs sur les cellules microgliales et les neurones.
Il est connu que les récepteurs purinergiques sont capables de s’assembler pour former des
homo- ou hétérodimères (North, 2002). Cette hétérodimérisation peut changer les
propriétés fonctionnelles et pharmacologiques des P2XRs.
1.4.3.2. Les récepteurs P2X7 Le gène de P2X7R code pour un polypeptide contenant 2 domaines transmembranaires
situés aux extrémités N- et C- terminales dans la portion cytoplasmique de la protéine
(Ferrari et al., 2006). La boucle extracellulaire du récepteur possède un site de liaison à
l’ATP (Gu et al., 2004). Le récepteur P2X7 est principalement exprimé chez les cellules
immunitaires du sang, principalement les monocytes, les macrophages tissulaires et la
microglie (Bianco et al., 2006). D’autres études récentes ont rapporté son expression chez
les astrocytes (Narcisse et al., 2005), les oligodendrocytes (Matute et al., 2007) et les
neurones (Anderson and Nedergaard, 2006). Tout comme P2X4R, P2X7R est activé par
l’ATP extracellulaire ce qui entraîne le clivage et la relâche de la forme mature de l’IL-1β
(Ferrari et al., 1997, Di Virgilio et al., 2009). Par contre, son effet s’avère aussi être
dépendant de la sortie d’ions posstassium à l’extérieur de la cellule étant donné que le
clivage et la relâche de l’IL-β sont inhibés par l’inhibition de la sortie d’ion K+ (Sanz and
Di Virgilio, 2000, Kahlenberg and Dubyak, 2004). De plus, la voie de signalisation de ce
récepteur semble être plus complexe puisque des études ont reporté que P2X7R peut former
un complexe avec la Pannexin-1 (Panx1), un canal membranaire perméable à des ions
comme le potassium et le calcium (Pelegrin and Surprenant, 2006, Silverman et al., 2009).
En effet, la présence d’un siRNA ciblant Panx1 a inhibé l’entrée dépendante de P2X7R
32
d’un dérivé de l’uridine, le BrdU, à l’intérieur de macrophages stimulés à l’ATP (Pelegrin
et al., 2006) . Il a aussi été démontré dans cette étude que le clivage de la caspase-1 et la
relâche de la forme mature de l’IL-1β en réponse à l’activation de P2X7R requièrent la
présence de Panx1.
P2X7R est impliqué dans plusieurs pathologies affectant le SNC telles que la sclérose en
plaques (Chen et Brosnan, 2006, Sharp et al., 2008), (Kim et al., 2013), la maladie
d’Alzheimer (Diaz-Hernandez et al., 2012) et les LME (Wang et al., 2004, Peng et al.,
2009). En effet, Chen et al. ont démontré que les souris P2x7r-/- développent des
symptômes d’EAE plus sévères que les souris sauvages (Chen et Brosnan, 2006). De plus,
les souris chimériques générées avec un animal hôte sauvage irradié et dont leur moelle
osseusse a été reconstituée avec des cellules provenant de souris P2x7r-/- ont présenté une
plus grande susceptibilité à developper la maladie, indiquant que les cellules sanguines
jouent un rôle important la régulation des mécanismes développant la maladie. Cette étude
suggère donc que ces effets sont causés par une perte de l’activité apoptotique chez les
lymphocytes corrélant avec une diminution des niveaux d’IFN-γ et de NO chez ces cellules.
NF-κB a été reconnu comme étant un facteur de transcription important pour la
transcription de gènes induits par l’IL-1β. P2X7R est capable d’activer la phosphorylation
de NF-κB dans les neurones et astrocytes et ainsi de contribuer aux dommages neuronaux
(Kim et al., 2013).
L’expression de P2X7R est également observée dans les neurones de la moelle épinière. Par
conséquent, ce récepteur pourrait induire la mort neuronale suite à une LME. L’inactivation
de ce récepteur pourrait donc être un moyen efficace afin de réduire les déficits survenant
suite à la lésion. Supportant cette possibilité sont des études démontrant que l’injection
d’antagonistes de P2X7R a pour effet d’augmenter la récupération locomotrice chez la
souris et le rat (Wang et al., 2004, Peng et al., 2009). Wang et al. ont de plus démontré que
l’injection d’OxATP protège la souris contre les dommages secondaires et la perte
neuronale qui surviennent suite à une LME, comme le démontre une réduction du nombre
de cellules TUNEL+ et une réduction de la sévérité des déficits locomoteurs (Wang et al.,
2004). Plus récemment, l’administration intravaineuse de BBG (Brillant Blue G), un autre
33
antagoniste de P2X7R, a pareillement diminué le volume de lésion du tissu nerveux et la
perte des fonctions motrices en réduisant le nombre de cellules microgliales activées
(CD68+), l’intensité de l’astrogliose et le recrutement de neutrophiles suite à la LME (Peng
et al., 2009). La régulation de l’activation de ce récepteur pourrait donc être un moyen très
efficace pour traiter les patients humains affligés par ce genre de lésion.
1.5. Rôles des cytokines et chimiokines suite à un trauma du SNC
Les cytokines et chimiokines sont un groupe de protéines principalement connues pour leur
rôle dans la régulation de l’inflammation suite à une infection à des microorganismes tels
que les bactéries et les virus. Cependant, les cytokines jouent aussi un rôle très important
dans le contrôle du métabolisme, de la différenciation et de la mort cellulaire ainsi que dans
plusieurs fonctions des organes internes. Ces molécules sont donc impliquées dans une
panoplie de maladies telles que le cancer, le diabète, l’obésité, l’arthrite et les maladies
neurodégénératives. Une cytokine se lie à son récepteur spécifique et déclenche une voie de
signalisation intracellulaire. Elle peut se lier aux récepteurs de la membrane de la cellule
qui l’a sécrétée, elle exerce alors une action autocrine. Elle peut aussi exercer une action
paracrine si elle se lie aux récepteurs d’une cellule située près de la cellule productrice. Si
elle se fixe aux récepteurs d’une cellule éloignée et voyage par le sang, elle exercera alors
une action endocrine. Les prochaines sections discuteront des principales cytokines ayant
des effets pro-inflammatoires ou anti-inflammatoires suite à une LME.
1.5.1. La famille de l’interleukine-1 (IL-1)
Il y a un peu plus de 50 ans, l’interleukine-1 (IL-1) fut la première cytokine décrite comme
étant une substance pyrogène relâchée par les leucocytes et capable d’induire la fièvre. En
1984, deux ADNc furent clonés puis séquencés. Les noms d’IL-1α et d’IL-1β furent
donnés aux 2 clones. Les gènes codant pour ces cytokines sont localisés sur le chromosome
2 (Dinarello, 1994). Aujourd’hui, la famille de l’IL-1 comprend 11 membres dont l’IL-1α,
34
IL-1β, IL-1Ra, IL-18 et IL-33. Étant moins bien connues, les autres cytokines de cette
famille (IL-36, IL-37 et IL-38) ne seront pas discutées dans cet ouvrage.
1.5.1.1. L’IL-1-αα
Bien que les séquences d’acides aminés de l’IL-1α et l’IL-1β possèdent une homologie de
25 à 30%, ces 2 cytokines présentent une structure tridimensionnelle et des propriétés
biologiques semblables (Graves et al., 1990, Dinarello, 1991). En effet, l’IL-1 entraine la
surexpression des molécules d’adhésion sur les cellules endothéliales, l’extravasation des
leucocytes provenant du sang et induit la production des métabolites de l’acide
arachidonique. Ces ligands sont aussi capables d’induire la production de chimiokine,
entrainant ainsi le recrutement et l’activation des différentes cellules immunitaires dans le
but de combattre une infection ou de stimuler la réparation tissulaire suite à une lésion.
L’IL-1α est synthétisée sous une forme précurseure de 31 kDa. Cette pro-forme (pro-IL-
1α) est capable de se lier à son récepteur, l’IL-1R1, et est, par conséquent, biologiquement
active (March et al., 1985, Mosley et al., 1987). Il fut toutefois démontré que la calpaïne,
une protéase dépendante du calcium, est capable de procéder à la protéolyse de la pro-IL-
1α dans le but de produire une forme clivée mature de 17 kDa (mIL-1α) (Kobayashi et al.,
1990, Carruth et al., 1991). Bien qu’il fut initialement avancé que ce clivage n’a que très
peu d’effets sur l’activité biologique de l’IL-1α, des études récentes ont démontré que son
clivage entraînerait une augmentation de son activité pro-inflammatoire (Afonina et al.,
2011, Zheng et al., 2013). Afonina et al. ont confirmé que l’IL-1α est un susbtrat pour une
protéase retrouvée dans les granules des cellules NK et les cellules T cytotoxiques, la
granzyme B. Leurs résultats ont aussi suggéré que cette protéase clive l’IL-1α à la position
Asp 103, libérant ainsi la partie N-terminale de la protéine. De plus, cette équipe a mesuré
la capacité de mIL-1α à induire la production d’IL-6 et IL-8 chez les cellules Hela et
HUVECs, démontrant que la forme clivée présente une activité pro-inflammatoire jusqu’à
10 fois plus importante que sa pro-forme. Zheng et al. ont aussi démontré que la forme p17
présente une plus grande activité pro-inflammatoire. En outre, ils ont reporté que le clivage
de l’IL-1α est régulé par sa liaison avec une forme intracellulaire de l’IL-1R de type II (IL-
1R2). En effet, l’IL-1R2 serait capable de lier l’IL-1α et de prévenir son clivage par la
35
calpaïne. Par contre, une fois l’IL-1R2 clivé par la caspase-1, l’IL-1α serait relâchée,
permettant ainsi son clivage. Contrairement à ces résultats, il fut démontré que la forme
précurseure p33 de l’IL-1α est capable d’induire le recrutement de leucocytes in vitro suite
à sa relâche par des cellules hypoxiques [Rider, 2011]. Cependant, il n’est pas connu si la
forme précurseure de l’IL-1α possède les mêmes fonctions biologiques que la forme
mature de 17 kDa.
L’IL-1α fait partie d’une classe de cytokines capables d’exercer leurs fonctions dans le
noyau mais aussi dans l’environnement extracellulaire. Cette molécule possède une
séquence de localisation nucléaire (SLN) dans sa région N-terminale qui lui permet de
transloquer vers le noyau, l’endroit où elle agirait comme facteur de transcription
(Buryskova et al., 2004, Werman et al., 2004). Dans le noyau, l’IL-1α peut être associée à
la chromatine où elle serait retenue dans les corps apoptotiques lors de la mort cellulaire par
apoptose. Lors d’une toute autre situation où les cellules meurent par nécrose, l’IL-1α se
détacherait de la chromatine et serait relâchée avec les composantes cellulaires, stimulant
ainsi l’inflammation (Luheshi et al., 2009, Cohen et al., 2010). Ce type de molécules
intracellulaires est appelé alarmines ou danger-associated molecular patterns (DAMPS).
Plusieurs alarmines ont été décrites, parmi lesquelles nous retrouvons aussi HMGB1, S100,
les protéines de choc thermique (HSP) et l’IL-33 (Hirsiger et al., 2012, Pittman et Kubes,
2013). La sécrétion de l’IL-1α ou d’une alarmine par les cellules nécrotiques se produit
suite à un traumatisme cellulaire, un phénomène appelé inflammation stérile. L’IL-1α
possède de fortes propriétés pro-inflammatoires lorsque relâchée lors de la nécrose. En
effet, les souris ayant reçu une injection de cellules nécrotiques présentent une forte
diminution du recrutement en neutrophiles lorsque traitées avec un anticorps anti-IL-1α
comparativement à des souris traitées avec l’anti-IL-1β ou un anticorps contrôle (Chen et
al., 2007). Une seconde étude a démontré l’importance de la relâche de l’IL-1α par des
cellules nécrotiques pour la sécrétion de la chimiokine CXCL1, une chimiokine clé pour le
recrutement des neutrophiles (Eigenbrod et al., 2008).
36
Comme bien des cytokines, l’IL-1α est exprimée en culture par plusieurs types cellulaires
tels que les lymphocytes B et T, monocytes, macrophages, cellules endothéliales et
fibroblastes (Dinarello, 2009). In vivo dans le SNC, les plaquettes et la microglie furent
identifiées comme étant une source importante d’IL-1α (Thornton et al., 2010, Luheshi et
al., 2011). Ces études ont aussi démontré que l’IL-1α provoque l’induction des molécules
d’adhésion ICAM-1 et VCAM-1 ainsi que le relâche de CXCL1 et la migration des
neutrophiles. Ce mécanisme serait important pour médier l’inflammation dans le cerveau
suite à un accident cérébrovasculaire. L’IL-1α est aussi exprimée dans les microglies près
de la lésion très tôt (4 h post-lésion) suite à une ischémie cérébrale (Luheshi et al., 2011).
Par contre, son absence chez la souris IL-1α-KO n’est pas suffisante pour réduire le volume
de la lésion suite à une ischémie. Au contraire, les deux formes d’IL-1, l’IL-1α et l’IL-1β,
doivent être absentes in vivo pour entraîner une neuroprotection significative (Boutin et al.,
2001). Ces résultats suggèrent la possibilité qu’il existe des mécanismes de compensation
au niveau de ces deux cytokines. L’IL-1α fut aussi identifiée comme étant un joueur clé
dans le recrutement des neutrophiles dans un modèle in vitro d’injection de cellules
nécrotiques chez la souris (Rider et al., 2011). Au contraire, l’IL-1β serait plutôt
responsable du recrutement des macrophages. Cette étude suggère également que l’IL-1α
serait impliquée beaucoup plus tôt dans le recrutement des leucocytes comparativement à
l’IL-1β (24 h vs. 5 jours). Ces données indiquent que cette cytokine aurait comme principal
rôle d’initier l’inflammation. Une investigation plus approfondie sera toutefois nécessaire
pour mieux comprendre les mécanismes distinguant les fonctions immunitaires et
neurologiques de l’IL-1α et de l’IL-1β.
1.5.1.2. L’IL-1ββ Comme l’IL-1α, l’IL-1β est une protéine synthétisée sous une pro-forme de 31 kDa. Par
contre, contrairement à la pro-IL-1α, la pro-IL-1β est incapable de se lier à son récepteur,
l’IL-1R1, et est par conséquent biologiquement inactive. Son clivage par la caspase-1, selon
les mécanismes discutés dans les sections précédentes (sections 1.4.2 et 1.4.3), et la
production d’une forme bioactive de 17 kDa sont nécessaires pour la liaison à son
37
récepteur. Comme bien des cytokines, l’expression de l’IL-1β est induite par une variété de
stimuli comme la présence d’une infection (bactérienne, fongique ou virale), d’une lésion
tissulaire, d’une condition d’hypoxie ou de produits biologiques (ex. : acide urique, LPS,
ATP, β-amyloïde, alun, silice). Par conséquent, l’IL-1β est impliquée dans une panoplie de
pathologies ou de conditions médicales telles que l’Alzheimer, le Parkinson, l’épilepsie,
l’ischémie cérébrale, les lésions du cerveau et de la moelle épinière, la SP, la goute,
l’arthrite, le psoriasis, l’asthme, etc.
Plus précisément, dans le SNC, cette cytokine affecte les leucocytes, les cellules gliales (c.-
à-d. les astrocytes, microglies, OLs), les neurones et les cellules endothéliales. L’IL-1β
favorise la prolifération des astrocytes, un phénomène appelé astrogliose, ainsi que la
relâche de glutamate, de radicaux libres, d’ions potassium (K+) et de cytokines et
chimiokines qui pourraient être potentiellement néfastes pour la survie neuronale (Basu et
al., 2004). Par contre, l’activation des astrocytes par l’IL-1β peut conférer des changements
neuroprotecteurs puisque ces cellules régulent la restauration de la barrière hémato-
encéphalique (BHE) en augmentant son étanchéité (Norenberg, 1994, Bush et al., 1999,
Sofroniew, 2005). Ces effets sont contradictoires avec d’autres études démontrant l’effet
néfaste de l’IL-1β sur la BHE. Zhu et al. ont démontré que l’IL-1β perturbe la stabilité de
l’endothélium dans un modèle de culture in vitro de cellules humaines via un mécanisme
impliquant la GTPase, ARF6, son activateur ARNO et la molécule adaptatrice MyD88
(Zhu et al., 2012). De plus, une analyse par micropuce à ADN d’astrocytes en culture
stimulés par l’IL-1β pendant 24 h a permis d’identifier près de 1500 gènes comme étant
régulés de façon positive ou négative par la dite cytokine (John et al., 2005). Ces gènes
comprennent des cytokines, chimiokines, métalloprotéinases (MMPs), molécules
d’adhésion (CAMs), protéines du cytosquelette et des facteurs de croissance cellulaire.
Certaines de ces molécules ont déjà été soupçonnées d’avoir des effets bénéfiques sur la
survie neuronale et la réparation tissulaire mais aussi des effets neurotoxiques.
L’IL-1β peut aussi lier l’IL-1R1 exprimé à la surface des microglies, ce qui résulte en
l’expression et la relâche de plusieurs molécules comme les prostanglandines E2 (PGE2) et
des cytokines et chimiokines proinflammatoires. La microglie peut aussi exprimer l’IL-1β
38
permettant par le fait même la relâche de CNTF par les astrocytes suite à une lésion du
cerveau chez la souris (Herx et al., 2000). De plus, il fut démontré que l’IL-1β permet
l’activation de la microglie suite à une lésion de la moelle épinière ou lors du processus de
DW chez la souris (Perrin et al., 2005, Sato et al., 2012). En effet, l’absence d’IL-1β a pour
effet de diminuer les niveaux d’expression de la protéine Ym1, un marqueur d’activation
des macrophages et microglies, aux temps 7 et 14 jours post-LME (Sato et al., 2012).
Mason et al. ont suggéré que l’IL-1β pourrait aussi exercer des effets sur les OLs en
favorisant notamment la remyélinisation (Mason et al., 2001). En utilisant le modèle de
démyélinisation à la cuprizone, ce groupe a démontré que l’absence d’IL-1β chez la souris
entraîne une réduction de la remyélinisation suite à une démyélinisation aigüe. Ce
phénomène fut corrélé avec une diminution de la présence d’OLs matures chez les souris Il-
1β-/- comparativement aux souris sauvages et ce bien que la présence de progéniteurs était
semblable chez les 2 groupes. Cette étude a aussi démontré que l’absence d’IL-1β suite au
traitement à la cuprizone a pour effet de diminuer le nombre de microglies et d’astrocytes
produisant le IGF-1 (facteur de croissance ressemblant à l’insuline 1), un facteur de
croissance important pour la différenciation et la survie des OLs.
Un autre rôle de l’IL-1β consiste à promouvoir l’activation et le recrutement des cellules
immunitaires dans le parenchyme du SNC en stimulant la production de cytokines,
chimiokines, CAMs, prostaglandines et MMPs (Allan et al., 2005). Ensemble, ces études
démontrent que l’IL-1β affecte une vaste gamme de cellules dans le SNC et stimule
l’expression de plusieurs molécules différentes impliquées autant dans les mécanismes de
neurodégénération que de réparation tissulaire.
1.5.1.3. Les récepteurs de l’IL-1 (IL-1Rs), leurs protéines accessoires et l’antagoniste, l’IL-1Ra
Comme mentionné précédemment, le récepteur capable de lier à la fois l’IL-1α et l’IL-1β
et de conférer une activité biologique pro-inflammatoire est l’IL-1R1. Ce récepteur contient
un domaine extracellulaire d’immunoglobuline ainsi qu’un domaine TIR dans sa portion
39
cytosolique. Ce récepteur fait donc partie de la superfamille de l’IL-1R/TLR (O'Neill et
Dinarello, 2000). L’IL-1R2, la seconde forme de l’IL-1R, possède seulement un court
domaine intracellulaire et est reconnu pour être biologiquement inerte. Bien que l’IL-1R2
puisse être rapidement relâché dans le milieu extracellulaire, il conserve néanmoins sa
capacité à lier l’IL-1 et peut l’empêcher d’interagir avec l’IL-1R1 situé à la surface d’une
cellule avoisinante (Arend et al., 2008). Dans une étude récente, il fut démontré que l’IL-
1R2 est capable de lier l’IL-1α dans le but de prévenir son clivage par la calpaïne (Zheng et
al., 2013).
La liaison de l’IL-1 à l’IL-1R1 exprimé à la surface externe de la membrane cellulaire
permet le recrutement d’une sous-unité, la protéine accessoire de l’IL-1R1, appelée IL-
1RAcP. Ce complexe hétérodimaire induit, via le domaine intracellulaire TIR, le
recrutement de la molécule adaptatrice MyD88. MyD88 recrute à son tour la kinase
associée à IL-1R (IRAK) et le récepteur du facteur tumoral nécrosant (TNF) associé au
facteur 6 (TRAF-6). Cette cascade permet l’activation de voies de signalisation telles que
NF-κB, protéine activatrice-1 (AP-1), kinase c-jun N-terminale (JNK) et protéine kinase
associée à la mitogène p38 (p38 MAPK) (O'Neill et Dinarello, 2000, Sims et Smith, 2010).
L’importance de la protéine adaptatrice MyD88 dans la signalisation et la fonction de l’IL-
1R1 a bien été étudiée dans différents modèles. En effet, l’absence de MyD88 entraine une
perte de fonction du récepteur (Adachi et al., 1998, Chen, 2006, Pineau et al., 2010). Plus
spécifiquement, la voie de signalisation MyD88/IL-1R1 joue un rôle majeur dans le
recrutement de cellules immunitaires comme les neutrophiles et monocytes pro-
inflammatoires de type 1 (M1) suite à une LME en favorisant entre autre l’expression des
chimiokines CXCL1 et CXCL2 par les astrocytes (Pineau et al., 2010). De plus, un variant
d’épissage de la protéine accessoire IL-1AcP, IL-1RAcPb, fut identifié dans le SNC,
principalement dans les neurones (Smith et al., 2009, Nguyen et al., 2011). Bien que l’IL-
1RAcPb soit capable de lier l’IL-1R1 par un mécanisme IL-1-dépendant, il est important de
savoir que cette liaison ne permet pas de recruter les protéines adaptatrices MyD88 et
IRAK4, suggérant par le fait même qu’il est incapable de stimuler la voie habituelle de
signalisation de l’IL-1 (Smith et al., 2009). Bien qu’une forte expression de l’ARNm de
l’IL-1RAcPb fut détectée dans les neurones, l’absence de cette protéine dans des cellules
40
neuronales en culture n’a pas eu d’effet sur la relâche de l’IL-6 en réponse à l’IL-1α et l’IL-
1β. Par contre, la phosphorylation de p38 induite par l’IL-1α fut significativement
diminuée par la délétion du gène codant pour l’IL-1RAcPb comparativement aux cellules
contrôles et celles traitées à l’IL-1β (Nguyen et al., 2011). Ces résultats indiquent que l’IL-
1RAcPb régule, du moins en partie, l’activité neuronale en réponse à l’IL-1α. Cette réponse
pourrait jouer un rôle important dans les fonctions inflammatoires de l’IL-1 dans le SNC.
D’autres études ont aussi rapporté l’implication de l’IL-1R1 dans les lésions du cerveau et
de la moelle épinière. Suite à une lésion du cerveau, les souris Il-1r1-/- présentent une
diminution du nombre de macrophages/microglies activés et d’astrocytes réactifs autour du
site de lésion (Basu et al., 2002). De plus, au niveau moléculaire, Basu et al. ont rapporté
une diminution de l’expression de l’IL-6 et de la cyclooxygénase-2 (COX-2) ainsi que de
l’ARNm de VCAM-1, une molécule d’adhésion. Bien que la déficience en IL-1R1 suite à
une lésion du cerveau semble affecter l’activation des astrocytes, causant une diminution de
l’expression de GFAP, d’autres réponses semblent être indépendantes de la voie de
signalisation de l’IL-1R1 comme par exemple l’expression des CSPGs, de la tenascine, de
S100β et du transporteur du glutamate. Ceci suggère que plusieurs fonctions des astrocytes,
comme leur capacité à éliminer le glutamate et réguler le niveau de calcium, ne dépendent
pas de ce récepteur (Lin et al., 2006).
Le traitement de plusieurs maladies se fait par le blocage de l’activité de l’IL-1R1 par son
antagoniste, IL-1Ra (Dinarello et al., 2012). L’anakinra est la forme recombinante de l’IL-
1Ra naturel, un inhibiteur compétitif de l’IL-1R1 largement utilisé en clinique. De part ses
effets secondaires minimes, sa courte demi-vie ainsi que les nombreuses voies
d’administration possibles, ce médicament permet de traiter une grande variété de maladies
telles que l’arthrite rhumatoïde, la goutte, certaines maladies auto-immunes, le diabète de
type 2 et même l’insuffisance cardiaque (Larsen et al., 2007, Abbate et al., 2008) (Van
Tassel et al., 2012). L’injection sous-cutanée de l’IL-1Ra aurait des effets neuroprotecteurs
suite à une ischémie cérébrale chez le rat en diminuant de 33% les dommages tissulaires
causés par l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (MCAO) (Greenhalgh et al., 2010). Le
traitement avec l’antagoniste a aussi permis de réduire l’étendue des dommages et de
41
diminuer la rupture de la BHE chez des rats ischémiques (Pradillo et al., 2012). De plus,
l’administration d’IL-1Ra au cours de la reperfusion suite à une MCAO a pour effet de
réduire la perméabilité de la BHE, le nombre de neutrophiles MMP-9+ recrutés, le nombre
de microglies Iba-1+ activées de même que la relâche d’IL-6 dans le cerveau. Un traitement
à l’IL-1Ra absorbé dans une éponge de gélatine déposée sur la moelle épinière lésée du rat
a pour effet d’améliorer la récupération des fonctions locomotrices sur une période d’au
moins 4 semaines post-LME (Zong et al., 2012). Il fut aussi démontré que l’injection
intrathécale d’IL-1Ra chez le rat ayant subi une LME réduit l’expression de l’IL-1β ainsi
que l’activation de la caspase-3 et l’apoptose, augmentant du même coup la récupération
locomotrice au temps 30 jours post-lésion (Nesic et al., 2001). Ces résultats suggèrent que
l’IL-1Ra pourrait être un traitement potentiel efficace pour le traitement de maladies
neurologiques initiées par l’inflammation.
1.5.1.4. L’interleukine-18 (IL-18) et son récepteur IL-18R
L’IL-18 possède une structure similaire à celle des autres cytokines de la famille de l’IL-1.
Elle fut longtemps connue sous le nom d’interferon-γ-inducing factor. Comme ce nom
l’indique, l’IL-18 est requise pour la production d’IFN-γ, contrairement à l’IL-1β. Par
contre, de façon semblable à l’IL-1β, l’IL-18 est synthétisée sous une forme biologique
inactive de 23 kDa qui peut être clivée entre les acides aminés Asp35 et Asn36 par la
caspase-1, générant ainsi une forme de 18 kDa (Ghayur et al., 1997, Gu et al., 1997). La
forme active de l’IL-18 est exprimée chez différents types cellulaires dont notamment chez
les macrophages (Tsutsui et al., 1999), les cellules dendritiques (Sakaki et al., 2013) et les
kératinocytes (Roth et al., 2012), tandis que la pro-forme ou son ARNm sont exprimés de
façon constitutive (Nakanishi et al., 2001). Chez les macrophages, cette cytokine est aussi
induite par l’endotoxine LPS ou le ligand de Fas (Fas-L), appartenant à la famille du TNF,
via un mécanisme caspase-1 indépendant (Tsutsui et al., 1999).
La polarisation de cellules T activées en Th1 est une caractéristique importante de l’IL-18
grâce à l’IFN-γ qu’elle induit. Cette polarisation est permise grâce à une sur-expression du
récepteur de l’IL-18, l’IL-18R, à la surface des cellules T naïves occasionnée par l’IL-18.
42
La sur-expression de l’IL-18R peut aussi être causée par une autre cytokine majeure dans le
processus de polarisation des cellules Th1, l’IL-12, qui agit en synergie avec l’IL-18
(Nakanishi et al., 2001, Dostert et al., 2013). Au contraire, en absence d’IL-12 et en
présence d’IL-2, l’IL-18 est capable d’induire la polarisation des cellules T naïves en Th2.
Ceci a été démontré en stimulant des cellules T naïves CD4+ avec de l’IL-2 et de l’IL-18
pendant 4 jours, entraînant ainsi la production d’IL-4 nécessaire à la formation des cellules
Th2 (Yoshimoto et al., 2000). D’autres exemples d’effets de l’IL-18 similaires à ceux de
l’IL-1 consistent en l’augmentation de l’expression de CAMs, la production d’oxyde
nitrique et la synthèse et relâche de chimiokines (Dinarello, 2007). L’IL-18 régule
également la synthèse d’IL-2, de GM-CSF et de TNF (Dinarello, 1999). L’IL-18 exogène
peut aussi activer les cellules NK nécessaires à l’élimination des cellules cancéreuses via la
relâche d’IFN. Par conséquent, l’absence d’IL-18 chez la souris a pour effet d’entrainer une
diminution d’IFN-γ et de l’activité cytotoxique des cellules NK. Ce phénomène peut être
renversé par l’injection d’une forte dose d’IL-12, ramenant ainsi les niveaux de l’activité
lytique à des niveaux de base, c.-à-d. comparables à ceux de souris contrôles (Takeda et al.,
1998).
L’IL-18 joue un rôle important, bien que souvent néfaste, dans diverses pathologies du
système nerveux comme la LME, la douleur neuropathique, la SP et son modèle animal
l’EAE. L’analyse de cerveaux de rats atteints d’EAE a d’ailleurs démontré la présence de
niveaux élevés de l’ARNm codant pour l’IL-18 au tout début et durant la maladie (Jander
and Stoll, 1998). Les souris Il-18-/- présentent une réduction des symptômes de l’EAE qui
corrèle avec une diminution des niveaux d’IL-17 et d’IFN-γ en comparaison avec les souris
sauvages (Gris et al., 2010). Dans un même ordre d’idée, l’injection d’un anticorps
neutralisant anti-IGIF (facteur induisant l’IFN-γ) a pour effet de réduire la production
d’IFN-γ chez les cellules T réactives contre la protéine basique de myéline (MBP),
bloquant ainsi le développement de l’EAE induite de façon passive ou active (Wildbaum et
al., 1998). Toutefois, ce ne sont pas toutes les études qui sont consistantes quant au rôle de
l’IL-18 dans l’EAE. En effet, Gutcher et al. ont démontré que les souris Il-18-/- sont autant
susceptibles de développer l’EAE que des souris contrôles et présentent des zones
d’inflammation et de démyélinisation similaires en dimension (Gutcher et al., 2006). Au
43
contraire, les souris Il-18rα-/- présentent très peu d’infiltrations leucocytaires et de zones de
démyélinisation, corrélant avec des symptômes fortement diminués. Les différences entre
ces résultats peuvent être expliquées par le fait qu’il pourrait y avoir un ligand autre que
l’IL-18 capable de se lier à l’IL-18Rα et entraîner l’induction de la pathologie ou bien que
les études ont été réalisées à des stades différents de la maladie.
Tel que mentionné plus tôt, il est connu que l’IL-1β est impliquée dans la remyélinisation
suite à une démyélinisation au cuprizone (Mason et al., 2001). Jha et al. ont rapporté que
l’IL-18 est aussi impliquée dans ce mécanisme (Jha et al., 2010). Cette étude a démontré
que des réponses telles que la démyélinisation, la mort des OLs et l’activation des
microglies et des astrocytes sont retardées suite à un traitement de 3 semaines à la
cuprizone chez des souris Il-18-/-, attribuant un rôle néfaste à l’IL-18. À 8 semaines post-
traitement, la remyélinisation est elle aussi retardée dans le modèle de la cuprizone. Dans le
cas d’une lésion d’un nerf périphérique, l’IL-18 est sur-exprimée dans les cellules
microgliales situées dans la corne dorsale de la moelle épinière et ce dès le premier jour
post-lésion via un mécanisme impliquant la voie de signalisation p38/MAPK (Miyoshi et
al., 2008). Cette étude a aussi démontré que cette cytokine possède un rôle important dans
le développement de la douleur neuropathique suite à une lésion du nerf sciatique chez la
souris puisque le blocage de l’IL-18 avec un anticorps neutralisant a permis de diminuer
l’hypersensitivité mécanique. De plus, le blocage de l’IL-18R avec un anticorps a permis
d’amoindrir la douleur occasionnée par la lésion en diminuant la phosphorylation de NF-κB
chez les astrocytes. Une surexpression de la pro-IL-18 a aussi été détectée dans la moelle
épinière suite à une LME et ce dès les premières 15-30 minutes post-lésion. Bien que les
niveaux de la forme active de l’IL-18 étaient beaucoup plus faibles que ceux de la pro-
forme, l’expression de la forme clivée était elle aussi augmentée très tôt suite à la lésion
pour ensuite diminuer et ré-augmenter autour des jours 1-3 post-lésion (de Rivero Vaccari
et al., 2008). Cette augmentation corrèle avec la formation et l’activation de
l’inflammasome NALP1 dans les neurones spinaux.
Les rôles et les fonctions de l’IL-18 sont entièrement médiés par son récepteur IL-18R et la
protéine accessoire IL-18 binding protein (IL-18BP). L’IL-18R est très similaire à l’IL-
44
1R1. La chaîne liant la cytokine est appelée IL-18Rα et doit se lier à un co-récepteur, l’IL-
18Rβ. Par la suite, ce complexe recrute différentes molécules intracellulaires comme
MyD88, IRAK et TRAF6 dans le but d’activer les voies de signalisation NF-κB, JNK et
p38 MAPK (Thomassen et al., 1998). L’expression de l’IL-18R, plus particulièrement celle
de la chaîne IL-18Rβ, est modulée par plusieurs cytokines telles que l’IL-2, l’IL-12 et l’IL-
23 (Yoshimoto et al., 1998, Sareneva et al., 2000). De son côté, IL-18BP peut lier la forme
mature de l’IL-18, mais pas sa pro-forme, avec une forte affinité, lui conférant ainsi un rôle
d’inhibiteur naturel en empêchant l’IL-18 d’agir sur son récepteur IL-18Rα (Kim et al.,
2000). De plus, la production de l’IL-18BP semble être induite par l’IFN-γ dans les cellules
épithéliales, suggérant que l’IL-18 puisse réguler l’expression de son propre inhibiteur
(Paulukat et al., 2001). Les cellules endothéliales, monocytes et macrophages représentent
aussi des sources non négligeables de l’IL-18BP (Corbaz et al., 2002).
1.5.1.5. L’Interleukine-33 (IL-33)
L’IL-33 est le 11e membre et dernière cytokine de la famille de l’IL-1 à avoir été
caractérisée. Elle est synthétisée sous une pro-forme de 30 kDa. L’IL-33 recombinante peut
être clivée par la caspase-1 pour générer une forme active de 18 kDa in vitro (Schmitz et
al., 2005). Par contre, la pro-IL-33 humaine ne possède pas de site défini pour la caspase-1.
Une étude récente a toutefois démontré que la calpaïne pourrait cliver la pro-IL-33 en une
forme mature dans les cellules épithéliales et endothéliales (Hayakawa et al., 2009). Ce
même clivage peut être bloqué par l’ajout d’un inhibiteur de la calpaïne. Cependant, Cayrol
et al. ont récemment rapporté que la pro-IL-33 est biologiquement active, mais que la
forme clivée par la caspase-1 est inactive dans le modèle murin (Cayrol and Girard, 2009,
Talabot-Ayer et al., 2009). En effet, les deux produits obtenus suite au clivage par la
caspase-1 sont incapables d’activer le récepteur de l’IL-33, contrairement à la pro-IL-33, tel
que démontré par l’absence d’activation de la voie NF-κB et l’absence d’expression de
l’IL-6 dans des mastocytes in vitro (Cayrol and Girard, 2009).
L’IL-33 est aussi connue comme étant une alarmine relâchée par les cellules nécrotiques ou
endommagées (Cayrol and Girard, 2009, Russell and Walsh, 2012). Comme l’IL-1α et
45
HMGB1, elle peut agir en tant que molécule régulatrice de la transcription dans le noyau ou
comme cytokine pro-inflammatoire lorsque relâchée. L’IL-33 fut démontrée comme étant
capable de s’associer à l’hétérochromatine dans des cellules endothéliales in vivo chez des
patients atteints d’arthrite ou de la maladie de Crohn et fut même retrouvée en association
avec les chromosomes mitotiques. De plus, cette cytokine semble posséder des propriétés
de répresseur de la transcription (Carriere et al., 2007). Plus récemment, la même équipe a
rapporté qu’une petite séquence peptidique de l’IL-33 est suffisante pour se lier à la
chromatine et moduler la structure de celle-ci en formant des ponts hydrogènes avec le
dimère H2A-H2B situé à la surface nucléosomale (Roussel et al., 2008). Des études de co-
immunoprécipitation effectuées chez des cellules surexprimant l’IL-33 ont révélé que la
pro-IL-33, mais pas la forme mature, peut interagir avec le facteur de transcription NF-κB
via la sous-unité p65 de NF-κB. La conséquence biologique de cette interaction serait
l’inhibition de la liaison de la sous-unité p65 avec l’ADN, causant une déficience dans la
transcription des gènes normalement régulés par NF-κB, tels que le TNF et IκBα (Ali et
al., 2011).
L’IL-33 fut identifiée comme étant un ligand du récepteur T1/ST2, un récepteur orphelin de
la famille de l’IL-1. Il est clair aujourd’hui que ce récepteur membranaire est impliqué dans
la polarisation des lymphocytes T naïfs en Th2 et qu’il constitue un marqueur de ces
mêmes cellules chez la souris et chez l’humain (Trajkovic et al., 2004). T1/ST2 serait aussi
fortement exprimé par les mastocytes au cours de leur différeniation (Moritz et al., 1998).
Ce récepteur existe également sous une forme soluble (sST2) qui ne possède ni de domaine
transmembranaire ni de domaine intracellulaire de type IL-1R/TLR. sST2 serait produit par
épissage alternatif de l’ARNm du récepteur T1/ST2. Cette isoforme de T1/ST2 est
dorénavant connue en tant qu’inhibiteur de la voie de signalisation activée par l’IL-33
(Hayakawa et al., 2007). En effet, le recombinant soluble exprimé par des cellules
HEK293T et sécrété dans le milieu extracellulaire est capable d’empêcher l’IL-33
recombinant de lier son récepteur T1/ST2 et d’induire la voie NF-κB.
L’expression de l’IL-33 est fortement stimulée par la LPS chez les cellules endothéliales et
les astrocytes tandis que son récepteur est présent chez les microglies et les astrocytes
46
(Yasuoka et al., 2011). Un traitement à l’IL-33 pendant 3 jours a permis notamment
d’augmenter la prolifération de cellules microgliales in vitro (Yasuoka et al., 2011). Cette
étude a aussi démontré que l’IL-33 est capable de stimuler la production microgliale de
diverses cytokines telles que l’IL-1β, le TNF et l’IL-10 de façon dose-dépendante. L’IL-33
fut détectée dans le plasma et le cerveau de patients atteints de SP (Christophi et al., 2012).
Cette sur-expression fut corrélée avec une augmentation de l’expression de NF-κB. Dans
les dernières années, un polymorphisme de l’IL-33 fut associé à un risque accru de la
maladie d’Alzheimer au cours de laquelle la production de l’IL-33 se retrouve diminuée
dans le cerveau de patients atteints de cette maladie (Han et al., 2011). Puisque l’IL-33
cause l’activation microgliale et augmente la capacité de ces cellules à phagocyter
(Yasuoka et al., 2011), et puisque la microglie phagocyte la β-amyloïde dans la maladie
d’Alzheimer (Lee and Landreth, 2010), l’IL-33 pourrait jouer un rôle dans la
neuroprotection mais aussi dans les dommages tissulaires survenant dans diverses maladies
neurodégénératives.
1.5.2. Le facteur nécrosant des tumeurs (TNF) Comme l’IL-1, le TNF exerce des effets neuroprotecteurs et neurotoxiques dans une
panoplie de maladies du SNC (Sriram and O'Callaghan, 2007). Le TNF est synthétisé sous
une forme membranaire de 26 kDa et clivé en sa forme mature de 17 kDa par l’enzyme de
conversion du TNF-α (TACE, communément appelée ADAM17) qui est exprimée dans le
SNC (Kärkkäinen et al., 2000). Son effet biologique est dépendant de sa liaison à un de ses
récepteurs membranaires, TNFR1 et TNFR2. Ces récepteurs signalisent via le facteur de
transcription NF-κB ou les protéines kinases JNK, ERK-1/2 et p38 MAPK (Cabal-Hierro et
al. 2012). TNFR1 est exprimé dans la plupart des cellules du SNC tandis que TNFR2 est
principalement exprimé chez la microglie et les cellules endothéliales. Le complexe formé
de TNF et de TNFR1 peut soit recruter le TNF-associated death domain (TRADD) et
réguler l’expression de protéines anti-apoptotiques ou recruter TRADD et FAS-associated
death domain (FADD) et stimuler la mort cellulaire par apoptose ou d’autres formes de
mort cellulaire programmée (Micheau et Tschopp, 2003).
47
Le TNF est rapidement produit par les microglies, les astrocytes, les OLs et les neurones
suite à une LME chez le rat et la souris (Yan et al., 2001, Yune et al., 2003, Pineau and
Lacroix, 2006). Ses récepteurs sont principalement exprimés par les astrocytes, les OLs et
les neurones (Yan et al., 2003). La neutralisation du TNF durant la phase aiguë post-LME
chez le rat grâce à l’injection d’etanercept a pour effet d’engendrer de nombreux effets
bénéfiques tels qu’une diminution de l’apoptose des OL et des neurones, une diminution
des dommages tissulaires et de la démyélinisation, entraînant par le fait même une
amélioration de la récupération des fonctions locomotrices (Chen et al., 2011). Un anticorps
se liant au TNF, l’infliximab, a aussi permis de réduire l’inflammation, les dommages
neurologiques et l’apoptose suite à une LME chez la souris (Genovese et al., 2008). Par
contre, d’autres études ont plutôt démontré que le TNF présente des effets neuroprotecteurs
dans des modèles animaux d’ischémie cérébrale et d’épilepsie (Bruce et al., 1996). En effet,
chez des souris où les deux types de récepteurs du TNF furent supprimés, l’activation des
cellules microgliales est réduite et le stress oxydatif et les dommages neuronaux sont
augmentés. Plus récemment, ces résultats furent confirmés par Lambersten et al. qui ont
démontré que le volume lésionnel suite à une ischémie cérébrale est augmenté et que les
fonctions motrices se détériorent chez des souris Tnf-/- (Lambertsen et al., 2009). Cette
étude a aussi établi que les effets du TNF d’origine microgliale sont médiés par un
mécanisme dépendant du TNFR1. Bruce et al. avaient préalablement proposé que
l’activation des voies de signalisation du TNF ne sont pas nécessaires chez les astrocytes
suite à une ischémie cérébrale (Bruce et al., 1996). Par contre, Chu et al. ont rapporté que
des rats Tg sur-exprimant le TNF présentent un plus grand nombre d’astrocytes activés et
une plus forte expression de GFAP suite à une LME, et que ces résultats corrèlent avec une
plus faible perte de tissu nerveux comparativement aux rats contrôles (Chi et al., 2008). Ces
résultats suggèrent que le TNF peut présenter autant des fonctions bénéfiques que néfastes
dans diverses pathologies du SNC. Les mécanismes régulateurs sous-jacents les fonctions
biologiques de cette cytokine restent donc mal compris et devront être mieux caractérisés
afin de développer des traitements cliniques plus efficaces.
48
1.6. Recrutement des cellules immunitaires Une lésion du SNC, plus particulièrement une LME, déclenche une réponse inflammatoire
forte et rapide qui permet le recrutement et l’infiltration de différents types de cellules
immunitaires au site lésionnel. Cette réponse inflammatoire est majoritairement induite par
l’activation des cellules gliales du SNC qui représentent une source importante de
cytokines pro-inflammatoires. Les mécanismes de recrutement des cellules immunitaires
suite à une LME ont été largement étudiés à travers les années dans divers modèles
animaux (Popovich et al., 1997, Stirling and Yong, 2008) et chez l’humain (Fleming et al.,
2006). Les prochaines sections discuteront des principales cellules recrutées au site de
lésion et de leurs effets sur le tissu nerveux.
1.6.1. Neutrophiles Les neutrophiles sont les premières cellules immunitaires à être recrutées à un site
infectieux ou lésionnel. Les neutrophiles proviennent des cellules souches
hématopoïétiques de la moelle osseuse au cours d’un processus appelé hématopoïèse. La
production des neutrophiles s’effectue à un flux de 1 à 2 x 1011 cellules par jour chez un
individu sain (Borregaard, 2010). Leur demi-vie est de 5,4 jours dans le sang (Pillay et al.,
2010). Le facteur de croissance granulocytaire (G-CSF) est essentiel à la production des
neutrophiles dans la moelle osseuse (Semerad et al., 2002, Roberts, 2005). Cette cytokine
est aussi connue pour jouer un rôle important dans la régulation de l’efflux des neutrophiles
de la moelle osseuse vers le sang (Semerad et al., 2002). Le G-CSF est d’ailleurs
grandement utilisé pour traiter les cas de neutropénie, une maladie caractérisée par un taux
relativement bas de neutrophiles sanguins (Roberts, 2005). Il peut aussi exercer son action
sur la lignée des macrophages, résultant en une augmentation du nombre de monocytes et
de macrophages (Bermudez et al., 1998). De plus, le G-CSF a la capacité d’entraîner une
baisse d’expression de l’ARNm et des niveaux protéiques de cytokines pro-inflammatoires
telles que l’IL-1β et le TNF suite à une LME chez le rat. Cette fonction anti-inflammatoire
permet d’atténuer la perte de matière blanche dans la moelle épinière lésée et de préserver
un plus grand nombre d’OLs. Ces effets ont pour conséquence d’améliorer les fonctions
locomotrices chez le rat (Kadota et al., 2012). D’autres études ont également démontré
49
l’efficacité d’un traitement au G-CSF dans la protection des neurones suite à une ischémie
cérébrale (Schäbitz et al., 2003, Chen et al., 2008) et chez des souris ayant reçu une
injection intracérébrale de l’agent neurotoxique 6-OHDA (Huang et al., 2007). Pris dans
leur ensemble, ces résultats confirment que le G-CSF peut réguler l’inflammation et la
survie neuronale suite à une lésion.
CXCR4 est une autre molécule essentielle à la maintenance des neutrophiles dans la moelle
osseuse (Lapidot and Kollet, 2002). L’absence de CXCR4 chez la souris cause une
redistribution des neutrophiles de la moelle osseuse vers le sang (Eash et al., 2009). Malgré
la présence accrue de neutrophiles sanguins, une déficience en CXCR4 résulte en une
altération du recrutement des neutrophiles en réponse au G-CSF ou à GROβ.
Les neutrophiles sanguins répondent à une panoplie de molécules inflammatoires incluant
les chimiokines CXCL1 (KC) et CXCL2 (MIP-2). Ces deux chimiokines sont reconnues
par un récepteur commun, CXCR2, exprimé à la surface des neutrophiles, monocytes et
cellules endothéliales (Charo and Ransohoff, 2006). Les neutrophiles provenant de souris
Cxcr2-/- sont incapables de répondre à la présence de CXCL1 et de CXCL2 lors d’une
infection (Kielian et al., 2001). Les neutrophiles sont indispensables à la défense de
l’organisme contre les microorganismes. Les produits générés par ces microorganismes
guident les neutrophiles au site d’infection, là où ceux-ci produiront divers agents anti-
microbiens (myéloperoxydase, protéases, espèces réactives de l’oxygène et de l’azote) et
des médiateurs inflammatoires (cytokines, chimiokines, prostaglandines), ceci en plus de
phagocyter les débris microbiens (Wright et al., 2010). Les neutrophiles répondent aussi
très fortement à la stimulation générée par les cellules nécrotiques présentes suite à un
trauma ou une pathologie inflammatoire de type stérile. Ce recrutement de neutrophiles en
absence d’infection semble être dépendant de la voie de signalisation de l’IL-1R1 et de la
protéine adaptatrice MyD88. En effet, les souris Il-1r1-/- et Myd88-/- présentent une
réduction du nombre de neutrophiles suite à l’injection de cellules nécrotiques EL4 (Chen
et al., 2007). Afin de déterminer lequel des deux ligands de l’IL-1R1 est impliqué dans
cette réponse, Chen et al. ont de plus traité des souris sauvages avec des anticorps
neutralisant contre l’IL-1α ou l’IL-1β et mesuré le recrutement neutrophilique en réponse à
50
ces mêmes cellules nécrotiques. Ils ont observé que l’anti-IL-1α a pour effet d’inhiber la
réponse inflammatoire tandis qu’aucun effet ne fut observé avec l’anti-IL-1β. Une étude
plus récente a identifié la pro-forme de l’IL-1α comme étant celle qui est responsable de
l’initiation de l’inflammation stérile en stimulant le recrutement de neutrophiles, tandis que
l’IL-1β entraîne plutôt la mobilisation des macrophages (Rider et al., 2011).
Dans un contexte de LME, les neutrophiles ont longtemps été reconnus comme étant des
contributeurs majeurs des dommages secondaires et de la perte du tissu nerveux. La
neutralisation de ICAM-1, une CAM impliquée dans le recrutement des neutrophiles,
entraîne une réduction de l’activité myéloperoxydase (MPO) et de la perte des fonctions
locomotrices dès le temps 24 heures post-LME (Hamada et al., 1996). L’injection d’un
anticorps neutralisant dirigé contre la P-sélectine, une autre CAM qui médit l’interaction
entre les neutrophiles et les cellules endothéliales, a pour effet de réduire l’infiltration
neutrophilaire, l’activité MPO et les signes d’hémorragie à la suite d’une LME chez le rat
(Taoka et al., 1997). Par contre, une étude plus récente de Stirling et al. a démontré que la
déplétion des leucocytes Gr-1+ à l’aide d’un anticorps a réduit de 90% le nombre de
neutrophiles circulants à 12 heures post-LME mais contribue à aggraver les déficits
neurologiques, suggérant ainsi que ces cellules favorisent la réparation tissulaire (Stirling et
al., 2009). La migration et l’adhésion des neutrophiles ainsi que l’astrogliose furent réduits
chez les souris traitées avec l’anticorps déplétant. Ces réponses furent corrélées avec un
plus grand volume de lésion et un plus grand nombre d’axones endommagés. Cependant, il
est essentiel de préciser que l’anticorps utilisé dans cette étude a ciblé toutes les cellules
exprimant l’antigène Gr-1 (Ly6C/G). Il est donc fortement probable que ce traitement a
causé la déplétion d’autres types cellulaires tels que les monocytes et les lymphocytes. Les
effets observés chez ces souris pourraient donc être attribuables à l’absence de neutrophiles
mais aussi à l’absence de différents sous-types de monocytes et lymphocytes. Plus
récemment, une équipe a tenté d’examiner les conséquences d’une déplétion plus
spécifique des neutrophiles et de monocytes sur les fonctions neurologiques chez la souris
suite à une LME (Lee et al., 2011). L’anticorps anti-Ly6G fut utilisé pour la déplétion des
neutrophiles tandis que les monocytes furent éliminés par des injections répétées de
liposomes dans lesquels furent encapsulé le chlodronate, un produit toxique pour les
51
cellules l’ayant ingéré. Cette étude a démontré que seulement la déplétion simultanée, mais
pas individuelle, des 2 types cellulaires est bénéfique à la récupération des fonctions
locomotrices à long terme. Ceci suggère donc une certaine redondance dans les fonctions
de ces 2 populations cellulaires durant la pathologie.
1.6.2. Monocytes/Macrophages En plus des neutrophiles, les cellules myéloïdes de l’immunité innée comprennent les
monocytes et les macrophages que l’on retrouve respectivement dans le sang et les tissus.
Des études suggèrent qu’un sous-type de monocytes pro-inflammatoires appelé M1
pourrait se différencier en cellules dendritiques (DCs) une fois infiltré dans des tissus où
l’inflammation prévaut (Geissmann et al., 2010). Les DCs représentent une lignée cellulaire
spécialisée dans la présentation des antigènes aux lymphocytes T (Zozulya et al., 2010).
Les macrophages sont les phagocytes résidents des tissues lymphoïdes et non-lymphoïdes.
Ils sont aussi impliqués dans l’homéostasie de l’organisme via l’élimination des corps
apoptotiques et la production de cytokines telles que l’IL-1β, IL-6, IL-10 et TNF-α. Ces
cellules possèdent également des récepteurs de chimiokines et de CAMs qui leur
permettent de migrer du sang vers les tissus ou à l’intérieur de ceux-ci, là où ils ont la
capacité de produire des médiateurs servant à l’élimination des microorganismes présents
lors d’une infection (Gordon, 2002).
Chez l’humain et la souris, 2 sous-groupes de monocytes ont été identifiés basé selon leur
expression de différents marqueurs immunophénotypiques. Chez l’homme, les monocytes
CD14+ CD16- représentent environ 80 à 90% des monocytes. Ils expriment fortement le
récepteur de chimiokine CCR2 mais très faiblement CX3CR1. Ils sont caractérisés comme
étant des monocytes pro-inflammatoires puisqu’ils produisent les cytokine pro-
inflammatoire IL-1β et TNF-α en réponse à la LPS in vitro. Au contraire, les monocytes
CD14-CD16+ expriment fortement CX3CR1 et les molécules MHC de classe II mais très
faiblement CCR2. Ils sont alors reconnus comme étant des monocytes anti-inflammatoires
(Gordon and Taylor, 2005). Chez la souris, les sous-groupes de monocytes sont identifiés
grâce à l’expression de CD115 et de Gr1 (Ly6C/Ly6G). Les monocytes CD115+ Ly6CHigh
Ly6G- expriment le marqueur CCR2 mais de très bas niveaux de CX3CR1. Les monocytes
52
CD115+ Ly6CLow Ly6G- expriment fortement CX3CR1 mais très peu CCR2. Ces
monocytes sont appelés monocytes résidents et se retrouvent tant bien dans les tissus sains
que dans les tissus inflammés. Ces monocytes sont souvent comparés aux monocytes
humains CD14- CD16+ pour leurs propriétés anti-inflammatoires (Geissmann et al., 2003,
Gordon and Taylor, 2005, Auffray et al., 2009). Les monocytes CX3CR1High sont capables
de patrouiller les tissus en rampant sur les cellules endothéliales via un mécanisme
CX3CR1-dépendant, ce qui permettrait leur recrutement rapide en cas d’infection ou de
blessure (Auffray et al., 2007).
Il a été rapporté que les monocytes Ly6CLow CX3CR1High sont impliqués dans le processus
de réparation tissulaire (Nahrendorf et al., 2007). En effet, Nahrendorf et al. ont démontré
qu’une lésion du myocarde entraîne le recrutement des 2 types de monocytes, soient les
cellules Ly6CHigh Ly6G- au cours d’une première phase et les cellules Ly6CLow Ly6G- qui
arrivent un peu plus tard au cours d’une deuxième phase de mobilisation. Les 2 sous-
groupes de monocytes possèdent la même activité phagocytaire in vivo. Par contre, les
cellules Ly6CHigh présentent une forte expression de cytokines pro-inflammatoires (TNF et
IL-1β) ainsi qu’une activité élevée en protéinases impliquées dans la rupture de la matrice
extracellulaire. En contrepartie, les monocytes Ly6CLow expriment de hauts niveaux du
facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF) et de faibles niveaux de TNF et
d’IL-1β, ce qui leur confère des propriétés angiogéniques et anti-inflammatoires.
La présence de ces différents types de monocytes/macrophages devient également une
caractéristique importante suite à une LME. Popovich et al. ont démontré que la déplétion
des macrophages via l’injection de chlodronate encapsulé dans des liposomes entraîne une
amélioration de la récupération locomotrice ainsi que de la réparation tissulaire chez le rat
suite à une LME (Popovich et al., 1999). Plus récemment, leur équipe a identifié la
présence de 2 types de macrophages suite à la LME (Kigerl et al., 2009). En effet, elle a
démontré que la lésion induit l’expression de gènes capables de polariser les macrophages
vers un phénotype M1 pro-inflammatoire (iNOS, CD32, CD86) ou un phénotype anti-
inflammatoire M2 (Arg1, CD14, CD206). De plus, lorsque co-cultivés avec des neurones
primaires, les macrophages M1 possèdent un effet neurotoxique diminuant ainsi la survie
53
cellulaire tandis que les macrophages M2 stimulent la régénérescence et la croissance
axonale. Enfin, Thawer et al. ont prouvé que le recrutement de macrophages M1
Ly6ChighF4/80low a lieu majoritairement dans la phase aigüe suivant la lésion (jours 1 à 3),
bien que ces cellules semblent revenir à nouveau 6 semaines post-LME (Thawer et al.,
2013). De leur côté, les macrophages M2 Ly6ClowF4/80high répondent plutôt entre les jours
7 et 14 post-LME. Ces résultats suggèrent que la régulation du recrutement des
macrophages à différents moments suivant la lésion peut avoir des effets soit bénéfiques
soit néfastes suite à une LME.
1.7. Protection et régénération du SNC La méthylprednisolone (MP), un anti-inflammatoire stéroïdien (corticostéroïde), fut le
premier traitement à être utilisé officiellement en clinique pour le traitement des LME chez
l’humain, et ce depuis le début des années 90 (Bracken et al., 1990) (Bracken et al., 1997).
Ses effets consistent en des effets anti-oxydants, l’inhibition de l’inflammation ainsi que la
peroxydation des lipides. La MP permet également de diminuer la mort apoptotique des
OLs, mais pas celle des neurones, et la démyélinisation suite à un traitement avec AMPA,
un agoniste des récepteurs du glutamate (Lee et al., 2008). Par contre, ce médicament a ses
limites puisque la MP doit absolument être administrée dans les 8 premières heures suite à
la LME pour que le traitement soit efficace chez l’humain (Sayer et al., 2006). Ses effets
secondaires et une interprétation erronée de plusieurs études cliniques ont amené depuis
quelques années les cliniciens a reconsidérer l’utilisation de la MP pour le traitement des
LME (Sayer et al., 2006, Juknis et al., 2012, Priestley et al., 2012).
Dans les dernières années, plusieurs autres études ont tenté de manipuler la réponse
inflammatoire dans le but de réduire les déficits locomoteurs occasionnés par la lésion.
Mais étant donné la complexité et les effets divergents de la réponse neuroinflammatoire,
les thérapies à l’essai en études pré-cliniques et cliniques ont donné des résultats tantôt
bénéfiques tantôt néfastes. Parmi celles-ci, la minocycline, qui fut démontrée comme ayant
des effet anti-inflammatoires et neuroprotecteurs chez les rongeurs (Kwon et al., 2011,
Wilson et al., 2013). L’injection de minocycline a pour effet de réduire le nombre de
microglies et d’oligodendrocytes en apoptose, corrélant avec une diminution de la
54
dégénérescence antérograde aiguë des fibres axonales situées à proximité de la LME
(Stirling et al., 2004). L’érythropoiétine, un facteur de croissance hématopoiétique, fut
démontré comme capable de réduire l’apoptose et l’inflammation et de promouvoir la
réparation vasculaire (Gorio et al., 2002). D’autres études ont utilisé des anticorps dirigés
contre l’intégrine CD11d, une protéine exprimée à la surface des macrophages et des
neutrophiles, et rapporté une baisse de la production de radicaux libres (ROS) et de
l’activité myéloperoxydase (MPO) chez le rat ayant subi une suite LME, entrainant par le
fait même une amélioreration des fonctions locomotrices et sensorielles (Gris, 2004, Bao et
al., 2005).
Parmi les études qui ont tenté de développer des stratégies thérapeutiques axées sur le
concept de régénération axonale, on retrouve les nombreuses études visant à comprendre
les mécanismes d’inhibition de la repousse axonale. Les molécules ayant cet effet sont
MAG, MOG, Nogo et les CSPGs. La chondroitinase ABC (ChABC) est une enzyme
capable de cliver les CSPGs (Crespo et al., 2007, Sharma et al., 2012). Lorsqu’elle a fut
testée dans un modèle de LME, ChABC a eu pour effet de diminuer les niveaux
d’expression des CSPGs et de stimuler la régénérescence axonale (Bradbury et al., 2002).
De plus, la combinaison de ChABC avec l’anti-Nogo-A s’est révélée encore plus efficace
que le traitement unique avec l’une ou l’autre de ces molécules (Zhao et al., 2013). Par
ailleurs, l’administration d’un anticorps neutralisant dirigé contre Nogo-A, une protéine de
la myéline capable d’inhiber la croissance axonale (Grandpre and Strittmatter, 2001), a eu
pour effet de stimuler une sur-régulation de facteurs de croissance tels que NGF, NT-3 et
NT-4/5 et une augmentation de la plasticité neuronale entraînant la formation de nouvelles
connections neuronales dans la moelle épinière lésée (Zörner and Schwab, 2010).
Les études décrites ci-dessus ont donc un objectif commun qui consiste à stimuler la
réparation tissulaire et diminuer l’apparition des dommages tissulaires secondaires afin
d’améliorer la santé des personnes affligées d’une LME.
55
1.8. Hypothèse et objectifs généraux Les LME entraînent des dommages tissulaires irréversibles réduisant la mobilité et la
qualité de vie des personnes atteintes par ce genre de lésion. Immédiatement après la lésion,
une réponse inflammatoire initiée par les neurones et les cellules gliales est déclenchée,
causant la relâche d’une panoplie de cytokines et de chimiokines dans le tissu nerveux lésé.
Cette cascade inflammatoire orchestre le recrutement de différents types de cellules
immunitaires telles que les neutrophiles et les monocytes sanguins au site de lésion.
Ensemble, ces mécanismes cellulaires et molécules ont pour rôle de stériliser le site
lésionnel et favoriser la réparation tissulaire mais pour « effet secondaire » d’entraîner des
dommages secondaires au tissu lésé.
Au cours des dernières années, plusieurs études ont tenté d’éclaircir la chronologie de
recrutement des cellules immunitaires impliquées ainsi que leur rôle biologique suite à une
LME (Popovich et al., 1999, Stirling and Yong, 2008, Kigerl et al., 2009, Shechter et al.,
2009, Stirling et al., 2009, Lee et al., 2011, Thawer et al., 2013). Précédemment aux
travaux présentés dans cette thèse, une étude effectuée par notre laboratoire a démontré que
les astroyctes sont responsables de l’expression de chimiokines (MCP-1, CXCL1 et
CXCL2) nécessaires au recrutement de neutrophiles et de monocytes pro-inflammatoires
M1 via un mécanisme dépendant de la voie de signalisation de l’IL-1R1/MyD88 (Pineau et
al., 2010). Par contre, les mécanismes initiant cette cascade demeurent inconnus. Nous
avons donc voulu déterminer les molécules et cellules impliquées dans l’initiation de
l’inflammation immédiatement après la LME.
1.8.1. Étude du rôle du récepteur P2X4R Une forte relâche d’ATP dans le milieu extracellulaire survient suite à une LME ou une
LNP activant ainsi des récepteurs purinergiques tels que P2X4R et P2X7R P2X7R (Wang et
al., 2004, Coull et al., 2005). Une augmentation de l’expression de P2X4R par les cellules
microgliales fut rapportée suite à une LME (Schwab et al., 2005) et une LNP (Ulmann et
al., 2008). De plus, Silvermann et al. ont démontré que P2X7R est capable d’activer la
formation de l’inflammasome NLRP1 dans les neurones et les astrocytes traités à l’ATP,
56
suggérant ainsi que ce récepteur puisse favoriser le clivage de l’IL-1β dans les cellules du
SNC. Nous nous sommes donc demandé quel pourrait être le rôle de l’activation de P2X4R
suite à une LME chez la souris.
Lors de la 1ère étude présentée au chapitre 3, nous avons émis comme hypothèse que, suite à
une LME, l’activation de P2X4R stimule la formation d’un inflammasome et le clivage de
l’IL-1β. La relâche de la forme mature de cette cytokine dans le tissu lésé entraîne un
recrutement rapide de cellules immunitaires pouvant infliger des dommages collatéraux aux
neuronaux et un déficit locomoteur. Pour vérifier cette hypothèse, notre plan expérimental
visait à :
1) Vérifier l’expression de P2X4R dans la moelle épinière naïve et lésée à différents
temps post-lésion par Western Blot.
2) Étudier l’expression de la caspase-1 clivée et de l’IL-1β en réponse à une LME par
Western Blot.
3) Vérifier le type cellulaire capable d’exprimer le récepteur dans notre modèle par des
marquages en immunofluorescence.
4) Quantifier le nombre de cellules pro-inflammatoires infiltrantes au site de lésion par
des marquages en immunohistochimie et par cytométrie en flux (FACS) chez des
souris P2x4r-/- versus sauvages.
5) Étudier la récupération des fonctions locomotrices chez des souris P2x4r-/- ayant
subi une LME à l’aide de tests de comportement (BMS et Grip Walk).
1.8.2. Étude des effets de l’IL-1αα et IL-1ββ Une famille de cytokines très importantes qui jouent un rôle dans la neurodégénérescence
suite à une lésion du SNC est la famille de l’IL-1. Les 2 principaux membres, l’IL-1α et
l’IL-1β, exercent leurs actions via un récepteur commun, l’IL-1R1. Il fut démontré que
l’IL-1α est associée à la chromatine dans une cellule normale ou en apoptose mais qu’elle
deviendrait sous une forme libre dans la cellule nécrotique, ce qui résulterait ultimement en
sa relâche dans le milieu extracellulaire et la stimulation de l’inflammation (Luheshi et al.,
57
2009, Cohen et al., 2010). Enfin, l’IL-1α serait requise plus tôt que l’IL-1β au cours de
l’inflammation puisque son rôle serait en lien avec le recrutement des neutrophiles lors
d’une inflammation de type stérile induite par la mort cellulaire (Chen et al., 2007, Kono et
al., 2010).
Lors de la 2e étude présentée dans le chapitre 4, nous avons voulu élucider le rôle de l’IL-
1α et de l’IL-1β dans la chronologie des événements menant à l’initiation de
l’inflammation suite à une LME et, par conséquent, dans la propagation des dommages
tissulaires et la perte des fonctions locomotrices. Nous avons émis comme hypothèse
qu’une LME entraîne la relâche de l’IL-1α et de l’IL-1β ayant pour effet de recruter les
cellules immunitaires innées au site de lésion ce qui pourrait éventuellement entraîner de
possibles dommages au tissu nerveux et causer une atteinte à la capacité locomotrice chez
la souris.
Pour vérifier cette hypothèse, nous nous sommes fixés comme objectifs majeurs de:
1) Déterminer la chronologie d’expression de l’IL-1α et de l’IL-1β et identifier les
cellules responsables de leur production suite à LME.
2) Quantifier le nombre de neutrophiles et de monocytes M1 pro-inflammatoires au
site lésionnel chez des souris Il-1α-/-, Il-1β-/- et Il-1r1-/- et des souris sauvages.
3) Étudier l’effet de l’absence d’IL-1α, d’IL-1β ou de IL-1R1 sur la récupération
locomotrice et la propagation des dommages tissulaires chez la souris lésées en
effectuant 2 tests de comportement (BMS et Grip Walk).
4) Étudier l’effet de l’absence de ces 2 cytokines sur la régulation du transcriptome
murin grâce à des micropuces à ADN et le RT-PCR quantitatif en temps réel.
5) Étudier l’expression du facteur de survie neuronale TOX3 chez les souris Il-1α-/-, Il-
1β-/-, Il-1r1-/- et sauvages à la suite d’une LME et identifier le(s) type(s) cellulaire(s)
responsable(s) de son expression.
59
2. Chapitre 2
Cytokine pathways regulating glial and leukocyte function after spinal cord and peripheral nerve injury
Dominic Bastien1 and Steve Lacroix1
1 Centre de recherche du Centre hospitalier de l'Université Laval and Département de Médecine Moléculaire, Université Laval, Québec, Québec, Canada, G1V 4G2
60
2.1. Résumé Les lésions du système nerveux entraînent la relâche rapide de cytokines par les cellules
gliales et les neurones. Ces cytokines sont responsables de la régulation de différentes
réponses conduisant à la microglioses, le recrutement de cellules immunitaires,
l’astrogliose, la cicatrisation, la dégradation des débris cellulaires, tous des mécanismes
affectant la survie neuronale ainsi que la réparation tissulaire. Cette revue se concentrera
sur les cytokines relâchées suite à une LME et une LNP et les principales voies de
signalisation déclenchées par ces médiateurs inflammatoires. Particulièrement, les familles
de cytokines suivantes seront discutées: IL-1, TNF, IL-6, TGF-β et IL-10. Comment le
contrôle de ces voies de signalisation pourrait mener au développement de nouvelles
thérapies sera aussi discuté. Finalement, cette revue discutera si la manipulation de ces
voies de signalisation pourrait entraîner différents effets dans la moelle épinière lésée
comparativement aux nerfs périphériques lésés.
61
2.2. Abstract Injury to the nervous system causes the almost immediate release of cytokines by glial cells
and neurons. These cytokines orchestrate a complex array of responses leading to
microgliosis, immune cell recruitment, astrogliosis, scarring, and the clearance of cellular
debris, all steps that affect neuronal survival and repair. This review will focus on cytokines
released after spinal cord and peripheral nerve injury and the primary signalling pathways
triggered by these inflammatory mediators. Notably, the following cytokine families will be
covered: IL-1, TNF, IL-6-like, TGF-β, and IL-10. Whether interfering with cytokine
signalling could lead to novel therapies will also be discussed. Finally, the review will
address whether manipulating the above-mentioned cytokine families and signalling
pathways could exert distinct effects in the injured spinal cord versus peripheral nerve.
62
2.3. Introduction Traumatic spinal cord injury (SCI) and peripheral nerve injury (PNI) cause damage to
axons and their myelin sheaths. How axons respond to injury has been extensively studied
for decades in a variety of organisms, ranging from invertebrates to non-human primates
(Bradke et al., 2012). From these studies a main conclusion can be drawn: axonal
regeneration is regulated by a multitude of intracellular and extracellular signals. Among
which are several axon growth inhibitory molecules that have been found in myelin or
associated with the scar (Burda and Sofroniew, 2014; Cregg et al., 2014; Schwab, 2010).
Wallerian degeneration (WD) and clearance of inhibitory myelin debris are delayed in the
injured CNS compared to the injured PNS, which could be one of the main reasons why
CNS regeneration is generally so poor (David and Lacroix, 2005). In addition, immune
cells that phagocytose myelin debris are potentially the source of neurotrophic factors and
anti-inflammatory molecules that may support the regenerative and repair processes. In
support of this are studies that showed that CNS axons can grow in transplanted peripheral
nerve segments (Barrette et al., 2008; David and Aguayo, 1981).
Another direct consequence of SCI is the destruction of neurons and glia at the site of
lesion, which has been referred to as the primary mechanical lesion. Long-standing
evidence suggests that a second wave of cell death follows the primary mechanical insult,
leading to apoptosis of oligodendrocytes (OLs) and neurons (Crowe et al., 1997; Liu et al.,
1997). However, it is important to note that they are many other suspected causes of
secondary damage in the injured spinal cord, including ischemia, vascular damage,
glutamate excitotoxicity, ionic dysregulation, and inflammation (for reviews, see (David
and Lacroix, 2005; Donnelly and Popovich, 2008)). The topic of inflammation has received
the greatest attention because immune cells are the main producers of free radicals,
proteases, eicosanoids and cytokines, all of which are molecules that have been shown to
be both capable of inducing cell death and myelin damage and of being expressed in the
injured spinal cord within minutes to days of mechanical impact (Bao and Liu, 2004; Hains
et al., 2001; Liu et al., 2000; Liu et al., 1998; Noble et al., 2002; Pineau and Lacroix, 2007;
Rice et al., 2007; Wells et al., 2003). This time course fits well with the timing of
secondary damage, suggested to occur between 4 h and 14 d post-SCI (Blight, 1985; Liu et
63
al., 1997). The concept of secondary cell damage is at the center of the preclinical
development of potential neuroprotective therapies, with many studies reporting reduced
lesion size and/or increased spared tissue as a result of treatment (reviewed extensively by
(Kwon et al., 2011)). An outstanding question has been why neurons projecting through
peripheral nerves do not seem to be as sensitive to these potentially cytotoxic molecules.
Indeed, peripheral nerve and spinal cord lesion sites seem to contain the same inflammatory
cells and molecules, but perhaps not at the same timing, duration and expression levels.
This subject will be addressed in the last part of this review.
In the CNS, as in the PNS, glia can be activated by several different types of signals and
modulators, among which cytokines and neurotransmission-related compounds are
considered to play major regulatory roles (Hanisch and Kettenmann, 2007). For example,
microglia respond within minutes to ATP released after laser-induced SCI by extending
their processes in order to rapidly shield the site of injury (Davalos et al., 2005;
Nimmerjahn et al., 2005) (Fig. 2.1). Depending on the repertoire of receptors activated,
microglia can either promote neuronal survival and regeneration or contribute to neuronal
death (Hanisch and Kettenmann, 2007; Ransohoff and Perry, 2009). Although they do not
physically respond as quickly as microglia (Farrar et al., 2012), astrocytes, the main cellular
component of the glial scar, increase their GFAP expression, become hypertrophic,
proliferate and migrate around the lesion site in a process generally referred to as reactive
astrogliosis (Sofroniew, 2009). Several different mediators of reactive astrogliosis exist,
among which are cytokines of the IL-1, TNF, IL-6-like, TGF-β, and IL-10 families
(reviewed by (Sofroniew, 2009)). Importantly, the glial scar has been shown to exert both
beneficial and detrimental effects after SCI (Brambilla et al., 2005; Brambilla et al., 2009;
Faulkner et al., 2004).
64
Figure 2.1 Microglia rapidly shield the site of a spinal cord lesion by first extending their cellular processes and then their cell bodies. To examine the microglial response toward the site of a laser-induced spinal cord lesion, time-lapse two-photon intravital microscopy was used to simultaneously image microglia, axons and blood vessels. Real-time in vivo imaging of microglia (green; CX3CR1-eGFP), axons (cyan; Thy1-CFP), and blood vessels (redwood color; Qtracker® 800 non-targeted quantum dots) was performed in the spinal cord of a Thy1-CFP; CX3CR1-eGFP double transgenic fluorescent mouse. Time zero minutes (min) correspond to the time of the lesion. The lesion site is shown in red. Scale bar: 25 µm.
65
Innate immune cells such as neutrophils and monocytes are rapidly recruited at sites of SCI
(Beck et al., 2010; Fleming et al., 2006; Lee et al., 2011; Mawhinney et al., 2012; Pineau et
al., 2010; Stirling and Yong, 2008; Thawer et al., 2013). Evidence suggests that these cells
could play a key role in both secondary damage and tissue repair after traumatic neural
injury (Barrette et al., 2008; Kigerl et al., 2009; Shechter et al., 2009; Stirling et al., 2009).
The apparent contradictions between these studies may be due to the fact that different
subsets of immune cells have divergent effects, resulting in either neurotoxicity or
regeneration in the injured spinal cord (David and Kroner, 2011). The effects of cytokines
on glia and leukocytes and the contribution of these cells to tissue damage, glial scarring
and regeneration will be explored in more detail in the second part of this review. One
important area of focus will be how cytokines govern immune cell recruitment, activation
and polarization in the context of injury, as this could explain some of the controversies and
paradoxical effects of neuroinflammation in SCI.
This review begins with an overview of the principal families of cytokines for which a role
in the pathophysiology of spinal cord and peripheral nerve injury has been established.
2.4. Cytokines released after neural injury: production, receptor signalling pathways and immune responses
2.4.1. IL-1 family members
The role of interleukin (IL)-1 family cytokines in the initiation and regulation of
inflammation during infection and injury is well established. The family contains 11
members, the best characterized of which are IL-1α, IL-1β, IL-1 receptor antagonist (IL-
1RA), IL-18, and IL-33 (Dinarello, 2009). IL-1α and IL-1β were the first two members of
the family to be described. Despite the fact they share only 25-30% amino acid homology,
they have a similar 3D structure and biological properties (Dinarello, 1991; Graves et al.,
1990). Since they bind to the same receptor, IL-1 receptor type 1 (IL-1R1), with the same
affinity and stimulate expression of similar downstream effectors, IL-1α and IL-1β have
long been thought to trigger identical responses. However, Rothwell and colleagues have
66
shown that the relative potencies of recombinant IL-1α and IL-1β vary depending on the
context and the response being studied, thus suggesting that different mechanisms are likely
to be involved in the various effects of IL-1 cytokines in the CNS (Andre et al., 2005;
Anforth et al., 1998; Tsakiri et al., 2008). For example, the study by Anforth et al. showed
that IL-1β is more effective than IL-1α at inducing fever when the cytokines are injected
intracerebroventricularly (i.c.v.) (Anforth et al., 1998). Moreover, and in contrast to IL-1β,
treatment with IL-1α failed to induce IL-6 production from glia and neurons, despite the
fact that both forms of IL-1 were equally effective at increasing expression levels of
chemokines such as CCL2/MCP-1, CXCL1/KC and IP-10 (Andre et al., 2005; Tsakiri et
al., 2008), More recently, Rider et al. suggested that the precursor of IL-1α and mature IL-
1β recruit different myeloid cells (neutrophils and macrophages, respectively) in response
to hypoxia-induced cell death (Rider et al., 2011). It is therefore plausible that the two IL-1
cytokines signal through distinct signalling complexes and regulate expression of specific
genes. Preliminary results in this direction, in which we compared the transcriptome of the
injured spinal cord of IL-1α-knockout (KO), IL-1ß-KO and wild-type (WT) mice during
the acute phase of SCI using Affymetrix GeneChip microarrays, indicate that a few genes
appear to be specifically regulated by IL-1α (D. Bastien and S. Lacroix, unpublished
observation).
2.4.1.1. Interleukin-1αα (IL-1αα) IL-1α and IL-1β are synthesized as 31-kDa precursor proteins. However, only the IL-1α
precursor (pro-IL-1α) is able to bind to IL-1R1, which suggests that this form is
biologically active (March et al., 1985; Mosley et al., 1987). Proteases such as calpain
(Carruth et al., 1991; Kobayashi et al., 1990), and more recently granzyme B, elastase and
chymase (Afonina et al., 2011), were shown to cleave pro-IL-1α and yield a 17-kDa form.
Initially, that cleavage was thought to have no effect on the biological activities of the
cytokine, but recent studies have shown that the 17-kDa mature form of IL-1α has
enhanced immunological potency compared to the proform (Afonina et al., 2011; Zheng et
al., 2013). Zheng et al. also identified the IL-1 receptor type 2 (IL-1R2) as a regulator of
67
IL-1α cleavage, being able to bind IL-1α and prevent calpain from processing the precursor
cytokine. Despite this, evidence has shown that the proform has the ability to recruit
leukocytes following its release from hypoxic cells (Rider et al., 2011). One unknown is
whether the pro- and mature forms of IL-1α have the same biological functions.
IL-1α, like IL-33, high-mobility group box protein 1 (HMGB1), S100 proteins and heat-
shock proteins (HSPs), belongs to a class of dual-function molecules capable of performing
their functions in the nucleus as well as in the extracellular compartment. These molecules,
also referred to as alarmins or danger-associated molecular pattern molecules (DAMPs)
(see also Kigerl et al., this issue), are constitutively expressed in the nucleus where they act
as regulators of DNA transcription, However, once released into the extracellular space
from necrotic cells upon tissue injury or infection, these molecules become powerful
mediators of inflammation (Chan et al., 2012).
IL-1α has an N-terminal nuclear localization sequence (NLS), allowing it to translocate to
the nucleus of cells, where it regulates transcription of proinflammatory genes (Buryskova
et al., 2004; Werman et al., 2004). During apoptosis, IL-1α remains associated with the
chromatin and is retained in the apoptotic bodies, thus preventing the cytokine from
triggering inflammation. Conversely, following necrosis, IL-1α dissociates from the
chromatin and is released first in the cytoplasm and then in the extracellular milieu where it
can initiate inflammation by binding the IL-1R1 on neighboring cells (Cohen et al., 2010;
Luheshi et al., 2009). Accordingly, mice treated with antibody to IL-1α have reduced
neutrophil recruitment in response to i.p. injection of necrotic cells when compared to mice
treated with control antibody or antibody to IL-1β (Chen et al., 2007). This finding was
confirmed by another in vivo study that showed that IL-1α released by dying cells, believed
to be tissue-resident macrophages, triggers neutrophil recruitment through the CXCL1-
CXCR2 axis in an IL-1R1-dependent manner (Eigenbrod et al., 2008).
In culture, IL-1α has been detected in multiple cell types (Dinarello, 2009). However, in
the CNS, only resident microglia and infiltrating platelets have been confirmed as possible
68
sources of IL-1α during inflammatory conditions, such as cerebral ischemia (Luheshi et al.,
2011; Thornton et al., 2010). In the ischemic brain, microglia express IL-1α mRNA and
protein as early as 4 hours following reperfusion, mainly in regions exhibiting neuronal cell
death (Luheshi et al., 2011). This time point precedes the reported infiltration of blood-
derived immune cells and appearance of apoptotic neurons in this animal model
(Broughton et al., 2009; Iadecola and Anrather, 2011). However, work with KO mice has
revealed that both forms of IL-1, but not IL-1α or IL-1β alone, need to be knocked out to
reduce ischemic infarct size (Boutin et al., 2001). These results highlight the possibility of
compensatory changes in the IL-1 system and reinforce the need to carefully assess the
individual and cumulative effects of cytokines of the IL-1 family.
2.4.1.2. Interleukin-1ββ (IL-1ββ) Because pro-IL-1β is unable to bind to IL-1R1, its enzymatic cleavage by caspase-1 is a
required step in the production of a bioactive 17-kDa mature form of IL-1β. This
proteolytic cleavage of pro-IL-1β depends on the assembly of large multiprotein complexes
termed inflammasomes (Franchi et al., 2009; Lamkanfi and Dixit, 2012; Mariathasan and
Monack, 2007; Martinon et al., 2009). Proteins encoded by the nucleotide-binding
oligomerization domain and leucine-rich repeat (NLR) containing gene family form the
central components of inflammasomes (see also Kigerl et al., this issue). A question that
had remained unanswered until recently is whether spinal cord resident cells express
inflammasomes, and if so which cells influence inflammasome activation after SCI?
de Rivero Vaccari and colleagues were the first to demonstrate the existence of the NLRP1
inflammasome, consisting of NLRP1, caspase-1, caspase-11, XIAP, and ASC, an adaptor
protein essential for caspase-1 recruitment and known to interact with several
inflammasomes (Tschopp et al., 2003), in neurons of the normal rat spinal cord (de Rivero
Vaccari et al., 2008). Neutralization of ASC in SCI mice reduced caspase-1 activation and
IL-1β cleavage, and this was correlated with increased tissue sparing and functional
recovery. More recently, we found that purinergic receptors of the P2X4-subtype are
expressed in spinal cord neurons and regulate inflammasome activation after SCI (de
69
Rivero Vaccari et al., 2012). P2X4-KO mice have decreased levels of activated caspase-1
and mature IL-1β after SCI. Mice lacking the P2X4 receptor also exhibited reduced
recruitment of neutrophils and pro-inflammatory monocytes at sites of SCI and improved
histopathological and functional outcomes compared with WT mice, thus suggesting that
interfering with P2X4R-mediated IL-1β processing in vivo is a potential target to limit
neuroinflammation and neurodegeneration (de Rivero Vaccari et al., 2012). However, an
intriguing observation made by de Rivero Vaccari et al. in the 2008 study is that ASC, but
not NLRP1, is expressed in microglia and OLs, thus suggesting the possibility that other
types of inflammasome sensors may also be implicated in neuroinflammation.
Interestingly, P2X4 receptors are not only expressed in neurons but also in microglia
(Ulmann et al., 2008), and SCI causes increased expression of P2X4 receptors in these two
cell populations (Schwab et al., 2005).
In the CNS, IL-1β can directly affect glial cells, endothelial cells (ECs), and even neurons,
as they all express IL-1R1 (Allan et al., 2005) (see Table 2.1). IL-1β has been shown to
promote astrogliosis (e.g. astrocyte proliferation) and trigger astrocytic release of
glutamate, nitric oxide (NO), potassium, prostaglandins (PGs), cytokines and chemokines
(Basu et al., 2004), all of which were shown to be toxic to neurons at high concentrations
(for review, (David and Lacroix, 2005)). In contrast, astrocyte activation by IL-1β can also
exert neuroprotective effects by stimulating blood-brain barrier repair and decreasing its
permeability. As many as 1,400 genes may be differentially regulated in astrocytes by IL-
1β (John et al., 2005). IL-1β can also stimulate microglia, resulting in the expression and
release of proinflammatory mediators such as prostaglandin E2 (PGE2), cytokines and
chemokines (Basu et al., 2004). Microglia can also release IL-1β, which in turn triggers the
production of ciliary neurotrophic factor (CNTF) by astrocytes in response to brain trauma
in mice (Herx et al., 2000). Oligodendrocytes (OLs) and their precursor cells, OPCs, also
respond to IL-1β. Using the cuprizone model of demyelination, Mason et al. suggested that
IL-1β promotes remyelination and repair (Mason et al., 2001). OPCs of IL-1β-KO mice
exhibited a prominent delay in differentiation into mature OLs, which resulted in
remyelination failure in these animals. Deletion of the IL-1β gene also led to decreased
70
microglial and astrocytic expression of insulin-like growth factor (IGF)-1, a factor known
to stimulate proliferation, differentiation and survival of cells of the OL lineage (Barres et
al., 1993; Mason et al., 2000). The multiple effects mediated by IL-1β in various cell types
raise the interesting question of whether these responses are mediated by different
intracellular signalling pathways.
Other than its effects on glia, IL-1β can also directly bind to IL-1R1 expressed on CNS
endothelium to stimulate production of cytokines, chemokines, cell adhesion molecules
(CAMs), PGs, NO, matrix metalloproteinases (MMPs); molecules that are involved in the
recruitment and infiltration of leukocytes into the CNS parenchyma (Allan et al., 2005).
Finally, although IL-1β does not seem to be directly toxic to healthy neurons, it can induce
production of mediators that are highly neurotoxic through the neurons themselves or
surrounding cells (Allan et al., 2005; Basu et al., 2004). Together, these studies demonstrate
that IL-1β affects a large range of CNS cells and drives the expression of several molecules
previously shown to play a key role in CNS injury and mechanisms of neurodegeneration
and repair.
2.4.1.3. Interleukin-1 receptor type 1 (IL-1R1) IL-1R1, through which both IL-1α and IL-1β signal, possesses an extracellular domain
together with a Toll-like/IL-1R1 (TIR) domain in the cytosolic compartment. It is part of
the IL-1R/Toll-like receptor (TLR) superfamily (O'Neill and Dinarello, 2000). The other
form of IL-1 receptor, IL-1R2, has a shorter intracellular domain believed to be biologically
inert. Intracellular IL-1R2 regulates cell activation by preventing cleavage and activity of
IL-1α (Zheng et al., 2013). IL-1R2 can also be cleaved from the cell membrane and
released in the extracellular milieu, where it can bind IL-1 cytokines and prevent them from
acting on IL-1R1 expressed on adjacent cells (Arend et al., 2008).
Activation of IL-1R1 by IL-1 cytokines leads to the recruitment of a sub-unit called IL-1
receptor accessory protein (IL-1RAcP). The complex composed of IL-1α/β, IL-1R1 and
IL-1RAcP then allows the recruitment of the adaptor protein, myeloid differentiation factor
71
88 (MyD88). MyD88 subsequently recruits the IL-1 receptor-associated kinases (IRAKs)
and tumor necrosis factor (TNF) receptor-associated factor 6 (TRAF6), to activate
transcription factors such as nuclear factor-κB (NF-κB), mitogen-activated protein kinases
(MAPKs) such as c-Jun N-terminal kinase (JNK), extracellular signal-regulated kinases 1
and 2 (ERK-1/2) and p38, and activator protein-1 (AP-1) (O'Neill, 2008) (Fig. 2.2). The
importance of MyD88 has been documented by Adachi et al. who reported a complete loss
of the characteristic immune responses normally mediated by IL-1R1 in MyD88-KO mice,
such as IL-1-mediated cytokine production, acute phase proteins expression and T cell
proliferation (Adachi et al., 1998). More recently, we found that the IL-1R1/MyD88
signalling pathway plays a major role in the recruitment of neutrophils and
proinflammatory M1 monocytes after SCI by promoting the expression of chemokines such
as CXCL1 and CXCL2 by astrocytes (Pineau et al., 2010). It is also important to know that
IL-1RAcPb, a splice isoform of IL-1RAcP with a variant TIR domain and whose
expression is restricted to CNS neurons, has been shown to modulate neuronal responses to
IL-1 (Nguyen et al., 2011; Smith et al., 2009). Although the neuron-specific function of IL-
1RAcPb is largely unknown, the C-terminal extension of AcPb allows it to bind adaptor
proteins and recruit them to the IL-1R1 receptor complex in an IL-1-dependent manner.
Despite the fact that IL-1RAcP is able to associate with IL-1R1 in the presence of IL-1, it
should be pointed out that this association does not lead to the recruitment of MyD88 and
IRAK4, and is therefore unable to mediate canonical IL-1 signalling (Smith et al., 2009).
Nguyen et al. further reported that IL-1α-induced, but not IL-1β-induced, p38
phosphorylation is significantly reduced in primary neuronal cultures from IL-1RAcPb-KO
mice (Nguyen et al., 2011). These results suggest an important role of IL-1RAcPb in
specific neuronal activities, but not all, in response to IL-1α.
Several studies suggested that IL-1R1 plays an important role in glial responses in brain
and spinal cord injury. After penetrating stab injury to the brain, IL-1R1-KO mice exhibit
reduced macrophage/microglia activation and astrogliosis around the lesion site (Basu et
al., 2002b). The study also reported a decrease in IL-6, cyclooxygenase-2 (COX-2), and
VCAM-1 mRNA expression. However, not all astrocytic responses that typically occur
after CNS injury are compromised in mice lacking IL-1R1, as levels of chondroitin
72
sulphate proteoglycans (CSPGs), tenascin, S100β and glutamate transporters (GLAST,
GLT-1) remain unchanged (Lin et al., 2006). Therefore, some astrocyte properties do not
seem to require the IL-1R1 pathway.
2.4.1.4. Interleukin-1 receptor antagonist (IL-1RA) Treatment of many diseases relies on blocking IL-1R1 signalling by way of administering
its receptor antagonist, IL-1RA. Anakinra, the recombinant form of IL-1RA, is widely used
in the clinical treatment of inflammatory diseases such as familial Mediterranean fever,
rheumatoid arthritis, gout and type 2 diabetes (reviewed in (Dinarello, 2011; Dinarello et
al., 2012)). In the CNS after stroke, a single subcutaneous injection of IL-1RA reduced
infarct volume by 33% in rats exposed to middle cerebral artery occlusion (MCAO)
(Greenhalgh et al., 2010). More relevant for the clinical practice, IL-1RA administered at
reperfusion after transient MCAO in a rat model reduced blood-brain barrier disruption,
neutrophil infiltration, microglial activation and cytokine (IL-6) levels in the brain (Pradillo
et al., 2012). Treatment with IL-1RA adsorbed into a gelatin sponge and applied on top of
the contused spinal cord of rats promoted functional recovery for at least 4 weeks (Zong et
al., 2012). Chronic intrathecal delivery of recombinant IL-1RA also reduced apoptosis and
caspase-3 activity in a contusion SCI rat model (Nesic et al., 2001). Together, these results
suggest an important beneficial effect of IL-1RA in the treatment of SCI and
neuropathologies with an inflammatory component.
2.4.1.5. Interleukin-18 (IL-18) Another molecule that possesses a similar structure to cytokines of the IL-1 family is IL-18.
Like IL-1β, IL-18 is synthesized as an inactive 23-kDa protein that can be cleaved by
caspase-1 into a bioactive 18-kDa mature form (Ghayur et al., 1997; Gu et al., 1997).
Because of its role in the production of IFN-γ in T-helper type I (Th1) cells, IL-18 is
perhaps best known for its involvement in T-cell polarization towards a Th1 phenotype
(Nakanishi et al., 2001). This skewing is due to a complex interplay between different
immune cells and involves IL-18, IL-12 and the IL-18 receptor (IL-18R). Somewhat
surprisingly, IL-18 alone can stimulate Th2 responses such as production of the anti-
inflammatory cytokines IL-4 and IL-13 (Nakanishi et al., 2001). Among its other functions,
73
IL-18 also regulates production of CAMs, NO, cytolytic granules and cytokines such as IL-
2, GM-CSF, IL-1β and TNF (Arend et al., 2008; Smith, 2011).
The biological functions of IL-18 are mediated through IL-18R, a receptor of the IL-
1R/TLR superfamily that is remarkably similar to the IL-1R complex (Arend et al., 2008;
Smith, 2011). The IL-18R is composed of a ligand-binding chain, IL-18Rα (also known as
IL-18R1 or IL-1R-related protein), and a signal-transducing chain, IL-18Rβ (also referred
to as IL-18R2 or IL-18R accessory protein). Once formed, this complex recruits different
intracellular molecules such as MyD88, IRAKs and TRAF6, leading to activation of NF-
κB and MAPK signalling pathways (JNK, ERK-1/2 and p38) (Thomassen et al., 1998)
(Fig. 2.2).
Like IL-1β, IL-18 is believed to play a major role in several CNS diseases including
neuropathic pain and SCI. IL-18 is involved in the induction of neuropathic pain that
develops after ligation of the L5 spinal nerve; a model in which microglia from the spinal
cord dorsal horn upregulate their production of IL-18, which in turn signals to astrocytes
through the IL-18R-NF-κB pathway (Miyoshi et al., 2008). In the contusion SCI model,
expression of the mature form of IL-18 is increased as early as 15-30 minutes post-injury
and continues to rise until at least day 3 (de Rivero Vaccari et al., 2008). Expression of the
mature form of IL-18 was further correlated with the assembly of a functional NALP1
inflammasome and caspase-1 activation in spinal cord neurons.
74
Figure 2.2 Cytokine signalling pathways relevant to spinal cord and peripheral nerve injury. Schematic representation of the main cytokines, receptors and signalling pathways regulating neuroinflammation and immune responses after spinal cord and peripheral nerve injury. IL-1R1 and IL-18Rαα are members of the IL-1R/TLR superfamily of receptors and thus share similar signalling pathways. Upon binding of their respective ligands, IL-1α/IL-1β (referred herein as IL-1) and IL-18, they rapidly recruit a second receptor subunit in the cell membrane; IL-1RAcP for IL-1R1 and IL-18Rββ for IL-18Rαα . Formation of the receptor heterodimers then leads to the recruitment of MyD88, IRAKs and TRAF6. The ensuing cellular responses are primarily mediated by NF-κκB- and MAPK-dependent gene expression. The effects of TNF and mTNF are mediated through binding with TNFR1 and TNFR2, respectively, which leads to the formation of complexes involving adaptor proteins of the TRADD, TRAF and FADD families. Depending on the composition of the receptor complexes formed and downstream signalling cascades, such as those mediated by NF-κκB and MAPK, TNF will induce a broad spectrum of effects, including regulation of inflammatory gene expression and cell death and survival. The binding of FasL to FasR induces the recruitment of cytosolic signalling proteins such as FADD and pro-caspase-8, resulting in activation of apoptotic caspase cascade. The three TGF-βs mediate their action through the TGF-βRI—TGF-βRII complex, leading to the phosphorylation of SMAD transcription factors. IL-6 binds to IL-6R, leading to the formation of a receptor complex with gp130. The phosphorylation of gp130 by JAK kinases activates the canonical STAT family of signalling proteins. The effects of IL-10 are mediated via two receptor chains, IL-10R1 and IL-10R2, through activation of the JAK-STAT signalling pathway. All cytokine signalling pathways discussed lead to the transcription of genes involved in immune responses, scarring, cell death and tissue repair. Please refer to the core text of the review for the definition of abbreviations.
75
2.4.2. TNF family members
2.4.2.1. Tumor necrosis factor (TNF) Similar to IL-1, TNF has both neuroprotective and neurodegenerative effects in a number
of CNS diseases and injuries (Sriram and O'Callaghan, 2007). TNF is synthesized as a 26-
kDa membrane-bound precursor (mTNF) and cleaved into a 17-kD mature form by the
TNF-alpha converting enzyme (TACE; also known as ADAM17), which is expressed in
the CNS (Karkkainen et al., 2000). Signalling pathways and biological effects of TNF are
mediated through high affinity transmembrane receptors, namely TNF receptor type 1
(TNFR1) and TNFR2. They are both part of the TNFR superfamily and, like IL-1R1, signal
through transcription factors such as NF-κB, JNK, ERK-1/2 and p38 MAPK, albeit through
a different set of adaptor molecules (Cabal-Hierro and Lazo, 2012). TNFR1 is expressed in
most CNS cell types and is the preferred target of soluble TNF, whereas TNFR2 is mainly
expressed in microglia and endothelial cells and preferentially activated by mTNF.
Following binding of TNF to TNFR1, which possesses a death domain (DD), two different
signalling complexes can be formed: 1) Complex 1 involving TNFR-associated death
domain (TRADD) and controlling expression of anti-apoptotic proteins that prevent cell
death, and 2) Complex II involving both TRADD and FAS-associated death domain
(FADD) and triggering cell death by way of apoptosis or programmed necrosis (also
referred to as necroptosis) (Micheau and Tschopp, 2003). As opposed to TNFR1, TNFR2
lacks a functional DD and binds mTNF with higher affinity than sTNF. Its functions are
mainly proinflammatory and anti-apoptotic, as it induces through TNFR-associated factors
(TRAFs) several proinflammatory mediators downstream of NF-κB and AP-1 activation
(Cabal-Hierro and Lazo, 2012; Santello and Volterra, 2012).
TNF is rapidly expressed (peak at 1 hour) by microglia, astrocytes, OLs and neurons after
SCI in both rats and mice (Pineau and Lacroix, 2007; Yan et al., 2001; Yune et al., 2003),
whereas TNFR1 and TNFR2 are mainly found in astrocytes, OLs and neurons (Yan et al.,
2003). Blockade of TNF during the acute phase of SCI in rats by means of systemic
administration of etanercept (Enbrel), a TNF inhibitor functioning as a decoy receptor that
binds to TNF, was shown to decrease neuronal and oligodendroglial apoptosis, reduce
76
tissue damage and demyelination, and improve recovery of locomotor function (Chen et al.,
2011). In support of the previous study, Genovese et al. have found that deletion of the
TNFR1 gene or TNF blockade using infliximab (Remicade; an antibody directed against
TNF) in SCI mice reduced inflammation, tissue damage and apoptosis, and improved
functional recovery (Genovese et al., 2008). On the contrary, work done using animal
models of stroke and epilepsy has revealed that TNF serves a neuroprotective function, as
microglial activation was suppressed, oxidative stress increased and neuronal damage
exacerbated in mice lacking both TNF receptors (Bruce et al., 1996). This result was
recently confirmed by Lambertsen et al. who showed that cortical infarction and behavioral
deficits are exacerbated in TNF-KO mice after cerebral ischemia (Lambertsen et al., 2009).
This research went further by demonstrating that microglial-derived TNF exerts its
neuroprotective properties through TNFR1. An interesting observation made by Bruce et
al., however, is that injury-induced astrogliosis is apparently unaltered in mice lacking both
TNFR1 and TNFR2. This suggests that TNF signalling is not critical for the astrocytic
response to ischemia and epilepsy. Whether this holds true after SCI remains to be seen,
especially when considering the discrepancies between the results obtained in the three
models discussed above. Along these lines, transgenic TNF overexpression in SCI rats
resulted in more activated astrocytes with longer processes and stronger GFAP staining in
the border of the lesion (Chi et al., 2008). Despite exhibiting more apoptotic cells during
the acute phase of SCI, tissue loss was reduced in TNF-transgenic rats compared to WT
controls. Together, these results suggest a dual role for TNF in the pathophysiology of CNS
injuries such as SCI. The protective or damaging outcome of TNF could depend on more
than one factor, such as for example the duration of NF-κB activation, which we know is
controlled by several regulatory proteins and may be affected by the redistribution of
receptors between lipid rafts and non-raft regions of the plasma membrane (Lotocki et al.,
2004). Hence, investigating these regulatory mechanisms will warrant the use time-specific
and cell lineage-specific knockdown systems.
77
2.4.2.2. Fas ligand (FasL) FasL is a transmembrane protein that closely resembles to other TNF family members. It
can directly act on adjacent cells or be released in a soluble form in the extracellular space
upon cleavage by MMPs. FasL signals through the Fas receptor (FasR, also known as
CD95), one of the most studied members of the TNFR superfamily bearing a DD, also
referred to as “death receptors” (reviewed in (Tibbetts et al., 2003)). The binding of FasL to
FasR induces the recruitment of cytosolic signalling proteins such as FADD and pro-
caspase-8, ultimately resulting in apoptosis (Siegel et al., 2000) (Fig. 2.2). Also of
relevance to this review is the fact that apoptosis triggered by FasL-FasR interactions plays
an important role in the regulation of various types of immune responses (Siegel et al.,
2000).
In the context of SCI, protein expression for FasR has been detected in OLs, astrocytes and
microglia, and expression correlated in time with markers of apoptosis (i.e. TUNEL,
cleaved caspase-8, cleaved caspase-3) (Casha et al., 2001). Accordingly, mice harbouring
deletion of FasR have reduced loss of OL, but not neurons, and significantly improved
axonal sparing, myelin preservation and locomotor recovery compared to WT after SCI
(Casha et al., 2005). FasR deficiency in SCI mice also caused a reduction in levels of
activated caspase-3 and -9, together with the upregulation of anti-apoptotoc proteins such
as BCL-2 and BCL-XL (Yu et al., 2009). Using cell-specific Cre-lox mice, Letellier et al.
have however found that the detrimental function of FasL after SCI is due to its propensity
to increase the migratory ability of neutrophils and macrophages at sites of injury, instead
of by directly inducing apoptosis of FasR-bearing CNS cells (Letellier et al., 2010). Indeed,
deletion of FasL in myeloid cells, but not of FasR in neural cells, led to improved
functional recovery after SCI. Despite these conflicting results on the cellular mechanisms
underlying the detrimental effects of FasL/FasR in SCI, it should be emphasized that
administration of soluble FasR (sFasR) in mice and rats, as a means to neutralize FasL, was
proven to be an effective strategy to improve biological outcome; that is, improvements in
cell survival, tissue sparing and integrity of descending axon tracts and functional recovery
(Ackery et al., 2006; Robins-Steele et al., 2012).
78
2.4.3. Interleukin-6 (IL-6) IL-6 is a proinflammatory cytokine that is rapidly upregulated at the mRNA level during
the acute phase of SCI (Bartholdi and Schwab, 1997; Pineau and Lacroix, 2007). We
recently demonstrated that microglia/macrophages, astrocytes and neurons are the principal
cellular source of IL-6 in the injured mouse spinal cord (Pineau and Lacroix, 2007). IL-6
exerts its biological functions by first binding to the IL-6 receptor (IL-6R). The IL-6/IL-6R
complex then recruits glycoprotein 130 (gp130), allowing it to homodimerize and
autophosphorylate. This, in turn, activates signal transduction through the JAK-STAT
pathway (Murakami et al., 1993) (Fig. 2.2).
Several studies have highlighted the importance of IL-6 in the initiation of inflammation
and recruitment of innate immune cells after CNS injury. In particular, IL-6 can modulate
the recruitment of neutrophils and macrophages by regulating chemokine expression
(Romano et al., 1997). Using a gene therapy approach, we delivered a “hyper-IL-6” fusion
molecule (consisting of IL-6 and the soluble IL-6R) at site of SCI. Hyper-IL-6 is known to
be 100-1000 times more active than the separate molecules. We observed that the number
of infiltrating neutrophils increased by six-fold (Lacroix et al., 2002). This was associated
with a two-fold increase in lesion volume and a reduction in axonal regrowth inside grafts
containing fibroblasts engineered to produce hyper-IL-6. IL-6 is also involved in the
activation of astrocytes and microglia in the injured CNS (Penkowa et al., 1999). This was
confirmed by Okada et al. who showed that treatment with an anti-IL-6R neutralizing
antibody suppressed the development of the astroglial scar, reduced the infiltration of Mac-
1 (CD11b/CD18)-positive myeloid cells and improved functional recovery (Okada et al.,
2004). Another group found that treatment with the same function blocking antibody,
MR16-1, shifted immune responsiveness towards an anti-inflammatory state, characterized
by increased production of anti-inflammatory cytokines and the presence of more than
normal numbers of M2 macrophages (Guerrero et al., 2012). Importantly, myelin was
significantly more preserved and recovery of locomotor function enhanced in mice treated
with the anti-IL-6R antibody. Besides its effects on immune and glial cells, IL-6 is known
to enhance the intrinsic growth capacity of sensory DRG neurons after lesion of their
79
peripheral branch axons (Cafferty et al., 2004; Cao et al., 2006), as well as to affect
neurotransmitter release and neural activity (Spooren et al., 2011).
2.4.4. TGF-β family members The TGF-β superfamily of ligands includes TGF-βs (TGF-β1, TGF-β2 and TGF-β3),
activins, bone morphogenetic proteins (BMPs) and growth and differentiation factors
(GDFs) (Schmierer and Hill, 2007). They regulate a broad range of biological responses
such as cell growth and differentiation, extracellular matrix molecule (ECM) production
and cell survival. Because TGF-βs play an important role in the immune system (Li and
Flavell, 2008), and because they have been the target of intensive research and clinical
trials for a number of diseases in recent years (Akhurst, 2006; Akhurst and Hata, 2012),
they will be the main focus here.
All three TGF-βs modulate their actions through a serine/threonine kinase receptor
complex composed of the type 1 (TGF-βRI) and type 2 (TGF-βRII) receptors. The TGF-β
molecule must first bind to TGF-βRII, which then recruits TGF-βRI to the complex and
activates it by phosphorylation (Heldin et al., 1997). This, in return, results the
phosphorylation of SMAD proteins by TGF-βRI and the propagation of the signal
(Massague, 2000).
TGF-β molecules are known to regulate the expression of genes coding for cell-cycle
regulators, differentiation factors, CAMs, and inflammatory mediators (Massague, 2000).
Accordingly, they exert profound biological functions during development and
neuropathology (Massague, 2000; Wyss-Coray and Mucke, 2002). Following traumatic
SCI in rodents and humans, TGF-β1 and TGF-β2 are upregulated, but with different
patterns of expression. While TGF-β1 was found to be associated with neurons and
immune cells (Buss et al., 2008; Lagord et al., 2002; McTigue et al., 2000), TGF-β2 was
mainly detected in reactive astrocytes forming the glial scar and small round CD68-positive
cells that appeared to be infiltrating immune cells (Buss et al., 2008; Lagord et al., 2002).
At first glance, these results suggest that TGF-β1 modulates neuronal and immune
80
responses, whereas TGF-β2 regulates glial scarring and the production of ECMs such as
collagen, fibronectin and CSPG. However, a number of studies indicate that it may be more
complicated than that. First, the administration of TGF-β1 i.c.v. in rats has been reported to
induce a glial scar (Laping et al., 1994; Logan et al., 1994; Morgan et al., 1995). Second,
the neutralization of endogenous TGF-β1 by means of an i.c.v injection of anti-TGF-β1
antibody attenuated the formation of fibrous scar tissue, as verified using immunostaining
for GFAP, fibronectin and laminin (Logan et al., 1994). Third, chronic inhibition of TGF-
ß1 suppressed glial scar formation and upregulated markers of microglia/macrophage
activation (Iba1, ED1) in the injured rat spinal cord, a finding that was correlated with
improved locomotor recovery (Kohta et al., 2009). Fourth, treatment of cerebral wounds
with an antibody specific to the active form of TGF-β2 also led to an attenuation of CNS
scarring and inflammation (Logan et al., 1999). These results therefore suggest that
substantial functional redundancy must be expected from members of the TGF-β family
after CNS injury. Another explanation for the different outcomes in these studies may be
the dosage, timing, duration and route of administration of the cytokine or antagonist
treatment. Whatever the explanation, these data raise the possibility that anti-TGF-β
therapies could be used as an effective anti-fibrotic therapy, thus limiting tissue scarring in
CNS pathologies where astrocyte activation becomes excessive. This is exactly what the
group of Frank Bradke has recently shown by giving the drug Taxol to SCI rats to dampen
TGF-ß1/SMAD signalling (Hellal et al., 2011). They reported that rats treated with Taxol
had reduced scarring, increased regeneration and/or sprouting of 5-HT fibers, and improved
functional recovery. Notably, Taxol was shown to reduce production of inhibitory
molecules in both astrocytes and meningeal cells at the protein level.
2.4.5. IL-10 family members IL-10 family members include IL-10, IL-19, IL-20, IL-22, IL-24, IL-26, IL-28A, IL-28B,
and IL-29 (Ouyang et al., 2011; Sabat, 2010). Because most, if not all, of the published
work on the subject of the IL-10 family of cytokines in SCI relates to IL-10, only the latter
cytokine will be covered in this review.
81
2.4.5.1. Interleukin-10 (IL-10) IL-10 was identified by Mosmann and colleagues in 1989 and first given the name of
cytokine synthesis inhibitory factor (CSIF) (Fiorentino et al., 1989). As its name implies,
one of its main function is the negative regulation of proinflammatory cytokine production
(e.g. IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-3, TNF, GM-CSF) in various cell types such as leukocytes and
microglia (Balasingam and Yong, 1996; Basu et al., 2002a; Fiorentino et al., 1989; Fuchs et
al., 1996; Kremlev and Palmer, 2005; Takeda et al., 1999), making it one of the most potent
anti-inflammatory cytokines. The biological effects of IL-10 are mediated via two receptor
chains, IL-10R1 and IL-10R2, and by activating the JAK-STAT signalling pathway (Moore
et al., 2001) (Fig. 2.2). STAT3 is the key transcription factor implicated in IL-10-mediated
responses (Moore et al., 2001; Ouyang et al., 2011).
Although IL-10 may play distinct roles in injured tissue, its primary purpose is to suppress
inflammatory cytokine production. This may help limit tissue damage that inflammation
could inflict to bystander cells. Of particular relevance here, IL-10 was found to induce
expression of anti-apoptotic proteins BCL-2 and BCL-XL and support survival of spinal
cord neurons both in vitro and in vivo (Zhou et al., 2009a, b). Notably, the study in which
IL-10 was delivered close to sites of SCI using a gene therapy approach showed that the
increased neuronal survival was accompanied by slight improvements in locomotion over 4
weeks (Zhou et al., 2009a). From a more therapeutic perspective, work from John Bethea’s
laboratory has revealed that a single i.p. injection of IL-10 at 30 min post-SCI in rats was
sufficient to improve recovery of hindlimb function (Bethea et al., 1999). It should be
pointed out, however, that SCI rats that received two doses of the recombinant cytokines at
30 min and 3 days did not perform better than controls on the BBB locomotor test, thus
suggesting once again the importance of timing when inflammation is concerned. Systemic
injection of IL-10 also had neuroprotective effects in rat models of traumatic brain injury
and spinal cord excitotoxicity (intraspinal injection of quisqualic acid) (Brewer et al., 1999;
Knoblach and Faden, 1998; Plunkett et al., 2001). Deletion of the IL-10 gene in SCI mice
increased levels of TNF, IL-1β, iNOS and myeloperoxidase (MPO) in the injured spinal
cord (Genovese et al., 2009). This was correlated with an augmented number of apoptotic
cells and worsening of hindlimb function at 30 days post-SCI. IL-10 may also be important
82
for the beneficial effects of a certain subset of Ly-6C+ CX3CR1+ CCR2+ CD11c+ monocytes
infiltrating the margins of spinal cord lesions and having anti-inflammatory and
neuroprotective properties (Shechter et al., 2009). In particular, Shechter et al. showed that
adoptive transfer of monocytes lacking IL-10 into SCI mice depleted in CD11c-expressing
monocytes failed to reduce the lesion size and improve functional recovery to the extent of
WT monocytes. In a subsequent publication, the same group reported that these infiltrating
IL-10-producing monocyte-derived macrophages accumulate at the lesion border and
apparently degrade inhibitory CSPGs associated with glial scar formation by producing
MMP-13 (Shechter et al., 2011). However, further studies will be needed to clarify the
phenotype of these immune cells and their functions, as well as the role of IL-10 in their
overall impact on the SCI milieu. Whether these monocyte-derived macrophages behave
the same way and can reproduce their beneficial effects in normal pathophysiological
conditions, i.e. without irradiation or prior immune cell depletion, will also need to be
addressed.
83
Table 2.1 Cytokine effects on glia, endothelial cells, leukocytes and neurons in the pathogenesis of spinal cord injury
84
2.5. Cytokine effects on glia, endothelial cells and leukocytes and contribution of these
cells to tissue damage, glial scarring and regeneration
The release of contents of necrotic cells and exposure of DAMPs, also referred to as danger
signals, triggers the rapid response of glia, among which microglia appear to react the
fastest (Fig. 2.1). This allows the activation of a cascade of inflammatory responses, mainly
regulated by cytokines, which cause the activation of the neurovascular unit (NVU) and
influx of innate immune cells at sites of neural injury. The inflammatory response is not
only limited to the recruitment of circulating leukocytes and their activation, but also
includes collateral responses from most if not all other cells present in the injury
environment (Table 2.1). Here, we will focus our discussion on the three main types of glia
(i.e. microglia, astrocytes and OLs), ECs of the NVU, and phagocytic innate immune cells
(i.e. neutrophils and monocytes/macrophages). Special attention will be given to the in vivo
role of these cells and their subsets in secondary tissue damage, glial scarring and
regeneration in the context of neural injury.
2.5.1. Glial cells
Recent advancements in two-photon intravital microscopy (2P-IVM) enable scientists the
opportunity to study dynamic physiological events within living tissues with minimal
impact on cells. Researchers have thus been able to show that microglia are highly
dynamic, constantly monitoring the nervous system in search of molecular evidence of
homeostatic disturbance (Davalos et al., 2005; Nimmerjahn et al., 2005). In general,
microglia residing in the normal adult mouse spinal cord seem to behave like those in the
brain (Soulet et al., 2013), though there is no doubt that the plasticity of these cells is
affected by their molecular environment (which we know varies greatly depending on
regions and conditions). Following tissue injury or disease-induced damage, spinal cord
microglia undergo rapid changes in cell shape, movements and migration ability (Davalos
et al., 2012; Dibaj et al., 2010; Dibaj et al., 2011; Farrar et al., 2012; Fenrich et al., 2012;
Nikic et al., 2011)(Fig. 2.1). It remains to be investigated whether cytokines are involved in
these early changes, but many of the implicated molecules, such as purinergic pathways
85
and NO (Dibaj et al., 2010), exert their effects through them (Pineau and Lacroix, 2009).
The case of IL-1ß is perhaps the best example of this, as cellular nucleotides released
almost immediately after SCI and acting through P2X4 purinoreceptors mediate the release
of mature IL-1ß by CNS resident cells within minutes of the injury, resulting in the
infiltration of innate immune cells from the blood (de Rivero Vaccari et al., 2012). It is also
important to note that the P2X-dependent release of mature IL-1ß could promote cell
motility indirectly by regulating the expression and release of other cytokines and
chemokines (for review, see (Inoue, 2006; Pineau and Lacroix, 2009)). As their name
implies, cytokines regulate cell movements, most often by the intermediary of chemokines,
and are produced by activated microglia in response to SCI (Pineau and Lacroix, 2007).
Cytokines have also been implicated in loss of neuronal and glial cells in both acute and
chronic neurodegenerative disorders (Allan and Rothwell, 2001; Allan et al., 2005), as well
as in regeneration of axons in the injured peripheral nerve (Nadeau et al., 2011).
Fate mapping studies in mice have recently revealed that microglia arise from
erythromyeloid precursors detected in the yolk sac during the embryonic stage of prenatal
development (around day 8.5 to 9.5) rather than from postnatal hematopoietic stem cells
(Ginhoux et al., 2010; Kierdorf et al., 2013; Schulz et al., 2012). Microglia are thus
ontogenetically distinct from monocyte-derived macrophages. Discriminating infiltrating
monocyte-derived macrophages from activated resident microglia in vivo has nevertheless
been an arduous task, due to the fact that both cell types express common antigenic markers
(David and Kroner, 2011; Gordon and Taylor, 2005). Microarray studies have however
revealed that microglia, macrophages and monocytes express identical molecules but at
different levels of expression (Bedard et al., 2007). One of these molecules is the
fractalkine (CX3CL1) receptor, CX3CR1. In both mice and humans, CX3CR1 is highly
expressed on microglia and a subset of patrolling monocytes referred to as M2, which will
be discussed in a subsequent subsection of this review, but weakly expressed in M1
monocytes/macrophages (Geissmann et al., 2003; Harrison et al., 1998; Mildner et al.,
2007). The creation of mice expressing the fluorescent reporter enhanced GFP under the
control of the endogenous Cx3cr1 locus, CX3CR1-eGFP knock-in mice (Jung et al., 2000),
has therefore been a valuable tool for studying microglia function in the healthy and
86
diseased CNS, with one important limitation being that some monocytes and macrophages
are also affected by the mutation. Keeping this limitation in mind, the Popovich laboratory
has reported that deficiency in CX3CR1 promotes functional recovery after SCI (Donnelly
et al., 2011). Lack of CX3CR1 signalling was shown to attenuate the capacity of microglia
and monocyte-derived macrophages to produce proinflammatory cytokines and oxidative
metabolites. This not only supports the idea that proinflammatory cytokines and oxidative
metabolites are toxic to neural cells in the context of injury, but also implies that activation
of CX3CR1 signalling in microglia and macrophages stimulates a proinflammatory
response. Together with earlier work showing that grafting microglial cells into the injured
spinal cord enhances neurite outgrowth (Rabchevsky and Streit, 1997), these data indicate
that microglia might have protective as well as harmful effects after in SCI. It is only
through the development of new approaches and technologies that we will understand all
the intricacies of microglia and grasp the role they play in the normal and injured CNS.
The rapid release of a battery of inflammatory mediators by microglia after injury suggests
that these cells could also influence the functions of other glial cells in their immediate
environment, such as astrocytes and OLs. Astrocytes play a central role in brain and spinal
cord homeostasis, in particular via their neurotransmitter recycling functions and ability to
“seal” the CNS. The latter function of astrocytes, being expressed in the form of the glia
limitans perivascularis, or in the form of the glial scar at its most extreme level of activation
such as in response to tissue damage, prevents the introduction of pathogens into the CNS
and controls attacks by immune cells (Sofroniew, 2009). Astrocytes contribute to
inflammation by rapidly producing IL-1ß, TNF, and IL-6 (Minkiewicz et al., 2013; Pineau
and Lacroix, 2007; Pineau et al., 2010). They also express receptors for many cytokines,
including those recognizing cytokines of the IL-1, TNF, IL-6-like, TGF-ß and IL-10
families (John et al., 2003), giving rise to an autocrine and/or paracrine loop of astroglial
activation. They must thus be considered among the first responders to injury, and NF-κB
and STAT3 seem to be central signalling hubs in this process. In this regard, it is
noteworthy that selective inhibition of astroglial NF-κB in transgenic mice reduces
inflammation and lesion volume and improves locomotor recovery after spinal cord
contusion (Brambilla et al., 2005). However, not all forms of astrocyte responses have a
87
detrimental impact on tissue sparing in the context of injury. STAT3 signalling, for
example, is a critical regulator of astrogliosis and scar formation limiting the spread of
potentially aggressive immune cells (Herrmann et al., 2008; Okada et al., 2006).
Conditional deletion of STAT3 from astrocytes resulted in increased lesion size and
exacerbated demyelination, which correlated with a reduced motor recovery after SCI.
STAT3 is a signal transducer of various cytokines including those of the IL-6-like and IL-
10 families. This suggests that interventions designed to inhibit a specific cytokine or
signalling pathway in astrocytes are most likely to provide effective long-term protection
than blocking all astrocytic functions.
Like microglia and astrocytes, OLs are another important target of cytokines. As reviewed
by McTigue and Tripathi, OLs and OPCs are particularly vulnerable to inflammatory
conditions that can arise from a traumatic injury to the CNS (McTigue and Tripathi, 2008).
Indeed, a 50 percent loss of the OL population has been reported as early as day 1 post-SCI
(Grossman et al., 2001). This could have important consequences on the early loss of motor
function after SCI, as OLs are required for the maintenance of normal axon transport and
an important source of growth factors and neurotrophic cytokines (Nave, 2010).
While OLs in the injured CNS respond to the loss of axonal contact and inflammation by
undergoing apoptosis (Vargas and Barres, 2007), Schwann cells (SCs) in the injured PNS
respond by entering cell cycle (Murinson et al., 2005). Furthermore, and in contrast to the
well-established role of Schwann cells (SC) in breakdown of the myelin sheets and
phagocytosis of its debris in the injured peripheral nerve (Fernandez-Valle et al., 1995;
Hirata and Kawabuchi, 2002; Reichert et al., 1994; Stoll et al., 1989), OLs have little or no
capacity to clear myelin debris after CNS injury. This may contribute to explain why WD is
extremely slow in the injured CNS compared to the PNS in both rodents and humans
(George and Griffin, 1994; Miklossy and Van der Loos, 1991).
2.5.2. Endothelial cells of the neurovascular unit The NVU of the CNS is a complex and dynamic structure composed of ECs, pericytes
embedded in the endothelial basement membrane, perivascular macrophages, and the glia
88
limitans perivascularis, consisting of the parenchymal basement membrane and a
juxtaposed layer of astrocytic processes (“end-feet”). This structure bears the name of
blood-brain barrier (BBB) or blood-spinal cord barrier (BSCB), depending on whether it is
located in the brain or spinal cord. An (almost) equivalent of the BBB/BSCB exists in the
PNS, and is called blood-nerve barrier (BNB). Like the BBB and BSCB, the BNB regulates
the access of soluble mediators and leukocytes circulating in the blood to neural tissue
parenchyma. Unlike its counterparts in the CNS, the BNB is believed to be more permeable
because of the absence of glia limitans perivascularis, but this remains to be demonstrated
experimentally. Since excellent reviews have described in detail the basic structure and
functions of these three barriers (Bartanusz et al., 2011; Kanda, 2013; Muldoon et al., 2013;
Zlokovic, 2008), we will focus here mainly on ECs forming the nonfenestrated
endothelium and their response to neural injury.
Damage to the NVU and breakdown of the BSCB are common consequences of SCI
(Balentine, 1978; Noble and Wrathall, 1988, 1989a, b; Popovich et al., 1996). Of particular
interest are studies that have linked vascular permeability with the evolution of secondary
damage (reviewed by (Tator and Fehlings, 1991), and revisited more recently by
Fassbender et al. (Fassbender et al., 2011)). Permeability of the BSCB has been reported as
early as 5 minutes following spinal cord contusion in rodents and primates (Dohrmann et
al., 1971; Maikos and Shreiber, 2007). This enhanced permeability is clearly too early to be
caused by the transmigration of blood-derived leukocytes, and is thus a direct consequence
of physical disruption of the spinal cord vasculature due to mechanical injury (Maikos and
Shreiber, 2007). However, mounting evidence suggests that activated resident and recruited
immune cells may inflict further damage to the endothelium in the injured peripheral nerve
and spinal cord (Gray et al., 2007; Lee et al., 2011). Although it may be expected that a
certain number of leukocytes will passively enter injured tissue due to disruption of the
microvasculature, active processes regulate the transmigration of immune cells. Leukocyte
entry is a tightly coordinated process requiring cytokines and bind to different subsets of
CAMs that are increased de novo in inflamed tissues (Ley et al., 2007). Interfering with the
mechanisms by which inflammatory mediators contribute to blood vessel dysfunction may
therefore offer a unique opportunity to interfere with secondary events leading to enhanced
89
neurological deficits. This was demonstrated by data showing that pharmacological or
genetic inhibition of MMP activity after SCI prevented BSCB disruption and improved
locomotor fuction (Lee et al., 2012a; Lee et al., 2012b; Noble et al., 2002). Lee et al. also
found that the administration of fluoxetine to SCI mice prevented the expression of
proinflmamatory cytokines (IL-1ß, TNF, IL-6), reduced infiltration of myeloid cells,
attenuated loss of tight junction molecules, and inhibited apototic cell death (Lee et al.,
2012b). It should be emphasized that cytokines such as IL-1 and TNF can directly disrupt
endothelial cell-cell interactions and trigger degradation of barrier function (Royall et al.,
1989; Zhu et al., 2012). An interesting observation in the case of IL-1ß is that its disruptive
effect on endothelial barrier function is mediated through the IL-1R1-MyD88-ARNO-
ARF6 cascade, a pathway independent of NF-κB (Zhu et al., 2012). A better understanding
of the signaling pathways involved in the different functions of cytokines could therefore
help target pathway-specific responses downstream of these receptors. An example would
be the inhibition of vascular leak without interfering with immune-cell adhesion or other
critical NF-κB-dependent responses.
Vessel regression and neovascularization are common features of spinal cord and
peripheral nerve injury (Barrette et al., 2008; Benton et al., 2008; Blight, 1994; Dray et al.,
2009). Such vascular remodelling processes are believed to be involved in the pathogenesis
and recovery of traumatic neural injury. In support of the former are studies suggesting that
OLs and neurons could be particularly sensitive to a constant blood supply due to their
high-energy demand (Attwell et al., 2010). Accordingly, disruption of the endothelium has
been regarded as one of the main causes of secondary damage after SCI (Fassbender et al.,
2011; Mautes et al., 2000; Tator and Fehlings, 1991), although this idea has been
challenged by Casella et al. who reported that neuronal death occurred before EC loss (and
to a greater extent) in the vicinity of a contusion injury (Casella et al., 2006). Despite this
correlative (not causal) evidence, several studies have shown that protecting the vasculature
led to improvements in tissue sparing and functional recovery after SCI (reviewed in
(Fassbender et al., 2011)). One unknown is whether blood vessel regression and
permeability may be necessary steps for neovascularization. This is important considering
90
that neovessels might influence axonal regeneration in the injured PNS and CNS (Barrette
et al., 2008; Dray et al., 2009).
2.5.3. Innate immune cells
Neutrophils and “classically activated” proinflammatory (M1) macrophages (Ly6Chi 7/4+)
are the first innate immune cells to respond, being already abundantly present in spinal cord
parenchymal tissue at 12 h post-SCI (Pineau et al., 2010; Stirling and Yong, 2008). Their
presence at sites of SCI is transient, peaking at 1-2 days before falling to lower levels at 4
days (Stirling and Yong, 2008; Thawer et al., 2013). Importantly, the time course of
recruitment of these two cell populations at sites of peripheral (sciatic) nerve injury is
identical to the one reported in the injured spinal cord in mice (Nadeau et al., 2011). The
presence of these immune cell types during the chronic phase of injury may however differ
between the CNS and PNS, as will be discussed in the last section of this review.
Neutrophils and macrophages are well recognized for their capacity to sterilize lesions by
killing pathogens and their ability to clear cellular debris. Although they have long been
considered as homogeneous cell populations, it is now well established that they show
remarkable heterogeneity in terms of the molecules they express and functional properties.
Monocyte and macrophage heterogeneity has been described first in humans and then more
recently in mice, and implicated in pathologies such as cancer, diabetes, arthritis, obesity,
atherosclerosis, infection, and neural injury (David and Kroner, 2011; Flavell et al., 2010;
Shi and Pamer, 2011; Sica and Mantovani, 2012; Woollard and Geissmann, 2010). M1 and
“alternatively activated” anti-inflammatory (M2) macrophages are commonly identified
based on expression of cell surface markers, such as CD14 and CD16 in humans and Ly6C,
CX3CR1 and CCR2 in mice (Geissmann et al., 2003; Gordon and Taylor, 2005). Monocyte-
derived M1 macrophages are rapidly recruited to injured tissues via CCL2 and primarily
involved in inflammation, proteolysis, and phagocytosis (Nahrendorf et al., 2007). M2
macrophages respond to a different chemokine, CX3CL1, and are implicated in both
immune surveillance and the healing process (Nahrendorf et al., 2007). In the mouse spinal
cord, like in the peripheral nerve, M1 and M2 are successively recruited at sites of injury
91
(Kigerl et al., 2009; Nadeau et al., 2011; Thawer et al., 2013). In line with their reported
effects in injured peripheral tissues, M1 macrophages present in the injured spinal cord
produce proinflammatory mediators and are neurotoxic when co-cultured with primary
neurons, whereas M2 macrophages have axon growth-promoting effects (Kigerl et al.,
2009). An in vivo demonstration that M1 macrophages can kill neurons and contribute to
secondary damage after SCI is however lacking, mainly because there is still no way to
deplete these cells specifically. Likewise for the in vivo role of M2 macrophages, but the
recent demonstration that mice lacking Nr4a (Nur77) developed fewer M2 monocytes and
macrophages may enable such work to be performed in the future (Hanna et al., 2011;
Hanna et al., 2012). Another way to investigate the role of the latter cell subset could be
using the cell depletion method recently developed by Miron et al. (Miron et al., 2013). The
method is based on the concept that phagocytosis of clodronate-containing liposomes will
induce apoptosis and relies on the accuracy of mannosylated clodronate liposomes that
specifically bind the mannose receptor, also called CD206, a receptor whose expression is
strongly upregulated after M2 polarization (Gordon, 2003; Martinez et al., 2006). Using
this depletion strategy, Miron et al. unveiled that M2 macrophages/microglia are important
for OL differentiation and remyelination (Miron et al., 2013). In the meantime, the closest a
study has come to a direct assessment of the role of M1 macrophages in SCI is by depleting
these cells in vivo by injection of liposome-encapsulated clodronate (Lee et al., 2011;
Popovich et al., 1999). The study by Lee et al. demonstrated that preventing the recruitment
of both neutrophils and monocytes, but not neutrophils or monocytes alone, is beneficial for
functional recovery following SCI in mice (Lee et al., 2011). In contrast, in the study by
Popovich et al., macrophage depletion alone was found sufficient to reduce spinal cord
tissue damage and promote partial recovery of hindlimb function in SCI rats (Popovich et
al., 1999). Thus, species differences might exist and could explain the need for dual
depletion in mice. Combined with our earlier results showing that neutrophils and
monocyte-derived M1 macrophages are recruited in the injured mouse spinal cord and
peripheral nerve via a common signalling pathway (i.e. IL-1R1) (Nadeau et al., 2011;
Pineau et al., 2010), these findings suggest a great level of redundant functions between
these two populations of innate immune cells at least in mice.
92
Aside from their role in inflammation, recent SCI studies have attributed to Gr1+
(Ly6G/Ly6C+) neutrophils and macrophages an important function in a variety of
biological processes ranging from angiogenesis to wound healing and scar formation
(Shechter et al., 2009; Shechter et al., 2011; Stirling et al., 2009). It thus appears that the
role of innate immune cells is more complex than previously thought and may also
contribute to recovery. One finding shared by all these studies is the demonstration that the
specialized functions of neutrophils and macrophages are dictated by cytokines present in
the SCI environment. In return, the cytokines produced by activated immune cells can
regulate a variety of subsequent cell responses, including inflammation and immunity,
BBB/BSCB maintenance and integrity, glial scar formation, demyelination and
remyelination, and even neural cell death (see Table 2.1). We believe that this concept of
heterogeneity in phenotype and function in the injured nervous system does not only apply
to monocytes/macrophages, but also to neutrophils which are far more plastic than
previously thought (for review, (Beyrau et al., 2012)). Recent work emerging from the
cancer field has shown that neutrophils can be polarized towards a proinflammatory (N1) or
anti-inflammatory (N2) phenotype, depending on the expression of TGF-ß1 (Fridlender et
al., 2009). The existence of different neutrophil subsets had previously been reported in
various infection models (Tsuda et al., 2004), and has since been confirmed in several
different systemic inflammatory diseases (Denny et al., 2010; Pillay et al., 2012; Pillay et
al., 2010). Whether N1 and N2 neutrophils can be found in the injured spinal cord and
peripheral nerve remains an open question. The future identification of specific markers for
the distinct populations of neutrophils will help answer these questions, and help study their
role in secondary damage, scarring, regeneration and repair.
2.6. Differences between the injured spinal cord and peripheral nerve It is interesting to note that, although the cells that reside in the normal spinal cord are to a
large extent different from those of peripheral nerves, the temporal pattern of cytokine
production and innate immune cell infiltration in these two systems is remarkably similar,
at least during the first week of injury (Boivin et al., 2007; de Rivero Vaccari et al., 2012;
Donnelly et al., 2011; Nadeau et al., 2011; Pineau and Lacroix, 2007; Stirling and Yong,
93
2008; Thawer et al., 2013). Assuming that excessive inflammation is one of the leading
causes of secondary damage after neural injury, it may come as a surprise that inhibition of
key proinflammatory cytokine pathways or depletion of innate immune CD11b+ cells has
been repeatedly demonstrated to reduce repair and recovery after peripheral nerve injury
(Barrette et al., 2008; Boivin et al., 2007; Nadeau et al., 2011). We are therefore led to ask
why an apparently similar inflammatory response would be detrimental in the injured
spinal cord, but beneficial in the injured peripheral nerve.
Following injury, severed proximal segments of axons that remain connected to their cell
bodies retract over hundreds of micrometers (~300 µm on average) in a process referred to
as “axonal dieback” or acute axonal degeneration (AAD) (Kerschensteiner et al., 2005).
Axonal dieback is commonly observed in both the injured CNS and PNS and mediated by
two distinct mechanisms. The initial phase of dieback occurs within 30 minutes of the
axonal injury (Kerschensteiner et al., 2005; Knoferle et al., 2010), a rapid time-course that
precedes the infiltration of circulating neutrophils and proinflammatory M1 monocytes and
which thus suggests it is regulated by intrinsic neuronal mechanisms. This was confirmed
by the demonstration that blocking calcium (Ca2+) release from intra-axonal Ca2+ stores or
inhibiting calcium-dependant proteases such as calpain prevents AAD in the injured spinal
cord and optic nerve (Kerschensteiner et al., 2005; Knoferle et al., 2010; Stirling et al.,
2014). The initial phase of AAD is followed by a delayed slow phase of axonal dieback
mediated by macrophages infiltrating sites of injury and occurring between days 2-4 and 28
post-lesion (Busch et al., 2009; Horn et al., 2008), thus supporting once again the concept
that macrophages are playing an active role in various forms of secondary damage.
Whether microglia contribute to SCI-induced axonal dieback is currently being debated,
with recent IVM studies in favour and against this idea (Evans et al., 2014; Stirling et al.,
2013). Stimulation of microglia with the TLR2-specific agonist Pam2CSK4, but not
zymosan, induced a protective mixed M1/M2 phenotype in microglia, which was
associated with a reduction in secondary bystander damage to axons that were originally
spared by the initial laser-induced SCI (Stirling et al., 2013). Accordingly, TLR2-KO mice
exhibited greater axonal dieback than control mice after laser-induced SCI and mildly
reduced functional recovery after contusion SCI (Kigerl et al., 2007; Stirling et al., 2013).
94
This is in contrast to the situation occurring in the injured peripheral nerve where
deficiency in TLR2 signalling was found to delay myelin debris clearance, axonal
regeneration and recovery of locomotor function (Boivin et al., 2007). The differences in
cell types present in each of these tissues could explain these different outcomes, taking
into account that microglia and Schwann cells, for example, express high levels of TLRs
such TLR2 (Babcock et al., 2006; Karanth et al., 2006; Lee et al., 2006).
Neutrophils and M1 macrophages are considered to be toxic for neurons (Allen et al., 2012;
Geremia et al., 2012; Kigerl et al., 2009; Lee et al., 2011). We find it particularly
interesting that the initial phase of axon retraction precedes the infiltration of neutrophils
and monocyte-derived M1 macrophages (CD45+ CD11b+ 7/4+ Ly-6Chi Ly-6G- cells), a
process that begins at around 6-12 hours post-injury (Nadeau et al., 2011; Pineau et al.,
2010; Stirling and Yong, 2008). It is also intriguing that these two cell types have almost
completely disappeared from the injured spinal cord and peripheral nerve at 3-4 days
(Nadeau et al., 2011; Pineau et al., 2010; Stirling and Yong, 2008). Three to 4 days post-
injury is the time at which macrophages found at sites of neurodegeneration start to express
genes and markers associated with pro-regenerative, anti-inflammatory M2-phenotype such
as arginase-1 and CD206 (Kigerl et al., 2009; Nadeau et al., 2011). It is also the time at
which peripheral nerve axons begin their attempt to regenerate across the injury site (Fu
and Gordon, 1997). However, for an unexplained reason, the expression of M2 genes and
protein markers is only transient after SCI and rapidly returns to preinjury levels by 7 days.
In contrast, the expression of M1-related genes (e.g., CD16, CD32, CD86) is maintained, as
such that after 28 days only M1 macrophages persist at sites of SCI (Kigerl et al., 2009). It
has been proposed that the predominance of M1 macrophages and almost complete absence
of M2 macrophages at sites of SCI could cause chronic inflammation, thus leading to
secondary damage. This scenario is in contrast to what is thought to occur in the injured
PNS, where it has been assumed that the expression of proinflammatory markers is rapidly
decreased and stay decreased chronically. However, a formal demonstration of this is still
lacking. This supposition, if true, could be explained by the increased expression of
immunosuppressive cytokines such as TGF-ß1 and IL-10, which were both found to be
upregulated in the peripheral nerve but not in the spinal cord after injury (Be'eri et al.,
95
1998; Perrin et al., 2005). Other than cytokines, and as suggested by observations made in
vitro and in vivo in the multiple sclerosis brain, the phagocytosis of myelin debris could be
the factor conferring anti-inflammatory function (Boven et al., 2006). This would mean that
the persistent expression of anti-inflammatory cytokines in the injured PNS is a direct
consequence of the latter response, not the cause. This brings another question to mind:
whether the long-lasting presence of M2 macrophages throughout the peripheral nerve
distal stump is the main reason why regeneration is more efficient in the PNS than CNS?
The inhibitory influences of myelin debris persist for prolonged periods in the CNS and
prevent axon regeneration. As explained above, this difference in the time required for
myelin clearance in the CNS compared to the PNS may be due to differences in the
immune response. The Rotshenker laboratory has established a strong correlation between
the magnitude and timing of cytokine production and the initiation and progression of WD,
and found that mice with abnormally slow WD express reduced levels of IL-1ß and TNF
(Be'eri et al., 1998; Shamash et al., 2002). Together with a previous study that showed that
microglia/macrophage activation is compromised in mice carrying a mutation that causes
delayed WD (Fujiki et al., 1996), these findings highlight the crucial role that cytokines
may play in immune cell activation/recruitment, WD, and myelin clearance. This idea is
further supported by our data showing that recruitment of innate immune cells and
functional recovery after sciatic nerve lesion are impaired in the absence of IL-1ß and TNF
(Nadeau et al., 2011). The entry of blood-derived immune cells into restricted areas of the
injured spinal cord, mostly limited to the core of the lesion, further suggests the possibility
that production and/or release of proinflammatory cytokine expression may be defective in
degenerating white matter tracts after SCI. Interestingly, injecting recombinant IL-1ß or
CCL2 and MIP-1α into the injured mouse dorsal column triggered macrophage/microglial
activation and myelin clearance. Neutralizing the same three cytokines/chemokines in the
lesioned sciatic nerve via the administration of function-blocking antibodies suppressed the
clearance of inhibitory myelin debris (Perrin et al., 2005). Taken together, these studies
suggest that changes in the immune responses, which are dictated by the nature of the
cytokines produced in the inflamed tissue, may explain the different responses to injury
between the CNS and PNS.
96
2.7. Conclusion In the recent years, we have learned a great deal about the complexity and heterogeneity of
the immune cell response. We now know that immune cells are remarkably plastic and can
be polarized towards different functional phenotypes depending on the cytokines and other
signals (e.g. DAMPs, PAMPs) present in their immediate environment. This has been
interpreted as indicating of the existence of different subsets of immune cells, playing a role
in immune regulation, host defence and wound healing. We have also learnt that microglia
are ontogenetically distinct from monocyte-derived macrophages, and that they are highly
dynamic (rather than quiescent) and plastic. This new knowledge has enabled us to address
key gaps in neuroimmunology, and to explain some of the discrepancies in results in the
SCI field that had remained unexplained until recently. As knowledge and technology is
evolving rapidly, it can be expected in years to come that the identification of the
endogenous signals regulating immune cell phenotype and function will allow the creation
of novel approaches to either trace/image, selectively deplete or manipulate/target immune
cells more specifically. It is expected that these advancements will eventually lead to the
development of therapeutics aimed at regulating the entry of potentially harmful immune
cells into the CNS or the activation these cell types to promote neuroprotective and
regenerative effects. In this regard, anti-cytokines therapies seem particularly promising to
achieve this goal.
2.8. Acknowledments The work leading to this review was supported by grants from the Canadian Institutes of
Health Research (Grant number MOP-84558), International Foundation for Research in
Paraplegia (Project number P97), and Wings for Life Spinal Cord Research Foundation
(Project number 48, Contract number WFL-CA-006/11) to S.L. Both D.B. and S.L. are
supported by the Fonds de la recherche en santé du Québec. We thank Nicolas Vallières,
Nadia Fortin and Martine Lessard for their invaluable technical assistance. The authors
would also like to thank Dr. Manu Rangachari for his critical review of this manuscript.
97
2.9. References Ackery, A., Robins, S., Fehlings, M.G., 2006. Inhibition of Fas-mediated apoptosis through
administration of soluble Fas receptor improves functional outcome and reduces
posttraumatic axonal degeneration after acute spinal cord injury. J Neurotrauma 23, 604-
616.
Adachi, O., Kawai, T., Takeda, K., Matsumoto, M., Tsutsui, H., Sakagami, M., Nakanishi,
K., Akira, S., 1998. Targeted disruption of the MyD88 gene results in loss of IL-1- and
IL-18-mediated function. Immunity 9, 143-150.
Afonina, I.S., Tynan, G.A., Logue, S.E., Cullen, S.P., Bots, M., Luthi, A.U., Reeves, E.P.,
McElvaney, N.G., Medema, J.P., Lavelle, E.C., Martin, S.J., 2011. Granzyme B-
dependent proteolysis acts as a switch to enhance the proinflammatory activity of IL-
1alpha. Mol Cell 44, 265-278.
Akhurst, R.J., 2006. Large- and small-molecule inhibitors of transforming growth factor-
beta signaling. Curr Opin Investig Drugs 7, 513-521.
Akhurst, R.J., Hata, A., 2012. Targeting the TGFbeta signalling pathway in disease. Nat
Rev Drug Discov 11, 790-811.
Allan, S.M., Rothwell, N.J., 2001. Cytokines and acute neurodegeneration. Nat Rev
Neurosci 2, 734-744.
Allan, S.M., Tyrrell, P.J., Rothwell, N.J., 2005. Interleukin-1 and neuronal injury. Nat Rev
Immunol 5, 629-640.
Allen, C., Thornton, P., Denes, A., McColl, B.W., Pierozynski, A., Monestier, M.,
Pinteaux, E., Rothwell, N.J., Allan, S.M., 2012. Neutrophil cerebrovascular
98
transmigration triggers rapid neurotoxicity through release of proteases associated with
decondensed DNA. J Immunol 189, 381-392.
Andre, R., Pinteaux, E., Kimber, I., Rothwell, N.J., 2005. Differential actions of IL-1 alpha
and IL-1 beta in glial cells share common IL-1 signalling pathways. Neuroreport 16,
153-157.
Anforth, H.R., Bluthe, R.M., Bristow, A., Hopkins, S., Lenczowski, M.J., Luheshi, G.,
Lundkvist, J., Michaud, B., Mistry, Y., Van Dam, A.M., Zhen, C., Dantzer, R., Poole,
S., Rothwell, N.J., Tilders, F.J., Wollman, E.E., 1998. Biological activity and brain
actions of recombinant rat interleukin-1alpha and interleukin-1beta. Eur Cytokine Netw
9, 279-288.
Arend, W.P., Palmer, G., Gabay, C., 2008. IL-1, IL-18, and IL-33 families of cytokines.
Immunol Rev 223, 20-38.
Attwell, D., Buchan, A.M., Charpak, S., Lauritzen, M., Macvicar, B.A., Newman, E.A.,
2010. Glial and neuronal control of brain blood flow. Nature 468, 232-243.
Babcock, A.A., Wirenfeldt, M., Holm, T., Nielsen, H.H., Dissing-Olesen, L., Toft-Hansen,
H., Millward, J.M., Landmann, R., Rivest, S., Finsen, B., Owens, T., 2006. Toll-like
receptor 2 signaling in response to brain injury: an innate bridge to neuroinflammation. J
Neurosci 26, 12826-12837.
Balasingam, V., Yong, V.W., 1996. Attenuation of astroglial reactivity by interleukin-10. J
Neurosci 16, 2945-2955.
Balentine, J.D., 1978. Pathology of experimental spinal cord trauma. I. The necrotic lesion
as a function of vascular injury. Lab Invest 39, 236-253.
99
Bao, F., Liu, D., 2004. Hydroxyl radicals generated in the rat spinal cord at the level
produced by impact injury induce cell death by necrosis and apoptosis: protection by a
metalloporphyrin. Neuroscience 126, 285-295.
Barres, B.A., Schmid, R., Sendnter, M., Raff, M.C., 1993. Multiple extracellular signals are
required for long-term oligodendrocyte survival. Development 118, 283-295.
Barrette, B., Hebert, M.A., Filali, M., Lafortune, K., Vallieres, N., Gowing, G., Julien, J.P.,
Lacroix, S., 2008. Requirement of myeloid cells for axon regeneration. J Neurosci 28,
9363-9376.
Bartanusz, V., Jezova, D., Alajajian, B., Digicaylioglu, M., 2011. The blood-spinal cord
barrier: morphology and clinical implications. Ann Neurol 70, 194-206.
Bartholdi, D., Schwab, M.E., 1997. Expression of pro-inflammatory cytokine and
chemokine mRNA upon experimental spinal cord injury in mouse: an in situ
hybridization study. Eur J Neurosci 9, 1422-1438.
Basu, A., Krady, J.K., Enterline, J.R., Levison, S.W., 2002a. Transforming growth factor
beta1 prevents IL-1beta-induced microglial activation, whereas TNFalpha- and IL-6-
stimulated activation are not antagonized. Glia 40, 109-120.
Basu, A., Krady, J.K., Levison, S.W., 2004. Interleukin-1: a master regulator of
neuroinflammation. J Neurosci Res 78, 151-156.
Basu, A., Krady, J.K., O'Malley, M., Styren, S.D., DeKosky, S.T., Levison, S.W., 2002b.
The type 1 interleukin-1 receptor is essential for the efficient activation of microglia and
the induction of multiple proinflammatory mediators in response to brain injury. J
Neurosci 22, 6071-6082.
100
Be'eri, H., Reichert, F., Saada, A., Rotshenker, S., 1998. The cytokine network of wallerian
degeneration: IL-10 and GM-CSF. Eur J Neurosci 10, 2707-2713.
Beck, K.D., Nguyen, H.X., Galvan, M.D., Salazar, D.L., Woodruff, T.M., Anderson, A.J.,
2010. Quantitative analysis of cellular inflammation after traumatic spinal cord injury:
evidence for a multiphasic inflammatory response in the acute to chronic environment.
Brain 133, 433-447.
Bedard, A., Tremblay, P., Chernomoretz, A., Vallieres, L., 2007. Identification of genes
preferentially expressed by microglia and upregulated during cuprizone-induced
inflammation. Glia 55, 777-789.
Benton, R.L., Maddie, M.A., Minnillo, D.R., Hagg, T., Whittemore, S.R., 2008. Griffonia
simplicifolia isolectin B4 identifies a specific subpopulation of angiogenic blood vessels
following contusive spinal cord injury in the adult mouse. J Comp Neurol 507, 1031-
1052.
Bethea, J.R., Nagashima, H., Acosta, M.C., Briceno, C., Gomez, F., Marcillo, A.E., Loor,
K., Green, J., Dietrich, W.D., 1999. Systemically administered interleukin-10 reduces
tumor necrosis factor-alpha production and significantly improves functional recovery
following traumatic spinal cord injury in rats. J Neurotrauma 16, 851-863.
Beyrau, M., Bodkin, J.V., Nourshargh, S., 2012. Neutrophil heterogeneity in health and
disease: a revitalized avenue in inflammation and immunity. Open Biol 2, 120134.
Blight, A.R., 1985. Delayed demyelination and macrophage invasion: a candidate for
secondary cell damage in spinal cord injury. Cent Nerv Syst Trauma 2, 299-315.
Blight, A.R., 1994. Effects of silica on the outcome from experimental spinal cord injury:
implication of macrophages in secondary tissue damage. Neuroscience 60, 263-273.
101
Boivin, A., Pineau, I., Barrette, B., Filali, M., Vallieres, N., Rivest, S., Lacroix, S., 2007.
Toll-like receptor signaling is critical for Wallerian degeneration and functional
recovery after peripheral nerve injury. J Neurosci 27, 12565-12576.
Boutin, H., LeFeuvre, R.A., Horai, R., Asano, M., Iwakura, Y., Rothwell, N.J., 2001. Role
of IL-1alpha and IL-1beta in ischemic brain damage. J Neurosci 21, 5528-5534.
Boven, L.A., Van Meurs, M., Van Zwam, M., Wierenga-Wolf, A., Hintzen, R.Q., Boot,
R.G., Aerts, J.M., Amor, S., Nieuwenhuis, E.E., Laman, J.D., 2006. Myelin-laden
macrophages are anti-inflammatory, consistent with foam cells in multiple sclerosis.
Brain 129, 517-526.
Bradke, F., Fawcett, J.W., Spira, M.E., 2012. Assembly of a new growth cone after
axotomy: the precursor to axon regeneration. Nat Rev Neurosci 13, 183-193.
Brambilla, R., Bracchi-Ricard, V., Hu, W.H., Frydel, B., Bramwell, A., Karmally, S.,
Green, E.J., Bethea, J.R., 2005. Inhibition of astroglial nuclear factor kappaB reduces
inflammation and improves functional recovery after spinal cord injury. J Exp Med 202,
145-156.
Brambilla, R., Hurtado, A., Persaud, T., Esham, K., Pearse, D.D., Oudega, M., Bethea, J.R.,
2009. Transgenic inhibition of astroglial NF-kappaB leads to increased axonal sparing
and sprouting following spinal cord injury. J Neurochem 110, 765-778.
Brewer, K.L., Bethea, J.R., Yezierski, R.P., 1999. Neuroprotective effects of interleukin-10
following excitotoxic spinal cord injury. Exp Neurol 159, 484-493.
Broughton, B.R., Reutens, D.C., Sobey, C.G., 2009. Apoptotic mechanisms after cerebral
ischemia. Stroke 40, e331-339.
102
Bruce, A.J., Boling, W., Kindy, M.S., Peschon, J., Kraemer, P.J., Carpenter, M.K.,
Holtsberg, F.W., Mattson, M.P., 1996. Altered neuronal and microglial responses to
excitotoxic and ischemic brain injury in mice lacking TNF receptors. Nat Med 2, 788-
794.
Burda, J.E., Sofroniew, M.V., 2014. Reactive gliosis and the multicellular response to CNS
damage and disease. Neuron 81, 229-248.
Buryskova, M., Pospisek, M., Grothey, A., Simmet, T., Burysek, L., 2004. Intracellular
interleukin-1alpha functionally interacts with histone acetyltransferase complexes. J Biol
Chem 279, 4017-4026.
Busch, S.A., Horn, K.P., Silver, D.J., Silver, J., 2009. Overcoming macrophage-mediated
axonal dieback following CNS injury. J Neurosci 29, 9967-9976.
Buss, A., Pech, K., Kakulas, B.A., Martin, D., Schoenen, J., Noth, J., Brook, G.A., 2008.
TGF-beta1 and TGF-beta2 expression after traumatic human spinal cord injury. Spinal
Cord 46, 364-371.
Cabal-Hierro, L., Lazo, P.S., 2012. Signal transduction by tumor necrosis factor receptors.
Cell Signal 24, 1297-1305.
Cafferty, W.B., Gardiner, N.J., Das, P., Qiu, J., McMahon, S.B., Thompson, S.W., 2004.
Conditioning injury-induced spinal axon regeneration fails in interleukin-6 knock-out
mice. J Neurosci 24, 4432-4443.
Cao, Z., Gao, Y., Bryson, J.B., Hou, J., Chaudhry, N., Siddiq, M., Martinez, J., Spencer, T.,
Carmel, J., Hart, R.B., Filbin, M.T., 2006. The cytokine interleukin-6 is sufficient but
not necessary to mimic the peripheral conditioning lesion effect on axonal growth. J
Neurosci 26, 5565-5573.
103
Carruth, L.M., Demczuk, S., Mizel, S.B., 1991. Involvement of a calpain-like protease in
the processing of the murine interleukin 1 alpha precursor. J Biol Chem 266, 12162-
12167.
Casella, G.T., Bunge, M.B., Wood, P.M., 2006. Endothelial cell loss is not a major cause of
neuronal and glial cell death following contusion injury of the spinal cord. Exp Neurol
202, 8-20.
Casha, S., Yu, W.R., Fehlings, M.G., 2001. Oligodendroglial apoptosis occurs along
degenerating axons and is associated with FAS and p75 expression following spinal cord
injury in the rat. Neuroscience 103, 203-218.
Casha, S., Yu, W.R., Fehlings, M.G., 2005. FAS deficiency reduces apoptosis, spares axons
and improves function after spinal cord injury. Exp Neurol 196, 390-400.
Chan, J.K., Roth, J., Oppenheim, J.J., Tracey, K.J., Vogl, T., Feldmann, M., Horwood, N.,
Nanchahal, J., 2012. Alarmins: awaiting a clinical response. J Clin Invest 122, 2711-
2719.
Chen, C.J., Kono, H., Golenbock, D., Reed, G., Akira, S., Rock, K.L., 2007. Identification
of a key pathway required for the sterile inflammatory response triggered by dying cells.
Nat Med 13, 851-856.
Chen, K.B., Uchida, K., Nakajima, H., Yayama, T., Hirai, T., Watanabe, S., Guerrero,
A.R., Kobayashi, S., Ma, W.Y., Liu, S.Y., Baba, H., 2011. Tumor necrosis factor-alpha
antagonist reduces apoptosis of neurons and oligodendroglia in rat spinal cord injury.
Spine (Phila Pa 1976) 36, 1350-1358.
104
Chi, L.Y., Yu, J., Zhu, H., Li, X.G., Zhu, S.G., Kindy, M.S., 2008. The dual role of tumor
necrosis factor-alpha in the pathophysiology of spinal cord injury. Neurosci Lett 438,
174-179.
Cohen, I., Rider, P., Carmi, Y., Braiman, A., Dotan, S., White, M.R., Voronov, E., Martin,
M.U., Dinarello, C.A., Apte, R.N., 2010. Differential release of chromatin-bound IL-
1alpha discriminates between necrotic and apoptotic cell death by the ability to induce
sterile inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A 107, 2574-2579.
Cregg, J.M., Depaul, M.A., Filous, A.R., Lang, B.T., Tran, A., Silver, J., 2014. Functional
regeneration beyond the glial scar. Exp Neurol 253C, 197-207.
Crowe, M.J., Bresnahan, J.C., Shuman, S.L., Masters, J.N., Beattie, M.S., 1997. Apoptosis
and delayed degeneration after spinal cord injury in rats and monkeys. Nat Med 3, 73-
76.
Davalos, D., Grutzendler, J., Yang, G., Kim, J.V., Zuo, Y., Jung, S., Littman, D.R., Dustin,
M.L., Gan, W.B., 2005. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in
vivo. Nat Neurosci 8, 752-758.
Davalos, D., Ryu, J.K., Merlini, M., Baeten, K.M., Le Moan, N., Petersen, M.A., Deerinck,
T.J., Smirnoff, D.S., Bedard, C., Hakozaki, H., Gonias Murray, S., Ling, J.B., Lassmann,
H., Degen, J.L., Ellisman, M.H., Akassoglou, K., 2012. Fibrinogen-induced perivascular
microglial clustering is required for the development of axonal damage in
neuroinflammation. Nat Commun 3, 1227.
David, S., Aguayo, A.J., 1981. Axonal elongation into peripheral nervous system "bridges"
after central nervous system injury in adult rats. Science 214, 931-933.
105
David, S., Kroner, A., 2011. Repertoire of microglial and macrophage responses after
spinal cord injury. Nat Rev Neurosci 12, 388-399.
David, S., Lacroix, S., 2005. Role of the Immune Response in Tissue Damage and Repair
in the Injured Spinal Cord, in: Antel, J., Birnbaum, G., Hartung, H.P., Vincent, A.
(Eds.), Clinical Neuroimmunology, Second edition ed. Oxford University press, New
York, pp. 53-63.
de Rivero Vaccari, J.P., Bastien, D., Yurcisin, G., Pineau, I., Dietrich, W.D., De Koninck,
Y., Keane, R.W., Lacroix, S., 2012. P2X4 receptors influence inflammasome activation
following spinal cord injury. J Neurosci 32, 3058-3066.
de Rivero Vaccari, J.P., Lotocki, G., Marcillo, A.E., Dietrich, W.D., Keane, R.W., 2008. A
molecular platform in neurons regulates inflammation after spinal cord injury. J
Neurosci 28, 3404-3414.
Denny, M.F., Yalavarthi, S., Zhao, W., Thacker, S.G., Anderson, M., Sandy, A.R.,
McCune, W.J., Kaplan, M.J., 2010. A distinct subset of proinflammatory neutrophils
isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and
synthesizes type I IFNs. J Immunol 184, 3284-3297.
Dibaj, P., Nadrigny, F., Steffens, H., Scheller, A., Hirrlinger, J., Schomburg, E.D., Neusch,
C., Kirchhoff, F., 2010. NO mediates microglial response to acute spinal cord injury
under ATP control in vivo. Glia 58, 1133-1144.
Dibaj, P., Steffens, H., Zschuntzsch, J., Nadrigny, F., Schomburg, E.D., Kirchhoff, F.,
Neusch, C., 2011. In Vivo imaging reveals distinct inflammatory activity of CNS
microglia versus PNS macrophages in a mouse model for ALS. PLoS One 6, e17910.
Dinarello, C.A., 1991. Interleukin-1 and interleukin-1 antagonism. Blood 77, 1627-1652.
106
Dinarello, C.A., 2009. Immunological and inflammatory functions of the interleukin-1
family. Annu Rev Immunol 27, 519-550.
Dinarello, C.A., 2011. Interleukin-1 in the pathogenesis and treatment of inflammatory
diseases. Blood 117, 3720-3732.
Dinarello, C.A., Simon, A., van der Meer, J.W., 2012. Treating inflammation by blocking
interleukin-1 in a broad spectrum of diseases. Nat Rev Drug Discov 11, 633-652.
Dohrmann, G.J., Wagner, F.C., Jr., Bucy, P.C., 1971. The microvasculature in transitory
traumatic paraplegia. An electron microscopic study in the monkey. J Neurosurg 35,
263-271.
Donnelly, D.J., Longbrake, E.E., Shawler, T.M., Kigerl, K.A., Lai, W., Tovar, C.A.,
Ransohoff, R.M., Popovich, P.G., 2011. Deficient CX3CR1 signaling promotes recovery
after mouse spinal cord injury by limiting the recruitment and activation of
Ly6Clo/iNOS+ macrophages. J Neurosci 31, 9910-9922.
Donnelly, D.J., Popovich, P.G., 2008. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal
regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Exp Neurol 209, 378-388.
Dray, C., Rougon, G., Debarbieux, F., 2009. Quantitative analysis by in vivo imaging of
the dynamics of vascular and axonal networks in injured mouse spinal cord. Proc Natl
Acad Sci U S A 106, 9459-9464.
Eigenbrod, T., Park, J.H., Harder, J., Iwakura, Y., Nunez, G., 2008. Cutting edge: critical
role for mesothelial cells in necrosis-induced inflammation through the recognition of
IL-1 alpha released from dying cells. J Immunol 181, 8194-8198.
Evans, T.A., Barkauskas, D.S., Myers, J., Hare, E.G., You, J., Ransohoff, R.M., Huang,
A.Y., Silver, J., 2014. High-resolution intravital imaging reveals that blood-derived
107
macrophages but not resident microglia facilitate secondary axonal dieback in traumatic
spinal cord injury. Exp Neurol.
Farrar, M.J., Bernstein, I.M., Schlafer, D.H., Cleland, T.A., Fetcho, J.R., Schaffer, C.B.,
2012. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber.
Nat Methods.
Fassbender, J.M., Whittemore, S.R., Hagg, T., 2011. Targeting microvasculature for
neuroprotection after SCI. Neurotherapeutics 8, 240-251.
Faulkner, J.R., Herrmann, J.E., Woo, M.J., Tansey, K.E., Doan, N.B., Sofroniew, M.V.,
2004. Reactive astrocytes protect tissue and preserve function after spinal cord injury. J
Neurosci 24, 2143-2155.
Fenrich, K.K., Weber, P., Hocine, M., Zalc, M., Rougon, G., Debarbieux, F., 2012. Long-
term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular
resolution using implanted glass windows. J Physiol 590, 3665-3675.
Fernandez-Valle, C., Bunge, R.P., Bunge, M.B., 1995. Schwann cells degrade myelin and
proliferate in the absence of macrophages: evidence from in vitro studies of Wallerian
degeneration. J Neurocytol 24, 667-679.
Fiorentino, D.F., Bond, M.W., Mosmann, T.R., 1989. Two types of mouse T helper cell.
IV. Th2 clones secrete a factor that inhibits cytokine production by Th1 clones. J Exp
Med 170, 2081-2095.
Flavell, R.A., Sanjabi, S., Wrzesinski, S.H., Licona-Limon, P., 2010. The polarization of
immune cells in the tumour environment by TGFbeta. Nat Rev Immunol 10, 554-567.
108
Fleming, J.C., Norenberg, M.D., Ramsay, D.A., Dekaban, G.A., Marcillo, A.E., Saenz,
A.D., Pasquale-Styles, M., Dietrich, W.D., Weaver, L.C., 2006. The cellular
inflammatory response in human spinal cords after injury. Brain 129, 3249-3269.
Franchi, L., Eigenbrod, T., Munoz-Planillo, R., Nunez, G., 2009. The inflammasome: a
caspase-1-activation platform that regulates immune responses and disease pathogenesis.
Nat Immunol 10, 241-247.
Fridlender, Z.G., Sun, J., Kim, S., Kapoor, V., Cheng, G., Ling, L., Worthen, G.S., Albelda,
S.M., 2009. Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-beta: "N1"
versus "N2" TAN. Cancer Cell 16, 183-194.
Fu, S.Y., Gordon, T., 1997. The cellular and molecular basis of peripheral nerve
regeneration. Mol Neurobiol 14, 67-116.
Fuchs, A.C., Granowitz, E.V., Shapiro, L., Vannier, E., Lonnemann, G., Angel, J.B.,
Kennedy, J.S., Rabson, A.R., Radwanski, E., Affrime, M.B., Cutler, D.L., Grint, P.C.,
Dinarello, C.A., 1996. Clinical, hematologic, and immunologic effects of interleukin-10
in humans. J Clin Immunol 16, 291-303.
Fujiki, M., Zhang, Z., Guth, L., Steward, O., 1996. Genetic influences on cellular reactions
to spinal cord injury: activation of macrophages/microglia and astrocytes is delayed in
mice carrying a mutation (WldS) that causes delayed Wallerian degeneration. J Comp
Neurol 371, 469-484.
Geissmann, F., Jung, S., Littman, D.R., 2003. Blood monocytes consist of two principal
subsets with distinct migratory properties. Immunity 19, 71-82.
Genovese, T., Esposito, E., Mazzon, E., Di Paola, R., Caminiti, R., Bramanti, P.,
Cappelani, A., Cuzzocrea, S., 2009. Absence of endogenous interleukin-10 enhances
109
secondary inflammatory process after spinal cord compression injury in mice. J
Neurochem 108, 1360-1372.
Genovese, T., Mazzon, E., Crisafulli, C., Di Paola, R., Muia, C., Esposito, E., Bramanti, P.,
Cuzzocrea, S., 2008. TNF-alpha blockage in a mouse model of SCI: evidence for
improved outcome. Shock 29, 32-41.
George, R., Griffin, J.W., 1994. Delayed macrophage responses and myelin clearance
during Wallerian degeneration in the central nervous system: the dorsal radiculotomy
model. Exp Neurol 129, 225-236.
Geremia, N.M., Bao, F., Rosenzweig, T.E., Hryciw, T., Weaver, L., Dekaban, G.A.,
Brown, A., 2012. CD11d Antibody Treatment Improves Recovery in Spinal Cord-
Injured Mice. J Neurotrauma 29, 539-550.
Ghayur, T., Banerjee, S., Hugunin, M., Butler, D., Herzog, L., Carter, A., Quintal, L.,
Sekut, L., Talanian, R., Paskind, M., Wong, W., Kamen, R., Tracey, D., Allen, H., 1997.
Caspase-1 processes IFN-gamma-inducing factor and regulates LPS-induced IFN-
gamma production. Nature 386, 619-623.
Ginhoux, F., Greter, M., Leboeuf, M., Nandi, S., See, P., Gokhan, S., Mehler, M.F.,
Conway, S.J., Ng, L.G., Stanley, E.R., Samokhvalov, I.M., Merad, M., 2010. Fate
mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages.
Science 330, 841-845.
Gordon, S., 2003. Alternative activation of macrophages. Nat Rev Immunol 3, 23-35.
Gordon, S., Taylor, P.R., 2005. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat Rev
Immunol 5, 953-964.
110
Graves, B.J., Hatada, M.H., Hendrickson, W.A., Miller, J.K., Madison, V.S., Satow, Y.,
1990. Structure of interleukin 1 alpha at 2.7-A resolution. Biochemistry 29, 2679-2684.
Gray, M., Palispis, W., Popovich, P.G., van Rooijen, N., Gupta, R., 2007. Macrophage
depletion alters the blood-nerve barrier without affecting Schwann cell function after
neural injury. J Neurosci Res 85, 766-777.
Greenhalgh, A.D., Galea, J., Denes, A., Tyrrell, P.J., Rothwell, N.J., 2010. Rapid brain
penetration of interleukin-1 receptor antagonist in rat cerebral ischaemia:
pharmacokinetics, distribution, protection. Br J Pharmacol 160, 153-159.
Grossman, S.D., Rosenberg, L.J., Wrathall, J.R., 2001. Temporal-spatial pattern of acute
neuronal and glial loss after spinal cord contusion. Exp Neurol 168, 273-282.
Gu, Y., Kuida, K., Tsutsui, H., Ku, G., Hsiao, K., Fleming, M.A., Hayashi, N., Higashino,
K., Okamura, H., Nakanishi, K., Kurimoto, M., Tanimoto, T., Flavell, R.A., Sato, V.,
Harding, M.W., Livingston, D.J., Su, M.S., 1997. Activation of interferon-gamma
inducing factor mediated by interleukin-1beta converting enzyme. Science 275, 206-
209.
Guerrero, A.R., Uchida, K., Nakajima, H., Watanabe, S., Nakamura, M., Johnson, W.E.,
Baba, H., 2012. Blockade of interleukin-6 signaling inhibits the classic pathway and
promotes an alternative pathway of macrophage activation after spinal cord injury in
mice. J Neuroinflammation 9, 40.
Hains, B.C., Yucra, J.A., Hulsebosch, C.E., 2001. Reduction of pathological and behavioral
deficits following spinal cord contusion injury with the selective cyclooxygenase-2
inhibitor NS-398. J Neurotrauma 18, 409-423.
111
Hanisch, U.K., Kettenmann, H., 2007. Microglia: active sensor and versatile effector cells
in the normal and pathologic brain. Nat Neurosci 10, 1387-1394.
Hanna, R.N., Carlin, L.M., Hubbeling, H.G., Nackiewicz, D., Green, A.M., Punt, J.A.,
Geissmann, F., Hedrick, C.C., 2011. The transcription factor NR4A1 (Nur77) controls
bone marrow differentiation and the survival of Ly6C- monocytes. Nat Immunol 12,
778-785.
Hanna, R.N., Shaked, I., Hubbeling, H.G., Punt, J.A., Wu, R., Herrley, E., Zaugg, C., Pei,
H., Geissmann, F., Ley, K., Hedrick, C.C., 2012. NR4A1 (Nur77) deletion polarizes
macrophages toward an inflammatory phenotype and increases atherosclerosis. Circ Res
110, 416-427.
Harrison, J.K., Jiang, Y., Chen, S., Xia, Y., Maciejewski, D., McNamara, R.K., Streit, W.J.,
Salafranca, M.N., Adhikari, S., Thompson, D.A., Botti, P., Bacon, K.B., Feng, L., 1998.
Role for neuronally derived fractalkine in mediating interactions between neurons and
CX3CR1-expressing microglia. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 10896-10901.
Heldin, C.H., Miyazono, K., ten Dijke, P., 1997. TGF-beta signalling from cell membrane
to nucleus through SMAD proteins. Nature 390, 465-471.
Hellal, F., Hurtado, A., Ruschel, J., Flynn, K.C., Laskowski, C.J., Umlauf, M., Kapitein,
L.C., Strikis, D., Lemmon, V., Bixby, J., Hoogenraad, C.C., Bradke, F., 2011.
Microtubule stabilization reduces scarring and causes axon regeneration after spinal cord
injury. Science 331, 928-931.
Herrmann, J.E., Imura, T., Song, B., Qi, J., Ao, Y., Nguyen, T.K., Korsak, R.A., Takeda,
K., Akira, S., Sofroniew, M.V., 2008. STAT3 is a critical regulator of astrogliosis and
scar formation after spinal cord injury. J Neurosci 28, 7231-7243.
112
Herx, L.M., Rivest, S., Yong, V.W., 2000. Central nervous system-initiated inflammation
and neurotrophism in trauma: IL-1 beta is required for the production of ciliary
neurotrophic factor. J Immunol 165, 2232-2239.
Hirata, K., Kawabuchi, M., 2002. Myelin phagocytosis by macrophages and
nonmacrophages during Wallerian degeneration. Microsc Res Tech 57, 541-547.
Horn, K.P., Busch, S.A., Hawthorne, A.L., van Rooijen, N., Silver, J., 2008. Another
barrier to regeneration in the CNS: activated macrophages induce extensive retraction of
dystrophic axons through direct physical interactions. J Neurosci 28, 9330-9341.
Iadecola, C., Anrather, J., 2011. The immunology of stroke: from mechanisms to
translation. Nat Med 17, 796-808.
Inoue, K., 2006. The function of microglia through purinergic receptors: neuropathic pain
and cytokine release. Pharmacol Ther 109, 210-226.
John, G.R., Lee, S.C., Brosnan, C.F., 2003. Cytokines: powerful regulators of glial cell
activation. Neuroscientist 9, 10-22.
John, G.R., Lee, S.C., Song, X., Rivieccio, M., Brosnan, C.F., 2005. IL-1-regulated
responses in astrocytes: relevance to injury and recovery. Glia 49, 161-176.
Jung, S., Aliberti, J., Graemmel, P., Sunshine, M.J., Kreutzberg, G.W., Sher, A., Littman,
D.R., 2000. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and
green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol 20, 4106-4114.
Kanda, T., 2013. Biology of the blood-nerve barrier and its alteration in immune mediated
neuropathies. J Neurol Neurosurg Psychiatry 84, 208-212.
113
Karanth, S., Yang, G., Yeh, J., Richardson, P.M., 2006. Nature of signals that initiate the
immune response during Wallerian degeneration of peripheral nerves. Exp Neurol 202,
161-166.
Karkkainen, I., Rybnikova, E., Pelto-Huikko, M., Huovila, A.P., 2000. Metalloprotease-
disintegrin (ADAM) genes are widely and differentially expressed in the adult CNS.
Mol Cell Neurosci 15, 547-560.
Kerschensteiner, M., Schwab, M.E., Lichtman, J.W., Misgeld, T., 2005. In vivo imaging of
axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med 11, 572-577.
Kierdorf, K., Erny, D., Goldmann, T., Sander, V., Schulz, C., Perdiguero, E.G., Wieghofer,
P., Heinrich, A., Riemke, P., Holscher, C., Muller, D.N., Luckow, B., Brocker, T.,
Debowski, K., Fritz, G., Opdenakker, G., Diefenbach, A., Biber, K., Heikenwalder, M.,
Geissmann, F., Rosenbauer, F., Prinz, M., 2013. Microglia emerge from erythromyeloid
precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nat Neurosci 16, 273-280.
Kigerl, K.A., Gensel, J.C., Ankeny, D.P., Alexander, J.K., Donnelly, D.J., Popovich, P.G.,
2009. Identification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing
either neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord. J Neurosci 29,
13435-13444.
Kigerl, K.A., Lai, W., Rivest, S., Hart, R.P., Satoska, A.R., Popovich, P.G., 2007. Toll-like
receptor (TLR)-2 and TLR-4 regulate inflammation, gliosis, and myelin sparing after
spinal cord injury. J Neurochem 102, 37-50.
Knoblach, S.M., Faden, A.I., 1998. Interleukin-10 improves outcome and alters
proinflammatory cytokine expression after experimental traumatic brain injury. Exp
Neurol 153, 143-151.
114
Knoferle, J., Koch, J.C., Ostendorf, T., Michel, U., Planchamp, V., Vutova, P., Tonges, L.,
Stadelmann, C., Bruck, W., Bahr, M., Lingor, P., 2010. Mechanisms of acute axonal
degeneration in the optic nerve in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 107, 6064-6069.
Kobayashi, Y., Yamamoto, K., Saido, T., Kawasaki, H., Oppenheim, J.J., Matsushima, K.,
1990. Identification of calcium-activated neutral protease as a processing enzyme of
human interleukin 1 alpha. Proc Natl Acad Sci U S A 87, 5548-5552.
Kohta, M., Kohmura, E., Yamashita, T., 2009. Inhibition of TGF-beta1 promotes functional
recovery after spinal cord injury. Neurosci Res 65, 393-401.
Kremlev, S.G., Palmer, C., 2005. Interleukin-10 inhibits endotoxin-induced pro-
inflammatory cytokines in microglial cell cultures. J Neuroimmunol 162, 71-80.
Kwon, B.K., Okon, E., Hillyer, J., Mann, C., Baptiste, D., Weaver, L.C., Fehlings, M.G.,
Tetzlaff, W., 2011. A systematic review of non-invasive pharmacologic neuroprotective
treatments for acute spinal cord injury. J Neurotrauma 28, 1545-1588.
Lacroix, S., Chang, L., Rose-John, S., Tuszynski, M.H., 2002. Delivery of Hyper-IL-6 to
the injured spinal cord increases neutrophil and macrophage infiltration and inhibits
axonal growth. J. Comp. Neurol. 454, 213-228.
Lagord, C., Berry, M., Logan, A., 2002. Expression of TGFbeta2 but not TGFbeta1
correlates with the deposition of scar tissue in the lesioned spinal cord. Mol Cell
Neurosci 20, 69-92.
Lambertsen, K.L., Clausen, B.H., Babcock, A.A., Gregersen, R., Fenger, C., Nielsen, H.H.,
Haugaard, L.S., Wirenfeldt, M., Nielsen, M., Dagnaes-Hansen, F., Bluethmann, H.,
Faergeman, N.J., Meldgaard, M., Deierborg, T., Finsen, B., 2009. Microglia protect
115
neurons against ischemia by synthesis of tumor necrosis factor. J Neurosci 29, 1319-
1330.
Lamkanfi, M., Dixit, V.M., 2012. Inflammasomes and their roles in health and disease.
Annu Rev Cell Dev Biol 28, 137-161.
Laping, N.J., Morgan, T.E., Nichols, N.R., Rozovsky, I., Young-Chan, C.S., Zarow, C.,
Finch, C.E., 1994. Transforming growth factor-beta 1 induces neuronal and astrocyte
genes: tubulin alpha 1, glial fibrillary acidic protein and clusterin. Neuroscience 58, 563-
572.
Lee, H., Jo, E.K., Choi, S.Y., Oh, S.B., Park, K., Kim, J.S., Lee, S.J., 2006. Necrotic
neuronal cells induce inflammatory Schwann cell activation via TLR2 and TLR3:
implication in Wallerian degeneration. Biochem Biophys Res Commun 350, 742-747.
Lee, J.Y., Kim, H.S., Choi, H.Y., Oh, T.H., Ju, B.G., Yune, T.Y., 2012a. Valproic acid
attenuates blood-spinal cord barrier disruption by inhibiting matrix metalloprotease-9
activity and improves functional recovery after spinal cord injury. J Neurochem 121,
818-829.
Lee, J.Y., Kim, H.S., Choi, H.Y., Oh, T.H., Yune, T.Y., 2012b. Fluoxetine inhibits matrix
metalloprotease activation and prevents disruption of blood-spinal cord barrier after
spinal cord injury. Brain 135, 2375-2389.
Lee, S.M., Rosen, S., Weinstein, P., van Rooijen, N., Noble-Haeusslein, L.J., 2011.
Prevention of both neutrophil and monocyte recruitment promotes recovery after spinal
cord injury. J Neurotrauma 28, 1893-1907.
Letellier, E., Kumar, S., Sancho-Martinez, I., Krauth, S., Funke-Kaiser, A., Laudenklos, S.,
Konecki, K., Klussmann, S., Corsini, N.S., Kleber, S., Drost, N., Neumann, A., Levi-
116
Strauss, M., Brors, B., Gretz, N., Edler, L., Fischer, C., Hill, O., Thiemann, M., Biglari,
B., Karray, S., Martin-Villalba, A., 2010. CD95-ligand on peripheral myeloid cells
activates Syk kinase to trigger their recruitment to the inflammatory site. Immunity 32,
240-252.
Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M.I., Nourshargh, S., 2007. Getting to the site of
inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol 7, 678-689.
Li, M.O., Flavell, R.A., 2008. TGF-beta: a master of all T cell trades. Cell 134, 392-404.
Lin, H.W., Basu, A., Druckman, C., Cicchese, M., Krady, J.K., Levison, S.W., 2006.
Astrogliosis is delayed in type 1 interleukin-1 receptor-null mice following a penetrating
brain injury. J Neuroinflammation 3, 15.
Liu, D., Ling, X., Wen, J., Liu, J., 2000. The role of reactive nitrogen species in secondary
spinal cord injury: formation of nitric oxide, peroxynitrite, and nitrated protein. J
Neurochem 75, 2144-2154.
Liu, D., Sybert, T.E., Qian, H., Liu, J., 1998. Superoxide production after spinal injury
detected by microperfusion of cytochrome c. Free Radic Biol Med 25, 298-304.
Liu, X.Z., Xu, X.M., Hu, R., Du, C., Zhang, S.X., McDonald, J.W., Dong, H.X., Wu, Y.J.,
Fan, G.S., Jacquin, M.F., Hsu, C.Y., Choi, D.W., 1997. Neuronal and glial apoptosis
after traumatic spinal cord injury. J Neurosci 17, 5395-5406.
Logan, A., Berry, M., Gonzalez, A.M., Frautschy, S.A., Sporn, M.B., Baird, A., 1994.
Effects of transforming growth factor beta 1 on scar production in the injured central
nervous system of the rat. Eur J Neurosci 6, 355-363.
117
Logan, A., Green, J., Hunter, A., Jackson, R., Berry, M., 1999. Inhibition of glial scarring
in the injured rat brain by a recombinant human monoclonal antibody to transforming
growth factor-beta2. Eur J Neurosci 11, 2367-2374.
Lotocki, G., Alonso, O.F., Dietrich, W.D., Keane, R.W., 2004. Tumor necrosis factor
receptor 1 and its signaling intermediates are recruited to lipid rafts in the traumatized
brain. J Neurosci 24, 11010-11016.
Luheshi, N.M., Kovacs, K.J., Lopez-Castejon, G., Brough, D., Denes, A., 2011.
Interleukin-1alpha expression precedes IL-1beta after ischemic brain injury and is
localised to areas of focal neuronal loss and penumbral tissues. J Neuroinflammation 8,
186.
Luheshi, N.M., Rothwell, N.J., Brough, D., 2009. Dual functionality of interleukin-1 family
cytokines: implications for anti-interleukin-1 therapy. Br J Pharmacol 157, 1318-1329.
Maikos, J.T., Shreiber, D.I., 2007. Immediate damage to the blood-spinal cord barrier due
to mechanical trauma. J Neurotrauma 24, 492-507.
March, C.J., Mosley, B., Larsen, A., Cerretti, D.P., Braedt, G., Price, V., Gillis, S., Henney,
C.S., Kronheim, S.R., Grabstein, K., et al., 1985. Cloning, sequence and expression of
two distinct human interleukin-1 complementary DNAs. Nature 315, 641-647.
Mariathasan, S., Monack, D.M., 2007. Inflammasome adaptors and sensors: intracellular
regulators of infection and inflammation. Nat Rev Immunol 7, 31-40.
Martinez, F.O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A., 2006. Transcriptional profiling of
the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: new molecules and
patterns of gene expression. J Immunol 177, 7303-7311.
118
Martinon, F., Mayor, A., Tschopp, J., 2009. The inflammasomes: guardians of the body.
Annu Rev Immunol 27, 229-265.
Mason, J.L., Suzuki, K., Chaplin, D.D., Matsushima, G.K., 2001. Interleukin-1beta
promotes repair of the CNS. J Neurosci 21, 7046-7052.
Mason, J.L., Ye, P., Suzuki, K., D'Ercole, A.J., Matsushima, G.K., 2000. Insulin-like
growth factor-1 inhibits mature oligodendrocyte apoptosis during primary
demyelination. J Neurosci 20, 5703-5708.
Massague, J., 2000. How cells read TGF-beta signals. Nat Rev Mol Cell Biol 1, 169-178.
Mautes, A.E., Weinzierl, M.R., Donovan, F., Noble, L.J., 2000. Vascular events after spinal
cord injury: contribution to secondary pathogenesis. Phys Ther 80, 673-687.
Mawhinney, L.A., Thawer, S.G., Lu, W.Y., Rooijen, N., Weaver, L.C., Brown, A.,
Dekaban, G.A., 2012. Differential detection and distribution of microglial and
hematogenous macrophage populations in the injured spinal cord of lys-EGFP-ki
transgenic mice. J Neuropathol Exp Neurol 71, 180-197.
McTigue, D.M., Popovich, P.G., Morgan, T.E., Stokes, B.T., 2000. Localization of
transforming growth factor-beta1 and receptor mRNA after experimental spinal cord
injury. Exp Neurol 163, 220-230.
McTigue, D.M., Tripathi, R.B., 2008. The life, death, and replacement of oligodendrocytes
in the adult CNS. J Neurochem 107, 1-19.
Micheau, O., Tschopp, J., 2003. Induction of TNF receptor I-mediated apoptosis via two
sequential signaling complexes. Cell 114, 181-190.
119
Miklossy, J., Van der Loos, H., 1991. The long-distance effects of brain lesions:
visualization of myelinated pathways in the human brain using polarizing and
fluorescence microscopy. J Neuropathol Exp Neurol 50, 1-15.
Mildner, A., Schmidt, H., Nitsche, M., Merkler, D., Hanisch, U.K., Mack, M.,
Heikenwalder, M., Bruck, W., Priller, J., Prinz, M., 2007. Microglia in the adult brain
arise from Ly-6ChiCCR2+ monocytes only under defined host conditions. Nat Neurosci
10, 1544-1553.
Minkiewicz, J., de Rivero Vaccari, J.P., Keane, R.W., 2013. Human astrocytes express a
novel NLRP2 inflammasome. Glia 61, 1113-1121.
Miron, V.E., Boyd, A., Zhao, J.W., Yuen, T.J., Ruckh, J.M., Shadrach, J.L., van
Wijngaarden, P., Wagers, A.J., Williams, A., Franklin, R.J., ffrench-Constant, C., 2013.
M2 microglia and macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS
remyelination. Nat Neurosci 16, 1211-1218.
Miyoshi, K., Obata, K., Kondo, T., Okamura, H., Noguchi, K., 2008. Interleukin-18-
mediated microglia/astrocyte interaction in the spinal cord enhances neuropathic pain
processing after nerve injury. J Neurosci 28, 12775-12787.
Moore, K.W., de Waal Malefyt, R., Coffman, R.L., O'Garra, A., 2001. Interleukin-10 and
the interleukin-10 receptor. Annu Rev Immunol 19, 683-765.
Morgan, T.E., Laping, N.J., Rozovsky, I., Oda, T., Hogan, T.H., Finch, C.E., Pasinetti,
G.M., 1995. Clusterin expression by astrocytes is influenced by transforming growth
factor beta 1 and heterotypic cell interactions. J Neuroimmunol 58, 101-110.
120
Mosley, B., Urdal, D.L., Prickett, K.S., Larsen, A., Cosman, D., Conlon, P.J., Gillis, S.,
Dower, S.K., 1987. The interleukin-1 receptor binds the human interleukin-1 alpha
precursor but not the interleukin-1 beta precursor. J Biol Chem 262, 2941-2944.
Muldoon, L.L., Alvarez, J.I., Begley, D.J., Boado, R.J., Del Zoppo, G.J., Doolittle, N.D.,
Engelhardt, B., Hallenbeck, J.M., Lonser, R.R., Ohlfest, J.R., Prat, A., Scarpa, M.,
Smeyne, R.J., Drewes, L.R., Neuwelt, E.A., 2013. Immunologic privilege in the central
nervous system and the blood-brain barrier. J Cereb Blood Flow Metab 33, 13-21.
Murakami, M., Hibi, M., Nakagawa, N., Nakagawa, T., Yasukawa, K., Yamanishi, K.,
Taga, T., Kishimoto, T., 1993. IL-6-induced homodimerization of gp130 and associated
activation of a tyrosine kinase. Science 260, 1808-1810.
Murinson, B.B., Archer, D.R., Li, Y., Griffin, J.W., 2005. Degeneration of myelinated
efferent fibers prompts mitosis in Remak Schwann cells of uninjured C-fiber afferents. J
Neurosci 25, 1179-1187.
Nadeau, S., Filali, M., Zhang, J., Kerr, B.J., Rivest, S., Soulet, D., Iwakura, Y., de Rivero
Vaccari, J.P., Keane, R.W., Lacroix, S., 2011. Functional Recovery after Peripheral
Nerve Injury is Dependent on the Pro-Inflammatory Cytokines IL-1{beta} and TNF:
Implications for Neuropathic Pain. J Neurosci 31, 12533-12542.
Nahrendorf, M., Swirski, F.K., Aikawa, E., Stangenberg, L., Wurdinger, T., Figueiredo,
J.L., Libby, P., Weissleder, R., Pittet, M.J., 2007. The healing myocardium sequentially
mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. J Exp
Med 204, 3037-3047.
Nakamura, M., Okada, S., Toyama, Y., Okano, H., 2005. Role of IL-6 in spinal cord injury
in a mouse model. Clinical reviews in allergy & immunology 28, 197-204.
121
Nakanishi, K., Yoshimoto, T., Tsutsui, H., Okamura, H., 2001. Interleukin-18 regulates
both Th1 and Th2 responses. Annu Rev Immunol 19, 423-474.
Nave, K.A., 2010. Myelination and the trophic support of long axons. Nat Rev Neurosci 11,
275-283.
Nesic, O., Xu, G.Y., McAdoo, D., High, K.W., Hulsebosch, C., Perez-Pol, R., 2001. IL-1
receptor antagonist prevents apoptosis and caspase-3 activation after spinal cord injury. J
Neurotrauma 18, 947-956.
Nguyen, L., Rothwell, N.J., Pinteaux, E., Boutin, H., 2011. Contribution of interleukin-1
receptor accessory protein B to interleukin-1 actions in neuronal cells. Neurosignals 19,
222-230.
Nikic, I., Merkler, D., Sorbara, C., Brinkoetter, M., Kreutzfeldt, M., Bareyre, F.M., Bruck,
W., Bishop, D., Misgeld, T., Kerschensteiner, M., 2011. A reversible form of axon
damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nat Med
17, 495-499.
Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F., 2005. Resting microglial cells are highly
dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science 308, 1314-1318.
Noble, L.J., Donovan, F., Igarashi, T., Goussev, S., Werb, Z., 2002. Matrix
metalloproteinases limit functional recovery after spinal cord injury by modulation of
early vascular events. J Neurosci 22, 7526-7535.
Noble, L.J., Wrathall, J.R., 1988. Blood-spinal cord barrier disruption proximal to a spinal
cord transection in the rat: time course and pathways associated with protein leakage.
Exp Neurol 99, 567-578.
122
Noble, L.J., Wrathall, J.R., 1989a. Correlative analyses of lesion development and
functional status after graded spinal cord contusive injuries in the rat. Exp Neurol 103,
34-40.
Noble, L.J., Wrathall, J.R., 1989b. Distribution and time course of protein extravasation in
the rat spinal cord after contusive injury. Brain Res 482, 57-66.
O'Neill, L.A., 2008. The interleukin-1 receptor/Toll-like receptor superfamily: 10 years of
progress. Immunol Rev 226, 10-18.
O'Neill, L.A., Dinarello, C.A., 2000. The IL-1 receptor/toll-like receptor superfamily:
crucial receptors for inflammation and host defense. Immunol Today 21, 206-209.
Okada, S., Nakamura, M., Katoh, H., Miyao, T., Shimazaki, T., Ishii, K., Yamane, J.,
Yoshimura, A., Iwamoto, Y., Toyama, Y., Okano, H., 2006. Conditional ablation of
Stat3 or Socs3 discloses a dual role for reactive astrocytes after spinal cord injury. Nat
Med 12, 829-834.
Okada, S., Nakamura, M., Mikami, Y., Shimazaki, T., Mihara, M., Ohsugi, Y., Iwamoto,
Y., Yoshizaki, K., Kishimoto, T., Toyama, Y., Okano, H., 2004. Blockade of
interleukin-6 receptor suppresses reactive astrogliosis and ameliorates functional
recovery in experimental spinal cord injury. J Neurosci Res 76, 265-276.
Ouyang, W., Rutz, S., Crellin, N.K., Valdez, P.A., Hymowitz, S.G., 2011. Regulation and
functions of the IL-10 family of cytokines in inflammation and disease. Annu Rev
Immunol 29, 71-109.
Penkowa, M., Moos, T., Carrasco, J., Hadberg, H., Molinero, A., Bluethmann, H., Hidalgo,
J., 1999. Strongly compromised inflammatory response to brain injury in interleukin-6-
deficient mice. Glia 25, 343-357.
123
Perrin, F.E., Lacroix, S., Aviles-Trigueros, M., David, S., 2005. Involvement of monocyte
chemoattractant protein-1, macrophage inflammatory protein-1alpha and interleukin-
1beta in Wallerian degeneration. Brain 128, 854-866.
Pillay, J., Kamp, V.M., van Hoffen, E., Visser, T., Tak, T., Lammers, J.W., Ulfman, L.H.,
Leenen, L.P., Pickkers, P., Koenderman, L., 2012. A subset of neutrophils in human
systemic inflammation inhibits T cell responses through Mac-1. J Clin Invest 122, 327-
336.
Pillay, J., Ramakers, B.P., Kamp, V.M., Loi, A.L., Lam, S.W., Hietbrink, F., Leenen, L.P.,
Tool, A.T., Pickkers, P., Koenderman, L., 2010. Functional heterogeneity and
differential priming of circulating neutrophils in human experimental endotoxemia. J
Leukoc Biol 88, 211-220.
Pineau, I., Lacroix, S., 2007. Proinflammatory cytokine synthesis in the injured mouse
spinal cord: Multiphasic expression pattern and identification of the cell types involved.
J Comp Neurol 500, 267-285.
Pineau, I., Lacroix, S., 2009. Endogenous signals initiating inflammation in the injured
nervous system. Glia 57, 351-361.
Pineau, I., Libo, S., Bastien, D., Lacroix, S., 2010. Astrocytes initiate inflammation in the
injured mouse spinal cord by promoting the entry of neutrophils and inflammatory
monocytes in an IL-1 receptor/MyD88-dependent fashion. Brain Behav Immun 24, 540-
553.
Plunkett, J.A., Yu, C.G., Easton, J.M., Bethea, J.R., Yezierski, R.P., 2001. Effects of
interleukin-10 (IL-10) on pain behavior and gene expression following excitotoxic
spinal cord injury in the rat. Exp Neurol 168, 144-154.
124
Popovich, P.G., Guan, Z., Wei, P., Huitinga, I., van Rooijen, N., Stokes, B.T., 1999.
Depletion of hematogenous macrophages promotes partial hindlimb recovery and
neuroanatomical repair after experimental spinal cord injury. Exp Neurol 158, 351-365.
Popovich, P.G., Horner, P.J., Mullin, B.B., Stokes, B.T., 1996. A quantitative spatial
analysis of the blood-spinal cord barrier. I. Permeability changes after experimental
spinal contusion injury. Exp Neurol 142, 258-275.
Pradillo, J.M., Denes, A., Greenhalgh, A.D., Boutin, H., Drake, C., McColl, B.W., Barton,
E., Proctor, S.D., Russell, J.C., Rothwell, N.J., Allan, S.M., 2012. Delayed
administration of interleukin-1 receptor antagonist reduces ischemic brain damage and
inflammation in comorbid rats. J Cereb Blood Flow Metab 32, 1810-1819.
Rabchevsky, A.G., Streit, W.J., 1997. Grafting of cultured microglial cells into the lesioned
spinal cord of adult rats enhances neurite outgrowth. J Neurosci Res 47, 34-48.
Ransohoff, R.M., Perry, V.H., 2009. Microglial physiology: unique stimuli, specialized
responses. Annu Rev Immunol 27, 119-145.
Reichert, F., Saada, A., Rotshenker, S., 1994. Peripheral nerve injury induces Schwann
cells to express two macrophage phenotypes: phagocytosis and the galactose-specific
lectin MAC-2. J Neurosci 14, 3231-3245.
Rice, T., Larsen, J., Rivest, S., Yong, V.W., 2007. Characterization of the early
neuroinflammation after spinal cord injury in mice. J Neuropathol Exp Neurol 66, 184-
195.
Rider, P., Carmi, Y., Guttman, O., Braiman, A., Cohen, I., Voronov, E., White, M.R.,
Dinarello, C.A., Apte, R.N., 2011. IL-1{alpha} and IL-1{beta} Recruit Different
Myeloid Cells and Promote Different Stages of Sterile Inflammation. J Immunol.
125
Robins-Steele, S., Nguyen, D.H., Fehlings, M.G., 2012. The delayed post-injury
administration of soluble fas receptor attenuates post-traumatic neural degeneration and
enhances functional recovery after traumatic cervical spinal cord injury. J Neurotrauma
29, 1586-1599.
Romano, M., Sironi, M., Toniatti, C., Polentarutti, N., Fruscella, P., Ghezzi, P., Faggioni,
R., Luini, W., van Hinsbergh, V., Sozzani, S., Bussolino, F., Poli, V., Ciliberto, G.,
Mantovani, A., 1997. Role of IL-6 and its soluble receptor in induction of chemokines
and leukocyte recruitment. Immunity 6, 315-325.
Royall, J.A., Berkow, R.L., Beckman, J.S., Cunningham, M.K., Matalon, S., Freeman,
B.A., 1989. Tumor necrosis factor and interleukin 1 alpha increase vascular endothelial
permeability. Am J Physiol 257, L399-410.
Sabat, R., 2010. IL-10 family of cytokines. Cytokine Growth Factor Rev 21, 315-324.
Santello, M., Volterra, A., 2012. TNFalpha in synaptic function: switching gears. Trends
Neurosci 35, 638-647.
Sato, A., Ohtaki, H., Tsumuraya, T., Song, D., Ohara, K., Asano, M., Iwakura, Y., Atsumi,
T., Shioda, S., 2012. Interleukin-1 participates in the classical and alternative activation
of microglia/macrophages after spinal cord injury. J Neuroinflammation 9, 65.
Schmierer, B., Hill, C.S., 2007. TGFbeta-SMAD signal transduction: molecular specificity
and functional flexibility. Nat Rev Mol Cell Biol 8, 970-982.
Schulz, C., Gomez Perdiguero, E., Chorro, L., Szabo-Rogers, H., Cagnard, N., Kierdorf,
K., Prinz, M., Wu, B., Jacobsen, S.E., Pollard, J.W., Frampton, J., Liu, K.J., Geissmann,
F., 2012. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells.
Science 336, 86-90.
126
Schwab, J.M., Guo, L., Schluesener, H.J., 2005. Spinal cord injury induces early and
persistent lesional P2X4 receptor expression. J Neuroimmunol 163, 185-189.
Schwab, M.E., 2010. Functions of Nogo proteins and their receptors in the nervous system.
Nat Rev Neurosci 11, 799-811.
Shamash, S., Reichert, F., Rotshenker, S., 2002. The cytokine network of Wallerian
degeneration: tumor necrosis factor- alpha, interleukin-1alpha, and interleukin-1beta. J
Neurosci 22, 3052-3060.
Shechter, R., London, A., Varol, C., Raposo, C., Cusimano, M., Yovel, G., Rolls, A.,
Mack, M., Pluchino, S., Martino, G., Jung, S., Schwartz, M., 2009. Infiltrating blood-
derived macrophages are vital cells playing an anti-inflammatory role in recovery from
spinal cord injury in mice. PLoS Med 6, e1000113.
Shechter, R., Raposo, C., London, A., Sagi, I., Schwartz, M., 2011. The glial scar-
monocyte interplay: a pivotal resolution phase in spinal cord repair. PLoS One 6,
e27969.
Shi, C., Pamer, E.G., 2011. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nat
Rev Immunol 11, 762-774.
Sica, A., Mantovani, A., 2012. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. J
Clin Invest 122, 787-795.
Siegel, R.M., Chan, F.K., Chun, H.J., Lenardo, M.J., 2000. The multifaceted role of Fas
signaling in immune cell homeostasis and autoimmunity. Nat Immunol 1, 469-474.
Smith, D.E., 2011. The biological paths of IL-1 family members IL-18 and IL-33. J Leukoc
Biol 89, 383-392.
127
Smith, D.E., Lipsky, B.P., Russell, C., Ketchem, R.R., Kirchner, J., Hensley, K., Huang,
Y., Friedman, W.J., Boissonneault, V., Plante, M.M., Rivest, S., Sims, J.E., 2009. A
central nervous system-restricted isoform of the interleukin-1 receptor accessory protein
modulates neuronal responses to interleukin-1. Immunity 30, 817-831.
Sofroniew, M.V., 2009. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar
formation. Trends Neurosci 32, 638-647.
Soulet, D., Pare, A., Coste, J., Lacroix, S., 2013. Automated Filtering of Intrinsic
Movement Artifacts during Two-Photon Intravital Microscopy. PLoS One 8, e53942.
Spooren, A., Kolmus, K., Laureys, G., Clinckers, R., De Keyser, J., Haegeman, G., Gerlo,
S., 2011. Interleukin-6, a mental cytokine. Brain Res Rev 67, 157-183.
Sriram, K., O'Callaghan, J.P., 2007. Divergent roles for tumor necrosis factor-alpha in the
brain. J Neuroimmune Pharmacol 2, 140-153.
Stirling, D.P., Cummins, K., Chen, S.R., Stys, P., 2014. Axoplasmic reticulum Ca release
causes secondary degeneration of spinal axons. Ann Neurol.
Stirling, D.P., Cummins, K., Mishra, M., Teo, W., Yong, V.W., Stys, P., 2013. Toll-like
receptor 2-mediated alternative activation of microglia is protective after spinal cord
injury. Brain.
Stirling, D.P., Liu, S., Kubes, P., Yong, V.W., 2009. Depletion of Ly6G/Gr-1 leukocytes
after spinal cord injury in mice alters wound healing and worsens neurological outcome.
J Neurosci 29, 753-764.
Stirling, D.P., Yong, V.W., 2008. Dynamics of the inflammatory response after murine
spinal cord injury revealed by flow cytometry. J Neurosci Res 86, 1944-1958.
128
Stoll, G., Griffin, J.W., Li, C.Y., Trapp, B.D., 1989. Wallerian degeneration in the
peripheral nervous system: participation of both Schwann cells and macrophages in
myelin degradation. J Neurocytol 18, 671-683.
Takeda, K., Clausen, B.E., Kaisho, T., Tsujimura, T., Terada, N., Forster, I., Akira, S.,
1999. Enhanced Th1 activity and development of chronic enterocolitis in mice devoid of
Stat3 in macrophages and neutrophils. Immunity 10, 39-49.
Tator, C.H., Fehlings, M.G., 1991. Review of the secondary injury theory of acute spinal
cord trauma with emphasis on vascular mechanisms. J Neurosurg 75, 15-26.
Thawer, S.G., Mawhinney, L., Chadwick, K., de Chickera, S.N., Weaver, L.C., Brown, A.,
Dekaban, G.A., 2013. Temporal changes in monocyte and macrophage subsets and
microglial macrophages following spinal cord injury in the lys-egfp-ki mouse model. J
Neuroimmunol.
Thomassen, E., Bird, T.A., Renshaw, B.R., Kennedy, M.K., Sims, J.E., 1998. Binding of
interleukin-18 to the interleukin-1 receptor homologous receptor IL-1Rrp1 leads to
activation of signaling pathways similar to those used by interleukin-1. J Interferon
Cytokine Res 18, 1077-1088.
Thompson, C.D., Zurko, J.C., Hanna, B.F., Hellenbrand, D.J., Hanna, A., 2013. The
therapeutic role of interleukin-10 after spinal cord injury. J Neurotrauma 30, 1311-1324.
Thornton, P., McColl, B.W., Greenhalgh, A., Denes, A., Allan, S.M., Rothwell, N.J., 2010.
Platelet interleukin-1alpha drives cerebrovascular inflammation. Blood 115, 3632-3639.
Tibbetts, M.D., Zheng, L., Lenardo, M.J., 2003. The death effector domain protein family:
regulators of cellular homeostasis. Nat Immunol 4, 404-409.
129
Tsakiri, N., Kimber, I., Rothwell, N.J., Pinteaux, E., 2008. Differential effects of
interleukin-1 alpha and beta on interleukin-6 and chemokine synthesis in neurones. Mol
Cell Neurosci 38, 259-265.
Tschopp, J., Martinon, F., Burns, K., 2003. NALPs: a novel protein family involved in
inflammation. Nat Rev Mol Cell Biol 4, 95-104.
Tsuda, Y., Takahashi, H., Kobayashi, M., Hanafusa, T., Herndon, D.N., Suzuki, F., 2004.
Three different neutrophil subsets exhibited in mice with different susceptibilities to
infection by methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Immunity 21, 215-226.
Ulmann, L., Hatcher, J.P., Hughes, J.P., Chaumont, S., Green, P.J., Conquet, F., Buell,
G.N., Reeve, A.J., Chessell, I.P., Rassendren, F., 2008. Up-regulation of P2X4 receptors
in spinal microglia after peripheral nerve injury mediates BDNF release and neuropathic
pain. J Neurosci 28, 11263-11268.
Vargas, M.E., Barres, B.A., 2007. Why is Wallerian degeneration in the CNS so slow?
Annu Rev Neurosci 30, 153-179.
Wells, J.E., Rice, T.K., Nuttall, R.K., Edwards, D.R., Zekki, H., Rivest, S., Yong, V.W.,
2003. An adverse role for matrix metalloproteinase 12 after spinal cord injury in mice. J
Neurosci 23, 10107-10115.
Werman, A., Werman-Venkert, R., White, R., Lee, J.K., Werman, B., Krelin, Y., Voronov,
E., Dinarello, C.A., Apte, R.N., 2004. The precursor form of IL-1alpha is an intracrine
proinflammatory activator of transcription. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 2434-2439.
Woollard, K.J., Geissmann, F., 2010. Monocytes in atherosclerosis: subsets and functions.
Nat Rev Cardiol 7, 77-86.
130
Wyss-Coray, T., Mucke, L., 2002. Inflammation in neurodegenerative disease-a double-
edged sword. Neuron 35, 419.
Yan, P., Li, Q., Kim, G.M., Xu, J., Hsu, C.Y., Xu, X.M., 2001. Cellular localization of
tumor necrosis factor-alpha following acute spinal cord injury in adult rats. J
Neurotrauma 18, 563-568.
Yan, P., Liu, N., Kim, G.M., Xu, J., Li, Q., Hsu, C.Y., Xu, X.M., 2003. Expression of the
type 1 and type 2 receptors for tumor necrosis factor after traumatic spinal cord injury in
adult rats. Exp Neurol 183, 286-297.
Ye, L., Huang, Y., Zhao, L., Li, Y., Sun, L., Zhou, Y., Qian, G., Zheng, J.C., 2013. IL-
1beta and TNF-alpha induce neurotoxicity through glutamate production: a potential
role for neuronal glutaminase. J Neurochem 125, 897-908.
Yu, W.R., Liu, T., Fehlings, T.K., Fehlings, M.G., 2009. Involvement of mitochondrial
signaling pathways in the mechanism of Fas-mediated apoptosis after spinal cord injury.
Eur J Neurosci 29, 114-131.
Yune, T.Y., Chang, M.J., Kim, S.J., Lee, Y.B., Shin, S.W., Rhim, H., Kim, Y.C., Shin,
M.L., Oh, Y.J., Han, C.T., Markelonis, G.J., Oh, T.H., 2003. Increased production of
tumor necrosis factor-alpha induces apoptosis after traumatic spinal cord injury in rats. J
Neurotrauma 20, 207-219.
Zheng, Y., Humphry, M., Maguire, J.J., Bennett, M.R., Clarke, M.C., 2013. Intracellular
interleukin-1 receptor 2 binding prevents cleavage and activity of interleukin-1alpha,
controlling necrosis-induced sterile inflammation. Immunity 38, 285-295.
Zhou, Z., Peng, X., Insolera, R., Fink, D.J., Mata, M., 2009a. IL-10 promotes neuronal
survival following spinal cord injury. Exp Neurol 220, 183-190.
131
Zhou, Z., Peng, X., Insolera, R., Fink, D.J., Mata, M., 2009b. Interleukin-10 provides direct
trophic support to neurons. J Neurochem 110, 1617-1627.
Zhu, W., London, N.R., Gibson, C.C., Davis, C.T., Tong, Z., Sorensen, L.K., Shi, D.S.,
Guo, J., Smith, M.C., Grossmann, A.H., Thomas, K.R., Li, D.Y., 2012. Interleukin
receptor activates a MYD88-ARNO-ARF6 cascade to disrupt vascular stability. Nature
492, 252-255.
Zlokovic, B.V., 2008. The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative
disorders. Neuron 57, 178-201.
Zong, S., Zeng, G., Wei, B., Xiong, C., Zhao, Y., 2012. Beneficial effect of interleukin-1
receptor antagonist protein on spinal cord injury recovery in the rat. Inflammation 35,
520-526.
133
3. Chapitre 3
P2X4 Receptors Influence Inflammasome Activation Following Spinal Cord Injury
Juan Pablo de Rivero Vaccari1,†, Dominic Bastien4,†, Geoffrey Yurcisin2, Isabelle Pineau4, W. Dalton Dietrich1, Yves De Koninck3, Robert W. Keane1,2, et Steve Lacroix4,*
The Miami Project to Cure Paralysis, 2 Department of Physiological & Biophysics, University of Miami Miller School of Medicine, Miami, 33136, FL; 3 Institut universitaire de santé mentale de Québec, Québec, Canada, G1J 2G3; 4 Centre de recherche du Centre hospitalier de l'Université Laval and Département de Médecine Moléculaire, Université
Laval, Québec, Québec, Canada, G1V 4G2
N.B. Juan Pablo de Rivero Vaccari et Dominic Bastien ont contribué également à la réalisation de ce manuscrit
134
3.1. Résumé Les récepteurs P2X4 et P2X7 sont les récepteurs purinergiques principaux exprimés chez les
cellules immunitaires et les cellules du SNC. Ces récepteurs sont capables de former des
interactions entre eux pour réguler des voies de signalisation dépendante de l’ATP. Nos
plus récentes études ont démontré que le récepteur P2X7 chez les neurones et les astrocytes
active l’inflammasome NLRP1. Si P2X4R régule l’activation d’un ou plusieurs
inflammasomes demeure encore inconnu. Dans cette étude, nous démontrons que P2X4R
est exprimé chez les neurones de la moelle épinière. De plus, nous fournissons des
évidences que les LME induisent une réponse inflammatoire entraînant une augmentation
du clivage de la caspase-1 ainsi que de la production de l’IL-1β, mais pas de l’IL-18. Les
souris déficientes en P2X4R ont présenté des niveaux plus faibles de caspase-1 clivée et
d’IL-1β corrélant avec une diminution de l’infiltration de neutrophiles et de macrophages
M1 dérivés des monocytes ainsi qu’avec une réduction de la perte de tissu nerveux et une
amélioration des fonctions locomotrices. Ces résultats suggèrent que P2X4R influence
l’activation et la formation de l’inflammasome conduisant à l’activation de la caspase-1 et
au clivage de l’IL-1β chez les neurones suite à une LME. Ce récepteur pourrait représenter
une cible thérapeutique intéressante pour limiter la réponse inflammatoire initiée après une
lésion du SNC.
135
3.2. Abstract P2X4 and P2X7 are the predominant P2X receptor subtypes expressed on immune and
neural cells. These receptor subtypes traffic between intracellular compartments and the
plasma membrane and form protein interactions with each other to regulate ATP-dependent
signaling. Our recent studies have shown that P2X7 receptors in neurons and astrocytes
activate NLRP1 inflammasomes, but whether P2X4 receptors regulate inflammasome
signaling is largely unknown. Here, we demonstrate that P2X4 receptors are expressed in
neurons of the spinal cord. We provide direct evidence that SCI induces an innate
inflammatory response that leads to increased caspase-l cleavage and production of IL-1β,
but not IL-18. Consistent with these findings, P2X4-knockout mice showed impaired
inflammasome signaling in the cord resulting in decreased levels of IL-1β and reduced
infiltration of neutrophils and monocyte-derived M1 macrophages, resulting in significant
tissue sparing and improvement in functional outcomes. These results indicate that P2X4
receptors influence inflammasome signaling involving caspase-1 activation and IL-1β
processing in neurons after SCI. P2X4 might thus represent a potential therapeutic target to
limit inflammatory responses associated with SCI and neurodegenerative disorders.
136
3.3. Introduction The innate immune response is classically known as the first line of defense against
endogenous and exogenous insults. However, innate immunity actually serves as a
sophisticated system for sensing “danger signals” such as host-derived signals of cellular
stress and tissue destruction. One of the most studied endogenous insults that activates the
innate immune response is adenosine 5’ triphosphate (ATP). Extracellular ATP is elevated
in neuroinflammation in spinal cord injury (SCI) and neuropathic pain and acts on
purinergic receptors such as P2X7 or P2X4 (Tsuda et al., 2003; Wang et al., 2004; Coull et
al., 2005). P2X4 is the most abundant P2X receptor subtype present in the central nervous
system (CNS) (Buell et al., 1996; Soto et al., 1996). It is expressed in neurons of different
brain regions and in microglia (Burnstock, 2007; Ulmann et al., 2008).
Increased expression of P2X4 is observed in injured tissue following SCI (Schwab et al.,
2005), traumatic brain injury (Zhang et al., 2006), and cerebral ischemia (Cavaliere et al.,
2003). Moreover, P2X4 receptors are elevated in spinal cord microglia after peripheral
nerve injury (Tsuda et al., 2003; Ulmann et al., 2008). Neutralizing P2X4 activity using an
antisense oligonucleotide or a transgenic approach prevents tactile allodynia (Tsuda et al.,
2003; Ulmann et al., 2008), suggesting that P2X4 receptors are involved in neuropathic
pain. P2X4 receptors are also expressed within the immune system (Wang et al., 2004).
However, the involvement of P2X4 in neuroinflammatory processes remains unresolved.
The inflammasome is a multiprotein complex that promotes the maturation of inflammatory
cytokines such as IL-1β and IL-18, and is therefore likely to control many aspects of
neuroinflammatory processes. Our previous work demonstrated that P2X7 receptors
activate the NLRP1 inflammasome in neurons and astrocytes via a mechanism mediated by
pannexin-1 (Silverman et al., 2009). Heteromeric interactions between P2X4 and P2X7
receptors have been reported in human embryonic kidney 293 cells and in primary cultures
of bone marrow-derived macrophages (Guo et al., 2007; Casas-Pruneda et al., 2009).
Moreover, genetic knockdown studies in mouse epithelial cells indicate that interactions
between P2X4 and P2X7 regulate overall P2X receptor levels (Weinhold et al., 2010). In
this study we used P2X4-knockout (ko) mice to examine the role of P2X4 receptors in
137
inflammasome activation and neuroinflammation following SCI. We show that P2X4-KO
mice have significant decreases in inflammasome activation, pro-inflammatory cytokine
production, inflammatory cell infiltration and improved histopathological and functional
outcomes compared with wild types following SCI. Thus, P2X4 receptors may play a
critical role in neurons mediating innate neuroinflammatory events following SCI.
3.4. Materials and Methods
3.4.1. Animals
A total of 190 adult mice were used in this study. P2X4-KO mice in the C57BL/6
background were generated, reproduced, and genotyped as previously described by the
Rassendren laboratory (Ulmann et al., 2008). C57BL/6 mice from Charles River
Laboratories (St-Constant, QC, Canada) were used as controls. Bone marrow chimeric
mice were produced using our previously published protocol (Pineau and Lacroix, 2007).
All mice had free access to food and water.
3.4.2. Spinal cord injury C57BL/6 (n = 99) and P2X4-KO (n = 91) mice were anesthetized with isoflurane and
underwent a laminectomy at vertebral level T9-10, which corresponds to spinal segment
T10-11. Briefly, the vertebral column was stabilized and a contusion of 70 kdyn was
performed using the Infinite Horizon (IH) SCI device (Precision Systems &
Instrumentation, Lexington, KY). Animals used for behavioral testing received a 50-kdyn
injury. Overlying muscular layers were then sutured and cutaneous layers stapled. Post-
operatively, animals received manual bladder evacuation twice daily to prevent urinary
tract infections. Depending on the experiment performed, SCI mice were sacrificed at 30
minutes, 6 and 12 hours, and 3, 4, 7, 14 and 38 days post-contusion. All surgical procedures
were approved by the Laval University Animal Care Committee and followed Canadian
Council on Animal Care guidelines.
138
3.4.3. Immunoblotting For detection of protein levels, a 4-mm spinal cord segment centered over the lesion was
harvested at different time points after injury with extraction buffer (20 mM Tris–HCl, pH:
7.5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100; 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid, 1 mM
ethylene glycol tetraacetic acid, 2.5 mM pyrophosphate, 1 mM β-glycerophosphate)
containing protease and phosphatase inhibitor cocktails (Sigma). Immunoblot analysis was
carried with the Criterion system (Bio-Rad), as described before (de Rivero Vaccari et al.,
2008), using antibodies to caspase-1 (Imgenex, 1:1000), IL-1β (National Cancer Insitute,
1:10,000), IL-18 (Abcam, 1:1000), P2X4 (Abcam, 1:1000), and P2X7 (Alomone, 1:1000).
Actin (Sigma, 1:10,000) was used as a protein loading control and internal standard.
3.4.4. Flow cytometry Cells freshly isolated from the spinal cord of injured mice were analyzed using flow
cytometry following our previously published method (Pineau et al., 2010). Briefly,
animals were transcardially perfused with cold Hanks' balanced salt solution (HBSS) to
remove immune cells from the vasculature, their spinal cords dissected out, and a 1-cm
segment centered at the site of the lesion isolated and mechanically homogenized with a
small tissue grinder. Cells were filtered through a 40-µm nylon mesh cell strainer (BD
Bioscience, Mississauga, ON, Canada), centrifuged at 200g for 10 min, washed once with
HBSS, and resuspended with HBSS containing 20% fetal bovine serum (FBS; Sigma-
Aldrich Canada Ltd., Oakville, ON, Canada). For multicolor immunofluorescent labeling,
cells were incubated with Mouse Fc Block (i.e., purified anti-mouse CD16/CD32; BD
Bioscience) for 5 min in order to prevent nonspecific binding, followed by labeling for 30
min at room temperature with the following fluorescently conjugated primary antibodies:
PerCP-conjugated anti-CD45 (1:33, BD Biosciences), BD HorizonTM V450-conjugated
anti-CD11b (1:66, BD Biosciences), FITC-conjugated anti-Ly-6C (1:100, BD Biosciences),
PE-Cy7-conjugated anti-Ly-6G (1:100, BD Biosciences), and PE-conjugated anti-7/4 (1:20,
AbD Serotec) (for a full description of these primary antibodies, please refer to our
published work (Nadeau et al., 2011)). Cells were analyzed using FlowJo software (v. 9.2;
Tree Star Inc.) on a FACS LSRII flow cytometer (BD Biosciences). Myeloid cells were
139
identified based on their expression of CD45, CD11b, Ly-6C, and Ly-6G, as follows:
neutrophils, CD45hi CD11b+ Ly-6C+ Ly-6G+; monocyte-derived M1 macrophages, CD45hi
CD11b+ Ly-6Chi Ly-6G-; monocyte-derived M2 macrophages, CD45hi CD11b+ Ly-6C- Ly-
6G-; microglia, CD45dim CD11b+ Ly-6C- Ly-6G- (Babcock et al., 2003; Gordon and Taylor,
2005; Auffray et al., 2007; Nahrendorf et al., 2007). As well, the phenotype of these
myeloid cells was analyzed by flow cytometry using antibodies directed against the
following antigens: APC-conjugated anti-CD11c (1:50, BD Biosciences), Alexa-Fluor 700-
conjugated anti-MHCII (1:100, eBiosciences), PE-conjugated anti-iNOS (1:20, Santa Cruz
Biotechnology), and PE-conjugated anti-COX2 (1:20, Santa Cruz Biotechnology). For the
intracellular detection of iNOS and COX-2, cells were permeabilized in a solution
containing 1% PFA, 0.1% saponin (Sigma-Aldrich Canada Ltd.) and 10 mM HEPES for 30
min at room temperature. Cells were then washed with PBS and stained with either one of
the fluorescently conjugated primary antibodies for an additional 30 min on ice. For all
multi-color experiments, fluorescence-minus-one (FMO) staining was used to define the
cutoff for positivity.
3.4.5. Tissue processing and histology
Spinal cords were collected and prepared as previously described (Pineau and Lacroix,
2007). Briefly, mice were overdosed with a mixture of ketamine-xylazine and
transcardially perfused with 4% paraformaldehyde (PFA), pH 7.4, in PBS. Spinal cords
were dissected out and placed overnight in a PBS/20% sucrose solution. For each animal, a
spinal cord segment of 12 mm centered over the lesion site was cut in several series of 14-
µm-thick coronal sections using a cryostat. For immunohistochemistry against 7/4, mice
were perfused with 0.9% saline solution followed by 4% PFA, pH 9.5, in borax buffer.
Spinal cords were dissected out, post-fixed for 2 days, and placed overnight in a 4% PFA-
borax/10% sucrose solution until processing using a cryostat set at 30 µm thickness. All
sections were collected directly onto slides having a permanent positive charged surface
(Surgipath Canada Inc., Winnipeg, MB, Canada) and stored at -20 °C until use. To identify
the lesion epicenter and quantify lesion volume, one series of adjacent sections was stained
with hematoxylin-eosin (H&E) and luxol fast blue (LFB).
140
3.4.6. Immunohistochemistry and quantification of immunolabeling
Cells expressing P2X4 in the normal and injured spinal cord were identified by confocal
immunofluorescence labeling of the reporter protein beta-galactosidase (β-Gal; dilution
1:20,000, MP Biomedicals), HuC/HuD (to visualize neurons; 1:80, Invitrogen Canada),
NeuN (neurons; 1:250, Millipore), GFAP (astrocytes; 1:100, Invitrogen Canada), and
CD11b (microglia/macrophages; 1:500, AbD Serotec). Alexa Fluor® secondary antibody
conjugates (1:200, Invitrogen Canada) were used as secondary antibodies, whereas 4', 6-
diamidino-2-phenylindole, dilactate (DAPI; Invitrogen Canada) was used for nuclear
counterstaining. Immunofluorescence labeling was performed according to our previously
published methods (Barrette et al., 2008). Sections were observed and imaged on a
Fluoview FV1000 confocal microscope system equipped with Ar 488, HeNe1 543, and
HeNe2 633 lasers (Olympus Canada Inc.).
Immunoperoxidase labeling using the anti-7/4 antibody was performed to detect both
neutrophils and proinflammatory M1 macrophages in the spinal cord of injured mice.
Immunoperoxidase labeling was performed on spinal cord tissue sections directly mounted
onto slides using CoverWell incubation chambers (Invitrogen Canada) and our previously
published protocol (Pineau and Lacroix, 2007), with the only difference that sections were
pre-treated for 15 min with proteinase K to improve immunolabeling efficiency. The anti-
7/4 antibody was purchased from AbD Serotec (Raleigh, NC) and used at a dilution of
1:800. Following immunoperoxidase labeling, tissue sections were counterstained with
LFB to visualize damaged areas.
For the quantification of neutrophils and M1 macrophages, the outline of the coronal
section was traced at 20X magnification and a grid of 50 µm x 50 µm positioned over the
spinal cord using the Bioquant Nova Prime software (Bioquant Image Analysis
Corporation, Nashville, TN). All 7/4+ cells were then counted at 20X magnification.
Results were expressed as an average number of positive cells per coronal section.
Macrophage and microglial activity in the injured mouse spinal cord was examined using
the anti-galectin-3 (Gal-3, also referred to as Mac-2) antibody (1:500, ATCC), as described
141
in previous studies (Reichert and Rotshenker, 1999; Kriz et al., 2003; Lalancette-Hebert et
al., 2007). For the quantification, the proportional area of tissue occupied by Gal-3
immunoperoxidase labeling was measured in coronal sections taken at specific distances
from the lesion epicenter. In brief, digital images were collected with a high resolution
Retiga QICAM fast color 1394 camera (1392 x 1040 pixels; QImaging, Burnaby, BC,
Canada) installed on a Nikon Eclipse 80i microscope. Digitized images were then
thresholded using the Bioquant Nova Prime software, such that only immunoperoxidase
labeled product resulted in measurable pixels, and the area occupied by the signal measured
and divided by the total area of the cross-section. All quantifications were done blind with
respect to the identity of the animals and the epineurial layer excluded from analyses.
3.4.7. Behavioral analyses
Recovery of locomotor function after SCI was quantified in an open field using the Basso
Mouse Scale, according to the method developed by Basso et al. (Basso et al., 2006).
Recovery of hindlimb function was also assessed using the grip walk (GW) test, a modified
version of the grid walk or "foot fault" test, following the method recently described by
Pajoohesh-Ganji et al. (Pajoohesh-Ganji et al., 2010). All behavioral analyses were done
blind with respect to the identity of the animals.
3.4.8. Statistical analysis
Statistical evaluations were performed with one- or two-way ANOVA or repeated-
measures ANOVA. Post-ANOVA comparisons were made using the Bonferroni correction.
All statistical analyses were performed using the GraphPad Prism software (GraphPad
Software Inc., San Diego, CA). A p value < 0.05 was considered as statistically significant.
142
3.5. Results
3.5.1. Caspase-1 and IL-1ββ responses are decreased in P2X4-KO mice following SCI
P2X4 and P2X7 receptor expression in the spinal cord was analyzed by immunoblotting in
WT and P2X4-KO mice at 30 min, 6 h and 3 days after SCI (Fig. 3.1). Three days after
SCI, P2X4 expression was significantly elevated in WT animals, whereas P2X4 was not
detected in P2X4-KO mice, thus corroborating that the knockout phenotype was
maintained in this colony of animals. However, although SCI significantly increased levels
of P2X7 by 6 hr after SCI, no significant differences in P2X7 expression were observed
between WT and P2X4-KO mice (Fig. 3.1).
Figure 3.1 P2X4 and P2X7 expression in the normal and injured mouse spinal cord. A, Representative immunoblots of P2X4 and P2X7 receptor expression after SCI. B, Densitometric analysis indicates that P2X4 protein expression is increased after SCI. The P2X4 protein was not detected in P2X4-KO mice. C, P2X7 expression is not altered in P2X4-KO animals when compared to wild type (WT) animals. Moreover, the levels of P2X7 increased at 6 h after SCI (N=5 per group). Data are presented as mean + s.e.m. * p < 0.05 compared to P2X4-KO animals. † P < 0.05 compared to sham animals.
143
As shown in Figure 3.2, active caspase-1 and IL-1β were elevated after SCI in both WT
and ko mice after SCI, but the levels of these proteins were significantly higher in WT
animals when compared to P2X4-KO mice. In contrast, levels of active IL-18 were not
significantly altered following SCI in either WT or P2X4-KO mice. These results indicate
that P2X4 is involved in inflammasome activation after SCI.
Figure 3.2 Increased expression of bioactive caspase-1 and IL-1ß is reduced in the injured spinal cord of P2X4-knockout mice. A, Representative immunoblots of caspase-1, IL-1ββ and IL-18 after SCI. B-D, Densitometric analysis indicates that both caspase-1 (B) and IL-1ββ (C) are decreased in the P2X4-KO when compared to WT animals. Levels of IL-18 (D) are not altered in P2X4-KO animals when compared to WT animals (N=5 per group). Data are presented as mean + s.e.m. * p < 0.05 compared to P2X4-KO animals. † P < 0.05 compared to sham animals.
144
3.5.2. P2X4 is expressed in neurons of the dorsal horn and medial grey
To investigate which cell type(s) express P2X4 in the normal and injured mouse spinal
cord, we took advantage of the fact that the reporter gene ß-Gal was inserted in place of the
first exon of P2X4 in P2X4-KO animals. ß-Gal expression in the mouse spinal cord was
examined using multiple immunofluorescence confocal microscopy. As demonstrated in
Figure 3.3, no ß-Gal signal was detected in the spinal cord of C57BL/6 (negative control)
mice. In contrast, ß-Gal immunostaining was clearly detected in the spinal cord of P2X4-
KO mice, with expression mainly located in the dorsal horn and medial gray areas.
Combination of ß-Gal immunostaining with immunofluorescence markers of neurons
(HuC/HuD), astrocytes (GFAP), and microglia (CD11b) revealed that mostly all ß-Gal+
cells also expressed the neuronal marker HuC/HuD (Fig. 3.3C-E). Importantly, neurons
were found to be the main, if not the only, cell type expressing ß-Gal in both the normal
and injured mouse spinal cord (Fig. 3.3F-H). This expression pattern was observed until at
least day 3 post-SCI, the latest time point examined in colocalization experiments. These
findings were confirmed using a second antibody specific for neurons, NeuN (data not
shown).
145
Figure 3.3 ß-galactosidase staining is localized in neurons in the normal and injured spinal cord of P2X4-KO mice. A-B, Representative confocal photomicrographs showing ß-Gal immunostaining (green) in the spinal cord of naive C57BL/6 (negative control) and P2X4-KO mice. Note that in P2X4-KO mice the ß-Gal reporter gene was inserted in place of the first exon of P2X4, meaning that the P2X4 promoter drives expression of ß-Gal in these animals. C-E, ß-Gal immunoreactivity (ir) colocalized with the neuronal marker HuC/HuD (red, C), but not with GFAP-ir astrocytes (red, D) and CD11b-ir microglia (red, E), in the spinal cord dorsal horn of naive P2X4-KO mice. F-H, ß-Gal expression colocalized with neurons, but not astrocytes and microglia, at 24 hours after SCI. Scale bars = (in B) A-B, 200 µm; (in H) C-H, 20 µm.
146
3.5.3. P2X4 deficiency in neural cells reduces inflammation at sites of SCI
To establish whether the anti-7/4 antibody may be appropriate for analysis of infiltration of
neutrophils and monocyte-derived M1 macrophages using immunohistochemistry, we first
confirmed that the 7/4 antigen (also referred to as Ly-6B (Rosas et al., 2010)) was
expressed in these two subsets of infiltrating myeloid cells, but that it was not present in
activated resident microglia. To accomplish this aim, we used flow cytometry, which
allows simultaneous analysis of several different markers in individual cells in a
quantitative manner. Additionally this approach took advantage of the fact that infiltrating
blood-derived leukocytes and microglia express different levels (high vs. dim) of the
leukocyte common antigen CD45 (Sedgwick et al., 1991; Babcock et al., 2003). As shown
in Figure 3.4A, CD45hi CD11b+ Ly-6C+ Ly-6G+ neutrophils and CD45hi CD11b+ Ly-6Chi
Ly-6G- monocyte-derived M1 macrophages expressed 7/4 at high intensity, whereas the 7/4
antigen was absent in CD45dim CD11b+ Ly-6C- Ly-6G- microglia.
147
Figure 3.4 P2X4 deficiency in neural cells reduces neutrophil and M1 monocyte infiltration at sites of SCI. A, Evaluation of 7/4 as a specific marker for blood-derived neutrophils and M1 macrophages. Expression of 7/4 in neutrophils (green; CD45hi CD11b+ Ly-6C+ Ly-6G+), M1 macrophages (blue; CD45hi CD11b+ Ly-6Chi Ly-6G-), and microglia (red; CD45dim CD11b+ Ly-6C- Ly-6G-) isolated by flow cytometry from the spinal cord of a C57BL/6 mouse at 12 hours post-SCI (data are representative of N=6 mice). The fluorescence-minus-one (FMO) negative control for 7/4 (i.e. all antibodies minus the PE-conjugated anti-7/4 antibody; CD45+CD11b+ gated cells) is shown in the far right panel. B, Quantification of the number of neutrophils and proinflammatory M1 macrophages, as visualized by immunostaining of the 7/4 antigen, at various rostral (R) and caudal (C) distances from the lesion epicenter at 12 hours post-SCI (N=9-11 per group). C-D, Representative bright-field photomicrographs showing 7/4 immunolabeling in the spinal cord of WT (C) and P2X4-KO (D) mice at 12 hours after SCI. The central canal (cc) in panels C-D is identified by dashed lines. E, Representative bright-field photomicrograph showing the absence of 7/4+ cells in the spinal cord of a non-injured WT —> WT chimeric mouse at 12 h post-laminectomy. F, Photomicrograph showing several 7/4+ cells closely associated with spinal cord blood vessels in a WT —> WT chimeric mouse at 6 h post-SCI. Dashed boxes delimit blood vessels. G, Quantification of 7/4+ neutrophils
148
and M1 macrophages in the spinal cord of WT —> WT, WT —> P2X4-KO, and P2X4-KO —> WT bone marrow chimeras at 12 hours post-SCI (N=4 per group). ***p < 0.001, **p < 0.01, and *p < 0.05, significant difference between WT and P2X4-ko mice (B). ***p < 0.001, **p < 0.01, and *p < 0.05, significant difference between WT —> WT and WT —> P2X4-KO chimeric mice (G). †††p < 0.001, ††p < 0.01, and †p < 0.05, significant difference between P2X4-KO —> WT and WT —> P2X4-KO chimeric mice (G). Scale bars: (in D) C-D, 50 µm; (in F) E-F, 50 µm.
To determine whether deficiency in P2X4 affects the immune cell infiltration at the injury
site, we next quantified the number of neutrophils and proinflammatory M1 macrophages
identified by 7/4 immunolabeling in tissue sections from P2X4-KO and WT mice (Fig.
3.4B-D). At 12 hours after SCI, approximately 1123 ± 72 cells expressing the 7/4 marker
were counted at the lesion epicenter in WT mice. This number was reduced by
approximately 25% in P2X4-KO mice, with an average of 855 ± 77 7/4+ cells at the lesion
epicenter. This effect was transient and the numbers of 7/4+ cells at the lesion epicenter
were not significantly different (ANOVA) between the two groups at 4 days post-SCI (data
not shown).
To confirm that P2X4 channels expressed in neural cells (as opposed to in bone marrow-
derived leukocytes) were involved in the initiation of neuroinflammation after SCI, we
investigated immune cell recruitment in irradiation bone marrow chimeras. First, we
confirmed that irradiation did not lead to the infiltration of 7/4+ cells in the spinal cord of
non-injured, laminectomized chimeric mice (Fig. 3.4E). However, the pattern of expression
was dramatically different after SCI in which 7/4+ cells were observed within the
perivascular spaces of spinal cord blood vessels as early as 6 h (Fig. 3.4F). At 12 h post-
SCI, WT mice that were reconstituted with either WT (WT –> WT) or P2X4-deficient
(P2X4-KO –> WT) bone marrow did not show a significant reduction in recruitment of
7/4+ neutrophils and monocyte-derived M1 macrophages (Fig. 3.4G). In contrast, P2X4-KO
mice reconstituted with WT bone marrow (WT –> P2X4-KO) had markedly reduced
immune cell infiltration at the injury site. These results confirm that P2X4 plays an
important role in neural cells, but not in bone marrow-derived cells, in the regulation of
innate immune cell infiltration at sites of SCI. Importantly, this conclusion would not have
been affected even if irradiation would have promoted the infiltration of bone marrow-
149
derived leukocytes in the spinal cord, as was suggested by others (Shechter et al., 2009;
Donnelly et al., 2011).
Using immunohistochemistry against Gal-3, we next examined microglial/macrophage
activation and found that it was reduced by approximately 50% in the spinal cord of P2X4-
KO mice compared with WT mice at 4 days post-SCI (Fig. 3.5A-C). By contrast, these
differences were not observed at 38 days (data not shown). To further explore the role of
P2X4 in the response of microglia and infiltrating macrophages, referred hereinafter as
monocyte-derived macrophages (Kigerl et al., 2009; Shechter et al., 2009), cells were
isolated from the injured spinal cord at 7 and 14 days and then characterized and quantified
by flow cytometry based on expression of the following markers: CD45, CD11b, Ly-6C,
MHCII, CD11c, iNOS, COX-2.
Figure 3.5 P2X4 deficiency attenuates microglial/macrophage activation after SCI. A, Quantification of microglial/macrophage activation, as visualized by galectin-3 immunolabeling, in the spinal cord of P2X4-KO and WT mice at 4 days post-SCI (N=5 per group). B-C, Representative bright-field photomicrographs showing galectin (Gal)-3 immunolabeling in the spinal cord of WT (B) and P2X4-KO (C) mice at a distance of 1176 µm rostral to the lesion at 4 days after SCI. D, Representative flow cytometry profiles showing the presence of monocyte-derived M1 macrophages (M1;
150
CD45hi CD11b+ Ly-6Chi), monocyte-derived M2 macrophages (M2; CD45hi CD11b+ Ly-6C-), neutrophils (N; CD45hi CD11b+ Ly-6C+), and microglia (CD45dim CD11b+ Ly-6C-) in the spinal cord of a C57BL/6 mouse at 7 days post-SCI (representative of N=6 mice per group per time point). CD45 levels (high vs. intermediate) were used to distinguish infiltrating blood-derived CD11b+ myeloid cells (CD45hi CD11b+; boxed region G1) from CD11b+ resident microglia (CD45dim CD11b+; boxed region G2). E, Quantification of proportions of M1 macrophages, M2 macrophages and microglia, relative to total CD45+ CD11b+ myeloid cells, in P2X4-KO and WT mice at 7 and 14 days post-SCI. Also shown in (E) are quantitative analyses of CD11c, MHCII, iNOS and COX-2 expression. ***p < 0.001, **p < 0.01, and *p < 0.05, significant difference between WT and P2X4-KO mice (A, E). Scale bar: (in C) B-C, 250 µm.
As shown in Fig. 3.5D-E, no significant changes in numbers of monocyte-derived M1
macrophages (CD45hi CD11b+ Ly-6Chi), monocyte-derived M2 macrophages (CD45hi
CD11b+ Ly-6C-), and microglia (CD45dim CD11b+ Ly-6C-) were detected between both
groups at 7-14 days post-SCI. With the exception of a modest, but significant, decrease in
the number of iNOS+ cells in the P2X4 group at 7 days, no obvious differences were
observed either in the phenotype of microglia and macrophage subsets between both mouse
strains. In agreement with Donnelly et al. (Donnelly et al., 2011), iNOS was mainly
detected in the CD11b+/Ly-6C- population. All together, these results suggest that the
immune response is attenuated and delayed in SCI P2X4-KO mice, thus supporting a role
of the inflammasome as an initiator of neuroinflammation after SCI.
3.5.4. P2X4-KO mice show improved histopathological outcomes when compared to
wild type mice
To determine if lack of P2X4 expression resulted in decreased tissue damage after SCI in
vivo, various groups of animals were subjected to SCI, sacrificed 4 days after injury and
lesion volume was measured. Spinal cord sections from P2X4-KO mice showed a
significant reduction in lesion volume after SCI when compared to injured WT mice (Fig.
3.6A), as determined by decreased immune cell infiltration, diminished white matter
degeneration and preservation of motor neuron morphology. These results are consistent
151
with the lower levels of inflammasome activation and decrease in IL-1β cytokine
production observed in P2X4-KO mice.
Figure 3.6 Spinal cord lesion volume and recovery of locomotor function are improved in P2X4-KO mice. A P2X4-KO mice had significantly reduced spinal cord tissue damage at 4 days after injury (N=5 per group). B-C, Locomotor function was assessed using the Basso Mouse Scale (BMS) (B) and BMS subscore (C) over a 35-day period after SCI (N=10 mice/group). D, The modified grip walk (GW) test was also used to assess hind-paw function, and the number of hind-paw grips on the grid walk counted at 8, 15, 22, 29 and 36 days post-injury (N=10 mice/group). The GW test was performed using three different patterns: easy, medium, and hard. The total number of grips for the three different patterns is presented in D. E, Impact force (kdyn) and spinal cord tissue displacement (µm) at the time of the contusion injury for all animals included in behavioral analyses. *** p < 0.001, ** p < 0.01, and * p < 0.05 compared
152
with SCI WT (C57BL/6) mice; 2-way repeated-measures ANOVA, Bonferroni post-test.
3.5.5. Functional recovery after SCI is improved in P2X4-KO mice when compared to
wild type mice
We next examined whether deletion of the P2X4 gene affects locomotor recovery after
SCI. Evaluation was performed in an open-field using the 9-point BMS scale and the 11-
point BMS subscores. Uninjured P2X4-KO and WT (C57BL/6) mice performed flawlessly
in these tests and received perfect scores on the BMS and BMS subscore scales. However,
after a moderate (50 kdyn) traumatic SCI (Fig. 3.6B) P2X4-KO mice performed
significantly better than WT mice at 1 and 3 days post-SCI. At 3 days post-SCI, more than
80% of P2X4-KO mice regained occasional plantar stepping (score ≥ 4 on the BMS)
compared with only 30% in control mice. Importantly, significant improvements in specific
aspects of locomotion such as coordination, paw position and trunk stability were observed
between P2X4-KO mice (average subscore of 6.8 ± 0.5 at 35 days post-SCI) and WT mice
(5.0 ± 0.4) at the conclusion of behavioral testing (Fig. 3.6C). Early recovery of forelimb-
hindlimb coordination after SCI was confirmed in P2X4-KO mice compared with WT mice
using the grip walk test (Fig. 3.6D). The severity of SCI was almost identical between both
groups, with an average force applied of 51.9 ± 0.8 kdyn for WT mice vs. 51.9 ± 0.7 kdyn
for P2X4-KO mice (Fig. 3.6E). Moreover, the average spinal cord tissue displacement did
not differ significantly (ANOVA) between groups with 357.6 ± 12.6 µm for WT mice
compared to 392.5 ± 17.4 µm for P2X4-KO mice. Thus, lack of expression of P2X4 results
in improved behavioral outcomes after SCI.
3.6. Discussion In this study, we show that deletion of P2X4 in mice results in decreased innate immune
responses following SCI compared to wild type animals. These decreased inflammatory
responses involve a significant reduction in inflammasome activation in neurons as
determined by decreased cleavage of caspase-1 and production of IL-1β, and decreased
infiltration of innate immune cells into the injury site acutely after SCI. The reduction in
153
inflammatory processes was transient in nature, but resulted in significant improvements in
histopathological and functional outcomes. Our findings suggest that blocking neuronal
P2X4 acutely after SCI may be an effective means to prevent the detrimental effects of
inflammation and loss of neurological function after trauma.
To investigate which CNS cell type(s) express P2X4 in the normal and injured mouse
spinal cord, we took advantage of the finding that the P2X4 promoter drives ß-Gal
expression in P2X4-KO animals. This approach also served to get around the difficult
problem that all commercially available anti-P2X4 antibodies tested produced positive
immunostaining in spinal cord tissue from P2X4-KO mice (de Rivero Vaccari et al.,
personal observation). Therefore, commercial antibodies were not reliable for detection of
P2X4 immunoreactivity in the mouse CNS, but rather ß-Gal immunodetection proved to
better measure of P2X4 cell type expression. Our results demonstrate that the co-
localization of ß-Gal immunostaining was almost exclusively observed within neurons and
not astrocytes or microglia. Thus, in both the normal and injured spinal cord, P2X4 is
mainly expressed in neurons. However, our results do not rule out the possibility that cells
that would normally express P2X4 fail to infiltrate in the spinal cord, either in the control
state or after SCI, due to lack of the receptor. In this case, such cells would not be seen in
ko animals, in spite of their possible relevance to outcome.
We have previously shown that the NOD-like receptor complex NLRP1 inflammasome is
expressed in neurons of the spinal cord. The NLRP1 inflammasome activates caspase-1,
resulting in production of IL-1β and IL-18 (de Rivero Vaccari et al., 2008). In this study,
animals lacking P2X4 showed lower levels of inflammasome activation as determined by
decreased levels of active caspase-1 and IL-1β. However, the levels of IL-18 did not
significantly differ between wild type animals and knockouts. This finding suggests that IL-
1β and IL-18 are regulated by different signaling mechanisms after SCI. In support of this
idea are reports demonstrating that in addition to regulation by the inflammasome, IL-18
levels are influenced by exogenous hormones (Park et al., 2005a; Park et al., 2005b; Park et
al., 2007).
154
P2X4 forms heteromeric interactions with another purinergic receptor, P2X7 (Guo et al.,
2007). In the present study, the protein expression levels of P2X7 were not affected in the
P2X4-KO mice after SCI, suggesting that P2X4 is not necessary for the regulation of P2X7
in the spinal cord. However, P2X7 is an ATP activated receptor involved in the
inflammatory response after SCI (Wang et al., 2004; Peng et al., 2009). Moreover, P2X7
interacts with pannexin-1 and the inflammasome in CNS cells (Silverman et al., 2009).
Therefore, more detailed studies involving protein associations of P2X4 and P2X7 with
inflammasomes are needed to establish more precise regulation of inflammasome responses
after SCI.
Deletion of P2X4 also significantly diminished the number of neutrophils and monocyte-
derived M1 macrophages that infiltrated the injury site after SCI. P2X4-KO animals
showed a 25% decrease in the amount of infiltrated neutrophils and M1 macrophages in the
spinal cord at 12 h post-injury and a 50% decrease in the amount of microglial/macrophage
activation at 4 days. Importantly, studies using irradiation bone marrow chimeras revealed
that the P2X4 was required on radioresistant (i.e. non-bone marrow-derived), but not
radiosensitive (i.e. bone marrow-derived) host cells for modulating innate immune cell
entry into the damaged spinal cord. Taken together with our previous work that showed that
the IL-1R1/MyD88 signaling pathway triggers innate immune cell infiltration after SCI
(Pineau et al., 2010), these results suggest that one of the cellular sources of IL-1β in the
injured spinal cord are neurons and that activation of P2X4 is critical for inflammatory cell
infiltration. The relationship between inflammation and the pathogenesis of SCI remains
controversial in that mounting evidence shows that some subsets of immune cells may
support regeneration whereas others may cause neurotoxicity (Gensel et al., 2009; Kigerl et
al., 2009; Stirling et al., 2009). A recent cell depletion study has demonstrated quite
convincingly that preventing the recruitment of both neutrophils and monocytes that
differentiate into proinflammatory M1 macrophages is beneficial for functional recovery
after injury (Lee et al., 2011).
Previous reports have mainly discussed the effects of ATP stimulation of P2X4 that results
in increased intracellular calcium concentrations, activation of mitogen-activated protein
155
kinases and release of proinflammatory cytokines (Ferrari et al., 1997; Schwiebert et al.,
2002). P2X4 receptor activation has been suggested to mediate synaptic transmission
(North, 2002), and P2X4 signaling may play a critical role in the inflammatory responses in
the pathology of brain tumors, neuropathic pain and multiple sclerosis (Guo et al., 2004;
Guo and Schluesener, 2005; Guo et al., 2006; Ulmann et al., 2008). Our study shows that
P2X4-KO animals have lower levels of caspase-1 activation and IL-1β cleavage, resulting
in significant improvement in tissue sparing and functional recovery. The improvements in
functional outcomes were predominantly observed during the first week post-injury,
suggesting that the deleterious inflammatory processes mediated by P2X4 activation occur
during the acute phase after SCI. Interestingly, only neurons were found to express P2X4 in
the spinal cord during the acute phase after SCI. However, other groups have reported that
activated microglia in the spinal cord upregulate P2X4 expression after peripheral (sciatic)
nerve injury, although the increased expression peaked during the second week post-lesion
in this particular model (Cavaliere et al., 2003; Tsuda et al., 2003; Schwab et al., 2005;
Ulmann et al., 2008). In the chronic phase after SCI, P2X4 does not seem to play a
significant role, yet the improved functional recovery observed in P2X4-KO compared with
wild type mice was maintained up to at least day 35. We propose that blocking neuronal
P2X4 early after SCI may be an effective means for preventing the detrimental effects of
inflammation and loss of neurological function in a variety of CNS injuries including
traumatic brain injury, ischemia and SCI.
3.7. References
Auffray C, Fogg D, Garfa M, Elain G, Join-Lambert O, Kayal S, Sarnacki S, Cumano A,
Lauvau G, Geissmann F (2007) Monitoring of blood vessels and tissues by a
population of monocytes with patrolling behavior. Science 317:666-670.
Babcock AA, Kuziel WA, Rivest S, Owens T (2003) Chemokine expression by glial cells
directs leukocytes to sites of axonal injury in the CNS. J Neurosci 23:7922-7930.
Barrette B, Hebert MA, Filali M, Lafortune K, Vallieres N, Gowing G, Julien JP, Lacroix S
(2008) Requirement of myeloid cells for axon regeneration. J Neurosci 28:9363-
9376.
156
Basso DM, Fisher LC, Anderson AJ, Jakeman LB, McTigue DM, Popovich PG (2006)
Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord
injury in five common mouse strains. J Neurotrauma 23:635-659.
Buell G, Lewis C, Collo G, North RA, Surprenant A (1996) An antagonist-insensitive P2X
receptor expressed in epithelia and brain. EMBO J 15:55-62.
Burnstock G (2007) Physiology and pathophysiology of purinergic neurotransmission.
Physiol Rev 87:659-797.
Casas-Pruneda G, Reyes JP, Perez-Flores G, Perez-Cornejo P, Arreola J (2009) Functional
interactions between P2X4 and P2X7 receptors from mouse salivary epithelia. J
Physiol 587:2887-2901.
Cavaliere F, Florenzano F, Amadio S, Fusco FR, Viscomi MT, D'Ambrosi N, Vacca F,
Sancesario G, Bernardi G, Molinari M, Volonte C (2003) Up-regulation of P2X2,
P2X4 receptor and ischemic cell death: prevention by P2 antagonists. Neuroscience
120:85-98.
Coull JA, Beggs S, Boudreau D, Boivin D, Tsuda M, Inoue K, Gravel C, Salter MW, De
Koninck Y (2005) BDNF from microglia causes the shift in neuronal anion gradient
underlying neuropathic pain. Nature 438:1017-1021.
de Rivero Vaccari JP, Lotocki G, Marcillo AE, Dietrich WD, Keane RW (2008) A
molecular platform in neurons regulates inflammation after spinal cord injury. J
Neurosci 28:3404-3414.
Donnelly DJ, Longbrake EE, Shawler TM, Kigerl KA, Lai W, Tovar CA, Ransohoff RM,
Popovich PG (2011) Deficient CX3CR1 signaling promotes recovery after mouse
spinal cord injury by limiting the recruitment and activation of Ly6Clo/iNOS+
macrophages. J Neurosci 31:9910-9922.
Ferrari D, Chiozzi P, Falzoni S, Dal Susino M, Melchiorri L, Baricordi OR, Di Virgilio F
(1997) Extracellular ATP triggers IL-1 beta release by activating the purinergic P2Z
receptor of human macrophages. J Immunol 159:1451-1458.
Gensel JC, Nakamura S, Guan Z, van Rooijen N, Ankeny DP, Popovich PG (2009)
Macrophages promote axon regeneration with concurrent neurotoxicity. J Neurosci
29:3956-3968.
157
Gordon S, Taylor PR (2005) Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat Rev Immunol
5:953-964.
Guo C, Masin M, Qureshi OS, Murrell-Lagnado RD (2007) Evidence for functional
P2X4/P2X7 heteromeric receptors. Mol Pharmacol 72:1447-1456.
Guo LH, Schluesener HJ (2005) Lesional accumulation of P2X(4) receptor(+) macrophages
in rat CNS during experimental autoimmune encephalomyelitis. Neuroscience
134:199-205.
Guo LH, Trautmann K, Schluesener HJ (2004) Expression of P2X4 receptor in rat C6
glioma by tumor-associated macrophages and activated microglia. J Neuroimmunol
152:67-72.
Guo LH, Guo KT, Wendel HP, Schluesener HJ (2006) Combinations of TLR and NOD2
ligands stimulate rat microglial P2X4R expression. Biochem Biophys Res Commun
349:1156-1162.
Kigerl KA, Gensel JC, Ankeny DP, Alexander JK, Donnelly DJ, Popovich PG (2009)
Identification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing
either neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord. J Neurosci
29:13435-13444.
Kriz J, Gowing G, Julien JP (2003) Efficient three-drug cocktail for disease induced by
mutant superoxide dismutase. Ann Neurol 53:429-436.
Lalancette-Hebert M, Gowing G, Simard A, Weng YC, Kriz J (2007) Selective ablation of
proliferating microglial cells exacerbates ischemic injury in the brain. J Neurosci
27:2596-2605.
Lee SM, Rosen S, Weinstein P, van Rooijen N, Noble-Haeusslein LJ (2011) Prevention of
both neutrophil and monocyte recruitment promotes recovery after spinal cord
injury. J Neurotrauma 28:1893-1907.
Nadeau S, Filali M, Zhang J, Kerr BJ, Rivest S, Soulet D, Iwakura Y, de Rivero Vaccari JP,
Keane RW, Lacroix S (2011) Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury is
Dependent on the Pro-Inflammatory Cytokines IL-1{beta} and TNF: Implications
for Neuropathic Pain. J Neurosci 31:12533-12542.
Nahrendorf M, Swirski FK, Aikawa E, Stangenberg L, Wurdinger T, Figueiredo JL, Libby
P, Weissleder R, Pittet MJ (2007) The healing myocardium sequentially mobilizes
158
two monocyte subsets with divergent and complementary functions. J Exp Med
204:3037-3047.
North RA (2002) Molecular physiology of P2X receptors. Physiol Rev 82:1013-1067.
Pajoohesh-Ganji A, Byrnes KR, Fatemi G, Faden AI (2010) A combined scoring method to
assess behavioral recovery after mouse spinal cord injury. Neurosci Res 67:117-
125.
Park HJ, Kim HJ, Lee JY, Cho BK, Gallo RL, Cho DH (2007) Adrenocorticotropin
hormone stimulates interleukin-18 expression in human HaCaT keratinocytes. J
Invest Dermatol 127:1210-1216.
Park HJ, Kim HJ, Lee JH, Lee JY, Cho BK, Kang JS, Kang H, Yang Y, Cho DH (2005a)
Corticotropin-releasing hormone (CRH) downregulates interleukin-18 expression in
human HaCaT keratinocytes by activation of p38 mitogen-activated protein kinase
(MAPK) pathway. J Invest Dermatol 124:751-755.
Park HS, Kim Y, Lee C (2005b) Single nucleotide variants in the beta2-adrenergic and
beta3-adrenergic receptor genes explained 18.3% of adolescent obesity variation. J
Hum Genet 50:365-369.
Peng W, Cotrina ML, Han X, Yu H, Bekar L, Blum L, Takano T, Tian GF, Goldman SA,
Nedergaard M (2009) Systemic administration of an antagonist of the ATP-
sensitive receptor P2X7 improves recovery after spinal cord injury. Proc Natl Acad
Sci U S A 106:12489-12493.
Pineau I, Lacroix S (2007) Proinflammatory cytokine synthesis in the injured mouse spinal
cord: Multiphasic expression pattern and identification of the cell types involved. J
Comp Neurol 500:267-285.
Pineau I, Sun L, Bastien D, Lacroix S (2010) Astrocytes initiate inflammation in the injured
mouse spinal cord by promoting the entry of neutrophils and inflammatory
monocytes in an IL-1 receptor/MyD88-dependent fashion. Brain Behav Immun
24:540-553.
Reichert F, Rotshenker S (1999) Galectin-3/MAC-2 in experimental allergic
encephalomyelitis. Exp Neurol 160:508-514.
159
Rosas M, Thomas B, Stacey M, Gordon S, Taylor PR (2010) The myeloid 7/4-antigen
defines recently generated inflammatory macrophages and is synonymous with Ly-
6B. J Leukoc Biol 88:169-180.
Schwab JM, Guo L, Schluesener HJ (2005) Spinal cord injury induces early and persistent
lesional P2X4 receptor expression. J Neuroimmunol 163:185-189.
Schwiebert LM, Rice WC, Kudlow BA, Taylor AL, Schwiebert EM (2002) Extracellular
ATP signaling and P2X nucleotide receptors in monolayers of primary human
vascular endothelial cells. Am J Physiol Cell Physiol 282:C289-301.
Sedgwick JD, Schwender S, Imrich H, Dorries R, Butcher GW, ter Meulen V (1991)
Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and
inflamed central nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A 88:7438-7442.
Shechter R, London A, Varol C, Raposo C, Cusimano M, Yovel G, Rolls A, Mack M,
Pluchino S, Martino G, Jung S, Schwartz M (2009) Infiltrating blood-derived
macrophages are vital cells playing an anti-inflammatory role in recovery from
spinal cord injury in mice. PLoS Med 6:e1000113.
Silverman WR, de Rivero Vaccari JP, Locovei S, Qiu F, Carlsson SK, Scemes E, Keane
RW, Dahl G (2009) The pannexin 1 channel activates the inflammasome in neurons
and astrocytes. J Biol Chem 284:18143-18151.
Soto F, Garcia-Guzman M, Gomez-Hernandez JM, Hollmann M, Karschin C, Stuhmer W
(1996) P2X4: an ATP-activated ionotropic receptor cloned from rat brain. Proc Natl
Acad Sci U S A 93:3684-3688.
Stirling DP, Liu S, Kubes P, Yong VW (2009) Depletion of Ly6G/Gr-1 leukocytes after
spinal cord injury in mice alters wound healing and worsens neurological outcome.
J Neurosci 29:753-764.
Tsuda M, Shigemoto-Mogami Y, Koizumi S, Mizokoshi A, Kohsaka S, Salter MW, Inoue
K (2003) P2X4 receptors induced in spinal microglia gate tactile allodynia after
nerve injury. Nature 424:778-783.
Ulmann L, Hatcher JP, Hughes JP, Chaumont S, Green PJ, Conquet F, Buell GN, Reeve
AJ, Chessell IP, Rassendren F (2008) Up-regulation of P2X4 receptors in spinal
microglia after peripheral nerve injury mediates BDNF release and neuropathic
pain. J Neurosci 28:11263-11268.
160
Wang X, Arcuino G, Takano T, Lin J, Peng WG, Wan P, Li P, Xu Q, Liu QS, Goldman
SA, Nedergaard M (2004) P2X7 receptor inhibition improves recovery after spinal
cord injury. Nat Med 10:821-827.
Weinhold K, Krause-Buchholz U, Rodel G, Kasper M, Barth K (2010) Interaction and
interrelation of P2X7 and P2X4 receptor complexes in mouse lung epithelial cells.
Cell Mol Life Sci 67:2631-2642.
Zhang Z, Artelt M, Burnet M, Trautmann K, Schluesener HJ (2006) Lesional accumulation
of P2X4 receptor+ monocytes following experimental traumatic brain injury. Exp
Neurol 197:252-257.
161
4. Chapitre 4
IL-1α gene deletion protects oligodendrocytes after spinal cord injury through upregulation of survival factor Tox3
Dominic Bastien1, Victor Bellver Landete1, Martine Lessard1, Nicolas Vallières1, Akira Takashima2, Yannick Doyon1, and Steve Lacroix1
1Centre de recherche du Centre hospitalier de l'Université Laval and Département de Médecine Moléculaire, Université Laval, Québec, Québec, Canada; 2Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Toledo College of Medicine, Toledo, OH, USA
162
4.1. Résumé Les lésions de la moelle épinière (LME) entraînent la relâche de signaux de danger par les
cellules nécrotiques, un processus qui mène à la neuroinflammation. Des études suggèrent
que l’inflammation joue un role dans les dommages mais aussi dans la réparation du tissu
nerveux. Dans notre étude, nous avons étudié la synthèse, la relâche et les fonctions de
l’IL-1α et l’IL-1β dans la neuroinflammation, les dommages tissulaires et la récupération
locomotrice suite à une LME. Nous avons démontré que les microglies situées au site de
lésion expriment rapidement l’IL-1α, tandis que les neutrophiles (Ly6G+ 7/4+) et les
macrophages dérivés des monocytes infiltrants (Ly6Chi 7/4+) produisent l’IL-1β. Bien que
l’infiltration de ces 2 types cellulaires fut également réduite chez les souris Il-1α-/- et Il-1β-
/- comparée aux souris sauvages, les souris Il-1α-/- présentaient une plus grande
amélioration locomotrice dès le jour 1 post-LME. Cette récupération a persisté à travers le
temps et corrélé avec un volume de lésion plus petit. L’analyse du transcriptome des
cellules du tissus nerveux à 1 jour post-LME a permis d’identifier 18 transcrits qui furent
différentiellement régulés chez les souris Il-1α-/- comparativement aux souris Il-1β-/- et
sauvages, parmi lesquels se retrouve le facteur de survie cellulaire TOX3. En absence d’IL-
1a, les souris ont présenté des niveaux plus élevés de TOX3 dans leurs oligodendrocytes et
ce dès le jour 10 post-natal, un effet qui a persisté jusqu’à l’âge adulte. L’analyse de la
moelle épinière en développement de souris sauvages a révélé que les niveaux d’ARNm de
l’IL-1α mais pas de l’IL-1β augmentent drastiquement entre les jours P5 et P10, coïncidant
avec une période critique de l’activation microgliale et de l’initiation de la myélinisation.
Chez les souris Il-1α-/- adultes, la survie des oligodendrocytes fut significativement plus
élevée comparativement aux sourisIl-1β-/- et sauvages au jour 1 post-LME. Nous avons
donc démontré pour la première fois que l’absence de l’IL-1α chez la souris réduit
l’expression du facteur de survie TOX3 chez les oligodendrocytes, suggérant que
l’inhibition de cette cytokine pourrait réduire la dégénérescence suite à un traumatisme du
SNC ou certaines maladies neurodégénératives.
163
4.2. Abstract Spinal cord injury (SCI) causes the release of danger signals by stressed and dying cells, a
process that leads to neuroinflammation. Evidence suggests that inflammation plays a role
in both damage and repair of injured neural tissue. Here, we have studied the synthesis,
release mechanisms and function of IL-1α and IL-1β in neuroinflammation, tissue damage
and recovery after SCI. We found that microglia at sites of injury rapidly express IL-1α,
and that infiltrating Ly6G+ 7/4+ neutrophils and Ly6Chi 7/4+ monocyte-derived M1
macrophages subsequently produce IL-1β. While infiltration of these two cell types was
equally reduced in IL-1α-/- and IL-1β-/- mice compared to wild-type (WT), IL-1α-/- mice
exhibited better locomotor recovery as early as day 1 post-SCI. This early recovery seen in
IL-1α-/- mice persisted over time and correlated with reduced lesion volume. Transcriptome
analysis of SCI tissue at day 1 identified 18 transcripts differentially regulated in IL-1α-/-
mice compared with IL-1β-/- and WT, among which is the survival factor TOX3. IL-1α-/-
mice have markedly increased levels of TOX3 in their oligodendrocytes, beginning at
postnatal day (P) 10 and persisting through adulthood. An examination of the developing
spinal cord of WT mice revealed that mRNA levels for IL-1α, but not IL-1β, are
dramatically increased between P5 and P10, coinciding with a critical period of microglial
activation and the beginning of myelination. In adult spinal cord of IL-1α-/- mice,
oligodendrocyte survival was significantly increased compared to IL-1β-/- and WT at day 1
post-SCI. Thus, we show for the first time that IL-1α represses expression of the survival
factor TOX3 in oligodendrocytes, suggesting that inhibiting IL-1α may help reduce
neurodegeneration during CNS insult and neurodegenerative disease.
164
4.3. Introduction Spinal cord injury (SCI) can lead to loss of motor and sensory function in the lower and/or
upper limbs. At the site of injury, the pathology is divided into two major chronological
events: the primary and secondary lesions. The second wave of tissue destruction that
follows the primary mechanical insult is believed to be caused by a complex series of
events leading to apoptosis, including ischemia, vascular damage, glutamate excitotoxicity,
ionic dysregulation, inflammation, free radical generation, and cytokine and protease
production (David and Lacroix, 2005). Damage to the CNS is associated with an almost
immediate response of microglia (Davalos et al., 2005). Astrocytes, the main cellular
component of the glial scar, also react quickly by exhibiting changes in gene expression,
hypertrophy, and process extension (Sofroniew, 2009). The glial scar has been shown to
have both protective and detrimental functions in the context of SCI (Faulkner et al., 2004,
Brambilla et al., 2005, Brambilla et al., 2009).
Innate immune cells such as neutrophils and monocytes are rapidly recruited at sites of SCI
(Fleming et al., 2006, Stirling and Yong, 2008, Pineau et al., 2010, Lee et al., 2011, Thawer
et al., 2013). Evidence suggests that these cells could play a key role in both damage and
repair of neural tissue after an injury or ischemia (Barrette et al., 2008, Kigerl et al., 2009,
Shechter et al., 2009, Stirling et al., 2009, Allen et al., 2012). The apparent contradictions
between these studies may be due to the fact that different subsets of immune cells have
divergent effects causing either neurotoxicity or regeneration in the injured spinal cord
(David and Kroner, 2011, Bastien and Lacroix, 2014). A better understanding of the roles
of the various subsets of immune cells and the identification of the endogenous factors
stimulating their recruitment is key for the development of efficient immunotherapies.
One important family of cytokines playing a key role in neurodegeneration is the
interleukin (IL)-1 family (Allan and Rothwell, 2001, Allan et al., 2005). Two of the
members of this large family, IL-1α and IL-1β, are believed to exert similar
proinflammatory actions by binding to the IL-1 type I receptor (IL-1R1). Work done by the
Rock group has shown that IL-1α rather than IL-1β is required for neutrophil recruitment
during cell death-induced sterile inflammation (Chen et al., 2007). However, a more recent
165
study by the same group now suggests that both IL-1α and IL-1β produced by tissue
resident macrophages are important for this response (Kono et al., 2010).
IL-1β has been proven to be important in the development and progression of a number of
autoinflammatory and CNS diseases (Allan et al., 2005, Dinarello, 2011). Apart from its
role in the initiation of gliosis and inflammation (Basu et al., 2002), studies have linked IL-
1β to the production of growth factors by CNS resident cells in various disease/injury
models (Herx et al., 2000, Albrecht et al., 2002, Albrecht et al., 2003, Amankulor et al.,
2009). Other evidence indicates that IL-1β likely plays an important role in CNS
remyelination by regulating multiple stages of oligodendrocyte development (Mason et al.,
2001).
In this study, we have analyzed the source, synthesis and release mechanisms, and
roles of IL-1α and IL-1β in the context of traumatic SCI. Furthermore, we have identified
some of the genes and proteins that are regulated by these two cytokines after SCI. Finally,
we have evaluated the effects of blocking IL-1α and IL-1β on neuroinflammation, tissue
damage and functional recovery. Importantly, we uncovered a dual role for IL-1α not only
in promoting neuroinflammation after SCI, but also in repressing a key survival factor in
oligodendrocytes. Blocking this cytokine may therefore be a promising therapeutical
avenue to prevent loss of CNS cells following SCI and other neurodegenerative conditions.
4.4. Materials and methods
4.4.1. Animal A total of 249 adult mice were used in this study. C57BL/6 mice, used as controls, were
purchased from Charles River Laboratories (St-Constant, QC, Canada). IL-1α-, IL-1β-, and
IL-1α/β-knockout (KO) were obtained from Dr. Yoichiro Iwakura (Institute of Medical
Science, University of Tokyo, Japan) and have been previously described (Horai et al.,
1998). Breeders for the pIL1β-DsRed transgenic mouse line were obtained from Dr. Akira
Takashima (University of Toledo College of Medicine, Toledo, OH) and bred in-house at
166
the Animal Research Facility of the CHUL Research Center and genotyped according to
the method published by Matsushima et al. (Matsushima et al., 2010). Finally, CX3CR1-
eGFP transgenic mice were purchased from The Jackson Laboratory. All mice had free
access to food and water.
4.4.2. Spinal cord injury C57BL/6 (n = 65), IL-1α-KO (n = 67), IL-1β-KO (n = 65), IL-1α/β-KO (n = 26), pIL1β-
DsRed (n = 8) and CX3CR1-eGFP (n = 18) mice were anesthetized with isoflurane and
underwent a laminectomy at vertebral level T9-10, which corresponds to spinal segment
T10-11. Briefly, the vertebral column was stabilized and a contusion of 50 kdyn was
performed using the Infinite Horizon (IH) SCI device (Precision Systems &
Instrumentation, Lexington, KY). Animals used for quantification of immune cells, either
by IF or by flow cytometry, received a 70-kdyn injury. Overlying muscular layers were
then sutured and cutaneous layers stapled. Post-operatively, animals received manual
bladder evacuation twice daily to prevent urinary tract infections. Depending on the
experiment performed, SCI mice were sacrificed by perfusion at 1, 3, 4, 6, 12 and 24 hours,
and 3, 4 and 36 days post-contusion. All surgical procedures were approved by the Laval
University Animal Care Committee and followed Canadian Council on Animal Care
guidelines.
4.4.3. Flow cytometry Cells freshly isolated from the spinal cord of injured mice were analyzed using flow
cytometry following our previously published method (De Rivero Vaccari et al., 2012).
Briefly, animals were transcardially perfused with cold Hanks’ balanced salt solution
(HBSS) to remove immune cells from the vasculature, their spinal cords dissected out, and
a 1-cm segment centered at the site of the lesion isolated and mechanically homogenized
with a small tissue grinder. Cells were filtered through a 40-µm nylon mesh cell strainer
(BD Bioscience, Mississauga, ON, Canada), centrifuged at 200g for 10 min, washed once
with HBSS, and resuspended with HBSS containing 20% fetal bovine serum (FBS; Sigma-
Aldrich Canada Ltd.). For multicolor immunofluorescent labeling, cells were incubated
167
with Mouse Fc Block (i.e., purified anti-mouse CD16/CD32; BD Bioscience) for 5 min in
order to prevent nonspecific binding, followed by labeling for 30 min at room temperature
with the following fluorescently conjugated primary antibodies: PerCP-conjugated anti-
CD45 (1:33, BD Biosciences), BD HorizonTM V450-conjugated anti-CD11b (1:66, BD
Biosciences), FITC-conjugated anti-Ly-6C (1:100, BD Biosciences), PE-Cy7-conjugated
anti-Ly-6G (1:100, BD Biosciences), and PE-conjugated anti-7/4 (1:20, AbD Serotec) (for
a full description of these primary antibodies, please refer to our published work (Nadeau et
al., 2011)). Cells were analyzed using FlowJo software (v. 9.2; Tree Star Inc.) on a FACS
LSRII flow cytometer (BD Biosciences). Myeloid cells were identified based on their
expression of CD45, CD11b, Ly-6C, and Ly-6G, as follows: neutrophils, CD45hi CD11b+
Ly-6C+ Ly-6G+; monocyte-derived M1 macrophages, CD45hi CD11b+ Ly-6Chi Ly-6G-;
microglia, CD45dim CD11b+ Ly-6C- Ly-6G- (De Rivero Vaccari et al., 2012).
4.4.4. Tissue processing and histology Spinal cords were collected and prepared as previously described (Pineau and Lacroix,
2007). Briefly, mice were overdosed with a mixture of ketamine-xylazine and
transcardially perfused with 4% paraformaldehyde (PFA), pH 7.4, in PBS. Spinal cords
were dissected out and placed overnight in a PBS/30% sucrose solution. For each animal, a
spinal cord segment of 12 mm centered over the lesion site was cut in 7 series of 14-µm-
thick coronal sections using a cryostat. For immunohistochemistry against 7/4 (also
referred to as Ly-6B, see (Rosas et al., 2010)) and Ly-6G and experiments involving in situ
hybridization (ISH), mice were perfused with 0.9% saline solution followed by 4% PFA,
pH 9.5, in borax buffer. Spinal cords were dissected out, post-fixed for 2 days, and placed
overnight in a 4% PFA-borax/10% sucrose solution until processing using a cryostat set at
30 µm thickness. All sections were collected directly onto Surgipath X-tra microslides
having a permanent positive charged surface (Leica Microsystems Canada, Concord, ON,
Canada) and stored at -20 °C until use. To identify the lesion epicenter and quantify lesion
volume, one series of adjacent sections was immunostained using a rabbit anti-GFAP
(mouse) antibody (1:750 dilution, Dako Canada Inc., Burlington, ON, Canada) and then
counterstained with 4', 6-diamidino-2-phenylindole, dilactate (DAPI; 1 µg/ml, Life
168
Technologies Inc., Burlington, ON, Canada) and FluoroMyelinTM red fluorescent myelin
stain (1:300 dilution, Life Technologies Inc.).
4.4.5. Immunohistochemistry and quantification
Cells expressing IL-1α were identified by confocal IF labeling using a goat anti-mouse IL-
1α polyclonal antibody (1:100 dilution, R&D Systems Inc., Minneapolis, MN), and co-
localized with markers of microglia such as ionized calcium-binding adaptor molecule 1
(Iba1; 1:750 dilution, Wako Chemicals USA, Richmond, VA) and the GFP reporter
expressed under the control of the CX3CR1 promoter (CX3CR1-eGFP transgenic mice).
The astroglial scar was visualized using the anti-GFAP antibody described above. Alexa
Fluor® secondary antibody conjugates (1:250, Life Technologies Inc.) were used as
secondary antibodies, whereas DAPI was used for nuclear counterstaining.
Immunofluorescence labeling was performed according to our previously published
methods (De Rivero Vaccari et al., 2012). Sections were observed and imaged on an
Olympus IX81 Fluoview FV1000 confocal microscope system equipped with 488 nm, 543
nm, and 633 nm lasers (Olympus Canada Inc.). Quantification of double-labeled cells was
performed manually at 40x using the Olympus confocal microscope. Results were
presented as the percent of IL-1α-positive (+) cells that expressed each of the two
microglial markers (Iba1, GFP).
TOX3 protein expression was visualized by confocal IF microscopy using a rabbit
polyclonal anti-TOX3 antibody (1:100 dilution, Novus Biologicals Canada ULC, Oakville,
ON, Canada). Colocalization of TOX3 in neurons, oligodendrocytes and endothelial cells
was performed using the neuron-specific markers NeuN (1:250 dilution, EMD Millipore,
Billerica, MA) and HuC/HuD (1:80 dilution, Life Technologies Inc.), the oligodendrocyte
marker CC-1 (also referred to as anti-APC; 1/500 dilution, Abcam) and the endothelial cell
marker CD31 (also referred to as PECAM-1; 1:750 dilution, BD Biosciences), respectively.
For the quantification of NeuN+ neurons and CC1+ oligodendrocytes expressing or not
TOX3, the number of labeled cells was estimated by the optical fractionator method using
the Bioquant Nova Prime software (Bioquant Image Analysis Corporation, Nashville, TN)
169
on video images transmitted by a high-resolution Retiga QICAM fast color 1394 camera
(1392 x 1040 pixels, QImaging, Burnaby, BC, Canada) installed on a Nikon Eclipse 80i
microscope. For this, the outline of the coronal section (for the quantification of neurons) or
spinal white matter (for the quantification of oligodendrocytes) was traced at 10X and then
sampled at 40X magnification. The counting parameters were as follows: sampling grid
size, 150 x 150 µm; counting frame size, 50 x 50 µm, and; dissector height, 14 µm. Cells
were counted only if their nuclei laid within the dissector area, did not intersect forbidden
lines, and came into the focus as the optical plane moved through the height of the
dissector. Quantification was performed on a total of 9 equally spaced sections (294 µm
apart) spanning 3 mm centered at the lesion epicenter, as we noted in our previous work
that the lesion normally extends over approximately 3 mm in mice that received a 50-kdyn
SCI contusion. For each section, the total number of positively-stained cells was calculated
by multiplying the total volume of the coronal section or spinal cord white matter, as
measured using the Bioquant Nova Prime software, by the average number of cells per
mm3. A relative number of cells that survived the trauma was then estimated by adding the
total number of positively-stained cells counted in each of the 9 sections encompassing the
lesion.
Immunoperoxidase labeling using the anti-7/4 antibody was performed to detect both
neutrophils and proinflammatory M1 macrophages in the spinal cord of injured mice, as
this antibody was recently shown to be specific for detecting these two cell types in SCI
tissue (De Rivero Vaccari et al., 2012). Immunoperoxidase labeling was performed on
spinal cord tissue sections directly mounted onto slides using CoverWell incubation
chambers (Life Technologies Inc.) and our previously published protocol (Pineau and
Lacroix, 2007), with the only difference that sections were pre-treated for 15 min with
proteinase K to improve immunolabeling efficiency. The anti-7/4 antibody was purchased
from AbD Serotec (Raleigh, NC) and used at a dilution of 1:800. Following
immunoperoxidase labeling, tissue sections were counterstained with Luxol Fast blue
(LFB) to visualize damaged areas. For the quantification of neutrophils and M1
macrophages, the outline of the coronal section was traced at 10X magnification, as
described above, and a grid of 50 µm x 50 µm positioned over the spinal cord using the
170
Bioquant Nova Prime software. All 7/4+ cells were then counted at 20X magnification.
Results were expressed as an average number of positive cells per coronal section.
All quantifications were done blind with respect to the identity of the animals and the
epineurial layer excluded from analyses.
4.4.6. In situ hybridization (ISH) ISH was carried out to detect mRNAs coding for IL-1α and IL-1ß, following our
previously published method (Pineau and Lacroix, 2007).
4.4.7. Lesion volume analysis The calculation of areas of tissue damage and lesion volume after SCI was performed on 1
series of adjacent sections within a predetermined spinal cord segment, including the lesion
epicenter and sections located up to approximately 1 mm distal to the center of the lesion in
both directions (i.e., rostral and caudal). Fourteen-µm-thick coronal sections were first
immunostained for GFAP and then counterstained with DAPI and FluoroMyelinTM to
visualize the glial scar and identify gray and white matter sparing, respectively. The
analysis was performed using the BioQuant Nova Prime computerized image analysis
system (Bioquant Topographer XP plug-in; Nashville, TN). In each section, the total area
of the coronal section was first determined by manually tracing the contour at low
magnification. Next, the outline of necrotic and damaged tissue was traced at higher
magnifications. Areas where normal spinal cord architecture was absent and areas
containing cellular and myelin debris surrounded by the astroglial scar were considered as
areas of tissue damage. The Topographer (Atlas Shop and Atlas Modeler) offered with the
Bioquant program was then used to reconstruct the injured spinal cord and measure lesion
volume.
171
4.4.8. Microarray analysis Spinal cord segments of 6 mm-long centered over the lesion were rapidly dissected, frozen
in liquid nitrogen, and stored at -80°C until RNA extraction. Total RNA was isolated by
TRI Reagent and purified with the GenElute mammalian total RNA miniprep kit (Sigma-
Aldrich Canada Ltd.). Ten µg of total RNA was converted to complementary DNA (cDNA)
using SuperScriptTM Reverse Transcriptase (Life Technologies Inc.), and T7-oligo-d(T)24
(Geneset, La Jolla, CA) as a primer. Second-strand synthesis was performed using T4 DNA
polymerase and E. coli DNA ligase and then blunt-ended by T4 polynucleotide kinase.
cDNA was purified by phenol-chloroform extraction using Phase Lock Gel (Brinkmann
Instruments Inc., Westbury, NY), then in vitro transcribed for 16 h at 37°C using the IVT
Labeling Kit (Affymetrix, Santa Clara, CA) to produce biotinylated cRNA. Biotin-labeled
cRNA was purified using the RNeasy Mini Kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA) and
fragmented to a size range of 30-200 nt using fragmentation buffer. The quality of total
RNA, cDNA synthesis, cRNA amplification, and cRNA fragmentation was monitored by
microcapillary electrophoresis (Bioanalyzer 2100, Agilent Technologies, Santa Clara, CA).
Fifteen µg of fragmented cRNA was hybridized for 16 h at 45°C with constant rotation on a
GeneChip® Mouse Gene 1.0 ST Array (Affymetrix, Santa Clara, CA). After hybridization,
microarrays (n = 12) were processed using the Affymetrix GeneChip Fluidic Station 450
(protocol EukGE-WS2v5_450). In brief, staining was made with streptavidin-conjugated
phycoerythrin (SAPE; Life Technologies Inc.), followed by amplification with a
biotinylated anti-streptavidin antibody (Life Technologies Inc.), and by a second round of
SAPE staining. Microarrays were scanned using a GeneChip Scanner 3000 G7
(Affymetrix) enabled for high-resolution scanning. Images were extracted with the
GeneChip Operating Software (Affymetrix GCOS v1.4). Quality control of microarrays
was performed using the AffyQCReport software (Gautier et al., 2004).
Background subtraction and normalization of probe set intensities was performed using the
method of Robust Multiarray Analysis (RMA) described by Irizarry et al. (Irizarry et al.,
2003). To identify differentially expressed genes, gene expression intensity was compared
using an ANOVA test with a significance threshold < 0.001 and fold change of ≥ 1.5, and a
Bayes smoothing approach developed for a low number of replicates (Smyth, 2004). False
172
discovery rate (FDR) < 0.2 was used to adjust for multiple testing. This analysis was
performed using the AffylmGUI Graphical User Interface for the LIMMA microarray
package (Wettenhall et al., 2006), and Partek Genomics Suite (Partek Incorporated, St-
Louis, MO). All microarray data compliant with the MIAME guidelines
(http://www.mged.org/) were deposited in the Gene Expression Omnibus (GEO) database
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), Accession Number GSE22291.
4.4.9. Real time quantitative RT-PCR (qRT-PCR) Quantitative RT-PCR was used to validate microarray data for selected candidate genes
found to be preferentially upregulated in the injured spinal cord of IL-1α-KO compared
with IL-1β-KO and C57BL/6 mice. Total RNA was isolated from spinal cords
(exsanguinated by intracardiac perfusion with saline) using the TRIzol method following
the manufacturer’s protocol (Life Technologies Inc.). RNA quantity and quality were
assessed using the RNA 6000 Nano LabChip and Agilent Bioanalyzer 2100. First-strand
cDNA synthesis was accomplished using 5 µg of isolated RNA in a reaction containing 200
U of SuperScriptTM III RNase H-Reverse Transcriptase (Life Technologies Inc.), 300 ng of
oligo-dT18, 50 ng of random hexamers, 50 mM Tris-HCl pH 8.3, 75 mM KCl, 3 mM
MgCl2, 500 uM deoxynucleotides triphosphate, 5 mM dithiothreitol, and 40 U of Protector
RNase inhibitor (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) in a final volume of 50 µl. The
reaction was incubated at 25°C for 10 min and then at 50°C for 1 h, and a PCR purification
kit (Qiagen, Hilden, Germany) was used to purify cDNA (Life Technologies Inc.). Equal
amounts of cDNA were amplified in duplicate in a final volume of 10 µl containing 5 µL of
2X LightCycler 480 SYBRGreen I Master (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN), 0.5 µM
of forward and reverse primers and 2 µL of cDNA (10 ng/µl). The primer pairs were:
TOX3, 5’-cctttcagactctcagcgatcc-3’ and 5’-ctggcggtactgtgacacttgt-3’; and GAPDH, 5’-
acgggaagctcactggcatgg-3’ and 5’-atgcctgcttcaccaccttcttg-3’. The sequences chosen were
selected to match only the intended gene using the GeneTools software (BioTools Inc.),
and verified by BLAST analysis in GenBank. Amplification was performed using the
LightCycler 480 (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) and the following conditions:
2 min at 50°C, 4 min at 95°C, followed by 45 cycles of 10 sec at 95°C (denaturation), 10
173
sec at 60°C (annealing), 12 sec at 72°C (elongation), and 5 sec at 74°C (reading).
Amplification efficiencies were validated and normalized to GAPDH and amounts of
TOX3 mRNA levels calculated according to a standard curve.
4.4.10. Behavioral analysis Recovery of locomotor function after SCI was quantified in an open field using the Basso
Mouse Scale, according to the method developed by Basso et al. (Basso et al., 2006).
Recovery of hindlimb function was also assessed using the grip walk (GW) test, a modified
version of the grid walk or "foot fault" test, following the method recently described by
Pajoohesh-Ganji et al. (Pajoohesh-Ganji et al., 2010). All behavioral analyses were done
blind with respect to the identity of the animals.
4.4.11. Statistical analysis Statistical evaluations were performed with one- or two-way ANOVA or repeated-
measures ANOVA. Post-ANOVA comparisons were made using the Bonferroni correction.
All statistical analyses were performed using the GraphPad Prism software (GraphPad
Software Inc., San Diego, CA). A p value < 0.05 was considered as statistically significant.
4.5. Results
4.5.1. Il-1αα protein expression in the injured spinal cord precedes IL-1ββ and is localized in microglia at the site of injury
Previous work has suggested that IL-1α released by cells undergoing necrosis could induce
sterile inflammation (Chen et al., 2007, Cohen et al., 2010, Rider et al., 2011). We thus
investigated whether IL-1α protein expression could be detected early in the injured mouse
spinal cord by confocal IF microscopy. Immunostaining was performed using a polyclonal
anti-IL-1α antibody directed against the N-terminal (6-166) part of murine IL-1α, thus
recognizing both the mature and precursor forms of the cytokine. No IL-1α expression was
observed in the spinal cord of adult naïve (uninjured) mice (Fig. 4.1A), either suggesting
that constitutive IL-1α is undetectable by IF because the protein is closely associated with
174
chromatin or that its expression is regulated by injury. As shown in Fig. 4.1A-B, IL-1α
immunostaining became detectable in the cells of the spinal cord as early as 4 hours post-
SCI, with the presence of 38 ± 6 cells at the lesion epicenter. This number had decreased to
15 ± 1 cells by 24 hours. No IL-1α-positive (+) cells were seen at 1 hour or 3 days after
injury (data not shown). At 4 hours post-SCI, IL-1α+ cells were mainly found at the lesion
epicenter and surrounding damaged areas. On very rare occasions, a few IL-1α+ cells were
found proximal or distal to the lesion site, while at 24 hours all IL-1α+ cells were physically
contained within the contusion site. It should be noted that most of them had a ramified
morphology reminiscent of microglia (Fig. 4.1C-E). Taking advantage of transgenic mice
in which the GFP reporter is expressed in microglia under the control of the CX3CR1
promoter, CX3CR1-eGFP+/- mice, we confirmed that the vast majority of IL-1α+ cells
colocalized with GFP-expressing cells following SCI, with an average colocalization
percentage of 88 ± 3% at 24 hours. IL-1α+ cells also colocalized with the myeloid cell
marker CD11b and the microglial/macrophage marker Iba1 (Fig. 4.1C-E). At 4 hours post-
SCI, a time that precedes the entry of blood-derived macrophages, colocalization of the IL-
1α protein with the Iba1 marker was estimated to be 96 ± 1%. Confocal microscopy
analysis revealed that the IL-1α protein was localized in the cell nucleus or cytoplasm (Fig.
4.1C-E). No IF signal was detected in the injured spinal cord of IL-1α-KO mice at any of
the times analyzed (Fig. 4.1A), confirming the specificity of the antibody used.
175
Figure 4.1 IL-1α protein expression in the injured spinal cord precedes IL-1β and is localized in microglia at the site of injury. A: Representative confocal photomicrographs showing IL-1α immunostaining (red) in the spinal cord of naïve and injured C57BL/6 mice at 4 and 24 hours (h) post-SCI (n=6-9 mice/time). Note that no IL-1α signal was detected in the injured spinal cord of IL-1α-KO mice, thus
IL-1 7/4
3528
2744
1960
1176
392
392C
1176C
1960C
2744C
3528C
0
200
400
600
800
1000
IL-1
IL-1
IL-1
IL-1
IL-1
IL-1
3528
2940
2352
1764
1176
588
0
588C
1176C
1764C
2352C
2940C
3528C
0
10
20
30
40
50
60
IL-1
IL-1
H
E
C
BA
176
confirming antibody specificity. B: Quantification of IL-1α+ cells in spinal cord sections taken both rostral (R) and caudal (C) to the lesion epicenter at 4 and 24 h post-SCI. C-E: Confocal photomicrographs showing co-localization of the IL-1α protein (red) with the myeloid cell marker CD11b (purple) and the microglial/macrophage markers Iba1 (purple) and CX3CR1-eGFP (eGFP, green). The nuclear staining DAPI is shown in blue. F: Imaging of IL-1β-producing cells (red cells) in the injured spinal cord of pIL-1β-DsRed transgenic mice at 4 and 24 hours post-SCI. In these transgenic mice, the DsRed fluorescent reporter is expressed under the control of the IL-1β gene promoter. G: Confocal photomicrographs showing the co-localization of IL-1β-DsRed+ cells (red) with 7/4-expressing cells (green). H: Quantification of IL-1β-DsRed+ cells in spinal cord sections taken both rostral (R) and caudal (C) to the lesion epicenter at 4 and 24 h post-SCI (n=3 mice/time). Scale bars: A, 100 µm; C-E (in E), 10 µm; F, 100 µm; G, 20 µm.
Using ISH, we detected two waves of IL-1β mRNA expression during the early acute phase
of SCI: the first one at 45 min to 3 h throughout the entire 12-mm (spinal cord) segment
analyzed, including the lesion and surrounding areas, and the second one restricted to the
lesion site at 6 h to 24 h (with a peak at 12 h) (data not shown; see also (Pineau and
Lacroix, 2007)). To determine whether mRNA expression resulted in production of IL-1β
protein, we took advantage of pIL-1β-DsRed transgenic mice in which the DsRed
fluorescent protein gene is expressed under the control of the IL-1β promoter. Such as for
IL-1β mRNA signal, no DsRed expression was detected in the spinal cord of uninjured
mice (data not shown). Time-course experiments showed that DsRed marker expression
was almost completely absent at 4 hours, but increased thereafter to reach a peak at 24
hours post-SCI (Fig. 4.1F, H). As for IL-1α+ cells, IL-1β-DsRed+ cells were found almost
exclusively within the lesion site, thus suggesting that only the second wave of IL-1β
mRNA expression is translated into protein production. However, the morphological
characteristics of these cells differed drastically, as IL-1α+ cells were typically ramified and
arborized, whereas IL-1β-DsRed+ cells were round. As seen in Fig. 4.1G, DsRed+ cells
colocalized with 7/4-expressing cells (i.e. neutrophils and monocyte-derived M1
macrophages), but only in rare occasions with Iba1-expressing microglia. Taken together,
these results indicate that microglia located as sites of SCI rapidly (< 4 hours) respond to
injury by expressing IL-1α, and that neutrophils and M1 monocytes that infiltrate the lesion
site starting at 6 hours further contribute to amplify the IL-1 response by producing IL-1β.
177
4.5.2. Infiltration of neutrophils and proinflammatory “M1” macrophages is equally reduced in the injured spinal cord of IL-1αα- and IL-1ββ-KO mice
To determine to what extent these cytokines are responsible for the early recruitment of
innate immune cells at sites of injury, we first quantified the number of neutrophils and
monocyte-derived M1 macrophages expressing the 7/4 antigen. Importantly, we recently
demonstrated that the 7/4 antigen is specifically expressed at the surface of both of these
cell populations, but not in resident microglia, thus justifying our immunohistochemical
approach (De Rivero Vaccari et al., 2012).
At 12 h after SCI, 1123 ± 72 cells immunopositive for 7/4 were counted at the lesion
epicenter in WT mice (Fig. 4.2A). This number was reduced by 69%, 58% and 79% in IL-
1α-, IL-1β- and IL-1α/β-KO mice, respectively, with an average of 347 ± 79, 470 ± 45 and
237 ± 114 cells at the lesion epicenter. Similarly, the number of Ly-6G+ neutrophils was
reduced by ~65%, 48% and 78% in IL-1α-, IL-1β- and IL-1α/β-KO mice, respectively,
compared with WT animals (Fig. 4.2B). To validate immunohistochemical data, cells were
isolated from the spinal cord of contused mice at 12 h and then characterized and quantified
by flow cytometry based on expression of the following cell-surface markers: CD45,
CD11b, Ly-6C, Ly-6G, and F4/80. As shown in Fig. 4.2C-E, flow cytometry data
confirmed the significantly reduced presence of neutrophils (CD45hi CD11b+ Ly-6C+ Ly-
6G+ F4/80-) and monocyte-derived M1 macrophages (CD45hi CD11b+ Ly-6Chi Ly-6G-
F4/80+) in SCI mice lacking IL-1α and/or IL-1β. The number of microglia (CD45dim
CD11b+ Ly-6C- Ly-6G- F4/80+) did not significantly differ between groups (data not
shown).
Altogether, these results suggest that cytokines of the IL-1 family are important regulators
of the infiltration of innate immune cells of the granulomonocytic lineage after SCI.
178
Figure 4.2 IL-1deficiency reduces neutrophil and M1 monocyte infiltration in the injured spinal cord. A-B: Quantification of the number of neutrophils and proinflammatory M1 macrophages, as visualized by 7/4 (A) and Ly-6G (B) immunostaining, at various rostral (R) and caudal (C) distances from the lesion epicenter at 12 h after SCI (n=4-12 mice/group). C-D: Quantification of the proportions of M1 macrophages (C) and neutrophils (D) relative to total CD45+ cells in KO and WT (C57BL/6) mice at 12 h after SCI. E: Representative flow cytometry profiles showing the presence of neutrophils (green; CD45hi CD11b+ Ly6C+ Ly6G+) and monocyte-derived M1 macrophages (red; CD45hi CD11b+ Ly6Chi Ly6G-) in the spinal cord of a C57BL/6 and IL-1αα/ββ-KO mouse at 12 h after SCI (date are
-way repeated-measures ANOVA with Bonferroni’s post hoc test.
BAM
ea
n o
f 7
/4+
ce
lls p
er
se
ctio
n
Me
an
of
Ly-6
G+
ce
lls p
er
se
ctio
n
***
†††
###
***
†††
###
DC
M1
Mo
no
cyte
s
E
Ne
utr
op
hils
0 103
104
105
0
103
104
105
0 103
104
105
0
103
104
105
C57BL/6
CD
45
0 102
103
104
105
0
103
104
105
0 102
103
104
105
0
103
104
105
Ly-6
C
0 103
104
105
0
103
104
105
0 103
104
105
0
103
104
105
Ly-6
C
CD11b Ly-6G F4/80
M1 Monocytes
Neutrophils
Others
0.30
0.20
0.10
0.00
WT
IL-1 KO
IL-1 KO
IL-1 KO
***
†††
###
***
†††
###
***
†††
###
***
†††
###
179
4.5.3. Mice harboring deletion of the IL-1αα gene exhibit improved functional recovery and histopathological outcome compared to IL-1ββ-KO and WR mice after SCI
Neuroinflammation is considered as one of the leading causes of secondary damage in the
injured spinal cord. Therefore, we next investigated whether the absence of the IL-1α or IL-
1β gene affects neuropathology in SCI. Evaluation was performed in an open field using
the 9-point BMS scale and the 11-point BMS subscore. Naïve IL-1α-KO, IL-1β-KO and
WT mice all performed flawlessly and received perfect scores on the BMS and BMS
subscore scales. The situation was however different after a moderate (50 kdyn) traumatic
SCI. As shown in Fig. 4.3A, IL-1α- and IL-1β-KO mice recovered significantly better than
WT mice at 1 and 3 days post-SCI. Unlike IL-1β-KO mice, IL-1α-KO performed
significantly better than WT mice at 7 and 14 days as well. At day 14, more than 90% of
IL-1α-KO were mostly coordinated and had parallel paw position at initial contact (score ≥
7 on the BMS), compared to 0% and 10% in WT and IL-1β-KO mice, respectively. The
average BMS subscore of IL-1α-KO mice was 8.3 ± 0.4 compared with 5.4 ± 0.3 for WT
and 4.7 ± 0.6 for IL-1β-KO mice at 14 days post-SCI (Fig. 4.3B). The extent and
reproducibility of the early locomotor recovery seen at day 1 in SCI IL-1α-KO mice
compared with the other two groups is best demonstrated by a dot plot showing individual
BMS scores of mice included in all experiments performed (n=27 mice per group) (Fig.
4.3C). We also analysed lesion volume by GFAP immunostaining delimiting the lesion
frontier and found that tissue damage was reduced in IL-1α-KO mice compared to IL-1β-
KO and WT mice at day 35 post-SCI (Fig. 4.3D). Together, these results suggest that
deletion of the IL-1α gene contributes to better functional recovery by reducing lesion
volume after SCI.
180
Figure 4.3 Recovery of locomotor function and spinal cord lesion volume are improved in IL-1-KO mice. A-B: Locomotor function was assessed using the Basso mouse scale (BMS) (A) and BMS subscore (B) over a 35-day period after SCI (n= 8-10 mice per group). *, † p < 0.05; **, †† p < 0.01; and ***, ††† p < 0.001, significant difference between KO and WT (C57BL/6) mice; two-way repeated-measures ANOVA with Bonferroni’s post hoc test. C: Dot plot showing BMS scores assigned to individual mice of each mouse line at day 1 post-SCI across all experiments performed (n = 27 mice per group). Males are shown in black filled circles and females in empty white circles. D: IL-1αα-KO mice had significantly reduced spinal cord tissue damage at 35 d after injury (n= 8-10 per group). For C-D, Data are expressed as mean ± SEM. ***p < 0.001, **p < 0.01; one-way ANOVA with Bonferroni’s post hoc tests.
4.5.4. IL-1ββ-KO mice have reduced IL-1αα levels in their spinal cord compared to WT mice whereas IL-1αα-KO mice express IL-1ββ normally
Horai et al. have previously suggested that IL-1β exerts greater control on IL-1α
production than does IL-1α on IL-1β production, at least in the brain (diencephalon).
0.05
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
C57BL/6 IL-1 KO IL-1 KO
Le
sio
n v
olu
me
(m
m3)
D
BM
S score
± S
EM
Female
0123456789
Male
C57BL/6 IL-1 KO IL-1 KO
*****
C
01234567891011
0 7 14 21 28 35Days after injury
BM
S s
ubscore
± S
EM ***
**
***†
B
IL-1 ko
IL-1 ko
0 7 14 21 28 35Days after injury
0123456789
BM
S s
core
± S
EM
***
***
*
†
***†††
C57BL/6
A
181
Specifically, they reported a 1.5-fold decrease in IL-1β mRNA expression in the brain of
IL-1α-KO mice compared to WT, and a 30-fold decrease in IL-1α mRNA levels in IL-1β-
KO mice (Horai et al., 1998). To extend these data to the adult spinal cord, we have
examined by various means the expression of IL-1α and IL-1β in IL-1β-KO and IL-1α-KO
mice, respectively. Using qRT-PCR, we determined that IL-1α mRNA is weakly expressed
in the spinal cord of WT (C57BL/6) naïve mice and virtually absent in IL-1β-KO under
baseline conditions (Fig. 4.4A). After SCI, IL-1α mRNA levels increased by more than 10-
fold in the spinal cord of WT mice. Importantly, this increase was 2.5-fold higher than that
found in SCI IL-1β-KO mice. On the contrary, IL-1β mRNA expression was undetectable
in the normal spinal cord of IL-1α-KO and WT mice. IL-1β mRNA expression increased
markedly at 24 hours after SCI in both IL-1β-KO and WT mice, with no difference
observed between the two groups, thus corroborating the microarray data (Fig. 4.4B). To
further study the importance of IL-1β in production of IL-1α protein, we next performed
immunofluorescence staining for IL-1α and quantified the number of IL-1α+ cells in SCI
tissue from both IL-1β-KO and WT mice at 4 hours post-SCI, which corresponds to the
maximum expression of the IL-1α protein. We counted a total of 101 ± 13 positive cells in
IL-1β-KO mice compared to 280 cells ± 25 in WT mice, corresponding to a nearly 3-fold
decrease in the number of IL-1α+ cells at sites of SCI in mice lacking IL-1β (Fig. 4.4C).
Together, these results indicate that deficiency in IL-1β attenuates production of IL-1α (but
not the opposite) in the normal and injured spinal cord. This raises the possibility that the
early locomotor recovery seen in IL-1β-KO mice compared to WT might be due to a
reduction in IL-1α production.
182
Figure 4.4 IL-1α and IL-1b mRNA expression levels in the spinal cord of naive and injured mice at 1 day post-SCI. A-B: Quantitative real time RT-PCR (qRT-PCR) analysis shows decreased expression of IL-1αα mRNA in Il-1ββ-/- mice while no changes in IL-1ββ levels were detected in Il-1ββ-/- mice after injury. Data are means ± SEM of the ratio between each IL-1 gene and 18S mRNA levels. ***p < 0.001, *p < 0.05, one-way ANOVA, Bonferroni’s post hoc.
4.5.5. Increase expression of TOX3 in the injured spinal cord of IL-1αα-KO mice To investigate the mechanism by which IL-1α mediates its detrimental effect after
traumatic SCI, we analyzed the transcriptome of the injured spinal cord of IL-1α-KO, IL-
1β-KO and WT mice at 24 hours after injury using GeneChip microarrays. Our results
showed that only 18 transcripts were significantly up- or down- regulated in IL-1α-KO
compared with IL-1β-KO and WT mice (Table 4.1). Surprisingly, none of these genes have
IL-1
mR
NA
/18S
IL-1
mR
NA
/18S
C57BL/6
IL-1
-KO
C57BL/6
-SCI
IL-1
-KO-S
CI
0.0
0.5
1.0
1.5
C57BL/6
IL-1
-KO
C57BL/6
-SCI
IL-1
-KO-S
CI
0.0
0.5
1.0
1.5
A
B
***
*
***
183
been previously shown to play a role in neuroinflammation. This is in drastic contrast with
the list of 23 transcripts found to be differentially regulated in both IL-1 KO mouse lines
compared to WT after SCI (Table 4.2), as many of the genes listed in Table 4.2 are
involved in neuroinflammation. Together, these data reinforce the idea that the absence of
IL-1α could mediate protection of spinal cord cells by a mechanism distinct from its known
inflammatory activities, most likely through its ability to regulate transcription and
chromatin, as recently suggested by others but without a direct link to specific genes
(Buryskova et al., 2004, Lamacchia et al., 2013).
Table 4.1 Transcripts found to be differentially regulated exclusively in IL-1α ko mice after SCI. Table listing the transcripts found to be significantly regulated in IL-1α-KO mice exclusively after SCI, as determined using Affymetrix GeneChip® microarrays. The abbreviation “F.C.” means fold change compared to the C57BL/6 control group. All mice in this analysis received a SCI.
184
Table 4.2 Transcripts found to be differentially regulated simultaneously in IL-1α and IL-1β-KO mice after SCI. Table listing the transcripts found to be significantly regulated in IL-1α-KO and IL-1ββ-KO mice after SCI, as determined using Affymetrix GeneChip® microarrays. The abbreviation “F.C.” means fold change compared to the C57BL/6 control group. All mice in this analysis received a SCI.
Among the 18 genes found to be differentially regulated in IL-1α-KO mice compared to
the other two mouse strains, one has particularly attracted our attention because of its
known biological function, namely, the neuronal survival factor TOX high mobility group
box family member 3 (TOX3) (Fernandes-Alnemri et al., 2009, Dittmer et al., 2011). Using
qRT-PCR, we confirmed that TOX3 is significantly upregulated in IL-1α-KO mice
compared to the other two groups at 24 hours post-SCI, consistent with microarray data
(Fig. 4.5A-B).
185
Figure 4.5 Expression of the survival factor TOX3 is increased in the injured spinal cord of IL-1α-KO mice. B: Microarray analysis of gene expression shows that TOX3 is differentially expressed (i.e. upregulated) in the spinal cord of IL-1α-KO mice compared with IL-1β-KO and C57BL/6 mice at day 1 post-SCI. Data are expressed as an average microarray hybridization signal (n = 4 mice per group). Normalization of probe set intensities was performed using the method of Robust Multiarray Analysis (RMA). C: Quantitative real time RT-PCR (qRT-PCR) analysis confirms increased expression of TOX3 in the injured spinal cord of IL-1α-KO at day 1 post-SCI. Data are expressed as a ratio to GAPDH mRNA levels. All data are expressed as mean ± SEM. ***p < 0.001.
4.5.6. Oligodendrocytes from mice lacking IL-1αα upregulate the survival factor TOX3 and are protected from SCI-induced death
TOX3 is a nuclear protein that was recently found to protect neurons from apoptotic cell
death when overexpressed (Dittmer et al., 2011). Building on our transcriptome data
showing higher levels of TOX3 transcript in IL-1α-KO mice than WT after SCI, we next
examined whether these changes translated into differences at the protein level. Using
immunofluorescence confocal microscopy and co-staining with various makers of CNS
cells, we found that the TOX3 protein was weakly expressed in the spinal cord of WT mice
under normal conditions. The TOX3 signal was mainly localized in the nucleus of NeuN+
neurons and CC1+ oligodendrocytes (Fig. 4.6A), as well as being associated with CD31+
endothelial cells (data not shown). Quantification of TOX3 immunostaining revealed that
protein levels of the survival factor were markedly increased in the spinal cord of naïve IL-
1α-KO mice compared with IL-1β-KO and WT mice. The overexpression concerned
mainly neurons and oligodendrocytes, with an approximate 130% and 200% increase in
TOX3
GeneChip microarrays
Aver
age
hybr
idiz
atio
n si
gnal
(Nor
mal
ized
dat
a)
A******
C57BL/6IL-1 KOIL-1 KO
qRT-PCRB
mR
NA
leve
ls(R
elat
ive
to G
AP
DH
)
******
TOX3
186
signal intensity in these two cell types, respectively (data not shown). This also translated
into higher numbers of neurons and oligodendrocytes expressing TOX3 in the adult spinal
cord of naïve IL-1α-KO mice. On average, we counted 206 ± 18 NeuN+ TOX3+ cells per
mm2 in the grey matter of IL-1α-KO mice compared to 80 ± 9 and 101 ± 17 in IL-1β-KO
and WT mice, respectively. The same also applied to oligodendrocytes of the white matter,
where we counted 278 ± 11 CC1+ TOX3+ cells per mm2 in naïve IL-1α-KO mice compared
to 127 ± 12 and 113 ± 10 in IL-1β-KO and WT mice, respectively. Importantly for data
interpretation, the total numbers of NeuN+ neurons and mature CC1+ oligodendrocytes
were similar between the three mouse strains under normal, uninjured conditions.
Intriguingly, overexpression of TOX3 in IL-1α-KO mice was maintained in
oligodendrocytes but completely lost in neurons at 24 h after SCI (Fig. 4.6B, D), thus
suggesting that the former cell type is more likely to be protected from injury.
To investigate whether more neurons and oligodendrocytes were protected from SCI in IL-
1α-KO mice, and whether TOX3-expressing neurons/oligodendrocytes were more likely to
be protected from injury-induced death, we counted these cells in spinal cord sections
spanning the entire rostro-caudal extent of the lesion (i.e., ~3 mm centered at the lesion
epicenter). As expected from the work of the Wrathall lab (Grossman et al., 2001, Lytle and
Wrathall, 2007), fewer NeuN+ neurons and CC1+ oligodendrocytes were detected in the
injured compared with uninjured spinal cord, independently of the mouse line (data not
shown). On average, the neuronal and oligodendroglial cell loss in IL-1β-KO and WT
(C57BL/6) mice was estimated to be around 50% at 24 hours post-SCI. Importantly, the
total numbers of CC1+ oligodendrocytes, but not NeuN+ neurons, were significantly higher
(by more than 20%) in the injured spinal cord of IL-1α-KO mice at this time (Fig. 4.6C). In
IL-1α-KO mice, a total of 2656 ± 210 neurons and 3283 ± 209 oligodendrocytes survived
the injury compared to 2746 ± 186 and 2680 ± 135 in IL-1β-KO mice and 2759 ± 167 and
2707 ± 133 in WT mice. Another important observation is that 75% of the CC1+
oligodendrocytes that survived the injury in IL-1α-KO mice express TOX3 (Fig. 4.6D),
while CC1+ TOX3+ oligodendrocytes accounted for only 35% of the total number of CC1+
oligodendrocytes in the uninjured spinal cord of these mice (data not shown). This once
187
again suggests that TOX3 overexpression is protective in SCI and that CC1+ TOX3+
oligodendrocytes have a greater capacity to survive the hypoxic, ischemic and
inflammatory conditions of the lesion.
188
Figure 4.6 IL-1α deficiency upregulates expression of the survival factor TOX3 in oligodendrocytes and protects these cells from death after SCI. A: Confocal photomicrographs showing TOX3 immunostaining (red) in the spinal cord of a naïve C57BL/6 mouse. Note that the TOX3 protein is weakly expressed and localized specifically in the nucleus of oligodendrocytes (CC1+, green cells in the upper right
Tota
l ce
ll n
um
be
r
0
1000
2000
3000
4000
5000
Oligodendrocytes Neurons
**
C57BL/6
IL-1 ko
IL-1 ko
Oligodendrocytes Neurons
TO
X3
inte
nsity
0
20
40
60
80
********TOX3 Dapi
TOX3 Dapi Merge + NeuN
Merge + CC1
Olig
od
en
dro
cyte
sN
eu
ron
s
A B
C
C57BL/6
IL-1 KO
IL-1 KO
CC1 TOX3 Merge + Dapi
D
189
panel) and neurons (NeuN+, green cells in the lower right panel), as well as being associated with CD31+ endothelial cells (not shown). The nuclear staining DAPI is shown in blue. The right-most panels are an overlay of the three colors. B: Quantification of TOX3 immunostaining intensity in spinal cord oligodendrocytes and neurons of the three mouse strains at day 1 post-SCI. C: Quantification of the total number of CC1+ oligodendrocytes and NeuN+ neurons in spinal cord sections spanning the entire rostro-caudal extent of the lesion, i.e. ~3 mm centered at the lesion epicenter. Data in B-C are expressed as mean ± SEM. ***p < 0.001, **p < 0.01, *p < 0.05, one-way ANOVA, Bonferroni’s post hoc. D: Representative confocal photomicrographs showing CC1 (green) and TOX3 (red) immunostainings in the injured spinal cord of C57BL/6 mice as well as IL-1α- and IL-1β-KO mice. Scale bars: A, 10 µm; D, 50 µm.
4.5.7. Tox3 overexpression in oligodendrocytes of IL-1αα -/- mice occurs at early at an early stage of the myelination process and persists through adulthood.
To determine whether TOX3 overexpression occurs during a specific period of CNS
development or later during adulthood, we performed immunostaining for TOX3 and
measured protein levels in the developing and adult spinal cord of naïve IL-1α-KO, IL-1β-
KO and WT mice. As shown in Fig. 6, TOX3 protein levels were increased in the spinal
cord of IL-1α-KO mice compared with IL-1β-KO and WT mice during the postnatal
period. Importantly, this overexpression translated into much higher numbers of CC1+
oligodendrocytes expressing TOX3 in the spinal cord of naïve IL-1α-KO mice than the
other two groups of mice from P10 up to P30 (Fig. 4.7A), and as described above, this
difference was maintained up to adulthood. At P10, we counted as many as 924 ± 266
CC1+ TOX3+ oligodendrocytes per cross-section in the spinal cord white matter of IL-1α-
KO mice compared to only 34 ± 34 and 55 ± 37 in IL-1β-KO and WT mice, respectively.
This represents an almost 30-fold increase in cell numbers. With the exception of P10,
numbers of CC1+ mature oligodendrocytes were similar between mouse strains at all times
(Fig. 4.7B). Together, these results suggest that IL-1α represses TOX3 in spinal cord
oligodendrocytes during early postnatal development, at around P10, right before the
beginning of the myelination process.
190
To assess whether IL-1α is produced during this developmental phase, we next measured
mRNA levels for IL-1α and IL-1β in the spinal cord of C57BL/6 mice at various times
postnatally (between P1 and P30). Using real-time qRT-PCR, we found that mRNA levels
for IL-1α, but not IL-1β, are dramatically increased between P5 and P10 (Fig. 4.7C).
Therefore, our results indicate that spinal cord microglia become activated and produce IL-
1α just before the beginning of the myelination process, suggesting that interactions
between microglia and oligodendrocytes appear to regulate the survival of mature
oligodendrocytes through TOX3.
Figure 4.7 Increased mRNA expression levels of IL-1α, but not IL-1β, between postnatal day 5 and 10, coinciding with a critical period of microglial activation and the beginning of myelination A-B: Quantification of the total numbers of TOX3+CC1+ (A) and CC1+ (B) oligodendrocytes in the spinal cord of Il-1a-/-, Il-1b-/- and wild-type (WT) mice at postnatal day 3, 10, 18 and 30. C: Quantitative real time RT-PCR (qRT-PCR) analysis confirms increased expression of IL-1a mRNA in the spinal cord of WT mice during the postnatal development period. Data are means ±
P1 P3 P7 P10 P14 P18 P300.000
0.001
0.002
0.003
0.004
0.005 IL-1 mRNAIL-1 mRNA
mR
NA
/ G
APD
H
Postnatal day
0
2000
4000
6000
8000
P3 P10 P18 P30
Postnatal day
Tota
l # o
f CC
1+ cel
l
***
C57BL/6
IL-1 koIL-1 ko
P3 P10 P18 P300
500
1000
1500
2000
Postnatal day
Tota
l # o
f CC
1+ /TO
X3+ c
ell
***
***
***
###
****
****
***
A B
C
* **
191
SEM of the ratio between each IL-1 gene and GAPDH mRNA levels. **** p < 0.0001, ***p < 0.001, **p < 0.01, *p < 0.05, ###p < 0.001 compared to postnatal day 1, one-way ANOVA, Bonferroni’s post hoc.
4.6. Discussion In this study, we show that deletion of the IL-1α gene in mice results in decreased lesion
volume and improved functional outcome after SCI, an effect that we ascribe to an increase
in survival of oligodendrocytes in damaged areas. Our immunohistochemical data indicate
that IL-α is rapidly produced by microglia after SCI, in line with a recent report from
Luheshi et al. using an ischemic brain injury model in mice (Luheshi et al., 2011).
Specifically, we found that IL-1α is produced and/or released at sites of trauma, and that
IL-1α production by microglia precedes both the infiltration of blood-derived innate
immune cells, which we found are the main cellular source of IL-1β, and secondary
damage to oligodendrocytes. Importantly, the infiltration of neutrophils and monocyte-
derived M1 macrophages is severely compromised in the injured spinal cord of Il-1α-/-
mice. Our results thus support the growing body of evidence that IL-1α is a damage-
associated molecular pattern (DAMP) molecule released by dying cells, thus enabling the
recruitment of innate immune cells (Chen et al., 2007, Eigenbrod et al., 2008). A key new
finding of this study is the discovery that the survival factor TOX3 is overexpressed in
oligodendrocytes as a result of deletion of the IL-1α gene, and that this overexpression
occurs during the early postnatal period and lasts for the lifetime of the Il-1α-/- mouse.
Furthermore, oligodendrocytes overexpressing TOX3 in the spinal cord of Il-1α-/- mice
survived better than those not expressing TOX3 (in these same animals), as well as those of
Il-1β-/- and WT mice after SCI in vivo.
Cohen et al. have recently reported that IL-1α is associated with the chromatin and released
with the cytoplasmic content as a result of necrotic cell death, but not apoptotic cell death,
following which it stimulates myeloid cell recruitment (Cohen et al., 2010). Although our
results indicate that IL-1α is released by microglia and initiates inflammation after SCI, we
do not know whether this inflammatory response mediates secondary (bystander) damage.
192
Interestingly, the Allan group has recently shown that neutrophils acquire potentially
neurotoxic properties upon transmigration across IL-1-stimulated blood-brain barrier
(BBB) (Allen et al., 2012). This particular study suggested that neurotoxicity could be
mediated by the action of neutrophil-derived proteases that are released in association with
decondensed DNA, commonly referred to as neutrophil extracellular traps (NETs). In
addition, monocyte-derived M1 macrophages identified by their production of
proinflammatory mediators are present in the injured spinal cord and neurotoxic when co-
cultured with primary neurons (Kigerl et al., 2009). A recent cell depletion study in SCI
mice has further revealed that preventing the recruitment of both neutrophils and
monocytes is beneficial for functional recovery (Lee et al., 2011). Future studies will
therefore be required to determine whether innate immune cells that rapidly infiltrate sites
of SCI in response to IL-1α are those that contribute to secondary tissue damage.
Pro-IL-1α and pro-IL-1β are expressed as 31-kDa polypeptides. Despite long-standing
evidence that the precursor form of IL-1α is biologically active, in contrast to pro-IL-1β,
recent studies have challenged this view by showing that pro-IL-1α has minimal activity,
but its cleavage into a 17-kDa fragment by proteases such as calpain or granzyme B
enhanced biological activity by up to 10-50 fold in vitro and in vivo (Afonina et al., 2011,
Zheng et al., 2013). The processing and secretion of IL-1β is regulated by inflammasomes
(Lamkanfi and Dixit, 2012), and we now know that this is also partially the case for IL-1α,
at least in the context of exposition to microbial pathogen-associated molecular pattern
(PAMP) molecules (Gross, 2012). Here, we show that IL-1α is rapidly (within 4 h)
produced by resident microglia after SCI, and that innate immune cells that are
subsequently, but still rapidly (within 6-12 h), recruited from the blood into sites of injury
further amplify the inflammatory response by producing IL-1β. Interestingly, Iyer et al.
have demonstrated that necrotic cell extracts, when injected into the peritoneal cavity of
mice deficient in key molecules involved in IL-1β processing and secretion, such as
caspase-1, the inflammasome adaptor molecule apoptosis-associated speck-like protein
(ASC) and the NLR protein Nlrp3 (also referred to as Nalp3, CIAS1 or cryopyrin), failed to
induce neutrophil influx as they would normally do in WT recipient mice (Iyer et al.,
2009). Using LPS-primed macrophages as a model, they further showed that necrotic cells
193
induce IL-1β maturation through Nlrp3, a finding confirmed by Li et al. using necrosis-
inducing drugs (Li et al., 2009). This suggests that some of the inflammatory effects of IL-
1α may also result from the induction of IL-1β production and maturation, which may
explain why neutrophil and M1 monocyte infiltration is equally reduced in the injured
spinal cord of IL-1α-/- and IL-1β-/- mice compared to WT mice.
The inflammasomes and other signals regulating IL-1α and IL-1β activity and
inflammation in the injured CNS remain largely unknown and may be different from those
identified in peripheral tissues. Recently, we showed that deletion of the purinergic P2X4
receptor, a receptor known to bind extracellular nucleotides, is associated with reduced
inflammasome activation and decreased production of cleaved IL-1β after SCI (De Rivero
Vaccari et al., 2012). This finding was correlated with reduced spinal cord tissue damage
and improved locomotor recovery as early as day 1, reminiscent of the early recovery
observed here in IL-1α-/- mice. One unknown, however, is whether levels of the pro- and
mature forms of IL-1α are impaired in P2X4-/- mice under normal and injured conditions.
Perhaps the most important conclusion that can be drawn from the comparison of Il-1α-/-
and Il-1β-/- mice is that despite showing a similarly reduced inflammatory response after
SCI, Il-1α-/- mice exhibited better recovery of locomotor abilities and had reduced lesion
volume. This, combined with the early functional recovery seen at day 1 in Il-1α-/- mice,
suggests that these mutant animals are protected from SCI-induced neurodegeneration
rather than benefiting from improved regenerative abilities. It also suggests that the
improved recovery of function in injured Il-1α-/- mice is unlikely to be mediated by innate
immune cells recruited from the blood. Still, we cannot completely rule out the possibility
that the absence of IL-1α or IL-1β could have differentially affected the expression of
specific proinflammatory and cytotoxic effectors by the remaining immune cells recruited
at the lesion site. However, it must be pointed out that our microarray study failed to detect
significant changes in expression levels of inflammatory genes between the two IL-1
mouse strains at day 1 post-SCI.
194
In contrast to the function of IL-1α, which remains uncertain, the role of IL-1β has been
relatively well studied in the context of CNS injury (Allan and Rothwell, 2001, Allan et al.,
2005). It has been assumed that IL-1 proteins have identical biological functions given that
both cytokines bind and activate the same cell surface receptor, IL-1R1, although a role for
IL-1R2 in the regulation of IL-1α activity post-necrosis has recently been highlighted
(Zheng et al., 2013). Despite the fact that intracellular IL-1R2 can regulate cell activation
by preventing cleavage of IL-1α by calpain and act extracellularly as a decoy receptor for
free IL-1, IL-1R2 lacks an intracellular Toll-like/IL-1R1 (TIR) domain and therefore is not
a direct mediator of cytokine signalling. Thus, it may come as a surprise that Il-1β-/- mice
did not recover locomotor function to the extent of Il-1α-/- mice after SCI. This could
suggest that IL-1α mediates CNS cell loss independently of IL-1R1, through a yet
unidentified receptor. Interestingly, a novel isoform of the IL-1R1 accessory protein, IL-
1RAcPb, containing a variant TIR domain and whose expression is restricted to CNS
neurons has recently been implicated in neuroprotection in animal models of
neuroinflammation (Smith et al., 2009). Nguyen et al. later reported that IL-1α-induced, but
not IL-1β-induced, p38 phosphorylation is significantly reduced in primary neuronal
cultures from IL-1RAcPb-KO mice (Nguyen et al., 2011). This is convincing evidence that
supports the idea that IL-1α has specific effects within the CNS. Here, we have extended
this work by identifying 18 genes that are regulated by IL-1α, but not by IL-1β, and through
the demonstration that IL-1α regulates oligodendrocyte survival after SCI. It is important to
note that the study by Smith et al. assessed IL-1RAcPb mRNA expression in purified
neurons, microglia and astrocytes, but not in oligodendrocytes. It is therefore possible that
IL-1α may exert its effects on oligodendrocytes through a receptor other than IL-1R1, such
as IL-1RAcPb.
Our genome-wide transcriptome analysis identified 18 genes as significantly up- or down-
regulated in IL-1α-/- mice compared with IL-1β-/- and WT mice, among which is the
transcript coding for the TOX high mobility group box (HMGB) family member 3, also
known as TOX3. TOX3 was recently shown to regulate Ca2+-dependent transcription in
neurons through interaction with the cAMP-response-element-binding protein (CREB)
(Yuan et al., 2009). Dittmer et al. have since established that TOX3 is predominantly
195
expressed in the CNS where it acts as a neuronal survival factor (Dittmer et al., 2011). It
was demonstrated that TOX3 overexpression protects neurons from cell death via the
upregulation of anti-apoptotic genes and downregulation of pro-apoptotic genes. Here, our
data show the presence of almost 3 times more neurons and oligodendrocytes expressing
TOX3 in the spinal cord of naïve IL-1α-/- mice compared to IL-1β-/- and WT mice, but this
difference did not translate into an increased neuronal survival in IL-1α-/- mice at day 1
post-SCI. Instead, deletion of the IL-1α gene distinctively induced the survival of mature
oligodendrocytes after SCI. Recently, Miron et al. unveiled that M2 anti-inflammatory
microglia/macrophages are important for oligodendrocyte differentiation and CNS
remyelination (Miron et al., 2013). It will be of interest in future work to determine whether
the absence of IL-1α could induce a phenotypic switch in polarization of microglia during
the early developmental period, thus leading to gene expression changes in
oligodendrocytes.
In summary, we have established that deletion of the IL-1α gene provides protection of
oligodendrocytes from SCI via a mechanism that involves overexpression of the survival
factor TOX3. Therefore, we propose that inhibition of IL-1α or overexpression of TOX3
during the early acute phase of a CNS insult may be an effective means for preventing loss
of neurological function in a variety of injuries such as ischemia and traumatic brain and
spinal cord injury.
4.7. References
Afonina IS, Tynan GA, Logue SE, Cullen SP, Bots M, Lüthi AU, Reeves EP, McElvaney
NG, Medema JP, Lavelle EC, Martin SJ (2011) Granzyme B-dependent proteolysis acts
as a switch to enhance the proinflammatory activity of IL-1α. Molecular Cell, vol. 44, pp
265-278.
Albrecht P, Dahl J, Stoltzfus O, Levenson R, Levison S (2002) Ciliary Neurotrophic Factor
Activates Spinal Cord Astrocytes, Stimulating Their Production and Release of
196
Fibroblast Growth Factor-2, to Increase Motor Neuron Survival. Experimental
neurology, vol. 173, pp 46-62.
Albrecht P, Murtie J, Ness J, Redwine J, Enterline J, Armstrong R, Levison S (2003)
Astrocytes produce CNTF during the remyelination phase of viral-induced spinal cord
demyelination to stimulate FGF-2 production. In: Neurobiology of Disease, vol. 13, pp
89-101.
Allan S, Rothwell N (2001) Cytokines and acute neurodegeneration. Nature reviews
Neuroscience, vol. 2, pp 734-744.
Allan S, Tyrrell P, Rothwell N (2005) Interleukin-1 and neuronal injury. Nature reviews
Immunology, vol. 5, pp 629-640.
Allen C, Thornton P, Denes A, McColl BW, Pierozynski A, Monestier M, Pinteaux E,
Rothwell NJ, Allan SM (2012) Neutrophil cerebrovascular transmigration triggers rapid
neurotoxicity through release of proteases associated with decondensed DNA. J
Immunol, vol. 189, pp 381-392.
Amankulor N, Hambardzumyan D, Pyonteck S, Becher O, Joyce J, Holland E (2009) Sonic
Hedgehog Pathway Activation Is Induced by Acute Brain Injury and Regulated by
Injury-Related Inflammation. Journal of Neuroscience, vol. 29, pp 10299-10308.
Barrette B, Hébert M-A, Filali M, Lafortune K, Vallières N, Gowing G, Julien J-P, Lacroix
S (2008) Requirement of myeloid cells for axon regeneration. In: The Journal of
neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience, vol. 28, pp 9363-
9376.
Basso D, Fisher L, Anderson A, Jakeman L, McTigue D, Popovich P (2006) Basso Mouse
Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five
common mouse strains. Journal of neurotrauma, vol. 23, pp 635-659.
197
Bastien D, Lacroix S (2014) Cytokine pathways regulating glial and leukocyte function
after spinal cord and peripheral nerve injury. Experimental neurology, vol. 258C, pp 62-
77.
Basu A, Krady J, O'Malley M, Styren S, DeKosky S, Levison S (2002) The type 1
interleukin-1 receptor is essential for the efficient activation of microglia and the
induction of multiple proinflammatory mediators in response to brain injury. The
Journal of neuroscience, vol. 22, pp 6071-6082.
Brambilla R, Bracchi-Ricard V, Hu W-H, Frydel B, Bramwell A, Karmally S, Green EJ,
Bethea JR (2005) Inhibition of astroglial nuclear factor kappaB reduces inflammation
and improves functional recovery after spinal cord injury. J Exp Med, vol. 202, pp 145-
156.
Brambilla R, Hurtado A, Persaud T, Esham K, Pearse D, Oudega M, Bethea J (2009)
Transgenic inhibition of astroglial NF-κB leads to increased axonal sparing and
sprouting following spinal cord injury. Journal of Neurochemistry, vol. 110, pp 765-778.
Buryskova M, Pospisek M, Grothey A, Simmet T, Burysek L (2004) Intracellular
interleukin-1alpha functionally interacts with histone acetyltransferase complexes. The
Journal of biological chemistry, vol. 279, pp 4017-4026.
Chen C-J, Kono H, Golenbock D, Reed G, Akira S, Rock KL (2007) Identification of a key
pathway required for the sterile inflammatory response triggered by dying cells. Nature
medicine, vol. 13, pp 851-856.
Cohen I, Rider P, Carmi Y, Braiman A, Dotan S, White M, Voronov E, Martin M,
Dinarello C, Apte R (2010) Differential release of chromatin-bound IL-1alpha
discriminates between necrotic and apoptotic cell death by the ability to induce sterile
198
inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America, vol. 107, pp 2574-2579.
Davalos D, Grutzendler J, Yang G, Kim J, Zuo Y, Jung S, Littman D, Dustin M, Gan W-B
(2005) ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nature
neuroscience, vol. 8, pp 752-758.
David S, Kroner A (2011) Repertoire of microglial and macrophage responses after spinal
cord injury. Nature reviews Neuroscience, vol. 12, pp 388-399.
David S, Lacroix S (2005) Role of the immune response in tissue damage and repair in the
injured spinal cord. Clinical Neuroimmunology 2e edition.
De Rivero Vaccari J, Bastien D, Yurcisin G, Pineau I, Dietrich W, De Koninck Y, Keane
R, Lacroix S (2012) P2X4 Receptors Influence Inflammasome Activation after Spinal
Cord Injury. The Journal of neuroscience, vol. 32, pp 3058-3066.
Dinarello CA (2011) Interleukin-1 in the pathogenesis and treatment of inflammatory
diseases. Blood, vol. 117, pp 3720-3732.
Dittmer S, Kovacs Z, Yuan SH, Siszler G, Kögl M, Summer H, Geerts A, Golz S, Shioda
T, Methner A (2011) TOX3 is a neuronal survival factor that induces transcription
depending on the presence of CITED1 or phosphorylated CREB in the transcriptionally
active complex. In: Journal of Cell Science, vol. 124, pp 252-260.
Eigenbrod T, Park J-H, Harder J, Iwakura Y, Núñez G (2008) Cutting edge: critical role for
mesothelial cells in necrosis-induced inflammation through the recognition of IL-1 alpha
released from dying cells. In: The Journal of Immunology, vol. 181, pp 8194-8198.
Faulkner JR, Herrmann JE, Woo MJ, Tansey KE, Doan NB, Sofroniew MV (2004)
Reactive astrocytes protect tissue and preserve function after spinal cord injury. In: J
Neurosci, vol. 24, pp 2143-2155.
199
Fernandes-Alnemri T, Yu J-W, Datta P, Wu J, Alnemri E (2009) AIM2 activates the
inflammasome and cell death in response to cytoplasmic DNA. In: Nature, vol. 458, pp
509-513.
Fleming J, Norenberg M, Ramsay D, Dekaban G, Marcillo A, Saenz A, Pasquale-Styles M,
Dietrich W, Weaver L (2006) The cellular inflammatory response in human spinal cords
after injury. In: Brain, vol. 129, pp 3249-3269.
Gautier L, Cope L, Bolstad BM, Irizarry RA (2004) affy--analysis of Affymetrix GeneChip
data at the probe level. In: Bioinformatics, vol. 20, pp 307-315.
Gross O (2012) Measuring the inflammasome. In: Methods in molecular biology (Clifton,
NJ), vol. 844, pp 199-222.
Grossman SD, Rosenberg LJ, Wrathall JR (2001) Temporal-spatial pattern of acute
neuronal and glial loss after spinal cord contusion. In: Experimental neurology, vol. 168,
pp 273-282.
Herx L, Rivest S, Yong V (2000) Central nervous system-initiated inflammation and
neurotrophism in trauma: IL-1 beta is required for the production of ciliary neurotrophic
factor. In: Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950), vol. 165, pp 2232-2239.
Horai R, Asano M, Sudo K, Kanuka H, Suzuki M, Nishihara M, Takahashi M, Iwakura Y
(1998) Production of mice deficient in genes for interleukin (IL)-1alpha, IL-1beta, IL-
1alpha/beta, and IL-1 receptor antagonist shows that IL-1beta is crucial in turpentine-
induced fever development and glucocorticoid secretion. In: The Journal of
Experimental Medicine, vol. 187, pp 1463-1475.
Irizarry RA, Hobbs B, Collin F, Beazer-Barclay YD, Antonellis KJ, Scherf U, Speed TP
(2003) Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array
probe level data. In: Biostatistics, vol. 4, pp 249-264.
200
Iyer S, Pulskens W, Sadler J, Butter L, Teske G, Ulland T, Eisenbarth S, Florquin S, Flavell
R, Leemans J, Sutterwala F (2009) Necrotic cells trigger a sterile inflammatory response
through the Nlrp3 inflammasome (Supporting information). In: Proceedings of the
National Academy of Sciences, vol. 106, pp 20388-20393.
Kigerl KA, Gensel JC, Ankeny DP, Alexander JK, Donnelly DJ, Popovich PG (2009)
Identification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing either
neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord. In: The Journal of
neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience, vol. 29, pp 13435-
13444.
Kono H, Karmarkar D, Iwakura Y, Rock K (2010) Identification of the Cellular Sensor
That Stimulates the Inflammatory Response to Sterile Cell Death. In: The Journal of
Immunology, vol. 184, pp 4470-4478.
Lamacchia C, Rodriguez E, Palmer G, Gabay C (2013) Endogenous IL-1α is a chromatin-
associated protein in mouse macrophages. In: Cytokine.
Lamkanfi M, Dixit VM (2012) Inflammasomes and their roles in health and disease. In:
Annu Rev Cell Dev Biol, vol. 28, pp 137-161.
Lee SM, Rosen S, Weinstein P, Van Rooijen N, Noble-Haeusslein LJ (2011) Prevention of
both neutrophil and monocyte recruitment promotes recovery after spinal cord injury. In:
Journal of Neurotrauma, vol. 28, pp 1893-1907.
Li H, Ambade A, Re F (2009) Cutting edge: Necrosis activates the NLRP3 inflammasome.
In: Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950), vol. 183, pp 1528-1532.
Luheshi NM, Kovács KJ, Lopez-Castejon G, Brough D, Denes A (2011) Interleukin-1α
expression precedes IL-1β after ischemic brain injury and is localised to areas of focal
neuronal loss and penumbral tissues. In: Journal of neuroinflammation, vol. 8, p 186.
201
Lytle JM, Wrathall JR (2007) Glial cell loss, proliferation and replacement in the contused
murine spinal cord. In: Eur J Neurosci, vol. 25, pp 1711-1724.
Mason J, Suzuki K, Chaplin D, Matsushima G (2001) Interleukin-1beta promotes repair of
the CNS. In: The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for
Neuroscience, vol. 21, pp 7046-7052.
Matsushima H, Ogawa Y, Miyazaki T, Tanaka H, Nishibu A, Takashima A (2010)
Intravital imaging of IL-1beta production in skin. In: Journal of Investigative
Dermatology, vol. 130, pp 1571-1580.
Miron VE, Boyd A, Zhao J-W, Yuen TJ, Ruckh JM, Shadrach JL, van Wijngaarden P,
Wagers AJ, Williams A, Franklin RJM, Ffrench-Constant C (2013) M2 microglia and
macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS remyelination. In:
Nature Neuroscience, vol. 16, pp 1211-1218.
Nadeau S, Filali M, Zhang J, Kerr BJ, Rivest S, Soulet D, Iwakura Y, de Rivero Vaccari JP,
Keane RW, Lacroix S (2011) Functional recovery after peripheral nerve injury is
dependent on the pro-inflammatory cytokines IL-1β and TNF: implications for
neuropathic pain. In: The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for
Neuroscience, vol. 31, pp 12533-12542.
Nguyen L, Rothwell NJ, Pinteaux E, Boutin H (2011) Contribution of interleukin-1
receptor accessory protein B to interleukin-1 actions in neuronal cells. In: Neurosignals,
vol. 19, pp 222-230.
Pajoohesh-Ganji A, Byrnes K, Fatemi G, Faden A (2010) A combined scoring method to
assess behavioral recovery after mouse spinal cord injury. In: Neuroscience Research, pp
1-9.
202
Pineau I, Lacroix S (2007) Proinflammatory cytokine synthesis in the injured mouse spinal
cord: Multiphasic expression pattern and identification of the cell types involved. In:
The Journal of Comparative Neurology, vol. 500, pp 267-285.
Pineau I, Sun L, Bastien D, Lacroix S (2010) Astrocytes initiate inflammation in the injured
mouse spinal cord by promoting the entry of neutrophils and inflammatory monocytes in
an IL-1 receptor/MyD88-dependent fashion. In: Brain Behav Immun, vol. 24, pp 540-
553.
Rider P, Carmi Y, Guttman O, Braiman A, Cohen I, Voronov E, White MR, Dinarello CA,
Apte RN (2011) IL-1α and IL-1β recruit different myeloid cells and promote different
stages of sterile inflammation. In: Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950), vol.
187, pp 4835-4843.
Rosas M, Thomas B, Stacey M, Gordon S, Taylor P (2010) The myeloid 7/4-antigen
defines recently generated inflammatory macrophages and is synonymous with Ly-6B.
In: Journal of Leukocyte Biology, vol. 88, pp 169-180.
Shechter R, London A, Varol C, Raposo C, Cusimano M, Yovel G, Rolls A, Mack M,
Pluchino S, Martino G, Jung S, Schwartz M (2009) Infiltrating Blood-Derived
Macrophages Are Vital Cells Playing an Anti-inflammatory Role in Recovery from
Spinal Cord Injury in Mice. In: PLoS Medicine, vol. 6, p e1000113.
Smith D, Lipsky B, Russell C, Ketchem R, Kirchner J, Hensley K, Huang Y, Friedman W,
Boissonneault V, Plante M-M, Rivest S, Sims J (2009) A Central Nervous System-
Restricted Isoform of the Interleukin-1 Receptor Accessory Protein Modulates Neuronal
Responses to Interleukin-1. In: Immunity, vol. 30, pp 817-831.
Smyth GK (2004) Linear models and empirical bayes methods for assessing differential
expression in microarray experiments. In: Stat Appl Genet Mol Biol, vol. 3, p Article3.
203
Sofroniew M (2009) Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation.
In: Trends in neurosciences, vol. 32, pp 638-647.
Stirling DP, Liu S, Kubes P, Yong VW (2009) Depletion of Ly6G/Gr-1 leukocytes after
spinal cord injury in mice alters wound healing and worsens neurological outcome. In:
The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience, vol.
29, pp 753-764.
Stirling DP, Yong VW (2008) Dynamics of the inflammatory response after murine spinal
cord injury revealed by flow cytometry. In: J Neurosci Res, vol. 86, pp 1944-1958.
Thawer SG, Mawhinney L, Chadwick K, de Chickera SN, Weaver LC, Brown A, Dekaban
GA (2013) Temporal changes in monocyte and macrophage subsets and microglial
macrophages following spinal cord injury in the lys-egfp-ki mouse model. In: Journal of
Neuroimmunology.
Wettenhall JM, Simpson KM, Satterley K, Smyth GK (2006) affylmGUI: a graphical user
interface for linear modeling of single channel microarray data. In: Bioinformatics, vol.
22, pp 897-899.
Yuan S, Qiu Z, Ghosh A (2009) TOX3 regulates calcium-dependent transcription in
neurons. In: Proceedings of the National Academy of Sciences, vol. 106, pp 2909-2914.
Zheng Y, Humphry M, Maguire JJ, Bennett MR, Clarke MCH (2013) Intracellular
Interleukin-1 Receptor 2 Binding Prevents Cleavage and Activity of Interleukin-1α,
Controlling Necrosis-Induced Sterile Inflammation. In: Immunity.
205
5. Chapitre 5 : Discussion & Conclusion
Les LME sont causées par un impact direct sur le tissu résultant en la destruction des
neurones, des axones, de la myéline et des cellules gliales. Les LME occasionnent aussi
l’apparition de dommages secondaires caractérisés par la mort par apoptose de neurones et
d’OLs. Ces dommages secondaires peuvent être causés par différents mécanismes
cellulaires et moléculaires tels que l’activation des cellules gliales, l’hémorragie et la
relâche de cytokines pro-inflammatoires et de glutamate. L’inflammation est aussi une
conséquence inévitable des LME. Les cellules immunitaires innées telles que les
neutrophiles et les monocytes sont recrutées rapidement au site de lésion (Fleming et al.,
2006, Stirling et Yong, 2008, Beck et al., 2010, Pineau et al., 2010). Il est connu que ces
cellules peuvent jouer un rôle important dans la propagation des dommages secondaires de
par leur implication dans la production de molécules oxydantes, d’enzymes protéolitiques
et de cytokines. Cependant, ces cellules joueraient également un rôle essentiel dans la
réparation tissulaire. L’existence de plusieurs sous-types de cellules immunitaires exerçant
un effet soit neurotoxique soit réparateur pourrait expliquer cette divergence dans les
différentes études effectuées sur ce sujet (Popovich et al., 1999) (Stirling et Yong, 2008)
(Shechter et al., 2009)(Lee et al., 2011). Une meilleure compréhension des mécanismes
régulant la migration, l’activation et les différentes fonctions de ces cellules immunitaires
nous permettrait donc d’identifier des cibles potentielles pour traiter le SNC lésé de façon à
diminuer la perte de tissu nerveux et promouvoir la réparation tissulaire.
Les travaux ayant mené à la rédaction de cette thèse avaient pour but d’identifier les
mécanismes impliqués dans l’initiation de l’inflammation et le recrutement des cellules
immunitaires innées ainsi que les mécanismes sous-jacents aux dommages tissulaires
occasionnant un déficit moteur chez la souris ayant subi une LME. Tout d’abord, nous nous
sommes intéressés aux mécanismes d’activation et de relâche de l’IL-1β impliquant le
récepteur purinergique P2X4R et les inflammasomes. Ensuite, nous nous sommes attardés
206
aux effets de la délétion des gènes codant pour les cytokines IL-1α et IL-1β sur
l’inflammation et la perte des fonctions locomotrices suite à une LME.
5.1. Étude du rôle de P2X4R Les résultats présentés dans le chapitre 3 nous ont permis d’identifier le P2X4R comme un
activateur important du clivage de l’IL-1β très tôt suite à une LME. Ce mécanisme semble
être dépendant de l’activation et de la formation d’un complexe protéique appelé
inflammasome étant donné que nous avons noté une augmentation de l’expression de la
caspase-1 clivée, la protéine effectrice nécessaire au clivage de l’IL-1β. Les souris P2x4r-/-
présentent une diminution d’expression des formes clivées de la caspase-1 et de l’IL-1β
ainsi qu’une récupération locomotrice plus rapide dès le premier jour post-LME
comparativement aux souris contrôles C57BL/6.
Dans cette étude, nous avons utilisé une méthode indirecte pour détecter la localisation
cellulaire de P2X4R, c’est-à-dire la détection de l’expression de la β-galactosidase dont le
gène fut inséré à la place du premier exon de P2X4R chez les souris P2x4r-/-. Nous avons
observé une forte colocalisation de P2X4R avec les marqueurs neuronaux NeuN et HuC/D
dans nos préparations de moelles épinières intactes et lésées (temps 24 heures post-LME).
Par contre, nous n’avons pas réussi à détecter le récepteur chez la microglie malgré le fait
qu’il fut rapporté à plusieurs reprises que la microglie exprime une variété de récepteurs
purinergiques (Färber and Kettenmann, 2006, Fields and Burnstock, 2006), dont P2X4R
(Schwab et al., 2005, Ulmann et al., 2008, Ulmann et al., 2013, Vázquez-Villoldo et al.,
2013). P2X4R fut aussi démontré comme étant important dans le contrôle des fonctions
inflammatoires et phagocytaires des microglies dans diverses maladies du SNC (Tozaki-
Saitoh et al., 2011). Récemment, P2X4R fut observé chez les cellules microgliales
CX3CR1+ 48 heures après une crise épileptique de longue durée (Ulmann et al., 2013).
Cependant, son niveau d’expression semblait varier selon l’état d’activation de la
microglie. Au cours de l’étude présentée dans le chapitre 4, nous avons démontré que la
microglie est responsable de la synthèse de l’IL-1α très tôt suite à une LME (c.-à-d. au
temps 4 heures post-lésion). Ensemble, ces résultats suggèrent qu’il serait intéressant de
207
déterminer l’expression de P2X4R à des temps plus tôt post-LME. Il demeure donc possible
que l’ATP relâchée en grande quantité immédiatement suivant la lésion puisse avoir
stimulé l’expression de P2X4R chez les microglies.
La présence de P2X4R dans les neurones semble être impliquée dans plusieurs fonctions
neuronales telles que la neurotransmission et la potentialisation synaptique (Fields and
Burnstock, 2006, Burnstock, 2007, Henshall et al., 2013). L’activation de P2X4R chez les
neurones entraîne une mort cellulaire rapide de même que l’activation des microglies. Il
demeure donc possible que la diminution de l’activation des microglies, déterminée en
fonction de la baisse de l’intensité du marquage galectine-3 observé chez les souris P2x4r-/-,
puisse être causée par l’absence du récepteur chez les neurones, résultant ainsi à un déficit
de stimulation de la microglie par des facteurs normalement relâchés par les neurones en
détresse. Il serait donc intéressant d’étudier les effets de ce récepteur chez la microglie et
les neurones séparément pour élucider le rôle de P2X4R dans l’activation et la prolifération
de la microglie. Pour ce faire, nous pourrions prendre avantage des modèles de souris
transgéniques en utilisant le système Cre-lox dans le but de déléter de façon cellule
spécifique un gène d’intérêt. In vitro, nous pourrions co-cultiver des cellules microgliales et
neurones préalablement traités avec le système CRISPR-Cas9 afin d’induire une mutation
non-fonctionnelle spécifique dans un gène d’intérêt comme P2x4r (Hsu et al., 2014).
Le mécanisme exact de l’activation de P2X4R et du clivage et de la relâche de l’IL-1β
demeure inconnu. L’ATP relâchée par les cellules endommagées et nécrotiques pourrait
l’être par l’entremise d’hémicanaux membranaires tels que les pannexines et les connexines
(Barbe et al., 2006). Les pannexines contribueraient à la propagation des dommages
neuronaux en permettant le transport des ions Ca2+ du milieu extracellulaire jusqu’à
l’intérieur de la cellule. Bien que les pannexines semblent rester dans une position ouverte,
il a été démontré que l’activation de la pannexine-1 (Panx1) facilite le passage de Ca2+ à
travers la membrane cellulaire (Vanden Abeele et al., 2006) (Locovei et al., 2006). Une
autre conséquence de l’activation de Panx1 est la sortie d’ATP de la cellule (Bao et al.,
2004). Les pannexines possèdent d’ailleurs une plus grande perméabilité à l’ATP
comparativement aux connexines (Iglesias et al., 2009, Iglesias and Spray, 2012). Plusieurs
208
interactions de Panx1 avec des récepteurs membranaires tels que le NMDA (N-methyl-D-
aspastate), le TRPV4 (transient receptor potential cation channel subfamily V member 4),
les récepteurs couplés aux protéines G et les récepteurs purinergiques ont été décrites
(Shestopalov and Slepak, 2014). Pelegrin et al. ont démontré que Panx1 est requise pour la
clivage de l’IL-1β par la caspase-1 de même que pour la relâche de cette cytokine en
réponse à l’activation de P2X7R par l’ATP dans des macrophages en culture (Pelegrin et
Surprenant, 2006) (Pelegrin et al., 2008). En effet, le traitement de macrophages en culture
avec un peptide inhibant Panx1, 10panx1, a pour effet de bloquer l’activation de la caspase-
1 en réponse à l’ATP, diminuant ainsi la relâche de l’IL-1α, l’IL-1β et l’IL-18. De plus
amples expériences seraient donc nécessaires pour vérifier l’importance de Panx1 suite à
l’activation de P2X4R et, par conséquent, dans les dommages neuronaux qui surviennent
suite à une LME. Toutefois, Silverman et al. ont démontré par co-immunoprécipitation que
Panx1 est capable de s’associer à P2X7R et la caspase-1 dans des cellules neuronales en
culture (Silverman et al., 2009). Cette étude a d’ailleurs démontré que l’activation de
l’inflammasome NLRP1 par les ions K+ peut être inhibée par l’ajout de probenecide, un
inhibiteur de Panx1. Ce mécanisme suggère donc la possibilité que Panx1 joue un rôle
important dans le clivage et la relâche de l’IL-1β par les neurones.
L’activation des récepteurs P2X suggère une augmentation des concentrations
intracellulaires en Ca2+, l’activation de protéases telles que les caspases et la calpaïne et
l’assemblage d’un inflammasome responsable du clivage de l’IL-1β. Plusieurs
inflammasomes candidats pourraient se former suite à l’activation par l’ATP, comme par
exemple NLRP1 (Silverman et al., 2009, Fan et al., 2014), NLRP2 (Minkiewicz et al.,
2013) et NLRP3 (Kanneganti et al., 2007, Gombault et al., 2012). L’inflammasome NLRP1
a déjà été identifié dans les neurones de la moelle épinière (de Rivero Vaccari et al., 2008)
ou du cerveau (de Rivero Vaccari et al., 2009) ainsi que dans les astrocytes, les
macrophages/microglies (Abulafia et al., 2009) et les OLs (Kummer et al., 2007). NLRP2
est aussi exprimé dans les astrocytes humains, du moins en culture (Minkiewicz et al.,
2013). Quant à NLRP3, il semble peu ou pas exprimé dans le cerveau normal (Kummer et
al., 2007, de Rivero Vaccari et al., 2008). Par contre, la situation est tout autre dans un
contexte pathologique. Dans la maladie d’Alzheimer, par exemple, il fut rapporté que
209
l’inflammasome NLRP3 est activé dans les cellules microgliales du cerveau en réponse à
l’augmentation des plaques β-amyloïdes (Tan et al., 2013). Des études in vitro et in vivo par
immunoprécipitation et par immunofluorescence pourraient contribuer dans le futur à
identifier les inflammasomes impliqués suite à l’activation de P2X4R.
Les P2XRs sont capables de former des homodimères mais peuvent aussi s’assembler en
hétérodimères avec d’autres P2XRs (North, 2002). Les récepteurs P2X4 et P2X7 ont la
possibilité d’influencer l’expression de l’un et l’autre, de sorte que l’expression de P2X4R
serait sur-régulée lorsque l’expression de P2X7R est sous-régulée (Weinhold et al., 2010).
Par contre, nous n’avons pas observé ce mécanisme de régulation suite à une LME, en
accord avec les résultats de d’autres études réalisées in vivo (Brône et al., 2007, Ulmann et
al., 2008, Barberà-Cremades et al., 2012). L’activation prolongée des P2XRs peut induire
la perméabilité de ces récepteurs à de plus grosses molécules telles que des colorants
fluorescents de plus de 900 Da de diamètre (Pelegrín, 2011). Les pores ainsi formés
seraient vraisemblablement associés à la mort cellulaire par apoptose (Virginio et al., 1999,
Mackenzie et al., 2005) et pourraient aussi impliquer la perméabilité de la membrane
mitochondriale (Bonora et al., 2014). Casas-Pruneda et al. ont mis à profit cette
caractéristique unique de P2X7R pour étudier l’interaction entre P2X4R et P2X7R (Casas-
Pruneda et al., 2009). Plus spécifiquement, ce groupe a étudié l’entrée du bromure
d’éthidium (BrEt) suite à une stimulation avec le Bz-ATP, un agoniste de P2X7R, dans des
cellules HEK-293 transfectées avec P2X4R, P2X7R ou les 2 récepteurs. Ils ont observé que
les cellules exprimant les 2 récepteurs présentent une entrée 4 fois plus faible en EtBr et
moins rapide comparativement aux cellules n’exprimant que P2X7R. De plus, l’amplitude
du courant Na+, mesurée par électrophysiologie, est fortement diminuée chez les cellules
exprimant les 2 récepteurs en comparaison avec celles n’exprimant que P2X7R. Par contre,
la coexpression de ces récepteurs a amélioré de façon siginificative la régulation du
courrant électrique cellulaire généré par l’activation de P2X7R. Ces résultats suggèrent
donc que la formation de larges pores dans la membrane, un signe avant-coureur de mort
cellulaire, et les autres effets biologiques de P2X7R pourraient être fortement régulés par la
présence de P2X4R. Il faudrait donc s’assurer que l’absence de P2X4R chez les souris
P2x4r-/- n’a pas entrainé d’effet sur l’activité biologique de P2X7R et que les effets
210
observés chez ces souris furent uniquement causés par l’absence de P2X4R. Supportant
cette possibilité sont les travaux de Hung et al. ayant démontré que ces 2 récepteurs
forment une certaine synergie. En effet, des études de co-immunoprécipitation effectuées
grâce à un anticorps liant le P2X4R ont démontré que P2X7R et Panx1 forment un
hétérotrimère avec P2X4R dans les cellules endothéliales des gencives suite à une
stimulation à l’ATP (Hung et al., 2013). Il semble que ce complexe favoriserait la
production de cytokines pro-inflammatoires telle que l’IL-1β en présence de P. gingivalis,
comme le suggère le fait que la sécrétion d’IL-1β par les cellules endothéliales soit bloquée
suite à une stimulation à l’ATP et un traitement avec des antagonistes de P2X7R (ex. :
PPADS, oxATP), un inhibiteur de Panx1 (probenecide) ou un inhibiteur de P2X4R (5-
BDBD). L’existence d’une association entre ces deux récepteurs P2X suppose une certaine
complexité de la voie de signalisation des récepteurs purinergiques. La création de modèles
transgéniques murins possédant des déficiences dans l’un ou l’autre de ces récepteurs ou
dans les deux de façon cellule spécifique serait très intéressante pour établir la dépendance
fonctionnelle in vivo de ces 2 récepteurs dans les mécanismes d’activation de
l’inflammation dans notre modèle de lésion.
Finalement, nous avons démontré que l’absence de P2X4R entraîne une amélioration des
fonctions locomotrices très tôt suite à une LME. Nous avions alors suggéré que le blocage
de ce récepteur dans la phase aigüe suivant la lésion serait un moyen efficace de prévenir
les effets néfastes de l’inflammation sur la perte des fonctions neurologiques dans plusieurs
modèles de lésion du SNC. Par conséquent, il serait intéressant de vérifier l’effet des
antagonistes de P2X4R sur l’activation de l’inflammasome et la propagation des dommages
neuronaux. Plusieurs drogues peuvent être utilisées pour bloquer ce récepteur. Parmi celles-
ci, nous retrouvons l’ivermectine, un inhibiteur allostérique de P2X4R, le TNP-ATP et le 5-
BDBD, deux antagonistes, ainsi que la paroxetine, un antidépresseur capable d’inhiber le
récepteur (Vázquez-Villoldo et al., 2013).
211
5.2. Étude des effets des cytokines de la famille de l’IL-1 : l’IL-1αα et l’IL-1ββ Les résultats présentés dans le chapitre 4 nous ont permis de démontrer que l’IL-1α est
impliquée dans la régulation des mécanismes de survie des OLs, et que son absence
entraîne une augmentation de la récupération des fonctions locomotrices suite à une LME.
L’effet protecteur de cette cytokine semble dépendant de la surexpression du facteur de
survie TOX3 chez les OLs. Nous avons tout d’abord analysé l’expression temporelle de
l’IL-1α et de l’IL-1β suite à une LME. L’IL-1α est très rapidement exprimée par la
microglie et ce dès le temps 4 heures post- LME, tandis que les neutrophiles et monocytes
pro-inflammatoires recrutés au site de lésion semblent être responsables de l’expression de
l’IL-1β entre 6 et 24 heures post-lésion. Étant donné que la pro-forme de l’IL-1α est
biologiquement active, contrairement à la pro-forme de l’IL-1β, il n’est pas étonnant que
l’expression et les effets de l’IL-1α suite à la lésion soient observés plus rapidement chez la
souris. Néanmoins, la pro-IL-1α pourrait avoir été rapidement clivée par des protéases
telles que la calpaïne (Carruth et al., 1991) (Zheng et al., 2013) ou la granzyme B (Afonina
et al., 2011). La calpaïne fut d’ailleurs associée à la propagation des dommages tissulaires
dans le SNC suite à une LME (Ray et al., 2003a, Vosler et al., 2008, Yang et al., 2013). Au
contraire, l’inhibition de la calpaïne avec E-64d chez le rat suite à une LME a eu pour effet
d’entraîner une diminution de la fragmentation de l’ADN génomique dans le tissu lésé. De
plus, cet inhibiteur a contribué à l’élévation du niveau de transcription du gène de la
protéine basique de la myéline (MBP), une composante importante de la structure de la
myéline, suggérant qu’un tel traitement pourrait améliorer le recouvrement des fonctions
locomotrices suite à une LME (Ray et al., 2003b). Amini et al. ont récemment produit une
souris déficiente en calpaïne spécifiquement dans le SNC (souris Nestin-cre; capns1flox/flox)
(Amini et al., 2013). Ils ont observé dans ce modèle une modification de la morphologie
des neurones pyramidaux CA1 chez les souris calpaïne-KO. En effet, l’absence de la
calpaïne a diminué la densité des épines dendritiques chez ces neurones ainsi que le nombre
totale d’épines chez l’animal. Une réduction des niveaux d’expression de certaines sous-
unités des récepteurs NMDA et AMPA a aussi été constatée, altérant ainsi la mémoire et
l’apprentissage. De plus, une déficience en calpaïne chez la souris a pour effet de diminuer
la sensitivité des neurones à une toxine spécifique du complexe 1 de la mitochondrie, le
212
MPP+, un métabolite actif du MPTP utilisé comme modèle animal de la maladie de
Parkinson. Dans cette étude, la survie neuronale fut favorisée via un mécanisme inhibant le
clivage de la sous-unité p35 de la kinase dépendante de la cycline (Cdk5). Étant donné le
rôle de la calpaïne dans le clivage de l’IL-1α et dans les dommages neuronaux, il serait
intéressant de caractériser les effets de cette protéase sur les OLs et la remyélinisation dans
notre modèle de LME.
Bien qu’il n’est pas surprenant que la microglie soit rapidement activée suite à une LME, il
s’agit de la toute première démonstration que cette cellule serait potentiellement impliquée
dans un mécanisme de régulation de la protéine de survie TOX3 chez les OLs. La microglie
fournit un environnement favorable à la croissance des OLs en produisant plusieurs
facteurs de croissance et médiateurs pro-inflammatoires nécessaires à la réparation
tissulaire et la remyélinisation (Lambertsen et al., 2009, Graeber et al., 2011, Peferoen et
al., 2014). Différentes études ont démontré que l’inhibition de la microgliose présente des
effets néfastes à la réparation tissulaire et la remyélinisation, suggérant ainsi une certaine
interaction physique et/ou moléculaire entre les microglies et les OLs. Il a été démontré que
les microglies s’accumulent dans le cerveau de souris traitées au cuprizone, une drogue
servant à induire la mort des OLs et une démyélinisation aiguë chez le rongeur, et
demeurent activées plusieurs jours suivant l’arrêt de la diète. Fait intéressant, l’inhibition de
l’activité de ces cellules grâce à un traitement à la minocycline permet de réduire la perte
d’OLs matures (CC1+) et de rétablir, du moins en partie, les niveaux d’expression de la
protéine basique de la myéline (MBP). Il fut également rapporté que la minocycline a pour
effet de diminuer la surexpression de l’ARNm du CNTF par les microglies situées dans les
zones de démyélinisation-remyélinisation. Ces résultats suggèrent que le CNTF relâché par
ces cellules une fois activées serait important pour la remyélinisation des axones (Tanaka et
al., 2013). Une seconde étude a aussi suggéré que la microglie favoriserait la
remyélinisation en stimulant la réponse des OPCs chez le rat dans un modèle de
démyélinisation avec le BrEt (Li et al., 2005). L’injection de la minocycline dans ce modèle
animal a eu pour effet de diminuer l’expression de deux marqueurs d’OPCs, soient le
PDGF-αR et Olig-1, 5 jours après le traitement au BrEt, moment auquel la prolifération des
OPCs est à son maximum suite à une démyélinisation. Il est à noter qu’Olig-1 et Olig-2
213
sont reconnus comme étant des facteurs de transcription nécessaires à la remyélinisation
dans le modèle de la cuprizone chez la souris. Ces protéines sont exprimées dans le noyau
des OLs et de leurs précurseurs et ce dès le jour 1 post-naissance (Arnett et al., 2004),
suggérant ainsi leur importance dans le développement du SNC.
D’un autre côté, la microglie peut aussi produire de nombreux médiateurs inflammatoires
pouvant infliger des dommages aux cellules du SNC tels que le glutamate, les MMPs, les
ROS et NOS ainsi que certaines cytokines (van Rossum and Hanisch, 2004, Graeber et al.,
2011, Peferoen et al., 2014). En lien avec cette affirmation, de nombreuses études ont
démontré que l’inhibition de l’activation et de la prolifération des microglies engendre des
effets neuroprotecteurs suite à des dommages neurologiques (Tikka et al., 2001, Stirling et
al., 2004, Yune et al., 2007, Howell et al., 2010, Schmitz et al., 2014). L’inhibition de
l’activité microgliale par la minocycline a permis de diminuer la production de métabolites
d’oxyde d’azote (NO) en réponse à des excitoxines (ex.: glutamate ou kainate) dans des
cultures mixtes provenant de moelles épinières via un mécanisme impliquant l’inhibition de
la phosphorylation de la MAPK p38 (Tikka et al., 2001). Yune et al. ont par la suite
approfondi l’étude de cette voie de signalisation en démontrant que l’inhibition de MAPK
p38 a pour effet de réduire la production de pro-NGF par les microglies dans la moelle
épinière lésée, définissant ainsi, un nouveau mécanisme par lequel les OLs pourraient
mourir suite à une LME chez le rat (Yune et al., 2007). L’équipe de Stirling et al. ont
rapporté que l’amélioration des fonctions locomotrices suite à l’inhibition de la microglie
par la minocycline serait plutôt due à une diminution de la dégénérescence rétrograde aiguë
dans les faisceaux corticospinaux (CST) (Stirling et al., 2004). Il est important de noter que
ces effets pourraient être occasionnés par d’autres types cellulaires étant donné que la
minocycline n’est pas spécifique aux microglies. Bien que l’IL-1β fut auparavant identifiée
comme étant nécessaire à la maturation des OPCs et la remyélinisation dans le modèle de la
cuprizone chez la souris (Mason et al., 2001), d’autres ont démontré qu’une diminution en
IL-1β résultant de l’inactivation des microglies permet d’augmenter l’intégrité de la matière
blanche chez des rats néonataux après 24 h d’exposition à une forte concentration (80% O2)
d’oxygène (Schmitz, 2014). Tous ces résultats suggèrent qu’il existe différentes fonctions
et états d’activation chez les cellules microgliales. Il serait donc intéressant d’étudier plus
214
en détail l’activation de la microglie et ses interactions physiques et moléculaires avec les
OLs dans notre modèle murin de LME dans le but de mieux contrôler les effets de la
microglie sur les OLs. L’observation de coupes histologiques par microscopie électronique
pourrait éventuellement nous fournir des évidences de l’intéraction physique entre ces 2
types cellulaires in vivo. De plus, nous pourrions prendre avantage de l’utilisation de co-
cultures de microglies et d’OLs ou de souris traitées avec un inhibiteur de la microglie pour
vérifier l’effet de cette cellule sur la prolifération et la différenciation des OL.
Nous avons aussi démontré que l’IL-1α joue un rôle dans les mécanismes cellulaires
impliqués dans la mort des OLs matures. En effet, l’absence de cette cytokine a pour effet
d’entrainer une amélioration de la récupération des fonctions locomotrices suite à une
LME. Tel que mentionné auparavant, l’IL-1α semble inhiber l’expression du facteur de
survie TOX3 chez les OLs. En effet, nous avons démontré que l’absence d’IL-1α chez la
souris augmente l’expression de TOX3 chez les OLs. Le mécanisme de régulation de
TOX3 dans les OLs par l’IL-1α demeure cependant inconnu. Des expériences futures
devront être réalisées pour établir si l’IL-1α possède un rôle direct ou indirect dans la
survie des OLs. L’utilisation de cultures d’OLs semble être une alternative très intéressante
puisque plusieurs modèles in vitro de mort cellulaire existent. L’équipe de Dittmer et al. a
démontré que la surexpression de TOX3 chez des cellules neuronales Neuro2a transfectées
avec un vecteur d’expression Myc-TOX3 protège celles-ci contre la mort cellulaire en
diminuant l’expression de gènes pro-apoptotiques tels que les caspases-3 et -9, Bax, Bid et
Bad et via la sur-régulation de gènes anti-apoptotiques tels que Bcl-XL et Bcl-2 (Dittmer et
al., 2011). Cette étude a aussi démontré que TOX3 est capable d’interagir avec CITED1 ou
CREB phosphorylé afin de former un complexe permettant la transcription de différents
promoteurs tel que les promoteurs C3 répondant à l’estrogène ou Bcl-2. Les modèles de
mort cellulaire utilisés dans cette étude comprenaient le traitement à la tunicamycine, une
drogue qui inhibe la synthèse des N-glycoprotéines et crée un stress mortel via le réticulum
endoplasmique, et la sur-expression de Bax qui elle mène à la relâche du cytochrome c par
les mitochondries et l’activation des caspases impliquées dans l’apoptose. Un autre modèle
in vitro très intéressant consiste en l’utilisation de conditions hypoxiques (O2 <0,3%, 5%
CO2, 95% N2) dans le but causer la nécrose et/ou l’apoptose. Ce modèle d’environnement
215
hypoxique fut entre autre utilisé par Cohen et al. lorsqu’ils ont rapporté la relâche de la
forme précurseure de l’IL-1α par des kératinocytes (BD7) nécrotiques après 24 heures de
culture (Cohen, 2010). De plus, cette relâche d’IL-1α fut corrélée à une augmentation du
recrutement de neutrophiles et de monocytes chez des souris injectées avec un surnageant
contenant des cellules nécrotiques. Enfin, l’ajout d’un anticorps dirigé contre l’IL-1α mais
pas contre l’IL-1β dans les lysats cellulaires a permis de diminuer le recrutement de cellules
pro-inflammatoires au site d’injection, fournissant ainsi des évidences du rôle spécifique de
l’IL-1α dans l’inflammation qui s’installe dans des conditions nécrotiques (Chen et al.,
2007). Donc, sachant que l’augmentation de TOX3 chez les OLs semble avoir un rôle
bénéfique sur la récupération locomotrice chez la souris, il pourrait être pertinent d’étudier
l’effet des conditions hypoxiques in vitro, par exemple, sur la mort des OLs et l’expression
de TOX3. Par la suite, nous pourrions vérifier l’effet de la sur-expression de TOX3 chez
des OLs transfectés avec un vecteur exprimant TOX3 et observer si la mort cellulaire est
effectivement diminuée chez ces OLs dans ces mêmes conditions.
Nous avons également observé un niveau d’expression basal plus élevé pour TOX3 chez
les souris Il-1α-/- naïves comparativement aux souris contrôles. La plus forte expression de
TOX3 chez les souris Il-1α-/- naïve suggère que cette protéine pourrait être fortement
régulée au cours du développement de l’animal. En effet, nous avons sacrifié des souris à
différents temps post-naissance (P3, P7, P10, P14, P18, P30) et observé que le nombre
d’OLs CC1+ TOX3+ est fortement augmenté chez les souris Il-1α-/- dès le dixième jour
suivant la naissance comparativement aux souris contrôles et Il-1β-/-. Ce temps correspond
au moment où la quantité de myéline tend à augmenter dans le cerveau de rongeurs en
développement, bien que des axones myélinisés soient déjà observés à P7 (Downes et
Mullins, 2013). Dans le cerveau de rats, les 10 premiers jours suivant la naissance
correspondent à des temps où la population microgliale se retrouve plutôt sous une forme
améboïde tandis que les microglies changent leur morphologie pour une forme ramifiée
vers la 14e journée post-naissance (Shigemoto-Mogami et al., 2014). Il fut aussi démontré
que les microglies peuvent stimuler l’oligodendrogénèse en favorisant la relâche de facteurs
trophiques e.g., IGF-1 (Butovski, 2006) et cytokines (e.g., IL-1β, IL-6 et TNF-α) ainsi que
la prolifération des cellules progénitrices O4+ (Shigemoto-Mogami et al., 2014). Pendant le
216
développement embryonnaire chez le rongeur, les OPCs semblent provenir de la région
ventrale de la moelle épinière avant de migrer vers les autres régions du SNC incluant le
cerveau (de Castro et al., 2005) (Crawford et al., 2014). Les OPCs se différencient en OLs
matures dans le SNC mais sont aussi capables de proliférer pour maintenir le nombre de
leur population. Il semblerait que ces cellules progénitrices auraient également le pouvoir
de générer des cellules de Schwann et, dans de plus rares occasions, des astrocytes
(Crawford et al., 2014). En plus des fonctions physiologiques dans le SNC sain ou en
développement, les OPCs jouent un rôle très important suite à une lésion tissulaire. En
effet, ces cellules migrent vers les zones de démyélinisation, prolifèrent et se différencient
en OLs matures dans le but de remyéliniser le tissu atteint (Zawadzka et al., 2010). Pour
bien déterminer le mécanisme de régulation de l’expression de TOX3 au cours du
développement, il serait intéressant d’étudier la migration des OPCs et leur différenciation
en OLs matures. Nous avons aussi planifié d’étudier par RT-PCR l’expression de l’ARNm
de l’IL-1α et de l’IL-1β à différents temps post-naissance (P1, P3, P7, P10, P14, P18, P30)
et vérifier si l’expression de l’IL-1α chez la microglie corrèle avec la présence de TOX3
dans les OLs.
Le développement des OLs est contrôlé par la présence de différents facteurs de croissance.
La présence de Sonic hedgehog (Shh) est nécessaire à l’apparition et à la différenciation des
OPCs dans un cerveau en développement et adulte (Orentas et al., 1999, Sussman et al.,
2002, Ortega et al., 2013). De plus, Shh semble jouer un rôle dans la remyélinisation
d’axones puisque son expression est augmentée chez les OLs Olig2+ dans un cerveau ayant
subi une démyélinisation via le traitement avec la lysophosphatidylcholine (LPC),
suggérant du même coup que ces cellules sont une source majeure de Shh (Ferrent et al.,
2013). Cette étude a aussi démontré que l’injection d’un vecteur sur-exprimant Shh chez la
souris favorise la différenciation des OPCs en OLs MBP+ au site de démyélinisation-
remyélinisation. Plus récemment, Jia et al. ont démontré qu’il est possible d’améliorer les
fonctions locomotrices chez le rat ayant subi une LME par une simple injection intrathécale
dans la moelle épinière de cellules souches mésenchymales (BMSCs) transfectées avec un
vecteur d’expression contenant Shh. Dans cette même étude, la surexpression de Shh a
également entraîné une sur-expression des facteurs de croissance bFGF et VEGF ainsi que
217
le neurofilament NF200 (Jia et al., 2014). Les résultats de cette étude corrèlent avec ceux de
2 études antérieures au cours desquelles il fut démontré que Shh possède des effets
bénéfiques dans un modèle d’ischémie cérébrale et de LME (Bambakidis et al., 2010,
Bambakidis et al., 2012). Ces résultats suggèrent donc que le ciblage de l’expression de
Shh serait d’une valeur thérapeutique prometteuse pour le traitement de plusieurs maladies
neurodégénératives chez l’humain. Il est important de noter que plusieurs cytokines telles
que l’IL-1β, TNF-α et IFN-γ sont capables d’induire l’expression de l’ARNm de Shh dans
des cultures primaires d’astrocytes (Falsig et al., 2006). Il fut aussi démontré que Shh est
exprimé par des astrocytes réactifs et que ces derniers stimuleraient la prolifération des
précurseurs Olig2+ suite à une lésion du cerveau (Amankulor et al., 2009). Cela suggère
que la voie de signalisation de Shh pourrait être en partie responsable du processus de
remyélinisation après l’apparition de dommages tissulaires du SNC. De plus, le facteur de
transcription NF-κB pouvant être induit par l’IL-β peut se lier au promoteur de Shh dans le
but d’activer la transcription de celui-ci (Kasperczyk et al., 2009). Ce mécanisme fut
démontré comme étant capable de stimuler la résistance des cellules à l’apoptose et la
croissance des cellules pancréatiques tumorales in vivo. Étant donné que la surexpression
de TOX3 semble réguler la survie des OLs et peut-être aussi celle des neurones via
l’expression de gènes pro- et anti-apoptotiques, il serait intéressant de vérifier si TOX3 peut
aussi réguler l’expression de Shh chez les OLs, favorisant ainsi la réparation tissulaire suite
à une LME.
5.3. Conclusion Les travaux présentés dans cette thèse ont permis d’identifier plusieurs médiateurs de
l’initiation de l’inflammation suite à une LME. Nous suggérons que le récepteur
purinergique P2X4R est activé très rapidement suite à une lésion, activant à son tour un
inflammasome encore non identifié (possiblement NLRP1b ou AIM2) qui serait nécessaire
au clivage de l’IL-1β impliqué dans la propagation de l’inflammation et des dommages
neuronaux dont la résultante serait une perte précoce des fonctions locomotrices chez la
souris.
218
Nous avons aussi démontré que la microglie exprime rapidement l’IL-1α tandis que
l’expression de l’IL-1β se fait un peu plus tardivement par les cellules immunitaires pro-
inflammatoires recrutées au site de lésion telles que les neutrophiles et les monocytes M1.
L’inhibition de l’IL-1α a permis d’accélérer la récupération locomotrice. Nous suggérons
donc que la microglie est primordiale à l’initiation de l’inflammation suite à la lésion. La
microglie contribuerait donc à la propagation des dommages tissulaires dans notre modèle.
Nous avons aussi prouvé que l’inhibition de l’IL-1α chez les souris Il-1α-/- a pour effet
d’augmenter l’expression de TOX3 dans les OLs. TOX3 est reconnu comme étant un
facteur de survie notamment pour les neurones. La sur-expression de TOX3 pourrait
possiblement contribuer à la diminution de la perte cellulaire suite à la lésion, mais cette
affirmation reste à être confirmée.
Cette thèse aura permis d’élucider de nouveaux mécanismes cellulaires et moléculaires
déclenchés suite à une LME et qui pourraient représenter des cibles thérapeutiques
intéressantes pour l’amélioration des fonctions neurologiques chez les individus affligés par
ce type de lésion.
219
Chapitre 6 : Bibliographie de l’introduction et la discussion Abbate A, Salloum F, Vecile E, Das A, Hoke N, Straino S, Biondi-Zoccai G, Houser J-E,
Qureshi I, Ownby E, Gustini E, Biasucci L, Severino A, Capogrossi M, Vetrovec G,
Crea F, Baldi A, Kukreja R, Dobrina A (2008) Anakinra, a Recombinant Human
Interleukin-1 Receptor Antagonist, Inhibits Apoptosis in Experimental Acute
Myocardial Infarction. In: Circulation, vol. 117, pp 2670-2683.
Abbott NJ, Rönnbäck L, Hansson E (2006) Astrocyte-endothelial interactions at the blood-
brain barrier. In: Nature reviews Neuroscience, vol. 7, pp 41-53.
Abbracchio MP, Burnstock G, Boeynaems J-M, Barnard EA, Boyer JL, Kennedy C, Knight
GE, Fumagalli M, Gachet C, Jacobson KA, Weisman GA (2006) International
Union of Pharmacology LVIII: update on the P2Y G protein-coupled nucleotide
receptors: from molecular mechanisms and pathophysiology to therapy. In:
Pharmacol Rev, vol. 58, pp 281-341.
Abulafia D, De Rivero Vaccari J, Lozano J, Lotocki G, Keane R, Dietrich W (2009)
Inhibition of the inflammasome complex reduces the inflammatory response after
thromboembolic stroke in mice. In: Journal of Cerebral Blood Flow; Metabolism,
vol. 29, pp 534-544.
Adachi O, Kawai T, Takeda K, Matsumoto M, Tsutsui H, Sakagami M, Nakanishi K, Akira
S (1998) Targeted disruption of the MyD88 gene results in loss of IL-1- and IL-18-
mediated function. In: Immunity, vol. 9, pp 143-150.
220
Adamczak SE, de Rivero Vaccari JP, Dale G, Brand Iii FJ, Nonner D, Bullock M, Dahl GP,
Dietrich W, Keane RW (2014) Pyroptotic neuronal cell death mediated by the
AIM2 inflammasome. In: J Cereb Blood Flow Metab.
Afonina IS, Tynan GA, Logue SE, Cullen SP, Bots M, Lüthi AU, Reeves EP, McElvaney
NG, Medema JP, Lavelle EC, Martin SJ (2011) Granzyme B-dependent proteolysis
acts as a switch to enhance the proinflammatory activity of IL-1α. In: Molecular
Cell, vol. 44, pp 265-278.
Agostini L, Martinon F, Burns K, McDermott M, Hawkins P, Tschopp J (2004) NALP3
forms an IL-1beta-processing inflammasome with increased activity in Muckle-
Wells autoinflammatory disorder. In: Immunity, vol. 20, pp 319-325.
Ajami B, Bennett JL, Krieger C, Tetzlaff W, Rossi FMV (2007) Local self-renewal can
sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. In: Nature
Neuroscience, vol. 10, pp 1538-1543.
Akira S, Uematsu S, Takeuchi O (2006) Pathogen recognition and innate immunity. In:
Cell, vol. 124, pp 783-801.
Ali S, Mohs A, Thomas M, Klare J, Ross R, Schmitz ML, Martin MU (2011) The dual
function cytokine IL-33 interacts with the transcription factor NF-κB to dampen
NF-κB-stimulated gene transcription. In: Journal of immunology (Baltimore, Md :
1950), vol. 187, pp 1609-1616.
Allan S, Tyrrell P, Rothwell N (2005) Interleukin-1 and neuronal injury. In: Nature reviews
Immunology, vol. 5, pp 629-640.
Amankulor N, Hambardzumyan D, Pyonteck S, Becher O, Joyce J, Holland E (2009) Sonic
Hedgehog Pathway Activation Is Induced by Acute Brain Injury and Regulated by
Injury-Related Inflammation. In: Journal of Neuroscience, vol. 29, pp 10299-10308.
221
Amini M, Ma C-l, Farazifard R, Zhu G, Zhang Y, Vanderluit J, Zoltewicz JS, Hage F,
Savitt JM, Lagace DC, Slack RS, Beique J-C, Baudry M, Greer PA, Bergeron R,
Park DS (2013) Conditional disruption of calpain in the CNS alters dendrite
morphology, impairs LTP, and promotes neuronal survival following injury. In: J
Neurosci, vol. 33, pp 5773-5784.
Anderson CM, Nedergaard M (2006) Emerging challenges of assigning P2X7 receptor
function and immunoreactivity in neurons. In: Trends in neurosciences, vol. 29, pp
257-262.
Arend W, Palmer G, Gabay C (2008) IL-1, IL-18, and IL-33 families of cytokines. In:
Immunological reviews, vol. 223, pp 20-38.
Arnett HA, Fancy SPJ, Alberta JA, Zhao C, Plant SR, Kaing S, Raine CS, Rowitch DH,
Franklin RJM, Stiles CD (2004) bHLH transcription factor Olig1 is required to
repair demyelinated lesions in the CNS. In: Science (New York, NY), vol. 306, pp
2111-2115.
Auffray C, Fogg D, Garfa M, Elain G, Join-Lambert O, Kayal S, Sarnacki S, Cumano A,
Lauvau G, Geissmann F (2007) Monitoring of Blood Vessels and Tissues by a
Population of Monocytes with Patrolling Behavior. In: Science (New York, NY),
vol. 317, pp 666-670.
Auffray C, Sieweke M, Geissmann F (2009) Blood Monocytes: Development,
Heterogeneity, and Relationship with Dendritic Cells. In: Annual Review of
Immunology, vol. 27, pp 669-692.
Bambakidis NC, Petrullis M, Kui X, Rothstein B, Karampelas I, Kuang Y, Selman WR,
LaManna JC, Miller RH (2012) Improvement of neurological recovery and
222
stimulation of neural progenitor cell proliferation by intrathecal administration of
Sonic hedgehog. In: J Neurosurg, vol. 116, pp 1114-1120.
Bambakidis NC, Wang X, Lukas RJ, Spetzler RF, Sonntag VKH, Preul MC (2010)
Intravenous hedgehog agonist induces proliferation of neural and oligodendrocyte
precursors in rodent spinal cord injury. In: Neurosurgery, vol. 67, pp 1709-1715;
discussion 1715.
Bao F, Dekaban GA, Weaver LC (2005) Anti-CD11d antibody treatment reduces free
radical formation and cell death in the injured spinal cord of rats. In: Journal of
Neurochemistry, vol. 94, pp 1361-1373.
Bao L, Locovei S, Dahl G (2004) Pannexin membrane channels are mechanosensitive
conduits for ATP. In: FEBS Lett, vol. 572, pp 65-68.
Barbe MT, Monyer H, Bruzzone R (2006) Cell-cell communication beyond connexins: the
pannexin channels. In: Physiology (Bethesda), vol. 21, pp 103-114.
Barberà-Cremades M, Baroja-Mazo A, Gomez A, Machado F, Di Virgilio F, Pelegrín P
(2012) P2X7 receptor-stimulation causes fever via PGE2 and IL-1β release. In:
FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for
Experimental Biology.
Basu A, Krady J, O'Malley M, Styren S, DeKosky S, Levison S (2002) The type 1
interleukin-1 receptor is essential for the efficient activation of microglia and the
induction of multiple proinflammatory mediators in response to brain injury. In:
The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience,
vol. 22, pp 6071-6082.
Bauernfeind F, Horvath G, Stutz A, Alnemri E, Macdonald K, Speert D, Fernandes-
Alnemri T, Wu J, Monks B, Fitzgerald K, Hornung V, Latz E (2009) Cutting Edge:
223
NF- B Activating Pattern Recognition and Cytokine Receptors License NLRP3
Inflammasome Activation by Regulating NLRP3 Expression. In: The Journal of
Immunology, vol. 183, pp 787-791.
Beck K, Nguyen H, Galvan M, Salazar D, Woodruff T, Anderson A (2010) Quantitative
analysis of cellular inflammation after traumatic spinal cord injury: evidence for a
multiphasic inflammatory response in the acute to chronic environment. In: Brain,
vol. 133, pp 433-447.
Beggs S, Trang T, Salter M (2012) P2X4R(+) microglia drive neuropathic pain. In: Nature
neuroscience, vol. 15, pp 1068-1073.
Bell MT, Puskas F, Agoston VA, Cleveland JC, Freeman KA, Gamboni F, Herson PS,
Meng X, Smith PD, Weyant MJ, Fullerton DA, Reece TB (2013) Toll-like receptor
4-dependent microglial activation mediates spinal cord ischemia-reperfusion injury.
In: Circulation, vol. 128, pp S152-156.
Bermudez LE, Petrofsky M, Stevens P (1998) Treatment with recombinant granulocyte
colony-stimulating factor (Filgrastin) stimulates neutrophils and tissue macrophages
and induces an effective non-specific response against Mycobacterium avium in
mice. In: Immunology, vol. 94, pp 297-303.
Bianco F, Ceruti S, Colombo A, Fumagalli M, Ferrari D, Pizzirani C, Matteoli M, Di
Virgilio F, Abbracchio M, Verderio C (2006) A role for P2X 7in microglial
proliferation. In: Journal of Neurochemistry, vol. 99, pp 745-758.
Boehme SA, Lio FM, Maciejewski-Lenoir D, Bacon KB, Conlon PJ (2000) The chemokine
fractalkine inhibits Fas-mediated cell death of brain microglia. In: Journal of
immunology (Baltimore, Md : 1950), vol. 165, pp 397-403.
224
Bonora M, Wieckowski MR, Chinopoulos C, Kepp O, Kroemer G, Galluzzi L, Pinton P
(2014) Molecular mechanisms of cell death: central implication of ATP synthase in
mitochondrial permeability transition. In: Oncogene, vol. 0.
Borregaard N (2010) Neutrophils, from marrow to microbes. In: Immunity, vol. 33, pp 657-
670.
Boutin H, LeFeuvre R, Horai R, Asano M, Iwakura Y, Rothwell N (2001) Role of IL-
1alpha and IL-1beta in ischemic brain damage. In: The Journal of neuroscience : the
official journal of the Society for Neuroscience, vol. 21, pp 5528-5534.
Bracchi-Ricard V, Lambertsen KL, Ricard J, Nathanson L, Karmally S, Johnstone J,
Ellman DG, Frydel B, Mctigue DM, Bethea JR (2013) Inhibition of astroglial NF-
kappaB enhances oligodendrogenesis following spinal cord injury. In: J
Neuroinflammation, vol. 10, p 92.
Bradbury EJ, Moon LDF, Popat RJ, King VR, Bennett GS, Patel PN, Fawcett JW,
McMahon SB (2002) Chondroitinase ABC promotes functional recovery after
spinal cord injury. In: Nature, vol. 416, pp 636-640.
Brambilla R, Bracchi-Ricard V, Hu W-H, Frydel B, Bramwell A, Karmally S, Green EJ,
Bethea JR (2005) Inhibition of astroglial nuclear factor kappaB reduces
inflammation and improves functional recovery after spinal cord injury. In: J Exp
Med, vol. 202, pp 145-156.
Brambilla R, Hurtado A, Persaud T, Esham K, Pearse D, Oudega M, Bethea J (2009)
Transgenic inhibition of astroglial NF-κB leads to increased axonal sparing and
sprouting following spinal cord injury. In: Journal of Neurochemistry, vol. 110, pp
765-778.
225
Brône B, Moechars D, Marrannes R, Mercken M, Meert T (2007) P2X currents in
peritoneal macrophages of wild type and P2X4 -/- mice. In: Immunol Lett, vol. 113,
pp 83-89.
Bruce AJ, Boling W, Kindy MS, Peschon J, Kraemer PJ, Carpenter MK, Holtsberg FW,
Mattson MP (1996) Altered neuronal and microglial responses to excitotoxic and
ischemic brain injury in mice lacking TNF receptors. In: Nat Med, vol. 2, pp 788-
794.
Bruey J-M, Bruey-Sedano N, Luciano F, Zhai D, Balpai R, Xu C, Kress C, Bailly-Maitre
B, Li X, Osterman A, Matsuzawa S-i, Terskikh A, Faustin B, Reed J (2007) Bcl-2
and Bcl-XL regulate proinflammatory caspase-1 activation by interaction with
NALP1. In: Cell, vol. 129, pp 45-56.
Bsibsi M, Ravid R, Gveric D, van Noort JM (2002) Broad expression of Toll-like receptors
in the human central nervous system. In: J Neuropathol Exp Neurol, vol. 61, pp
1013-1021.
Burnstock G (2007) Physiology and pathophysiology of purinergic neurotransmission. In:
Physiol Rev, vol. 87, pp 659-797.
Burnstock G, Arnett TR, Orriss IR (2013) Purinergic signalling in the musculoskeletal
system. In: Purinergic Signalling.
Buryskova M, Pospisek M, Grothey A, Simmet T, Burysek L (2004) Intracellular
interleukin-1alpha functionally interacts with histone acetyltransferase complexes.
In: The Journal of biological chemistry, vol. 279, pp 4017-4026.
Bush TG, Puvanachandra N, Horner CH, Polito A, Ostenfeld T, Svendsen CN, Mucke L,
Johnson MH, Sofroniew MV (1999) Leukocyte infiltration, neuronal degeneration,
226
and neurite outgrowth after ablation of scar-forming, reactive astrocytes in adult
transgenic mice. In: Neuron, vol. 23, pp 297-308.
Cardona A, Pioro E, Sasse M, Kostenko V, Cardona S, Dijkstra I, Huang D, Kidd G,
Dombrowski S, Dutta R, Lee J-C, Cook D, Jung S, Lira S, Littman D, Ransohoff R
(2006) Control of microglial neurotoxicity by the fractalkine receptor. In: Nature
neuroscience, vol. 9, pp 917-924.
Carriere V, Roussel L, Ortega N, Lacorre D-A, Americh L, Aguilar L, Bouche G, Girard J-
P (2007) IL-33, the IL-1-like cytokine ligand for ST2 receptor, is a chromatin-
associated nuclear factor in vivo. In: Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America, vol. 104, pp 282-287.
Carruth LM, Demczuk S, Mizel SB (1991) Involvement of a calpain-like protease in the
processing of the murine interleukin 1 alpha precursor. In: J Biol Chem, vol. 266,
pp 12162-12167.
Casanova J-L, Abel L, Quintana-Murci L (2011) Human TLRs and IL-1Rs in Host
Defense: Natural Insights from Evolutionary, Epidemiological, and Clinical
Genetics. In: Annual Review of Immunology, vol. 29, pp 447-491.
Casas-Pruneda G, Reyes JP, Pérez-Flores G, Pérez-Cornejo P, Arreola J (2009) Functional
interactions between P2X4 and P2X7 receptors from mouse salivary epithelia. In:
The Journal of physiology, vol. 587, pp 2887-2901.
Casha S, Yu WR, Fehlings MG (2001) Oligodendroglial apoptosis occurs along
degenerating axons and is associated with FAS and p75 expression following spinal
cord injury in the rat. In: Neuroscience, vol. 103, pp 203-218.
227
Cayrol C, Girard J-P (2009) The IL-1-like cytokine IL-33 is inactivated after maturation by
caspase-1. In: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America, vol. 106, pp 9021-9026.
Charo IF, Ransohoff RM (2006) The many roles of chemokines and chemokine receptors
in inflammation. In: The New England journal of medicine, vol. 354, pp 610-621.
Chen C-J (2006) MyD88-dependent IL-1 receptor signaling is essential for gouty
inflammation stimulated by monosodium urate crystals. In: The Journal of clinical
investigation, vol. 116, pp 2262-2271.
Chen C-J, Kono H, Golenbock D, Reed G, Akira S, Rock KL (2007) Identification of a key
pathway required for the sterile inflammatory response triggered by dying cells. In:
Nature medicine, vol. 13, pp 851-856.
Chen K-B, Uchida K, Nakajima H, Yayama T, Hirai T, Watanabe S, Guerrero AR,
Kobayashi S, Ma W-Y, Liu S-Y, Baba H (2011) Tumor necrosis factor-α antagonist
reduces apoptosis of neurons and oligodendroglia in rat spinal cord injury. In:
Spine, vol. 36, pp 1350-1358.
Chen L, Brosnan CF (2006) Exacerbation of experimental autoimmune encephalomyelitis
in P2X7R-/- mice: evidence for loss of apoptotic activity in lymphocytes. In:
Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950), vol. 176, pp 3115-3126.
Chen W-F, Jean Y-H, Sung C-S, Wu G-J, Huang S-Y, Ho J-T, Su T-M, Wen Z-H (2008)
Intrathecally injected granulocyte colony-stimulating factor produced
neuroprotective effects in spinal cord ischemia via the mitogen-activated protein
kinase and Akt pathways. In: Neuroscience, vol. 153, pp 31-43.
Chen Y, Swanson RA (2003) Astrocytes and brain injury. In: J Cereb Blood Flow Metab,
vol. 23, pp 137-149.
228
Chi L-Y, Yu J, Zhu H, Li X-G, Zhu S-G, Kindy MS (2008) The dual role of tumor necrosis
factor-alpha in the pathophysiology of spinal cord injury. In: Neuroscience letters,
vol. 438, pp 174-179.
Christophi GP, Gruber RC, Panos M, Christophi RL, Jubelt B, Massa PT (2012)
Interleukin-33 upregulation in peripheral leukocytes and CNS of multiple sclerosis
patients. In: Clin Immunol, vol. 142, pp 308-319.
Cohen I, Rider P, Carmi Y, Braiman A, Dotan S, White M, Voronov E, Martin M,
Dinarello C, Apte R (2010) Differential release of chromatin-bound IL-1alpha
discriminates between necrotic and apoptotic cell death by the ability to induce
sterile inflammation. In: Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America, vol. 107, pp 2574-2579.
Corbaz A, ten Hove T, Herren S, Graber P, Schwartsburd B, Belzer I, Harrison J, Plitz T,
Kosco-Vilbois MH, Kim S-H, Dinarello CA, Novick D, van Deventer S, Chvatchko
Y (2002) IL-18-binding protein expression by endothelial cells and macrophages is
up-regulated during active Crohn's disease. In: Journal of immunology (Baltimore,
Md : 1950), vol. 168, pp 3608-3616.
Coull JAM, Beggs S, Boudreau D, Boivin D, Tsuda M, Inoue K, Gravel C, Salter MW, De
Koninck Y (2005) BDNF from microglia causes the shift in neuronal anion gradient
underlying neuropathic pain. In: Nature, vol. 438, pp 1017-1021.
Craigie E, Birch RE, Unwin RJ, Wildman SS (2013) The relationship between P2X4 and
P2X7: a physiologically important interaction? In: Front Physiol, vol. 4, p 216.
Crawford AH, Stockley JH, Tripathi RB, Richardson WD, Franklin RJM (2014)
Oligodendrocyte progenitors: Adult stem cells of the central nervous system? In:
Exp Neurol.
229
Cregg JM, Depaul MA, Filous AR, Lang BT, Tran A, Silver J (2014) Functional
regeneration beyond the glial scar. In: Experimental neurology, vol. 253C, pp 197-
207.
Crespo D, Asher RA, Lin R, Rhodes KE, Fawcett JW (2007) How does chondroitinase
promote functional recovery in the damaged CNS? In: Experimental neurology, vol.
206, pp 159-171.
Davalos D, Grutzendler J, Yang G, Kim J, Zuo Y, Jung S, Littman D, Dustin M, Gan W-B
(2005) ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. In:
Nature neuroscience, vol. 8, pp 752-758.
David S, Lacroix S (2003) Molecular approaches to spinal cord repair. In: Annual Review
of Neuroscience, vol. 26, pp 411-440.
de Castro F, Bribián A (2005) The molecular orchestra of the migration of oligodendrocyte
precursors during development. In: Brain Res Brain Res Rev, vol. 49, pp 227-241.
de Rivero Vaccari JP, Lotocki G, Alonso OF, Bramlett HM, Dietrich WD, Keane RW
(2009) Therapeutic neutralization of the NLRP1 inflammasome reduces the innate
immune response and improves histopathology after traumatic brain injury. In: J
Cereb Blood Flow Metab, vol. 29, pp 1251-1261.
de Rivero Vaccari JP, Lotocki G, Marcillo AE, Dietrich WD, Keane RW (2008) A
molecular platform in neurons regulates inflammation after spinal cord injury. In:
The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience,
vol. 28, pp 3404-3414.
Del Puerto A, Wandosell F, Garrido JJ (2013) Neuronal and glial purinergic receptors
functions in neuron development and brain disease. In: Front Cell Neurosci, vol. 7,
p 197.
230
Dénes A, Ferenczi S, Halász J, Környei Z, Kovács KJ (2008) Role of CX3CR1 (fractalkine
receptor) in brain damage and inflammation induced by focal cerebral ischemia in
mouse. In: J Cereb Blood Flow Metab, vol. 28, pp 1707-1721.
Di Virgilio F, Ceruti S, Bramanti P, Abbracchio M (2009) Purinergic signalling in
inflammation of the central nervous system. In: Trends in neurosciences, vol. 32, pp
79-87.
Diaz-Hernandez JI, Gomez-Villafuertes R, León-Otegui M, Hontecillas-Prieto L, Del
Puerto A, Trejo JL, Lucas JJ, Garrido JJ, Gualix J, Miras-Portugal MT, Diaz-
Hernandez M (2012) In vivo P2X7 inhibition reduces amyloid plaques in
Alzheimer's disease through GSK3β and secretases. In: Neurobiol Aging, vol. 33,
pp 1816-1828.
Dinarello C (2007) Interleukin-18 and the pathogenesis of inflammatory diseases. In:
Seminars in nephrology, vol. 27, pp 98-114.
Dinarello CA (1991) Interleukin-1 and interleukin-1 antagonism. In: Blood, vol. 77, pp
1627-1652.
Dinarello CA (1994) The interleukin-1 family: 10 years of discovery. In: FASEB journal :
official publication of the Federation of American Societies for Experimental
Biology, vol. 8, pp 1314-1325.
Dinarello CA (1999) IL-18: A TH1-inducing, proinflammatory cytokine and new member
of the IL-1 family. In: The Journal of allergy and clinical immunology, vol. 103, pp
11-24.
Dinarello CA (2009) Immunological and inflammatory functions of the interleukin-1
family. In: Annual Review of Immunology, vol. 27, pp 519-550.
231
Dinarello CA, Simon A, Van Der Meer JWM (2012) Treating inflammation by blocking
interleukin-1 in a broad spectrum of diseases. In: Nat Rev Drug Discov, vol. 11, pp
633-652.
Dittmer S, Kovacs Z, Yuan SH, Siszler G, Kögl M, Summer H, Geerts A, Golz S, Shioda
T, Methner A (2011) TOX3 is a neuronal survival factor that induces transcription
depending on the presence of CITED1 or phosphorylated CREB in the
transcriptionally active complex. In: Journal of Cell Science, vol. 124, pp 252-260.
Domeniconi M, Cao Z, Spencer T, Sivasankaran R, Wang K, Nikulina E, Kimura N, Cai H,
Deng K, Gao Y, He Z, Filbin M (2002) Myelin-associated glycoprotein interacts
with the Nogo66 receptor to inhibit neurite outgrowth. In: Neuron, vol. 35, pp 283-
290.
Donnelly D, Longbrake E, Shawler T, Kigerl K, Lai W, Tovar C, Ransohoff R, Popovich P
(2011) Deficient CX3CR1 signaling promotes recovery after mouse spinal cord
injury by limiting the recruitment and activation of Ly6Clo/iNOS+ macrophages.
In: The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for
Neuroscience, vol. 31, pp 9910-9922.
Dostert C, Ludigs K, Guarda G (2013) Innate and adaptive effects of inflammasomes on T
cell responses. In: Curr Opin Immunol.
Dostert C, Pétrilli V, Van Bruggen R, Steele C, Mossman BT, Tschopp J (2008) Innate
immune activation through Nalp3 inflammasome sensing of asbestos and silica. In:
Science (New York, NY), vol. 320, pp 674-677.
Downes N, Mullins P (2013) The Development of Myelin in the Brain of the Juvenile Rat.
In: Toxicol Pathol.
232
Dreyfus CF, Dai X, Lercher LD, Racey BR, Friedman WJ, Black IB (1999) Expression of
neurotrophins in the adult spinal cord in vivo. In: J Neurosci Res, vol. 56, pp 1-7.
Eash KJ, Means JM, White DW, Link DC (2009) CXCR4 is a key regulator of neutrophil
release from the bone marrow under basal and stress granulopoiesis conditions. In:
Blood, vol. 113, pp 4711-4719.
Eddleston M, Mucke L (1993) Molecular profile of reactive astrocytes--implications for
their role in neurologic disease. In: Neuroscience, vol. 54, pp 15-36.
Eigenbrod T, Park J-H, Harder J, Iwakura Y, Núñez G (2008) Cutting edge: critical role for
mesothelial cells in necrosis-induced inflammation through the recognition of IL-1
alpha released from dying cells. In: The Journal of Immunology, vol. 181, pp 8194-
8198.
Elmore MRP, Najafi AR, Koike MA, Dagher NN, Spangenberg EE, Rice RA, Kitazawa M,
Matusow B, Nguyen H, West BL, Green KN (2014) Colony-stimulating factor 1
receptor signaling is necessary for microglia viability, unmasking a microglia
progenitor cell in the adult brain. In: Neuron, vol. 82, pp 380-397.
Eng LF, Ghirnikar RS, Lee YL (2000) Glial fibrillary acidic protein: GFAP-thirty-one
years (1969-2000). In: Neurochem Res, vol. 25, pp 1439-1451.
Falsig J, Pörzgen P, Lund S, Schrattenholz A, Leist M (2006) The inflammatory
transcriptome of reactive murine astrocytes and implications for their innate
immune function. In: J Neurochem, vol. 96, pp 893-907.
Fan C, Zhao X, Guo X, Cao X, Cai J (2014) P2X4 promotes interleukin‑1β production in
osteoarthritis via NLRP1. In: Mol Med Rep, vol. 9, pp 340-344.
233
Färber K, Kettenmann H (2006) Purinergic signaling and microglia. In: Pflügers Archiv -
European Journal of Physiology, vol. 452, pp 615-621.
Faulkner JR, Herrmann JE, Woo MJ, Tansey KE, Doan NB, Sofroniew MV (2004)
Reactive astrocytes protect tissue and preserve function after spinal cord injury. In:
J Neurosci, vol. 24, pp 2143-2155.
Faustin B, Chen Y, Zhai D, Le Negrate G, Lartigue L, Satterthwait A, Reed J (2009)
Mechanism of Bcl-2 and Bcl-X(L) inhibition of NLRP1 inflammasome: loop
domain-dependent suppression of ATP binding and oligomerization. In:
Proceedings of the National Academy of Sciences, vol. 106, pp 3935-3940.
Faustin B, Lartigue L, Bruey J-M, Luciano F, Sergienko E, Bailly-Maitre B, Volkmann N,
Hanein D, Rouiller I, Reed JC (2007) Reconstituted NALP1 inflammasome reveals
two-step mechanism of caspase-1 activation. In: Molecular Cell, vol. 25, pp 713-
724.
Fernandes-Alnemri T, Yu J-W, Juliana C, Solorzano L, Kang S, Wu J, Datta P, McCormick
M, Huang L, McDermott E, Eisenlohr L, Landel CP, Alnemri ES (2010) The AIM2
inflammasome is critical for innate immunity to Francisella tularensis. In: Nature
Immunology, vol. 11, pp 385-393.
Ferrari D, Chiozzi P, Falzoni S, Dal Susino M, Melchiorri L, Baricordi OR, Di Virgilio F
(1997) Extracellular ATP triggers IL-1 beta release by activating the purinergic P2Z
receptor of human macrophages. In: Journal of immunology (Baltimore, Md :
1950), vol. 159, pp 1451-1458.
Ferrari D, Pizzirani C, Adinolfi E, Lemoli R, Curti A, Idzko M, Panther E, Di Virgilio F
(2006) The P2X7 receptor: a key player in IL-1 processing and release. In: Journal
of immunology (Baltimore, Md : 1950), vol. 176, pp 3877-3883.
234
Fields R, Burnstock G (2006) Purinergic signalling in neuron–glia interactions. In: Nature
reviews Neuroscience, vol. 7, pp 423-436.
Figley SA, Khosravi R, Legasto JM, Tseng Y-F, Fehlings M (2013) Characterization of
Vascular Disruption and Blood-Spinal Cord Barrier Permeability Following
Traumatic Spinal Cord Injury. In: Journal of Neurotrauma, p 131117084218009.
Fleming J, Norenberg M, Ramsay D, Dekaban G, Marcillo A, Saenz A, Pasquale-Styles M,
Dietrich W, Weaver L (2006) The cellular inflammatory response in human spinal
cords after injury. In: Brain, vol. 129, pp 3249-3269.
Franchi L, Eigenbrod T, Muñoz-Planillo R, Nuñez G (2009) The inflammasome: a caspase-
1-activation platform that regulates immune responses and disease pathogenesis. In:
Nat Immunol, vol. 10, pp 241-247.
Freund P, Schmidlin E, Wannier T, Bloch J, Mir A, Schwab ME, Rouiller EM (2009) Anti-
Nogo-A antibody treatment promotes recovery of manual dexterity after unilateral
cervical lesion in adult primates--re-examination and extension of behavioral data.
In: The European journal of neuroscience, vol. 29, pp 983-996.
Gaudet A, Popovich P, Ramer M (2011) Wallerian degeneration: Gaining perspective on
inflammatory events after peripheral nerve injury. In: Journal of neuroinflammation,
vol. 8, p 110.
Geissmann F, Jung S, Littman D (2003) Blood monocytes consist of two principal subsets
with distinct migratory properties. In: Immunity, vol. 19, pp 71-82.
Geissmann F, Manz M, Jung S, Sieweke M, Merad M, Ley K (2010) Development of
Monocytes, Macrophages, and Dendritic Cells. In: Science (New York, NY), vol.
327, pp 656-661.
235
Genovese T, Mazzon E, Crisafulli C, Di Paola R, Muià C, Esposito E, Bramanti P,
Cuzzocrea S (2008) TNF-alpha blockage in a mouse model of SCI: evidence for
improved outcome. In: Shock, vol. 29, pp 32-41.
Gerondakis S, Grumont RJ, Banerjee A (2007) Regulating B-cell activation and survival in
response to TLR signals. In: Immunol Cell Biol, vol. 85, pp 471-475.
Ghayur T, Banerjee S, Hugunin M, Butler D, Herzog L, Carter A, Quintal L, Sekut L,
Talanian R, Paskind M, Wong W, Kamen R, Tracey D, Allen H (1997) Caspase-1
processes IFN-gamma-inducing factor and regulates LPS-induced IFN-gamma
production. In: Nature, vol. 386, pp 619-623.
Ginhoux F, Greter M, Leboeuf M, Nandi S, See P, Gokhan S, Mehler MF, Conway SJ, Ng
LG, Stanley ER, Samokhvalov IM, Merad M (2010) Fate mapping analysis reveals
that adult microglia derive from primitive macrophages. In: Science (New York,
NY), vol. 330, pp 841-845.
Gombault A, Baron L, Couillin I (2012) ATP release and purinergic signaling in NLRP3
inflammasome activation. In: Front Immunol, vol. 3, p 414.
Gordon S (2002) Pattern recognition receptors: doubling up for the innate immune
response. In: Cell, vol. 111, pp 927-930.
Gordon S, Taylor P (2005) Monocyte and macrophage heterogeneity. In: Nature reviews
Immunology, vol. 5, pp 953-964.
Gorio A, Gokmen N, Erbayraktar S, Yilmaz O, Madaschi L, Cichetti C, Di Giulio AM,
Vardar E, Cerami A, Brines M (2002) Recombinant human erythropoietin
counteracts secondary injury and markedly enhances neurological recovery from
experimental spinal cord trauma. In: Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America, vol. 99, pp 9450-9455.
236
Graeber M, Li W, Rodriguez M (2011) Role of microglia in CNS inflammation. In: FEBS
letters, vol. 585, pp 3798-3805.
Grandpre T, Strittmatter S (2001) Nogo: A Molecular Determinant of Axonal Growth and
Regeneration. In: The Neuroscientist, vol. 7, pp 377-386.
Graves BJ, Hatada MH, Hendrickson WA, Miller JK, Madison VS, Satow Y (1990)
Structure of interleukin 1 alpha at 2.7-A resolution. In: Biochemistry, vol. 29, pp
2679-2684.
Greenhalgh A, Galea J, Dénes A, Tyrrell P, Rothwell N (2010) Rapid brain penetration of
interleukin-1 receptor antagonist in rat cerebral ischaemia: pharmacokinetics,
distribution, protection. In: British Journal of Pharmacology, vol. 160, pp 153-159.
Gris D (2004) Transient Blockade of the CD11d/CD18 Integrin Reduces Secondary
Damage after Spinal Cord Injury, Improving Sensory, Autonomic, and Motor
Function. In: Journal of Neuroscience, vol. 24, pp 4043-4051.
Gris D, Ye Z, Iocca H, Wen H, Craven R, Gris P, Huang M, Schneider M, Miller S, Ting J
(2010) NLRP3 Plays a Critical Role in the Development of Experimental
Autoimmune Encephalomyelitis by Mediating Th1 and Th17 Responses. In: The
Journal of Immunology, vol. 185, pp 974-981.
Gross O, Thomas C, Guarda G, Tschopp J (2011) The inflammasome: an integrated view.
In: Immunological reviews, vol. 243, pp 136-151.
Gu BJ, Sluyter R, Skarratt KK, Shemon AN, Dao-Ung L-P, Fuller SJ, Barden JA, Clarke
AL, Petrou S, Wiley JS (2004) An Arg307 to Gln polymorphism within the ATP-
binding site causes loss of function of the human P2X7 receptor. In: The Journal of
biological chemistry, vol. 279, pp 31287-31295.
237
Gu Y, Kuida K, Tsutsui H, Ku G, Hsiao K, Fleming MA, Hayashi N, Higashino K,
Okamura H, Nakanishi K, Kurimoto M, Tanimoto T, Flavell RA, Sato V, Harding
MW, Livingston DJ, Su MS (1997) Activation of interferon-gamma inducing factor
mediated by interleukin-1beta converting enzyme. In: Science (New York, NY),
vol. 275, pp 206-209.
Guarda G, Zenger M, Yazdi A, Schroder K, Ferrero I, Menu P, Tardivel A, Mattmann C,
Tschopp J (2011) Differential Expression of NLRP3 among Hematopoietic Cells.
In: The Journal of Immunology, vol. 186, pp 2529-2534.
Gutcher I, Urich E, Wolter K, Prinz M, Becher B (2006) Interleukin 18-independent
engagement of interleukin 18 receptor-alpha is required for autoimmune
inflammation. In: Nature Immunology, vol. 7, pp 946-953.
Hamada Y, Ikata T, Katoh S, Nakauchi K, Niwa M, Kawai Y, Fukuzawa K (1996)
Involvement of an intercellular adhesion molecule 1-dependent pathway in the
pathogenesis of secondary changes after spinal cord injury in rats. In: Journal of
Neurochemistry, vol. 66, pp 1525-1531.
Han P, Mi W-L, Wang Y-Q (2011) Research progress on interleukin-33 and its roles in the
central nervous system. In: Neurosci Bull, vol. 27, pp 351-357.
Hayakawa H, Hayakawa M, Kume A, Tominaga S-i (2007) Soluble ST2 blocks
interleukin-33 signaling in allergic airway inflammation. In: J Biol Chem, vol. 282,
pp 26369-26380.
Hayakawa M, Hayakawa H, Matsuyama Y, Tamemoto H, Okazaki H, Tominaga S-i (2009)
Mature interleukin-33 is produced by calpain-mediated cleavage in vivo. In:
Biochemical and Biophysical Research Communications, vol. 387, pp 218-222.
238
Henshall DC, Diaz-Hernandez M, Miras-Portugal MT, Engel T (2013) P2X receptors as
targets for the treatment of status epilepticus. In: Front Cell Neurosci, vol. 7, p 237.
Herx L, Rivest S, Yong V (2000) Central nervous system-initiated inflammation and
neurotrophism in trauma: IL-1 beta is required for the production of ciliary
neurotrophic factor. In: Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950), vol. 165, pp
2232-2239.
Hirasawa T, Ohsawa K, Imai Y, Ondo Y, Akazawa C, Uchino S, Kohsaka S (2005)
Visualization of microglia in living tissues using Iba1-EGFP transgenic mice. In: J
Neurosci Res, vol. 81, pp 357-362.
Hirsiger S, Simmen H-P, Werner C, Wanner G, Rittirsch D (2012) Danger signals
activating the immune response after trauma. In: Mediators of inflammation, vol.
2012, p 315941.
Hoffman HM, Mueller JL, Broide DH, Wanderer AA, Kolodner RD (2001) Mutation of a
new gene encoding a putative pyrin-like protein causes familial cold
autoinflammatory syndrome and Muckle-Wells syndrome. In: Nat Genet, vol. 29,
pp 301-305.
Hornung V, Latz E (2010) Intracellular DNA recognition. In: Nature reviews Immunology,
vol. 10, pp 123-130.
Howell O, Rundle J, Garg A, Komada M, Brophy P, Reynolds R (2010) Activated
microglia mediate axoglial disruption that contributes to axonal injury in multiple
sclerosis. In: Journal of neuropathology and experimental neurology, vol. 69, pp
1017-1033.
Hsu L-C, Ali S, McGillivray S, Tseng P-H, Mariathasan S, Humke E, Eckmann L, Powell
J, Nizet V, Dixit V, Karin M (2008) A NOD2-NALP1 complex mediates caspase-1-
239
dependent IL-1beta secretion in response to Bacillus anthracis infection and
muramyl dipeptide. In: Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America, vol. 105, pp 7803-7808.
Hsu PD, Lander ES, Zhang F (2014) Development and Applications of CRISPR-Cas9 for
Genome Engineering. In: Cell, vol. 157, pp 1262-1278.
Huang H-Y, Lin S-Z, Kuo J-S, Chen W-F, Wang M-J (2007) G-CSF protects dopaminergic
neurons from 6-OHDA-induced toxicity via the ERK pathway. In: Neurobiol
Aging, vol. 28, pp 1258-1269.
Hughes EG, Kang SH, Fukaya M, Bergles DE (2013) Oligodendrocyte progenitors balance
growth with self-repulsion to achieve homeostasis in the adult brain. In: Nature
Neuroscience, vol. 16, pp 668-676.
Hung S-C, Choi CH, Said-Sadier N, Johnson L, Atanasova KR, Sellami H, Yilmaz Ö,
Ojcius DM (2013) P2X4 assembles with P2X7 and pannexin-1 in gingival epithelial
cells and modulates ATP-induced reactive oxygen species production and
inflammasome activation. In: PLoS ONE, vol. 8, p e70210.
Iglesias R, Dahl G, Qiu F, Spray DC, Scemes E (2009) Pannexin 1: the molecular substrate
of astrocyte "hemichannels". In: The Journal of neuroscience : the official journal of
the Society for Neuroscience, vol. 29, pp 7092-7097.
Iglesias RM, Spray DC (2012) Pannexin1-mediated ATP release provides signal
transmission between Neuro2A cells. In: Neurochem Res, vol. 37, pp 1355-1363.
Ignácio AR, Müller YMR, Carvalho MSL, Nazari EM (2005) Distribution of microglial
cells in the cerebral hemispheres of embryonic and neonatal chicks. In: Braz J Med
Biol Res, vol. 38, pp 1615-1621.
240
Jander S, Stoll G (1998) Differential induction of interleukin-12, interleukin-18, and
interleukin-1beta converting enzyme mRNA in experimental autoimmune
encephalomyelitis of the Lewis rat. In: J Neuroimmunol, vol. 91, pp 93-99.
Jha S, Srivastava SY, Brickey WJ, Iocca H, Toews A, Morrison JP, Chen VS, Gris D,
Matsushima GK, Ting JP-Y (2010) The inflammasome sensor, NLRP3, regulates
CNS inflammation and demyelination via caspase-1 and interleukin-18. In: The
Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience, vol.
30, pp 15811-15820.
Jia Y, Wu D, Zhang R, Shuang W, Sun J, Hao H, An Q, Liu Q (2014) Bone marrow-
derived mesenchymal stem cells expressing the Shh transgene promotes functional
recovery after spinal cord injury in rats. In: Neuroscience letters, vol. 573C, pp 46-
51.
John GR, Lee SC, Song X, Rivieccio M, Brosnan CF (2005) IL-1-regulated responses in
astrocytes: relevance to injury and recovery. In: Glia, vol. 49, pp 161-176.
Juknis N, Cooper JM, Volshteyn O (2012) The changing landscape of spinal cord injury.
In: Spinal Cord Injury, vol. 109, pp 149-166.
Kadota R, Koda M, Kawabe J, Hashimoto M, Nishio Y, Mannoji C, Miyashita T, Furuya T,
Okawa A, Takahashi K, Yamazaki M (2012) Granulocyte colony-stimulating factor
(G-CSF) protects oligpdendrocyte and promotes hindlimb functional recovery after
spinal cord injury in rats. In: PLoS ONE, vol. 7, p e50391.
Kahlenberg J, Dubyak G (2004) Mechanisms of caspase-1 activation by P2X7 receptor-
mediated K+ release. In: American journal of physiology Cell physiology, vol. 286,
pp C1100-1108.
241
Kaisho T, Akira S (2006) Toll-like receptor function and signaling. In: J Allergy Clin
Immunol, vol. 117, pp 979-987; quiz 988.
Kanneganti T-D, Lamkanfi M, Kim Y-G, Chen G, Park J-H, Franchi L, Vandenabeele P,
Núñez G (2007) Pannexin-1-mediated recognition of bacterial molecules activates
the cryopyrin inflammasome independent of Toll-like receptor signaling. In:
Immunity, vol. 26, pp 433-443.
Kärkkäinen I, Rybnikova E, Pelto-Huikko M, Huovila AP (2000) Metalloprotease-
disintegrin (ADAM) genes are widely and differentially expressed in the adult CNS.
In: Mol Cell Neurosci, vol. 15, pp 547-560.
Kasperczyk H, Baumann B, Debatin K-M, Fulda S (2009) Characterization of sonic
hedgehog as a novel NF-kappaB target gene that promotes NF-kappaB-mediated
apoptosis resistance and tumor growth in vivo. In: FASEB journal : official
publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology, vol.
23, pp 21-33.
Kerschensteiner M, Schwab M, Lichtman J, Misgeld T (2005) In vivo imaging of axonal
degeneration and regeneration in the injured spinal cord. In: Nature medicine, vol.
11, pp 572-577.
Kielian T, Barry B, Hickey W (2001) CXC chemokine receptor-2 ligands are required for
neutrophil-mediated host defense in experimental brain abscesses. In: Journal of
immunology (Baltimore, Md : 1950), vol. 166, pp 4634-4643.
Kierdorf K, Erny D, Goldmann T, Sander V, Schulz C, Perdiguero EG, Wieghofer P,
Heinrich A, Riemke P, Hölscher C, Müller DN, Luckow B, Brocker T, Debowski
K, Fritz G, Opdenakker G, Diefenbach A, Biber K, Heikenwalder M, Geissmann F,
Rosenbauer F, Prinz M (2013) Microglia emerge from erythromyeloid precursors
242
via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. In: Nature Neuroscience, vol. 16, pp 273-
280.
Kigerl K, Lai W, Rivest S, Hart R, Satoskar A, Popovich P (2007) Toll-like receptor
(TLR)-2 and TLR-4 regulate inflammation, gliosis, and myelin sparing after spinal
cord injury. In: Journal of Neurochemistry, vol. 102, pp 37-50.
Kigerl KA, Gensel JC, Ankeny DP, Alexander JK, Donnelly DJ, Popovich PG (2009)
Identification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing
either neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord. In: The
Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience, vol.
29, pp 13435-13444.
Kim J-E, Kim D-S, Jin Ryu H, Il Kim W, Kim M-J, Won Kim D, Young Choi S, Kang T-C
(2013) The effect of P2X7 receptor activation on nuclear factor-κB phosphorylation
induced by status epilepticus in the rat hippocampus. In: Hippocampus, vol. 23, pp
500-514.
Kim SH, Eisenstein M, Reznikov L, Fantuzzi G, Novick D, Rubinstein M, Dinarello CA
(2000) Structural requirements of six naturally occurring isoforms of the IL-18
binding protein to inhibit IL-18. In: Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America, vol. 97, pp 1190-1195.
Kobayashi Y, Yamamoto K, Saido T, Kawasaki H, Oppenheim JJ, Matsushima K (1990)
Identification of calcium-activated neutral protease as a processing enzyme of
human interleukin 1 alpha. In: Proceedings of the National Academy of Sciences of
the United States of America, vol. 87, pp 5548-5552.
Köles L, Leichsenring A, Rubini P, Illes P (2011) P2 receptor signaling in neurons and glial
cells of the central nervous system. In: Adv Pharmacol, vol. 61, pp 441-493.
243
Kono H, Karmarkar D, Iwakura Y, Rock K (2010) Identification of the Cellular Sensor
That Stimulates the Inflammatory Response to Sterile Cell Death. In: The Journal of
Immunology, vol. 184, pp 4470-4478.
Kreutzberg GW (1996) Microglia: a sensor for pathological events in the CNS. In: Trends
Neurosci, vol. 19, pp 312-318.
Kummer J, Broekhuizen R, Everett H, Agostini L, Kuijk L, Martinon F, Van Bruggen R,
Tschopp J (2007) Inflammasome Components NALP 1 and 3 Show Distinct but
Separate Expression Profiles in Human Tissues Suggesting a Site-specific Role in
the Inflammatory Response. In: Journal of Histochemistry and Cytochemistry, vol.
55, pp 443-452.
Kwon B, Okon E, Hillyer J, Mann C, Baptiste D, Weaver L, Fehlings M, Tetzlaff W (2011)
A systematic review of non-invasive pharmacologic neuroprotective treatments for
acute spinal cord injury. In: Journal of neurotrauma, vol. 28, pp 1545-1588.
Laflamme N, Soucy G, Rivest S (2001) Circulating cell wall components derived from
gram-negative, not gram-positive, bacteria cause a profound induction of the gene-
encoding Toll-like receptor 2 in the CNS. In: Journal of Neurochemistry, vol. 79, pp
648-657.
Lambertsen KL, Clausen BH, Babcock AA, Gregersen R, Fenger C, Nielsen HH, Haugaard
LS, Wirenfeldt M, Nielsen M, Dagnaes-Hansen F, Bluethmann H, Faergeman NJ,
Meldgaard M, Deierborg T, Finsen B (2009) Microglia protect neurons against
ischemia by synthesis of tumor necrosis factor. In: J Neurosci, vol. 29, pp 1319-
1330.
Lamkanfi M, Dixit V (2009) Inflammasomes: guardians of cytosolic sanctity. In:
Immunological reviews, vol. 227, pp 95-105.
244
Lamkanfi M, Dixit VM (2012) Inflammasomes and their roles in health and disease. In:
Annu Rev Cell Dev Biol, vol. 28, pp 137-161.
Lapidot T, Kollet O (2002) The essential roles of the chemokine SDF-1 and its receptor
CXCR4 in human stem cell homing and repopulation of transplanted immune-
deficient NOD/SCID and NOD/SCID/B2m(null) mice. In: Leukemia, vol. 16, pp
1992-2003.
Larsen PH, Holm TH, Owens T (2007) Toll-like receptors in brain development and
homeostasis. In: Sci STKE, vol. 2007, p pe47.
Latz E (2010) The inflammasomes: mechanisms of activation and function. In: Current
Opinion in Immunology, vol. 22, pp 28-33.
Lee CYD, Landreth GE (2010) The role of microglia in amyloid clearance from the AD
brain. In: J Neural Transm, vol. 117, pp 949-960.
Lee H, Lee S, Cho I-H, Lee SJ (2013) Toll-like receptors: sensor molecules for detecting
damage to the nervous system. In: Curr Protein Pept Sci, vol. 14, pp 33-42.
Lee J-M, Yan P, Xiao Q, Chen S, Lee K-Y, Hsu CY, Xu J (2008) Methylprednisolone
protects oligodendrocytes but not neurons after spinal cord injury. In: The Journal
of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience, vol. 28, pp
3141-3149.
Lee JK, Zheng B (2012) Role of myelin-associated inhibitors in axonal repair after spinal
cord injury. In: Experimental neurology, vol. 235, pp 33-42.
Lee SM, Rosen S, Weinstein P, Van Rooijen N, Noble-Haeusslein LJ (2011) Prevention of
both neutrophil and monocyte recruitment promotes recovery after spinal cord
injury. In: Journal of Neurotrauma, vol. 28, pp 1893-1907.
245
Lehnardt S (2010) Innate immunity and neuroinflammation in the CNS: the role of
microglia in Toll-like receptor-mediated neuronal injury. In: Glia, vol. 58, pp 253-
263.
Lehnardt S, Henneke P, Lien E, Kasper DL, Volpe JJ, Bechmann I, Nitsch R, Weber JR,
Golenbock DT, Vartanian T (2006) A mechanism for neurodegeneration induced by
group B streptococci through activation of the TLR2/MyD88 pathway in microglia.
In: Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950), vol. 177, pp 583-592.
Lehnardt S, Lachance C, Patrizi S, Lefebvre S, Follett PL, Jensen FE, Rosenberg PA,
Volpe JJ, Vartanian T (2002) The toll-like receptor TLR4 is necessary for
lipopolysaccharide-induced oligodendrocyte injury in the CNS. In: The Journal of
neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience, vol. 22, pp 2478-
2486.
Lehnardt S, Massillon L, Follett P, Jensen FE, Ratan R, Rosenberg PA, Volpe JJ, Vartanian
T (2003) Activation of innate immunity in the CNS triggers neurodegeneration
through a Toll-like receptor 4-dependent pathway. In: Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America, vol. 100, pp 8514-8519.
Li GL, Farooque M, Holtz A, Olsson Y (1999) Apoptosis of oligodendrocytes occurs for
long distances away from the primary injury after compression trauma to rat spinal
cord. In: Acta neuropathologica, vol. 98, pp 473-480.
Li W-W, Setzu A, Zhao C, Franklin RJM (2005) Minocycline-mediated inhibition of
microglia activation impairs oligodendrocyte progenitor cell responses and
remyelination in a non-immune model of demyelination. In: Journal of
Neuroimmunology, vol. 158, pp 58-66.
246
Li X-Q, Wang J, Fang B, Tan W-F, Ma H (2014) Intrathecal antagonism of microglial
TLR4 reduces inflammatory damage to blood-spinal cord barrier following
ischemia/reperfusion injury in rats. In: Mol Brain, vol. 7, p 28.
Lin H-W, Basu A, Druckman C, Cicchese M, Krady J, Levison S (2006) Astrogliosis is
delayed in type 1 interleukin-1 receptor-null mice following a penetrating brain
injury. In: Journal of neuroinflammation, vol. 3, p 15.
Locovei S, Wang J, Dahl G (2006) Activation of pannexin 1 channels by ATP through P2Y
receptors and by cytoplasmic calcium. In: FEBS Lett, vol. 580, pp 239-244.
Lu QR, Sun T, Zhu Z, Ma N, Garcia M, Stiles CD, Rowitch DH (2002) Common
developmental requirement for Olig function indicates a motor
neuron/oligodendrocyte connection. In: Cell, vol. 109, pp 75-86.
Lu QR, Yuk D, Alberta JA, Zhu Z, Pawlitzky I, Chan J, McMahon AP, Stiles CD, Rowitch
DH (2000) Sonic hedgehog--regulated oligodendrocyte lineage genes encoding
bHLH proteins in the mammalian central nervous system. In: Neuron, vol. 25, pp
317-329.
Luheshi NM, Kovács KJ, Lopez-Castejon G, Brough D, Denes A (2011) Interleukin-1α
expression precedes IL-1β after ischemic brain injury and is localised to areas of
focal neuronal loss and penumbral tissues. In: Journal of neuroinflammation, vol. 8,
p 186.
Luheshi NM, McColl BW, Brough D (2009) Nuclear retention of IL-1 alpha by necrotic
cells: a mechanism to dampen sterile inflammation. In: European journal of
immunology, vol. 39, pp 2973-2980.
Lytle JM, Wrathall JR (2007) Glial cell loss, proliferation and replacement in the contused
murine spinal cord. In: Eur J Neurosci, vol. 25, pp 1711-1724.
247
Mackenzie AB, Young MT, Adinolfi E, Surprenant A (2005) Pseudoapoptosis induced by
brief activation of ATP-gated P2X7 receptors. In: The Journal of biological
chemistry, vol. 280, pp 33968-33976.
Maezawa I, Maeda N, Montine TJ, Montine KS (2006) Apolipoprotein E-specific innate
immune response in astrocytes from targeted replacement mice. In: Journal of
neuroinflammation, vol. 3, p 10.
March CJ, Mosley B, Larsen A, Cerretti DP, Braedt G, Price V, Gillis S, Henney CS,
Kronheim SR, Grabstein K (1985) Cloning, sequence and expression of two distinct
human interleukin-1 complementary DNAs. In: Nature, vol. 315, pp 641-647.
Mariathasan S, Monack D (2007) Inflammasome adaptors and sensors: intracellular
regulators of infection and inflammation. In: Nature reviews Immunology, vol. 7,
pp 31-40.
Mariathasan S, Newton K, Monack D, Vucic D, French D, Lee W, Roose-Girma M,
Erickson S, Dixit V (2004) Differential activation of the inflammasome by caspase-
1 adaptors ASC and Ipaf. In: Nature, vol. 430, pp 213-218.
Mariathasan S, Weiss D, Newton K, Mcbride J, O'rourke K, Roose-Girma M, Lee
W, Weinrauch Y, Monack D, Dixit V (2006) Cryopyrin activates the inflammasome
in response to toxins and ATP. In: Nature, vol. 440, pp 228-232.
Martinon F, Burns K, Tschopp J (2002) The inflammasome: a molecular platform
triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. In:
Molecular Cell, vol. 10, pp 417-426.
Martinon F, Pétrilli V, Mayor A, Tardivel A, Tschopp J (2006) Gout-associated uric acid
crystals activate the NALP3 inflammasome. In: Nature, vol. 440, pp 237-241.
248
Mason J, Suzuki K, Chaplin D, Matsushima G (2001) Interleukin-1beta promotes repair of
the CNS. In: The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for
Neuroscience, vol. 21, pp 7046-7052.
Masumoto J, Taniguchi S, Ayukawa K, Sarvotham H, Kishino T, Niikawa N, Hidaka E,
Katsuyama T, Higuchi T, Sagara J (1999) ASC, a novel 22-kDa protein, aggregates
during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells. In: J Biol Chem,
vol. 274, pp 33835-33838.
Matute C, Torre I, Pérez-Cerdá F, Pérez-Samartín A, Alberdi E, Etxebarria E, Arranz AM,
Ravid R, Rodríguez-Antigüedad A, Sánchez-Gómez M, Domercq M (2007) P2X(7)
receptor blockade prevents ATP excitotoxicity in oligodendrocytes and ameliorates
experimental autoimmune encephalomyelitis. In: The Journal of neuroscience : the
official journal of the Society for Neuroscience, vol. 27, pp 9525-9533.
Mautes A, Weinzierl M, Donovan F, Noble L (2000) Vascular events after spinal cord
injury: contribution to secondary pathogenesis. In: Physical therapy, vol. 80, pp
673-687.
Mctigue DM, Tripathi RB (2008) The life, death, and replacement of oligodendrocytes in
the adult CNS. In: Journal of Neurochemistry, vol. 107, pp 1-19.
Mekki-Dauriac S, Agius E, Kan P, Cochard P (2002) Bone morphogenetic proteins
negatively control oligodendrocyte precursor specification in the chick spinal cord.
In: Development, vol. 129, pp 5117-5130.
Meucci O, Fatatis A, Simen AA, Miller RJ (2000) Expression of CX3CR1 chemokine
receptors on neurons and their role in neuronal survival. In: Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America, vol. 97, pp 8075-
8080.
249
Mildner A, Schmidt H, Nitsche M, Merkler D, Hanisch U-K, Mack M, Heikenwalder M,
Brück W, Priller J, Prinz M (2007) Microglia in the adult brain arise from Ly-
6ChiCCR2+ monocytes only under defined host conditions. In: Nature
neuroscience, vol. 10, pp 1544-1553.
Miller RH (2002) Regulation of oligodendrocyte development in the vertebrate CNS. In:
Progress in neurobiology, vol. 67, pp 451-467.
Minkiewicz J, de Rivero Vaccari JP, Keane RW (2013) Human astrocytes express a novel
NLRP2 inflammasome. In: Glia.
Mitew S, Hay CM, Peckham H, Xiao J, Koenning M, Emery B (2013) Mechanisms
Regulating the Development of Oligodendrocytes and Central Nervous System
Myelin. In: Neuroscience.
Miyoshi K, Obata K, Kondo T, Okamura H, Noguchi K (2008) Interleukin-18-Mediated
Microglia/Astrocyte Interaction in the Spinal Cord Enhances Neuropathic Pain
Processing after Nerve Injury. In: Journal of Neuroscience, vol. 28, pp 12775-
12787.
Mizuno T, Kawanokuchi J, Numata K, Suzumura A (2003) Production and neuroprotective
functions of fractalkine in the central nervous system. In: Brain Res, vol. 979, pp
65-70.
Moritz DR, Rodewald HR, Gheyselinck J, Klemenz R (1998) The IL-1 receptor-related T1
antigen is expressed on immature and mature mast cells and on fetal blood mast cell
progenitors. In: Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950), vol. 161, pp 4866-
4874.
250
Mosley B, Urdal DL, Prickett KS, Larsen A, Cosman D, Conlon PJ, Gillis S, Dower SK
(1987) The interleukin-1 receptor binds the human interleukin-1 alpha precursor but
not the interleukin-1 beta precursor. In: J Biol Chem, vol. 262, pp 2941-2944.
Myer DJ, Gurkoff GG, Lee SM, Hovda DA, Sofroniew MV (2006) Essential protective
roles of reactive astrocytes in traumatic brain injury. In: Brain, vol. 129, pp 2761-
2772.
Nahrendorf M, Swirski F, Aikawa E, Stangenberg L, Wurdinger T, Figueiredo J-L, Libby
P, Weissleder R, Pittet M (2007) The healing myocardium sequentially mobilizes
two monocyte subsets with divergent and complementary functions. In: Journal of
Experimental Medicine, vol. 204, pp 3037-3047.
Nakanishi K, Yoshimoto T, Tsutsui H, Okamura H (2001) Interleukin-18 is a unique
cytokine that stimulates both Th1 and Th2 responses depending on its cytokine
milieu. In: Cytokine Growth Factor Rev, vol. 12, pp 53-72.
Narcisse L, Scemes E, Zhao Y, Lee SC, Brosnan CF (2005) The cytokine IL-1beta
transiently enhances P2X7 receptor expression and function in human astrocytes.
In: Glia, vol. 49, pp 245-258.
Nesic O, Xu G, McAdoo D, High K, Hulsebosch C, Perez-Pol R (2001) IL-1 receptor
antagonist prevents apoptosis and caspase-3 activation after spinal cord injury. In:
Journal of neurotrauma, vol. 18, pp 947-956.
Nguyen L, Rothwell NJ, Pinteaux E, Boutin H (2011) Contribution of interleukin-1
receptor accessory protein B to interleukin-1 actions in neuronal cells. In:
Neurosignals, vol. 19, pp 222-230.
Nicolay DJ, Doucette JR, Nazarali AJ (2007) Transcriptional control of
oligodendrogenesis. In: Glia, vol. 55, pp 1287-1299.
251
Nimmerjahn A, Kirchhoff F, Helmchen F (2005) Resting microglial cells are highly
dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. In: Science (New York, NY),
vol. 308, pp 1314-1318.
Norenberg MD (1994) Astrocyte responses to CNS injury. In: J Neuropathol Exp Neurol,
vol. 53, pp 213-220.
North RA (2002) Molecular physiology of P2X receptors. In: Physiol Rev, vol. 82, pp
1013-1067.
O'Connor W, Harton JA, Zhu X, Linhoff MW, Ting JP-Y (2003) Cutting edge:
CIAS1/cryopyrin/PYPAF1/NALP3/CATERPILLER 1.1 is an inducible
inflammatory mediator with NF-kappa B suppressive properties. In: Journal of
immunology (Baltimore, Md : 1950), vol. 171, pp 6329-6333.
O'Neill LA, Dinarello CA (2000) The IL-1 receptor/toll-like receptor superfamily: crucial
receptors for inflammation and host defense. In: Immunology today, vol. 21, pp
206-209.
Okun E, Griffioen KJ, Mattson MP (2011) Toll-like receptor signaling in neural plasticity
and disease. In: Trends Neurosci, vol. 34, pp 269-281.
Orentas DM, Hayes JE, Dyer KL, Miller RH (1999) Sonic hedgehog signaling is required
during the appearance of spinal cord oligodendrocyte precursors. In: Development,
vol. 126, pp 2419-2429.
Ortega JA, Radonjić NV, Zecevic N (2013) Sonic hedgehog promotes generation and
maintenance of human forebrain Olig2 progenitors. In: Front Cell Neurosci, vol. 7,
p 254.
252
Park HH, Lo Y-C, Lin S-C, Wang L, Yang JK, Wu H (2007) The Death Domain
Superfamily in Intracellular Signaling of Apoptosis and Inflammation. In: Annual
Review of Immunology, vol. 25, pp 561-586.
Paulukat J, Bosmann M, Nold M, Garkisch S, Kämpfer H, Frank S, Raedle J, Zeuzem S,
Pfeilschifter J, Mühl H (2001) Expression and release of IL-18 binding protein in
response to IFN-gamma. In: Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950), vol.
167, pp 7038-7043.
Peferoen L, Kipp M, van der Valk P, van Noort JM, Amor S (2014) Oligodendrocyte-
microglia cross-talk in the central nervous system. In: Immunology, vol. 141, pp
302-313.
Pelegrín P (2011) Many ways to dilate the P2X7 receptor pore. In: British Journal of
Pharmacology, vol. 163, pp 908-911.
Pelegrin P, Barroso-Gutierrez C, Surprenant A (2008) P2X7 receptor differentially couples
to distinct release pathways for IL-1beta in mouse macrophage. In: Journal of
immunology (Baltimore, Md : 1950), vol. 180, pp 7147-7157.
Pelegrin P, Surprenant A (2006) Pannexin-1 mediates large pore formation and interleukin-
1beta release by the ATP-gated P2X7 receptor. In: The EMBO Journal, vol. 25, pp
5071-5082.
Peng W, Cotrina M, Han X, Yu H, Bekar L, Blum L, Takano T, Tian G-F, Goldman S,
Nedergaard M (2009) Systemic administration of an antagonist of the ATP-
sensitive receptor P2X7 improves recovery after spinal cord injury. In: Proceedings
of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol. 106, pp
12489-12493.
253
Pernet V, Schwab ME (2012) The role of Nogo-A in axonal plasticity, regrowth and repair.
In: Cell Tissue Res, vol. 349, pp 97-104.
Perrin FE, Lacroix S, Avilés-Trigueros M, David S (2005) Involvement of monocyte
chemoattractant protein-1, macrophage inflammatory protein-1alpha and
interleukin-1beta in Wallerian degeneration. In: Brain, vol. 128, pp 854-866.
Perry V, Nicoll J, Holmes C (2010) Microglia in neurodegenerative disease. In: Nature
Publishing Group, pp 1-9.
Pétrilli V, Papin S, Dostert C, Mayor A, Martinon F, Tschopp J (2007) Activation of the
NALP3 inflammasome is triggered by low intracellular potassium concentration. In:
Cell Death and Differentiation, vol. 14, pp 1583-1589.
Pillay J, Den Braber I, Vrisekoop N, Kwast L, De Boer R, Borghans J, Tesselaar K,
Koenderman L (2010) In vivo labeling with 2H2O reveals a human neutrophil
lifespan of 5.4 days. In: Blood, vol. 116, pp 625-627.
Pineau I, Lacroix S (2006) Proinflammatory cytokine synthesis in the injured mouse spinal
cord: Multiphasic expression pattern and identification of the cell types involved.
In: The Journal of Comparative Neurology, vol. 500, pp 267-285.
Pineau I, Sun L, Bastien D, Lacroix S (2010) Astrocytes initiate inflammation in the injured
mouse spinal cord by promoting the entry of neutrophils and inflammatory
monocytes in an IL-1 receptor/MyD88-dependent fashion. In: Brain Behav Immun,
vol. 24, pp 540-553.
Pittman K, Kubes P (2013) Damage-associated molecular patterns control neutrophil
recruitment. In: J Innate Immun, vol. 5, pp 315-323.
Popovich P, Guan Z, Wei P, Huitinga I, Van Rooijen N, Stokes B (1999) Depletion of
hematogenous macrophages promotes partial hindlimb recovery and
254
neuroanatomical repair after experimental spinal cord injury. In: Experimental
neurology, vol. 158, pp 351-365.
Popovich PG, Guan Z, McGaughy V, Fisher L, Hickey WF, Basso DM (2002) The
neuropathological and behavioral consequences of intraspinal
microglial/macrophage activation. In: J Neuropathol Exp Neurol, vol. 61, pp 623-
633.
Popovich PG, Wei P, Stokes BT (1997) Cellular inflammatory response after spinal cord
injury in Sprague-Dawley and Lewis rats. In: J Comp Neurol, vol. 377, pp 443-464.
Pradillo JM, Denes A, Greenhalgh AD, Boutin H, Drake C, McColl BW, Barton E, Proctor
SD, Russell JC, Rothwell NJ, Allan SM (2012) Delayed administration of
interleukin-1 receptor antagonist reduces ischemic brain damage and inflammation
in comorbid rats. In: J Cereb Blood Flow Metab, vol. 32, pp 1810-1819.
Priestley JV, Michael-Titus AT, Tetzlaff W (2012) Limiting spinal cord injury by
pharmacological intervention. In: Spinal Cord Injury, vol. 109, pp 463-484.
Rathinam VAK, Jiang Z, Waggoner SN, Sharma S, Cole LE, Waggoner L, Vanaja SK,
Monks BG, Ganesan S, Latz E, Hornung V, Vogel SN, Szomolanyi-Tsuda E,
Fitzgerald KA (2010) The AIM2 inflammasome is essential for host defense against
cytosolic bacteria and DNA viruses. In: Nature Immunology, vol. 11, pp 395-402.
Ray S, Hogan E, Banik N (2003a) Calpain in the pathophysiology of spinal cord injury:
neuroprotection with calpain inhibitors. In: Brain research Brain research reviews,
vol. 42, pp 169-185.
Ray S, Matzelle D, Sribnick E, Guyton M, Wingrave J, Banik N (2003b) Calpain inhibitor
prevented apoptosis and maintained transcription of proteolipid protein and myelin
255
basic protein genes in rat spinal cord injury. In: Journal of chemical neuroanatomy,
vol. 26, pp 119-124.
Rider P, Carmi Y, Guttman O, Braiman A, Cohen I, Voronov E, White MR, Dinarello CA,
Apte RN (2011) IL-1α and IL-1β recruit different myeloid cells and promote
different stages of sterile inflammation. In: Journal of immunology (Baltimore, Md :
1950), vol. 187, pp 4835-4843.
Roberts AW (2005) G-CSF: a key regulator of neutrophil production, but that's not all! In:
Growth Factors, vol. 23, pp 33-41.
Roth W, Kumar V, Beer H-D, Richter M, Wohlenberg C, Reuter U, Thiering S,
Staratschek-Jox A, Hofmann A, Kreusch F, Schultze JL, Vogl T, Roth J, Reichelt J,
Hausser I, Magin TM (2012) Keratin 1 maintains skin integrity and participates in
an inflammatory network in skin through interleukin-18. In: Journal of Cell Science,
vol. 125, pp 5269-5279.
Rotshenker S (2011) Wallerian degeneration: the innate-immune response to traumatic
nerve injury. In: Journal of neuroinflammation, vol. 8, p 109.
Roussel L, Erard M, Cayrol C, Girard J-P (2008) Molecular mimicry between IL-33 and
KSHV for attachment to chromatin through the H2A-H2B acidic pocket. In: EMBO
Rep, vol. 9, pp 1006-1012.
Russell SE, Walsh PT (2012) Sterile inflammation - do innate lymphoid cell subsets play a
role? In: Front Immunol, vol. 3, p 246.
Sabroe I, Whyte MKB (2007) Toll-like receptor (TLR)-based networks regulate
neutrophilic inflammation in respiratory disease. In: Biochem Soc Trans, vol. 35, pp
1492-1495.
256
Sagulenko V, Thygesen SJ, Sester DP, Idris A, Cridland JA, Vajjhala PR, Roberts TL,
Schroder K, Vince JE, Hill JM, Silke J, Stacey KJ (2013) AIM2 and NLRP3
inflammasomes activate both apoptotic and pyroptotic death pathways via ASC. In:
Cell Death Differ.
Sakaki H, Fujiwaki T, Tsukimoto M, Kawano A, Harada H, Kojima S (2013) P2X4
receptor regulates P2X7 receptor-dependent IL-1β and IL-18 release in mouse bone
marrow-derived dendritic cells. In: Biochem Biophys Res Commun, vol. 432, pp
406-411.
Sanz JM, Di Virgilio F (2000) Kinetics and mechanism of ATP-dependent IL-1 beta
release from microglial cells. In: Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950),
vol. 164, pp 4893-4898.
Sareneva T, Julkunen I, Matikainen S (2000) IFN-alpha and IL-12 induce IL-18 receptor
gene expression in human NK and T cells. In: Journal of immunology (Baltimore,
Md : 1950), vol. 165, pp 1933-1938.
Sato A, Ohtaki H, Tsumuraya T, Song D, Ohara K, Asano M, Iwakura Y, Atsumi T, Shioda
S (2012) Interleukin-1 participates in the classical and alternative activation of
microglia/macrophages after spinal cord injury. In: Journal of neuroinflammation,
vol. 9, p 65.
Sayer FT, Kronvall E, Nilsson OG (2006) Methylprednisolone treatment in acute spinal
cord injury: the myth challenged through a structured analysis of published
literature. In: Spine J, vol. 6, pp 335-343.
Schäbitz W-R, Kollmar R, Schwaninger M, Juettler E, Bardutzky J, Schölzke MN, Sommer
C, Schwab S (2003) Neuroprotective effect of granulocyte colony-stimulating factor
257
after focal cerebral ischemia. In: Stroke; a journal of cerebral circulation, vol. 34, pp
745-751.
Schmitz J, Owyang A, Oldham E, Song Y, Murphy E, McClanahan TK, Zurawski G,
Moshrefi M, Qin J, Li X, Gorman DM, Bazan JF, Kastelein RA (2005) IL-33, an
interleukin-1-like cytokine that signals via the IL-1 receptor-related protein ST2 and
induces T helper type 2-associated cytokines. In: Immunity, vol. 23, pp 479-490.
Schmitz T, Krabbe G, Weikert G, Scheuer T, Matheus F, Wang Y, Mueller S, Kettenmann
H, Matyash V, Bührer C, Endesfelder S (2014) Minocycline protects the immature
white matter against hyperoxia. In: Experimental neurology, vol. 254, pp 153-165.
Schnell L, Fearn S, Klassen H, Schwab ME, Perry VH (1999) Acute inflammatory
responses to mechanical lesions in the CNS: differences between brain and spinal
cord. In: Eur J Neurosci, vol. 11, pp 3648-3658.
Schroder K, Tschopp J (2010) The Inflammasomes. In: Cell, vol. 140, pp 821-832.
Schulz C, Perdiguero EG, Chorro L, Szabo-Rogers H, Cagnard N, Kierdorf K, Prinz M,
Wu B, Jacobsen SEW, Pollard JW, Frampton J, Liu KJ, Geissmann F (2012) A
Lineage of Myeloid Cells Independent of Myb and Hematopoietic Stem Cells. In:
Science, vol. 336, pp 86-90.
Schwab J, Guo L, Schluesener H (2005) Spinal cord injury induces early and persistent
lesional P2X4 receptor expression. In: Journal of neuroimmunology, vol. 163, pp
185-189.
Schwab ME, Strittmatter SM (2014) Nogo limits neural plasticity and recovery from injury.
In: Curr Opin Neurobiol, vol. 27C, pp 53-60.
258
Semerad C, Liu F, Gregory A, Stumpf K, Link D (2002) G-CSF is an essential regulator of
neutrophil trafficking from the bone marrow to the blood. In: Immunity, vol. 17, pp
413-423.
Sharma K, Selzer ME, Li S (2012) Scar-mediated inhibition and CSPG receptors in the
CNS. In: Experimental neurology, vol. 237, pp 370-378.
Sharp A, Polak P, Simonini V, Lin S, Richardson J, Bongarzone E, Feinstein D (2008)
P2x7 deficiency suppresses development of experimental autoimmune
encephalomyelitis. In: Journal of neuroinflammation, vol. 5, p 33.
Shechter R, London A, Varol C, Raposo C, Cusimano M, Yovel G, Rolls A, Mack M,
Pluchino S, Martino G, Jung S, Schwartz M (2009) Infiltrating Blood-Derived
Macrophages Are Vital Cells Playing an Anti-inflammatory Role in Recovery from
Spinal Cord Injury in Mice. In: PLoS Medicine, vol. 6, p e1000113.
Shestopalov VI, Slepak VZ (2014) Molecular pathways of pannexin1-mediated
neurotoxicity. In: Front Physiol, vol. 5, pp 1-8.
Shigemoto-Mogami Y, Hoshikawa K, Goldman JE, Sekino Y, Sato K (2014) Microglia
enhance neurogenesis and oligodendrogenesis in the early postnatal subventricular
zone. In: The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for
Neuroscience, vol. 34, pp 2231-2243.
Silver J, Miller JH (2004) Regeneration beyond the glial scar. In: Nature reviews
Neuroscience, vol. 5, pp 146-156.
Silverman W, De Rivero Vaccari J, Locovei S, Qiu F, Carlsson S, Scemes E, Keane R,
Dahl G (2009) The pannexin 1 channel activates the inflammasome in neurons and
astrocytes. In: The Journal of biological chemistry, vol. 284, pp 18143-18151.
259
Sims JE, Smith DE (2010) The IL-1 family: regulators of immunity. In: Nature reviews
Immunology, vol. 10, pp 89-102.
Smith D, Lipsky B, Russell C, Ketchem R, Kirchner J, Hensley K, Huang Y, Friedman W,
Boissonneault V, Plante M-M, Rivest S, Sims J (2009) A Central Nervous System-
Restricted Isoform of the Interleukin-1 Receptor Accessory Protein Modulates
Neuronal Responses to Interleukin-1. In: Immunity, vol. 30, pp 817-831.
Sofroniew M (2005) Reactive Astrocytes in Neural Repair and Protection. In: The
Neuroscientist, vol. 11, pp 400-407.
Sriram K, O'Callaghan JP (2007) Divergent roles for tumor necrosis factor-alpha in the
brain. In: J Neuroimmune Pharmacol, vol. 2, pp 140-153.
Stirling DP, Cummins K, Mishra M, Teo W, Yong VW, Stys P (2013) Toll-like receptor 2-
mediated alternative activation of microglia is protective after spinal cord injury. In:
Brain.
Stirling DP, Khodarahmi K, Liu J, McPhail LT, McBride CB, Steeves JD, Ramer MS,
Tetzlaff W (2004) Minocycline treatment reduces delayed oligodendrocyte death,
attenuates axonal dieback, and improves functional outcome after spinal cord
injury. In: J Neurosci, vol. 24, pp 2182-2190.
Stirling DP, Liu S, Kubes P, Yong VW (2009) Depletion of Ly6G/Gr-1 leukocytes after
spinal cord injury in mice alters wound healing and worsens neurological outcome.
In: The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for
Neuroscience, vol. 29, pp 753-764.
Stirling DP, Yong VW (2008) Dynamics of the inflammatory response after murine spinal
cord injury revealed by flow cytometry. In: J Neurosci Res, vol. 86, pp 1944-1958.
260
Sussman CR, Davies JE, Miller RH (2002) Extracellular and intracellular regulation of
oligodendrocyte development: roles of Sonic hedgehog and expression of E
proteins. In: Glia, vol. 40, pp 55-64.
Sutmuller R, Garritsen A, Adema GJ (2007) Regulatory T cells and toll-like receptors:
regulating the regulators. In: Ann Rheum Dis, vol. 66 Suppl 3, pp iii91-95.
Takebayashi H, Nabeshima Y, Yoshida S, Chisaka O, Ikenaka K, Nabeshima Y-i (2002)
The basic helix-loop-helix factor olig2 is essential for the development of
motoneuron and oligodendrocyte lineages. In: Curr Biol, vol. 12, pp 1157-1163.
Takeda K, Akira S (2005) Toll-like receptors in innate immunity. In: International
immunology, vol. 17, pp 1-14.
Takeda K, Tsutsui H, Yoshimoto T, Adachi O, Yoshida N, Kishimoto T, Okamura H,
Nakanishi K, Akira S (1998) Defective NK cell activity and Th1 response in IL-18-
deficient mice. In: Immunity, vol. 8, pp 383-390.
Takeuchi O, Akira S (2010) Pattern Recognition Receptors and Inflammation. In: Cell, vol.
140, pp 805-820.
Talabot-Ayer D, Lamacchia C, Gabay C, Palmer G (2009) Interleukin-33 is biologically
active independently of caspase-1 cleavage. In: J Biol Chem, vol. 284, pp 19420-
19426.
Tan M-S, Yu J-T, Jiang T, Zhu X-C, Tan L (2013) The NLRP3 Inflammasome in
Alzheimer’s Disease. In: Mol Neurobiol, vol. 48, pp 875-882.
Tanaka T, Murakami K, Bando Y, Yoshida S (2013) Minocycline reduces remyelination by
suppressing ciliary neurotrophic factor expression after cuprizone-induced
demyelination. In: J Neurochem, vol. 127, pp 259-270.
261
Taoka Y, Okajima K, Uchiba M, Murakami K, Kushimoto S, Johno M, Naruo M, Okabe H,
Takatsuki K (1997) Role of neutrophils in spinal cord injury in the rat. In:
Neuroscience, vol. 79, pp 1177-1182.
Tator C, Koyanagi I (1997) Vascular mechanisms in the pathophysiology of human spinal
cord injury. In: Journal of neurosurgery, vol. 86, pp 483-492.
Tator CH (1995) Update on the pathophysiology and pathology of acute spinal cord injury.
In: Brain Pathol, vol. 5, pp 407-413.
Thawer SG, Mawhinney L, Chadwick K, de Chickera SN, Weaver LC, Brown A, Dekaban
GA (2013) Temporal changes in monocyte and macrophage subsets and microglial
macrophages following spinal cord injury in the lys-egfp-ki mouse model. In:
Journal of Neuroimmunology.
Thomassen E, Bird TA, Renshaw BR, Kennedy MK, Sims JE (1998) Binding of
interleukin-18 to the interleukin-1 receptor homologous receptor IL-1Rrp1 leads to
activation of signaling pathways similar to those used by interleukin-1. In: J
Interferon Cytokine Res, vol. 18, pp 1077-1088.
Thornton P, Mccoll B, Greenhalgh A, Denes A, Allan S, Rothwell N (2010) Platelet
interleukin-1 drives cerebrovascular inflammation. In: Blood, vol. 115, pp 3632-
3639.
Tikka T, Fiebich BL, Goldsteins G, Keinanen R, Koistinaho J (2001) Minocycline, a
tetracycline derivative, is neuroprotective against excitotoxicity by inhibiting
activation and proliferation of microglia. In: The Journal of neuroscience : the
official journal of the Society for Neuroscience, vol. 21, pp 2580-2588.
Tozaki-Saitoh H, Tsuda M, Inoue K (2011) Role of purinergic receptors in CNS function
and neuroprotection. In: Adv Pharmacol, vol. 61, pp 495-528.
262
Trajkovic V, Sweet MJ, Xu D (2004) T1/ST2--an IL-1 receptor-like modulator of immune
responses. In: Cytokine Growth Factor Rev, vol. 15, pp 87-95.
Trang T, Beggs S, Wan X, Salter MW (2009) P2X4-receptor-mediated synthesis and
release of brain-derived neurotrophic factor in microglia is dependent on calcium
and p38-mitogen-activated protein kinase activation. In: The Journal of
neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience, vol. 29, pp 3518-
3528.
Tremblay M-È, Lowery RL, Majewska AK (2010) Microglial interactions with synapses
are modulated by visual experience. In: PLoS Biol, vol. 8, p e1000527.
Tsuda M, Shigemoto-Mogami Y, Koizumi S, Mizokoshi A, Kohsaka S, Salter MW, Inoue
K (2003) P2X4 receptors induced in spinal microglia gate tactile allodynia after
nerve injury. In: Nature, vol. 424, pp 778-783.
Tsutsui H, Kayagaki N, Kuida K, Nakano H, Hayashi N, Takeda K, Matsui K,
Kashiwamura S, Hada T, Akira S, Yagita H, Okamura H, Nakanishi K (1999)
Caspase-1-independent, Fas/Fas ligand-mediated IL-18 secretion from macrophages
causes acute liver injury in mice. In: Immunity, vol. 11, pp 359-367.
Ulmann L, Hatcher JP, Hughes JP, Chaumont S, Green PJ, Conquet F, Buell GN, Reeve
AJ, Chessell IP, Rassendren F (2008) Up-regulation of P2X4 receptors in spinal
microglia after peripheral nerve injury mediates BDNF release and neuropathic
pain. In: The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for
Neuroscience, vol. 28, pp 11263-11268.
Ulmann L, Levavasseur F, Avignone E, Peyroutou R, Hirbec H, Audinat E, Rassendren F
(2013) Involvement of P2X4 receptors in hippocampal microglial activation after
status epilepticus. In: Glia.
263
Van Loo G, De Lorenzi R, Schmidt H, Huth M, Mildner A, Schmidt-Supprian M,
Lassmann H, Prinz M, Pasparakis M (2006) Inhibition of transcription factor NF-κB
in the central nervous system ameliorates autoimmune encephalomyelitis in mice.
In: Nature Immunology, vol. 7, pp 954-961.
van Rossum D, Hanisch U-K (2004) Microglia. In: Metabolic brain disease, vol. 19, pp
393-411.
Vanden Abeele F, Bidaux G, Gordienko D, Beck B, Panchin YV, Baranova AV, Ivanov
DV, Skryma R, Prevarskaya N (2006) Functional implications of calcium
permeability of the channel formed by pannexin 1. In: J Cell Biol, vol. 174, pp 535-
546.
Vargas M, Barres B (2007) Why Is Wallerian Degeneration in the CNS So Slow? In:
Annual Review of Neuroscience, vol. 30, pp 153-179.
Vázquez-Villoldo N, Domercq M, Martín A, Llop J, Gómez-Vallejo V, Matute C (2013)
P2X4 receptors control the fate and survival of activated microglia. In: Glia.
Virginio C, MacKenzie A, North RA, Surprenant A (1999) Kinetics of cell lysis, dye
uptake and permeability changes in cells expressing the rat P2X7 receptor. In: J
Physiol (Lond), vol. 519 Pt 2, pp 335-346.
Voskuhl R, Peterson R, Song B, Ao Y, Morales L, Tiwari-Woodruff S, Sofroniew M
(2009) Reactive Astrocytes Form Scar-Like Perivascular Barriers to Leukocytes
during Adaptive Immune Inflammation of the CNS. In: Journal of Neuroscience,
vol. 29, pp 11511-11522.
Vosler PS, Brennan CS, Chen J (2008) Calpain-mediated signaling mechanisms in neuronal
injury and neurodegeneration. In: Molecular neurobiology, vol. 38, pp 78-100.
264
Wang X, Arcuino G, Takano T, Lin J, Peng WG, Wan P, Li P, Xu Q, Liu QS, Goldman
SA, Nedergaard M (2004) P2X7 receptor inhibition improves recovery after spinal
cord injury. In: Nature medicine, vol. 10, pp 821-827.
Weinhold K, Krause-Buchholz U, Rödel G, Kasper M, Barth K (2010) Interaction and
interrelation of P2X7 and P2X4 receptor complexes in mouse lung epithelial cells.
In: Cell Mol Life Sci, vol. 67, pp 2631-2642.
Werman A, Werman-Venkert R, White R, Lee J-K, Werman B, Krelin Y, Voronov E,
Dinarello C, Apte R (2004) The precursor form of IL-1alpha is an intracrine
proinflammatory activator of transcription. In: Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America, vol. 101, pp 2434-2439.
Wildbaum G, Youssef S, Grabie N, Karin N (1998) Neutralizing antibodies to IFN-gamma-
inducing factor prevent experimental autoimmune encephalomyelitis. In: Journal of
immunology (Baltimore, Md : 1950), vol. 161, pp 6368-6374.
Wilson JR, Forgione N, Fehlings MG (2013) Emerging therapies for acute traumatic spinal
cord injury. In: CMAJ : Canadian Medical Association Journal, vol. 185, p 485.
Wright H, Moots R, Bucknall R, Edwards S (2010) Neutrophil function in inflammation
and inflammatory diseases. In: Rheumatology, vol. 49, pp 1618-1631.
Yan P, Li Q, Kim GM, Xu J, Hsu CY, Xu XM (2001) Cellular localization of tumor
necrosis factor-alpha following acute spinal cord injury in adult rats. In: Journal of
neurotrauma, vol. 18, pp 563-568.
Yan P, Liu N, Kim G-M, Xu J, Xu J, Li Q, Hsu CY, Xu X-M (2003) Expression of the type
1 and type 2 receptors for tumor necrosis factor after traumatic spinal cord injury in
adult rats. In: Experimental neurology, vol. 183, pp 286-297.
265
Yang J, Weimer RM, Kallop D, Olsen O, Wu Z, Renier N, Uryu K, Tessier-Lavigne M
(2013) Regulation of Axon Degeneration after Injury and in Development by the
Endogenous Calpain Inhibitor Calpastatin. In: Neuron.
Yasuoka S, Kawanokuchi J, Parajuli B, Jin S, Doi Y, Noda M, Sonobe Y, Takeuchi H,
Mizuno T, Suzumura A (2011) Production and functions of IL-33 in the central
nervous system. In: Brain Res, vol. 1385, pp 8-17.
Yiu G, He Z (2006) Glial inhibition of CNS axon regeneration. In: Nature reviews
Neuroscience, vol. 7, pp 617-627.
Yoshimoto T, Mizutani H, Tsutsui H, Noben-Trauth N, Yamanaka K, Tanaka M, Izumi S,
Okamura H, Paul WE, Nakanishi K (2000) IL-18 induction of IgE: dependence on
CD4+ T cells, IL-4 and STAT6. In: Nature Immunology, vol. 1, pp 132-137.
Yoshimoto T, Takeda K, Tanaka T, Ohkusu K, Kashiwamura S, Okamura H, Akira S,
Nakanishi K (1998) IL-12 up-regulates IL-18 receptor expression on T cells, Th1
cells, and B cells: synergism with IL-18 for IFN-gamma production. In: Journal of
immunology (Baltimore, Md : 1950), vol. 161, pp 3400-3407.
Yune TY, Chang MJ, Kim SJ, Lee YB, Shin SW, Rhim H, Kim YC, Shin ML, Oh YJ, Han
CT, Markelonis GJ, Oh TH (2003) Increased production of tumor necrosis factor-
alpha induces apoptosis after traumatic spinal cord injury in rats. In: Journal of
neurotrauma, vol. 20, pp 207-219.
Yune TY, Lee JY, Jung GY, Kim SJ, Jiang MH, Kim YC, Oh YJ, Markelonis GJ, Oh TH
(2007) Minocycline alleviates death of oligodendrocytes by inhibiting pro-nerve
growth factor production in microglia after spinal cord injury. In: J Neurosci, vol.
27, pp 7751-7761.
266
Zawadzka M, Rivers LE, Fancy SPJ, Zhao C, Tripathi R, Jamen F, Young K, Goncharevich
A, Pohl H, Rizzi M, Rowitch DH, Kessaris N, Suter U, Richardson WD, Franklin
RJM (2010) CNS-resident glial progenitor/stem cells produce Schwann cells as well
as oligodendrocytes during repair of CNS demyelination. In: Cell Stem Cell, vol. 6,
pp 578-590.
Zhang Y-K, Liu J-T, Peng Z-W, Fan H, Yao A-H, Cheng P, Liu L, Ju G, Kuang F (2013)
Different TLR4 expression and microglia/macrophage activation induced by
hemorrhage in the rat spinal cord after compressive injury. In: Journal of
neuroinflammation, vol. 10, p 112.
Zhao R-R, Andrews MR, Wang D, Warren P, Gullo M, Schnell L, Schwab ME, Fawcett
JW (2013) Combination treatment with anti-Nogo-A and chondroitinase ABC is
more effective than single treatments at enhancing functional recovery after spinal
cord injury. In: The European journal of neuroscience, vol. 38, pp 2946-2961.
Zheng Y, Humphry M, Maguire JJ, Bennett MR, Clarke MCH (2013) Intracellular
Interleukin-1 Receptor 2 Binding Prevents Cleavage and Activity of Interleukin-1α,
Controlling Necrosis-Induced Sterile Inflammation. In: Immunity.
Zhou Q, Anderson DJ (2002) The bHLH transcription factors OLIG2 and OLIG1 couple
neuronal and glial subtype specification. In: Cell, vol. 109, pp 61-73.
Zhou Q, Wang S, Anderson DJ (2000) Identification of a novel family of oligodendrocyte
lineage-specific basic helix-loop-helix transcription factors. In: Neuron, vol. 25, pp
331-343.
Zhu W, London NR, Gibson CC, Davis CT, Tong Z, Sorensen LK, Shi DS, Guo J, Smith
MCP, Grossmann AH, Thomas KR, Li DY (2012) Interleukin receptor activates a
267
MYD88-ARNO-ARF6 cascade to disrupt vascular stability. In: Nature, vol. 492, pp
252-255.
Ziegler-Heitbrock L, Ancuta P, Crowe S, Dalod M, Grau V, Hart D, Leenen P, Liu Y-J,
Macpherson G, Randolph G, Scherberich J, Schmitz J, Shortman K, Sozzani S,
Strobl H, Zembala M, Austyn J, Lutz M (2010) Nomenclature of monocytes and
dendritic cells in blood. In: Blood, vol. 116, pp e74-e80.
Zong S, Zeng G, Wei B, Xiong C, Zhao Y (2012) Beneficial effect of interleukin-1 receptor
antagonist protein on spinal cord injury recovery in the rat. In: Inflammation, vol.
35, pp 520-526.
Zörner B, Schwab ME (2010) Anti-Nogo on the go: from animal models to a clinical trial.
In: Ann N Y Acad Sci, vol. 1198 Suppl 1, pp E22-34.
Zozulya A, Clarkson B, Ortler S, Fabry Z, Wiendl H (2010) The role of dendritic cells in
CNS autoimmunity. In: Journal of Molecular Medicine, vol. 88, pp 535-544.
Zujovic V, Benavides J, Vigé X, Carter C, Taupin V (2000) Fractalkine modulates TNF-
alpha secretion and neurotoxicity induced by microglial activation. In: Glia, vol. 29,
pp 305-315.
top related