t.c. sağlık bakanlığı türkiye halk sağlığı...
Post on 17-Jun-2019
225 Views
Preview:
TRANSCRIPT
T.C. Sağlık BakanlığıTürkiye Halk Sağlığı Kurumu
Yersinia pestis'inYüksek Duyarlılıklı
Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay (LAMP) ile Moleküler Tanısı
Bekir Çelebi, Alparslan Ceritli, Selçuk KILIÇ
Türkiye Halk Sağlığı Kurumu, Ulusal Biyoterör Tanı Laboratuvarı2
T.C. Sağlık BakanlığıTürkiye Halk Sağlığı Kurumu
VEBA
1) Ağrılı hassas bölgesel LAP “bubo”2) Pnömonik (akciğer) Veba3) Septisemik Veba
İnsandan bulaşma ve yüksek mortalite İdeal biyolojik harp maddesi
Hızlı, güvenilir ve risk içermeyen tanı (Moleküler Tanı)1) Y. pestis YPF/YPR 3a (41.7-kb Y.pestis –spesifik bölge ) 276 bp2) Y. pestis Caf 1 (Kapsüler 1 antijen) 517 bp
Klinik tablo
3
Radnedge L et al. Identification of nucleotide sequences for the specific and rapid detection of Yersinia pestis. Appl Environ Microbiol. 2001 Christensen DR et al. Detection of biological threat agents by real-time PCR: comparison of assay performance on the R.A.P.I.D., the LightCycler, and the Smart Cycler
Yersinia pestis’in oluşturduğu fatal seyirli akut bir enfeksiyon
3. KLİMUD Kongresi 18-22 Kasım 2015, Antalya
T.C. Sağlık BakanlığıTürkiye Halk Sağlığı Kurumu
AmaçYersinia pestis’in tanısı için moleküler tabanlı tanı kitinin
geliştirilmesi
Biyolojik Harp Maddeleri’nin (BHM) sahada tanısı (Çevresel örnek) Klinik tanıda kullanım olanağı
Kullanım Alanı
Tek bir cihazda; Enzimatik yöntemle tek basamakta DNA’sının eldesi PCR reaksiyonunun tek bir döngüde gerçekleştirilmesi
Gerçek zamanlı bulanıklık /floresans izlemi (Görsel tanımlama)
LAMPisotermal Nükleik Asid
Çoğaltma
3. KLİMUD Kongresi 18-22 Kasım 2015, Antalya4
Hızlı Kolay uygulanabilirBasit UcuzGüvenilir
T.C. Sağlık BakanlığıTürkiye Halk Sağlığı Kurumu
Yp LAMP Primerset 1-3
Analiz
•Y.pestis ve diğer Yersinia sp.
Primer Seçimi:
Y.p 3a primer set No: 3
6
MATERYAL-YÖNTEM:LAMP primer dizaynı ve en iyi primerin seçimi
3. KLİMUD Kongresi 18-22 Kasım 2015, Antalya
3a
T.C. Sağlık BakanlığıTürkiye Halk Sağlığı Kurumu
MATERYAL
• RSKK 375,376,377, 168• NCTC 10329,10029 & 2868• Y. Pestis (Ins. Pasteur) • RSKK 195 (California)
1. Yersinia spp.(Y. enterocolitica; Y.pseudotub., Y. aldovae; Y. frederiksenii; Y. intermedia; Y. kristensenii)
2. Yersinia dışı GNB ve GPB(A.baumannii; Alcaligenes sp. B.anthracis;C.freundii; Enterobacter sp; E. faecalis; E. coli;H.influenzae; Klebsiella sp.; P.mirabilis;P.aeruginosa; S.enterica; S.flexneri;S.maltophilia; S.marcescens; S.aureus;S.epidermidis; GABHS)
3. Y.Pestis içermeyen klinik örnek (n=20)4. Y.Pestis içermeyen çevresel örnek (n=10)
1. Y.pestis içeren klinik örnek (n=50)2. Y.pestis eklenmiş ‘Toprak’ (n=5)3. Y.pestis eklenmiş ‘Su ‘(n=5)4. Tavşan Karaciğer dokusu (n=4)
1. Y.pestis içeren klinik örnek (n=50)2. Y.pestis eklenmiş ‘Toprak’ (n=5)3. Y.pestis eklenmiş ‘Su ‘(n=5)4. Tavşan Karaciğer dokusu (n=4)
Analitik Duyarlılık - Saptama Limiti (LOD) ÖZGÜLLÜK (n= 24 bakteri)
Simüle örnek
3. KLİMUD Kongresi 18-22 Kasım 2015, Antalya 7
T.C. Sağlık BakanlığıTürkiye Halk Sağlığı KurumuT.C. Sağlık BakanlığıTürkiye Halk Sağlığı Kurumu
Balgam(n=10)
Balgam(n=10)
Lenf aspiratı(n=20)
Y. pestis (+) Simüle Örnek
Kan (n=20)Kan (n=20)
Y.
pes
tis
108
CFU
/mL
Y.
pes
tis
pla
smid
ko
ntr
ol
105 CFU /mL
104 CFU /mL
103 CFU /mL
500 CFU /mL
250-100-50-25-10-5-4-2-1
Enzimatikyöntemle
ekstraksiyon
MATERYAL-2
T.C. Sağlık BakanlığıTürkiye Halk Sağlığı Kurumu
9
Rxn 25 µL GspSSD DNA Polimeraz(Sarmal yer değiştirme aktivitesi)
LAMP (Genie II, Optigene, UK) Hızlı çoğaltma (< 30 dk) melting curve analizi Portatif (pille çalışma ve 2 kg) Tümleşik ekran USB ile kolay veri aktarımı floresan ve lüminesan işlemi
desteklemesi
LAMP Çalışması
T.C. Sağlık BakanlığıTürkiye Halk Sağlığı Kurumu
10
‘MELT CURVE’ ANALİZİ
LAMP Amplifikasyonlar
3. KLİMUD Kongresi 18-22 Kasım 2015, Antalya
BULGULAR
T.C. Sağlık BakanlığıTürkiye Halk Sağlığı Kurumu
11
SYBR Green ve (GspM 2.0 LF DNA polimeraz)
1. Amplikon; % 2.0 Jel elektroforez2. Sekans
1. SYBR Green içermeyen örnekler
2. SYBR Green içeren örnekler
3. UV-transillüminatör SYBR içeren
Bulgular-2
T.C. Sağlık BakanlığıTürkiye Halk Sağlığı Kurumu
LAMP
Kültür Simüle Örnek†
Çevresel Örnek†
Y.Pestis(n=8)
Yersinia sp. & Diğer Bakteriler
(24 bakteri28 örnek )
Kan#
(n=20)LAP
(n=20)Balgam
(n=10)KC
(n=4)Toprak
(n=5)Su
(n=5)
Sonuç Pozitif Negatif Poz Poz Poz Poz Poz Poz
Saptama Sınırı* 1 Negatif 10 2 2 2-5 10 1
12
CFU† Simüle örneklerden DNA eldesi için enzimatik yöntem ile spin kolonlu ekstraksiyon yöntemi karşılaştırılmıştır.#Kandaki saptama sınırı için kullanılan DNA ekstraksiyon yöntemi ve kan miktarı belirleyicidir.
BULGULAR-3
Y.pestis (-) 20 simüle klinik ve 10 çevresel örnek NegatifY.pestis (-) 20 simüle klinik ve 10 çevresel örnek Negatif
3. KLİMUD Kongresi 18-22 Kasım 2015, Antalya
T.C. Sağlık BakanlığıTürkiye Halk Sağlığı Kurumu
31
Bu sonuçlara göre, LAMP PCR yönteminin duyarlılığı (ve özgüllüğü) %100 olarak bulunmuştur.
PCR
Saptama Sınırı (LOD)*
Kültür Kan LAP Balgam KC Toprak Su
Konvansiyonel Yp- 3a PCR 50 1000 100 100-250 100 1000 100
In-house Yp-Pla RT-PCR < 5 25 25-50 25 25 50 5
In-house Yp- Caf1 RT-PCR 2 25 25 20 20 50 5
LAMP 1 10 2 2 2-5 10 1
*CFU
3. KLİMUD Kongresi 18-22 Kasım 2015, Antalya 13
BULGULAR-4
T.C. Sağlık BakanlığıTürkiye Halk Sağlığı Kurumu
BULGULAR-5Analiz Süresi ve Test Maliyeti
YöntemDNA ekstraksiyonu
Çoğaltma süresi Toplam İşlem
ZamanıToplam Maliyet#
(Test)Otomatize Manual
Konvansiyonel 30 dk > 3 saat 4 saat 4.5 - 8.0 saat 30
RT-PCR 30 dk > 3 saat 60-75 dk >1.5 - 4.5 saat 70
LAMP 10 dk 30 dk 40 dk (< 1 saat) 20-30
# Ekstraksiyon dahil
3. KLİMUD Kongresi 18-22 Kasım 2015, Antalya 14
T.C. Sağlık BakanlığıTürkiye Halk Sağlığı Kurumu
SONUÇ…
Biyoterörist saldırılarda ve endemik bölgelerde;klinik ve çevresel örneklerde kullanılma potansiyeli olduğu
kanısına varılmıştır.
Analitik
Avantajlar
Sonuç & Yorum
Yüksek duyarlılık ve özgüllük
LAMP yönteminin duyarlılığı RT-PCR yönteminden daha yüksek.
Basit (tek bir cihazda DNA izolasyonu ve amplifikasyonunyapılabilmesi),
Kolay uygulanabilir (analizin iki aşamada yapılabilmesi),Hızlı (toplam analiz süresi ≈ 45 dakika)EkonomikCihaz ve deneyimli personel olmadan uygulanabilme potansiyeli
153. KLİMUD Kongresi 18-22 Kasım 2015, Antalya
top related