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Técnica de CGH-array

María Rodríguez-Rivera Laboratori de Citogenètica Molecular. Servei de Patologia. Hospital del Mar. Programa de Càncer-IMIM. Barcelona

• Introducción a los microarrays

• Arrays genómicos

• Condiciones del ADN

• Técnica de CGH-array

• Aplicaciones

Índice

Introducción

• ¿Qué es un microarray?

• Tipos de microarrays

Introducción

• ¿Qué es un microarray?

• Tipos de microarrays

• Mikro (del griego,pequeño) y array (del inglés,distribución ordenada)

• Colección de biomoléculas ordenadas en filas y columnas sobre un soporte sólido miniaturizado.

Introducción: ¿Qué es un microarray?

Introducción

• ¿Que es un microarray?

• Tipos de microarrays

• Tejido (TMA)

• Proteínas

• Células

• Genómicos

• Expresión

• miRNA

• Metilación

Introducción: Tipos de microarrays

• Tejido (TMA)

• Proteínas

• Células

• Genómicos

• Expresión

• miRNA

• Metilación

Introducción: Tipos de microarrays

Microarrays genómicos

Microarrays genómicos

• Colección de sondas de ADN dispuestas sobre un soporte sólido que permiten detectar alteraciones en el genoma

• Tipos de microarrays genómicos:

– Arrays de CGH (Comparative Genome Hybridization)

– Arrays de SNP (Single Nucleotide Polymorphism)

Microarrays genómicos

• Colección de sondas de ADN dispuestas sobre un soporte sólido que permiten detectar alteraciones en el genoma.

• Tipos de microarrays genómicos:

– Arrays de CGH (Comparative Genome Hybridization)

– Arrays de SNP (Single Nucleotide Polymorphism)

• Array de “oligos” comerciales:

- Oligonucleótido: secuencias pequeñas de ADN 50pb

- Agilent TechnologiesTM, NimbleGen (RocheTM), BlueGnomeTM

- Diferentes formatos

- Microarrays “prefabricados” o custom

• Array de BACs:

- BAC: Bacterial Artificial Chromosome

- Puede ser “casero”

- Perkin ElmerTM, BlueGnomeTM

Microarrays genómicos: Arrays de CGH

Microarrays genómicos: Arrays de CGH

• Estudio de hibridación comparativa (ADN tumoral vs ADN control) que permite detectar ganancias y/o pérdidas de material genético

Microarrays de CGH

Microarrays genómicos

• Colección de sondas de ADN dispuestas sobre un soporte sólido que permiten detectar alteraciones en el genoma.

• Tipos de microarrays genómicos:

– Arrays de CGH (Comparative Genome Hybridization)

– Arrays de SNP (Single Nucleotide Polymorphism)

Microarrays genómicos: Arrays de SNPs

• Contiene además sondas de oligonucleótidos

correspondientes a variantes alélicas de SNPs seleccionados

(oligoarray).

• SNP ( Single nucleotide polymorphism ):

- Variación de la secuencia de ADN que afecta a una

sola base

- 1 SNP cada 1000 bases

Microarrays genómicos: Arrays de SNPs

• Permite obtener el número de copias de ADN y el

genotipo (señal de fluorescencia para cada alelo)

• Hibridación no competitiva:

- La muestra problema y control (si disponible) se hibridan

en arrays independientes

- Posterior comparación de resultados

Microarrays de SNP

Microarrays genómicos: Arrays de SNPs

Pérdida de heterocigosidad sin cambio en el número de copias (CNN-LOH)

Importancia en genes supresores de tumores:

mutación heterocigota mutación homocigota

Genes supresores de tumores: p53

Mutación p53

Proliferación células anormales

CGH SNP Hibridación competitiva Hibridación no competitiva

Muestra y control en Muestra y control se hibridan

un mismo array por separado

Ganancias y pérdidas Ganancias y pérdidas

LOH

CGH vs SNP

• No detecta alteraciones equilibradas

• No detecta diferentes clones

• >30% células tumorales

CGH y SNP:Limitaciones

Protocolo técnico

arrays CGH

• ADN:

– Sangre periférica o médula ósea • Separación de poblaciones celulares (microbeads)

– Tejido en fresco

– Tejido congelado (OCT) • Micro-Macrodisección del tumor

– Parafina • Micro-Macrodisección del tumor

Microarrays genómicos: ADN

• Extracción automatizada

• Extracción manual

– Kits columnas

– Kit manual

ADN: Tipos de extracción

• Extracción automatizada

• Extracción manual

– Kits columnas

– Kit manual

ADN: Tipos de extracción

Preparación ADN

Marcaje

Hibridación

Lavados y secado

Escaneado

Análisis de datos

• Cantidad ADN:

– 500ng

• Calidad ADN:

– Espectofotómetro

ADN: Criterios de calidad

• Espectofotómetro: NanoDrop 1000

ADN: Criterios de calidad

• Ratio ADN/ARN (A260/280) > 1.80

• Ratio ADN/alcoholes, fenoles (A260/230) > 1.80

Concentración

• Integridad ADN

ADN: Criterios de calidad

ADN no degradado ADN degradado (smear)

Preparación ADN

Marcaje

Hibridación

Lavados y secado

Escaneado

Análisis de datos

Marcaje del ADN

ADN tumoral

ADN control

Desnaturalización

Marcaje

Cy5 -dUTP Cy3 -dUTP

Marcaje del ADN

• Marcaje aleatorio (Random Priming)

Marcaje del ADN

• Marcaje aleatorio (Random Priming)

Marcaje del ADN

• Marcaje aleatorio (Random Priming)

Marcaje del ADN

• Marcaje aleatorio (Random Priming)

• Preparación del array e hibridación (muestra y control)

Hibridación

Muestra (Cy5)

Control (Cy3)

Hibridación

• Unimos el mixer con el array

Hibridación: Preparación del array

• Pipeteamos la muestra dentro del mixer

Hibridación

• Horneado

Hibridación

48-72h

Preparación ADN

Marcaje

Hibridación

Lavados y secado

Escaneado

Análisis de datos

• Lavados de astringencia

Lavados y secado

• Secado

Preparación ADN

Marcaje

Hibridación

Lavados y secado

Escaneado

Análisis de datos

• Plataforma MS200 NimbleGen, ROCHE TM

Escaneado del array

Preparación ADN

Marcaje

Hibridación

Lavados y secado

Escaneado

Análisis de datos

• Se obtiene una imagen con la lectura de los dos fluorocromos (Cy3 y Cy5)

• Se genera un archivo por cada fluorocromo para poder analizar en forma de datos

Visualización de datos

Análisis

ADN tumoral > ADN control

Ganancia

ADN tumoral < ADN control

Pérdida

ADN tumoral = ADN control

Normal

• Software para la visualización de los datos

• Análisis paralelo con tablas de datos

Análisis de datos

• Software para la visualización de los datos

• Análisis paralelo con tablas de datos

Análisis de datos

Análisis de datos: Principios

Sonda

Cromosoma Ideograma Cariotipo molecular

Análisis visual: Ejemplos

DEVA

Análisis visual: Ejemplos

Nexus

Análisis visual: Ejemplos

Nexus

Ganancia

Pérdida

• Software para la visualización de los datos

• Análisis paralelo con tablas de datos

Análisis de datos

Análisis datos: Ejemplos

Nº sondas: > 5 Log2 Ratio: < - 0.2 (Pérdidas) > 0.2 (Ganancias)

Aplicaciones arrays genómicos

• Oncohematología – Diagnóstico

– Pronóstico

– Investigación

• Post-natal y Pre-natal – Síndromes asociados a ganancias/pérdidas de material genético:

• Deleciones: ej síndrome de Cri-du-chat (5p-)

• Aneuploidias: +21 (Sd.Down), +13 (Sd.Patau), +18 (Sd.Edwards), +X/Y (Sd.Turner, …)

• Alteraciones en genes asociados a retraso mental y autismo

– Nuevos síndromes

Aplicaciones arrays genómicos

• Estudio de carcinomas de células renales (CCR) mediante arrays de CGH y cariotipo – N=24

• 16 CCR de células claras

• 5 CCR papilares

• 2 CCR cromófobos

• 1 Oncocitoma

• Tejido fresco: – Estudio citogenético

– Extracción ADN

Aplicaciones arrays genómicos: Ejemplos

Poster SEAP- 081. M.Salido

CCR-CC: Citogenética

45,X,add(X)(p28),der(1)t(1;1)(p36;q12),del(3)(p14),-14

CCR-CC: CGH-arrays

CCR-CC: CG vs CGH-arrays

• Buena herramienta complementaria

• Diferentes formatos

• Limitaciones

• Coste cada vez menor

Resumen

Laboratori de Citogenètica Molecular. Servei de Patologia. Hospital del Mar. Programa de Càncer-IMIM. Barcelona

Agradecimientos: Dra.Blanca Espinet Dra.Marta Salido Dra.Anna Puiggros Carme Melero Dra.Silvia de Muga Dra.Nuria Juanpere Dr.Josep Lloreta Dr.Josep Mª Corominas Prof.Sergi Serrano

Agradecimientos: