spettroscopia di assorbimento e fluorescenza
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assorbimento molecolareuna molecola può assorbire una radiazione (λ) solo se nella molecolaesiste una transizione di corrispondente energia
λ=ν=
hchE
c = 3x108 m/sech = 6.63x10-34 Jsec
la legge di Beer - Lambert
• variazioni dei coefficienti di assorbimento ad alte concentrazioni (>10mM)a causa delle interazioni elettrostatiche tra molecole vicine;
• scattering di luce (torbidità, particelle in sospensione, ~ 1/λ4);• contributi di fluorescenza o fosforescenza;• variazioni di indice di rifrazione ad alta concentrazione;• spostamento degli equilibri chimici in funzione della concentrazione;• contributi non monocromaticità (più affidabile il massimo della banda);• luce di fondo.
I0 I
cammino ottico l
sostanzaconcentrazione c
0II T arasmittanzt =
cl IIlog logT- A 0
ε=
−==
deviazioni:
250 300 350 400 450 5000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4as
sorb
anza
lunghezza d'onda
strumentazione
Assorbanza (A) A = log10 (I0/I)
A=3 I0 = 1000 IA=2 I0 = 100 IA=1 I0 = 10 I
% Transmission (%T) %T = I/IoA = log10 (1/T)
I0 Iz II-dI
dzz l
significato fisicoN = c NAV /1000 = molecole/cm3
r = raggio molecole
P = probabilità assorbimento luce incidente
σ = Pπr2 = sezione d’urto
A
dz N IdI z σ−= dz N IdI
σ−=
∫∫ σ−=l
0
I
Idz N
IdI
0l N IlnIln 0 σ−=−
l c /1000)(N l N IIln AV0
σ=σ=
−
=
−
00 II2.303log-
IIln
l c 03/1000)/2.3(N IIlog- AV0
σ=
l c A IIlog- 0
ε==
03/1000)/2.3(N AVσ=ε
I0 Iz II-dI
dxz l
significato fisicoN = c NAV /1000 = molecole/cm3
σ = sezione d’urtoA
dx N IdI σ−=
l N IlnIln 0 σ−=−
l c /1000)(N l N IIln AV0
σ=σ=
−
=
−
00 II2.303log-
IIln
l c 03/1000)/2.3(N IIlog- AV0
σ=
l c A
IIlog- 0
ε==
03/1000)/2.3(N AVσ=ε
3x10910-29scattering Raman
3x1010-19infrarosso
3x10410-16molecole
3x10810-12assorbimento atomi
ε(M-1cm-1)
σ(cm2)
1 GM = 10-50 cm4sec
assorbimento multi-fotoni
10-84 cm6sec2
www.drbio.cornell.edu/MPE
σ2 ÷ σ1 ∆x ∆t
∆x ≈ σ1 ≈ 10-17–10-16 cm2
∆t ≈ 10-16 sec
σn ÷ σ1n ∆tn-1
alcune sezioni d’urto a 2 fotoni
sonde convenzionali
indicatori del calcio
proteine fluorescenti
sezione d’urto a due fotoni
il picco di assorbimento si trova spesso ad una λ doppia rispetto al
picco a singolo fotone..
es.: cumarina
.. e spesso no!
es.: rodamina
assorbimentosingolo fotone(asse x per 2)
probabilitàassorbimento
2 fotoni
responsabili assorbimento nelle proteine..
Wavelength (nm)
E x
10-
4
1. alfa elica (pH 11, 25°C)
2. random (pH 6, 25°C)
3. beta sheet (pH 11, 52°C)
Wavelength (Å)
D. Hamdane et al, J. BIOL. CHEM Vol. 278, No. 51, pp. 51713–51721, 2003
TNB anione ε412 =13.6 mM-1 cm-1
analisi della reattivita’ dei gruppi SH via DTNB5,5-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid)
neuroglobina umanacitoglobina umanacitoglobina zebrafish
mioglobina
TNBS-STNB+SCys STNB+TNBS-SCys
TNB carbossilato ε420 = 190 mM-1 cm-1
la luce puo’ indurre transizionitra gli stati elettronici di una molecola
molecola nellostato fondamentale
molecola nellostato eccitato
fotone
fotone
fluorescenza di biomolecole
diagramma di Jablonskiassorbimento 10-15 sfluorescenza 10-12-10-7 sfosforescenza 10-2-101 s
NRR
R
qciicR
R
kkk
)Q(kkkkk
+=
+++=φ
regola dello specchio
lo spettro di emissioneè un’immagine specularedello spettro di assorbimento
i livelli S0 e S1 presentanostrutture vibrazionali simili
1kk
kRNRR
R <ττ
=+
=φ
kR
…
emabs PP)(F ⋅÷λ
d)(f ⋅λ⋅φ
II0 −
Cl)(303.20
sabeII λε−=
[ ]Cl)(303.21II sab0 λε−=
se εCl < 0.05
0sab0 ClI)(303.2II λε=−
KIC)(f)()(F 0abs ⋅⋅⋅λ⋅φ⋅λε=λ
linearenellaconcentrazione
non è una misura assoluta
parametri sperimentali
lampada appropriata per l’intervallo di lunghezze d’ondadi interesse
correzione per lo spettrodella lampada
parametri sperimentali
ampiezza fenditure monocromatore
risoluzione spettrale
scelta accurata dei filtri di eccitazione ed emissione
• spettri (effetti circondario)
• tempi di vita della fluorescenza
• polarizzazione (orientazione e dinamica)
• trasferimento eccitazione (distanze -> dinamiche)
• localizzazione della fluorescenza
proprietà misurabili con la fluorescenza
studio del folding1. apoazurin2. ribonuclease T13. staphylococcal nuclease4. glucagon
Eftink MR, Methods Biochem Anal, 1990.
human antithrombin
PGW Gettings, Univ Illinois
trpacidic residueshydrophobic res
Mehager JL et al., J Biol Chem, 1998.
Alexa 488 - actin (Ar ion 488 line)Texas Red-X - lectin ( green helium-neon 543 line)Hoechst 33342 - nucleus. (violet diode 405 line)
riconoscere i componenti cellulari..
Rat Diaphragm Smooth Muscle Tissue
Rat Brain Hippocampus Sagittal Thin (8-Micrometer) Section
Alexa 568 - vimentin intermediate filamentAlexa 488 - glial fibrillary acidic proteinDRAQ5 - nucleus
Adherent Rat Thoracic Aorta Smooth Muscle Cell
Alexa 568 - tubulinSYTOX Green - nucleusAlexa 350 - actin
Adherent Rat Kangaroo Kidney Epithelial Cell
Cy2 - cytokeratinMitoTracker Red CMXRos - mitochondrial network DAPI - nucleus
Adherent Normal Tahr Ovary (HJ1.Ov) Epithelial Cell
Alexa Fluor 488 - actinMitoTracker Red CMXRos - mitochondriaHoechst 33342 - nucleus
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