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Universidad Nacional de Tucumán Área 7: Agronomía y Zootecnia Comité Académico de AUGM: Medio Ambiente
INCIDENCIA DE LA INOCULACIÓN EN Pinus taeda L. CON HONGOS ECTOMICORRÍCICOS PROVENIENTES DE DOS ZONAS DE LA PROVINCIA DE TUCUMÁN, ARGENTINA*
Ale, M. de los A., Borrás, M. M., Caldez, L. B. y Weht, R. S. *Financiado con proyecto CIUNT 403. e-mail: maritiu20@hotmail.com
Palabras claves: micorriza, forestales, vivero
Palabras claves en portugués: micorriza, floresta, berçário
Cuartas Jornadas de Jóvenes Investigadores UNT - CONICET Tucumán, 22, 23 y 24 de Junio de 2010
INTRODUCCIÓN Pinus taeda L., conífera es originario del sudeste de Estados Unidos. Esta clase de
pino puede desarrollarse en varias condiciones edáficas, suelos superficiales o profundos,
pedregosos, arenosos o arcillosos, humíferos o pobres (Edwin & Nimmo, 1987). Los pinos
presentan un excelente crecimiento y en ellos debe asegurarse la presencia de micorrizas.
Las micorrizas son asociaciones de hongos con las raíces y define la íntima asociación entre
el sistema radical de las plantas y un hongo especializado. En las pináceas, predomina la
formación de ectomicorrizas (ECM). Éstas son importantes para las plantas, ya que por
medio de ellas, pueden obtener mayor cantidad de nutrientes del suelo (Harley & Smith,
1983; Trappe, 1963; Kottke, 1992). Las ECM se desarrollan en raíces cortas y activas en
vez de las raíces laterales estructurales, largas y de consistencia leñosa; se caracterizan por
la cubierta fúngica o manto que envuelve a las raíces activas; a menudo el micelio fúngico, o
crecimiento de moho en forma de fibra, puede ser visto emergiendo directamente del manto
y colonizando el suelo o el sustrato de enraizamiento. Las hifas penetran en el córtex radical
del huésped a varias profundidades, formándose entre los espacios de las células más
externas una red de hifas muy compacta llamada "Red de Hartig" (Martins de Azevedo,
1989). En ella se realiza el intercambio de los nutrientes y el agua entre el hongo y el
hospedante; el hongo capta y libera los nutrientes y el agua hacia su hospedante, recibiendo
a cambio azúcares y otros productos de la fotosíntesis generados por la planta. Este sitio es
considerado el de mayor intercambio de nutrientes entre el hongo y el hospedero (Agüero,
2002). Los hongos micorrícicos producen sustancias que modifican morfológicamente la
raíz y derivan en las ramificaciones dicotómicas cortas de las raíces. Los hongos que forman
las ectomicorrizas pertenecen a los Phyla Basidiomycota y Ascomycota.. Características
como color, presencia de micelio, espesor, ramificación de la raíz, y la ausencia de pelos
radicales son todas indicativas de ECM. En el presente trabajo, se fijaron como objetivos: 1) Relevar en campo la presencia-ausencia de hongos asociados a Pinus taeda. 2) Aislar y
multiplicar cepas de hongos medios de cultivo. 3) Identificar los hongos 4) Preparar
inoculantes. 5) Inocular plantines de Pinus taeda en vivero. 6) Determinar la incidencia de la
inoculación.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se tomaron muestras de hongos al azar en bosques con Pinus taeda L. de
plantaciones comerciales en dos sitios; uno en una propiedad privada (Peñalba-Arias),
ubicada en Villa Padre Monti (VPM), Dpto. Burruyacu, y otro ubicado en San Javier, Dpto.
Yerba Buena, ambos Tucumán. Se realizaron muestreos de carpóforos. El material
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recolectado se procesó en el laboratorio de Microbiología Agrícola, FAZ, UNT. Se estudiaron
las especies fúngicas teniendo en cuenta características microscópicas y macroscópicas.
A nivel microscópico, se extrajeron esporas sexuales de los carpófors; se montaron
entre porta y cubreobjeto en PVLG (alcohol polivinílico en lactoglicerol) como medio de
montaje y en PVLG + Melzer. Se les hicieron mediciones micrométricas. Se observaron en
microscopio fotónico en luz clara y con contraste de fase. Se realizaron registros fotográficos
de las observaciones con cámara digital Canon montada en microscopio Carl Zeiss modelo
Axiostar Plus.
A nivel macroscópico se midieron los carpóforos con un calibre Vernier y se usaron
claves taxonómicas para su identificación (Guzmán, 1970; Kuo, 2004). Los carpóforos se
lavaron con agua corriente estéril y se eliminaron restos de suelo. Se desinfectaron
superficialmente con NaHClO al 4% durante un minuto y se colocaron en agua destilada
estéril helada para detener el efecto del agente desinfectante. Trozos de himenio sin
esporas, peridio y rizoides se sembraron en placas de Petri con medio de cultivo Melin
Norkrans modificado (MNM) a pH 5,8 (adicionado con benomyl (Metil-1-(butilcarbamoil)
bencimidazol-2-il carbamato (10 mg/l), para controlar hongos no micorrícicos, sulfato de
estreptomicina (100 mg/l) y cloranfenicol (100mg/l) para controlar bacterias. Las placas se
incubaron a 26 ºC 20 días. Se preparó una suspensión de micelio en medio MNM líquido
proveniente de: a) cultivo de peridio de carpóforos proveniente de VPM en medio MNM, a
los 30 días de incubación en estufa (25º C) b) cultivo de rizoides de carpóforos provenientes
de SJ en medio MNM sólido adicionado con benomyl y antibióticos, a los 30 días de
incubación en estufa (25°C). Porciones de los mismos en crecimiento se repicaron a medio
MNM líquido. Se mantuvieron en agitación 15 días a temperatura ambiente para estimular el
crecimiento miceliar del hongo. Luego ambas suspensiones fueron procesadas en licuadora
para disgregar el micelio.
La suspensión inoculante fue estandarizada, para lo cual se determinó el peso húmedo del
micelio, para ello se tomaron 10 ml de la suspensión miceliar; se filtraron con papel de filtro
estéril, previamente pesado en cámara de flujo laminar; se pesó el papel de filtro con el
micelio retenido. Antes de la aplicación del inóculo miceliar se realizaron las siguientes
determinaciones en los plantines: 1) presencia/ ausencia de estructuras típicas de hongos
micorrícicos: se tomaron muestras de raicillas y se observaron en microscopio óptico y 2)
longitud de la parte aérea: se identificó cada planta y se midió la altura de todos los plantines
implicados en el tratamiento. Se utilizaron 56 plantines de P. taeda seleccionados al azar y se realizaron 6
tratamientos con inóculos miceliares de VPM y SJ, como puede observarse en la Tabla N° 1.
Luego de remover el suelo que contenía los plantines, se efectuó la inoculación por regado
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con ayuda de una pipeta estéril con diferentes volúmenes. Todos los plantines presentaron
distinto tamaño y estaban implantados en suelo agrícola (no esterilizado) como sustrato, en
contenedores individuales proporcionados por el vivero “La Pépinière” situado en la
provincia de Tucumán, Argentina. El bioensayo se desarrolló en invernadero.
Tabla Nº 1. Establecimiento del ensayo en invernadero con un diseño completamente al azar. Fitopatología, FAZ, UNT. 2009.
Zona Tipo de Inoculación Cantidad de plantines inoculados Tratamiento Diseño
Experimental 8 O I4D10 8 P I4D20
1 VPM
Peridio de hongo 1 en MNM liquido
8 Q I4P15 8 R I5D10 8 S I5D20
2 SJ
Rizoide de hongo 2 en MNM liquido
8 T I5P15 Testigo
Agua corriente 8 U T20
Los parámetros que se evaluaron con el fin de estudiar el desarrollo de la inoculación
en los plantines de Pinus taeda fueron:1) presencia-ausencia de estructuras características
del hongo ectomicorrícico en las raicillas de los plantines tratados con las suspensiones
miceliares y de los testigos a los 30 y 60 días. 2) determinación del porcentaje de
colonización por el método de intersección de líneas (Giovanetti & Mosse, 1980). Se
explora con un microscopio a lo largo de las líneas realizadas a una misma distancia en el
portaobjetos para cuantificar las intersecciones entre líneas en el portaobjetos y raíces, que
son designadas, ya sea como colonizados o no micorrizadas.
N° de muestras = 25 raicillas; Z= lecturas en el
punto de intersección de la línea y la raíz
4 líneas x 25 raicillas = 100 lecturas en la
intersección de líneas;
(+) raicillas colonizadas: se designa a la
presencia de hifas, y/o puntas de raicillas
modificadas por ECM. RESULTADOS
En la Tabla Nº 2 se describen las características macroscópicas y microscópicas de
las observaciones realizadas en los hongos ECM recolectados y en sus esporas.
Referencias: I4 e I5: Inóculo; D: Dilución 1/100; P: Puro; T: Testigo; 10: 10 ml; 15: 15 ml 20: 20 ml; Tratamientos: O equivale a (I4D10) Inóculo 4 procedente de peridio de un hongo 1 de VPM con dilución 10-2, cantidad inoculada de 10 ml; P equivale a (I4D20) Inóculo 4 procedente de peridio de un hongo 1 de VPM con dilución 10-2, cantidad inoculada de 20 ml; Q equivale a (I4P15) Inóculo 4 procedente de peridio de un hongo 1 de VPM sin diluir, cantidad inoculada de 15 ml; R equivale a (I5D10) Inóculo 5 procedente de rizoide de un hongo 2 de VPM con dilución 10-2, cantidad inoculada de 10 ml; S equivale a (I5D20) Inóculo 5 procedente de rizoide de un hongo 2 de VPM con dilución 10-2, cantidad inoculada de 20 ml; T equivale a (I5P15) Inóculo 5 procedente de rizoide de un hongo 2 de VPM sin diluir, cantidad inoculada de 15 ml y U equivale al testigo (T) sin inocular al que se adicionó 20 ml de agua corriente.
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Tabla Nº 2. Características macroscópicas y microscópicas de los hongos recolectados en dos sitios con P. taeda en Tucumán. Laboratorio de Microbiología Agrícola, FAZ, UNT.2009
Sitios de estudio
Características
VPM hongo 1 SJ hongo 2 SJ hongo 3
Característica de los esporocarpos
subgloboso sésil superficie del peridio: blanquecina a alutácea (color de cuero), con escamas pequeñas, de forma irregular, y de color café oscuro. contextura del peridio: delgado y maduro, 1 mm en parte superior; 2 mm en parte inferior. himenio o gleba: gris acero. dehiscencia: irregular a través de grietas en la parte apical del peridio.
subgloboso sésil. superficie del peridio: marrón amarillento, con escamas pequeñas. contextura del peridio: delgado y maduro, 0,5 mm en parte superior; 0,6 mm en parte inferior. himenio o gleba: gris acero. dehiscencia: irregular a través de grietas en la parte apical del peridio.
con sombrero y pedicelo con forma campanulada de superficie lisa y margen ondulado y curvado hacia arriba en algunos casos. color del sombrero: ámbar. estipe: central, relleno y de consistencia carnosa y liso. color del estipe: blanco amarillento. láminas: abundantes y finas.
Dimensiones de los esporocarpos(mm)
alto: 23,2 ancho: 31,4
espesor: 12,1
alto: 15,2 ancho: 24,1
espesor: 19,8
sombrero: longitudinal:27,3
perpendicular: 30,3
Dimensiones de las esporas (µm) 12,5 (± 3) 12,5 (± 3) 9,5 (± 2)
Características de las esporas en
PVLG equinuladas y reticuladas
con ornamentaciones
equinuladas y reticuladas con
ornamentaciones
equinuladas parcialmente reticuladas
Reacción de las esporas con Melzer
marrón amarillento (no amiloidea)
marrón amarillento (no amiloidea)
bordes azules y clara por dentro (amiloidea)
Referencias: VPM: campo Peñalba-Arias (Villa Padre Monti); SJ: campo privado (San Javier)
En base a las características macro y microscópicas obtenidas de los esporocarpos
recolectados en los sitios de estudio, se pudieron identificar 3 tipos de hongos asociados a
P. taeda. En VPM y SJ se detectó una misma especie perteneciente al género Scleroderma;
su clasificación taxonómica es la siguiente:
Reino: Fungi Phylum: Basidiomycota
Clase: Basidiomycetes
Orden: Sclerodermatales
Familia: Sclerodermacea
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Género: Scleroderma
Especie: Scleroderma bovista
Scleroderma bovista es un hongo epígeo y gregario en los sitios de toma de muestra
de los dos bosques. En el segundo sitio se encontró además una segunda especie, su
identificación no pudo dilucidarse exactamente, pero se estima que se trata del género
Russula sp. y su clasificación taxonómica es la siguiente:
Reino: Fungi
Phylum: Basidiomycota
Clase: Basidiomycetes
Orden: Russulales
Familia: Russulaceae
Género: Russula
Los hongos pertenecientes a SJ y sus esporas se muestran en las figuras N° 1 y 2.
El resultado de la siembra de peridios de esporocarpos de VPM en medio MNM, a los 30
días de incubación en estufa (25º C), mostró desarrollo de micelio. Las siembras de rizoides
en medio MNM (sólido) provenientes de SJ mostraron crecimiento positivo a los 30 días. Los
mismos se repicaron a medio MNM líquido pH 5,8. Las placas sembradas en medio MNM
Fig. N° 1. Esclerodermas de SJ y sus esporas. A- esporocarpos de Scleroderma bovista de SJ de contextura corchosa a más o menos dura en el laboratorio; B, C y D- esporocarpos con peridio escamoso por agrietamiento en la parte apical, escamas pequeñas y de forma irregular; E- masa de esporas esféricas, equinuladas y reticuladas de SJ de color marrón amarillenta con Melzer; F- espora de Scleroderma bovista medida con ocular micrométrico (100x), incluyendo las espínulas.
Fig. N° 2. Esporocarpos de Russula sp. y sus esporas. A- vista del cerro San Javier (SJ); B- Esporocarpos de Russula sp. encontrados en SJ en el laboratorio antes de ser procesados; C- masa de esporas esféricas, equinuladas y parcialmente reticuladas, de bordes azules con Melzer; E- espora de Russula sp. medida con ocular micrométrico (100x).
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con Russula sp de SJ, mostraron crecimiento positivo recién a los 60 días de incubación a
25°C. Los cultivos de peridios de SJ en el mismo medio presentaron crecimiento miceliar
positivo luego de 2 semanas. Las cepas aisladas se mantienen pura. El resultado del
desarrollo de los hongos ECM puede observarse en la fig. N° 3.
Fig. N° 3. Desarrollo miceliar de la siembra de peridio de Scleroderma bovista de VPM y de rizoides de Scleroderma bovista de SJ en medios de cultivo artificiales. A- desarrollo miceliar en medio MNM (sólido); B- repique de la cepa aislada a medio MNM (sólido); C- repique luego de 5 días a medio MNM (líquido) Laboratorio de Microbiología Agrícola, FAZ, UNT. 2009.
Raicillas de plantines de P. taeda se observaron en microscopio óptico antes de su
inoculación y se confirmó la ausencia tanto de colonización micorrícica como de otros
hongos. Se midió la longitud de la parte aérea de los plantines antes de la inoculación; los
resultados indicaron heterogeneidad en el tamaño de los mismos. Para la estandarización
de la suspensión inoculante se determinó el peso húmedo de la misma a partir de micelio de
peridio de Scleroderma sp de VPM que fue de 58 g de micelio/1000 ml de medio de cultivo;
y a partir de micelio de rizoide de Scleroderma sp de SJ fue de 81 g de micelio/1000 ml de
medio de cultivo. A los 30 días del tratamiento de inoculación se tomaron muestras de
raicillas de los distintos plantines y se constató la presencia de colonización. Las
modificaciones típicas de hongos ECM (raíces modificadas en color, longitud, aumento de
tamaño, dicotomía, entre otras) se complementaron con registros fotográficos como
muestran las figuras N° 4 de raicillas de P. taeda inoculados con suspensión miceliar
(www.deemy.de). Las características de las raicillas de los plantines inoculados con inóculo
miceliar y sin inocular se describen en la Tabla N° 3. En los testigos no se observó
colonización ECM.
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Fig. N° 4. Raicillas de P. taeda inoculados con suspensión miceliar. A- tratamiento R con textura granulada (g) y enredada (e) con hifas emanantes puntuales (pu); B- tratamiento T con ramificación dicotómica (d) con textura granulada (g); C- tratamiento S con parte distal del ápice cilíndrica (c) ehifas emanantes (h); D- tratamiento S co forma del ápice tortuso (t); E- tratamiento R con punta del ápice de color amarillenta (a) e hifas emanantes (h) y F- testigo sin signos de ramificación (nr). Laboratorio de Microbiología Agrícola, FAZ, UNT. 2009.
Tabla N° 3. Características de raicillas de plantines inoculados con suspensión miceliar y testigo sin
inocular. FAZ, UNT. 2009
Características O, P, Q, R, S y T Testigo U Ramificación dicotómica o irregular dicotómica
Textura (superficie del manto) granulada, verrucosa, algodonosa o fibrosa
aterciopelada
Forma del ápice tortuoso, retorcida, doblado o constreñida
doblada
Morfología de la parte distal del ápice cilíndrica o punta afilada cilíndrico
Color de la punta del ápice amarillento o blanco blanco amarillento
Color de la parte basal de la raíz ocre ocre
Abundancia del sistema micorrícico abundante solitario
Distribución de las hifas homogéneo o desde la punta concentrada distalmente
no se observa
Rizomorfos ausentes/presentes ausentes
Morfología del cordón miceliar puntual, perpendicular o abanico no se observa
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Determinación del porcentaje de colonización Observaciones al microscopio de raicillas montadas luego de la decoloración y
tinción (Phillips & Hayman, 1970), mostraron la presencia de estructuras bien desarrolladas
del tipo ECM. Los valores de colonización obtenidos a partir de inoculantes miceliares se
muestran en la figura N° 5. Los resultados que se exponen en la figura N° 5 A, muestran que
el porcentaje de colonización obtenido del inóculo 4 respecto del testigo U es mayor; el
tratamiento inóculo 4 puro 15 ml (I4P15) mostró mayor colonización en comparación a los
tratamientos inóculo 4 diluidos (I4D20 e I4D10), aunque los inóculos 4 diluido 10 y 20 ml
presentaron una colonización superior al 50%. El porcentaje de colonización obtenido del
inóculo 5 respecto del testigo U es mayor; el tratamiento de inóculo 5 diluido 10 ml (I5 D10)
fue mayor que los inóculos 5 diluido 20 ml (I5 D20) e inóculo 5 puro 15 ml (I5 P15), como se
observa en la figura N° 5 B. El porcentaje de colonización de raicillas con el inóculo miceliar
de rizoide proveniente de Scleroderma bovista de SJ mostró un comportamiento errático y
diferente a los otros tratamientos. Este micelio obtenido de un órgano de absorción y
nutrición es diferente al micelio obtenido de tejido del peridio de Scleroderma bovista VPM
(esporocarpo) que es un tejido promotor de la formación de esporas que luego generarán un
nuevo micelio. Los resultados mostraron que el inóculo 4 dio óptimos resultados en
contraste con los obtenidos del inóculo 5. El I4P15 de VPM logró mayor porcentaje de
colonización de raicillas (61,76 %) a diferencia del mismo tratamiento a partir del inóculo 5,
I5P15 (37,5 %).
Los plantines testigos U mostraron ausencia de colonización en comparación con los
tratados.
Fig. N° 5. Resultados obtenidos con los inóculos miceliares de VPM y SJ. A- Error estándar: ± 1,3 y B- Error estándar: ± 6,8. Laboratorio de Microbiología Agrícola, FAZ, UNT.2009.
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CONCLUSIONES
1) Las cepas inoculadas de Scleroderma bovista y Russula sp. son promisorias como
componentes nativos de esta especie introducida y adaptada a los ecosistemas de la
provincia. 2) Los plantines micorrizados están mejor preparados para minimizar el estrés
propio del trasplante e iniciar la exploración del suelo respecto a los no micorrizados. 3) El
porcentaje de micorrización obtenido con el inóculo Scleroderma bovista VPM miceliar
diluido 1/100 y dosificado 20 ml por planta es el más adecuado y económico. 4) Se
establece que Scleroderma bovista, hasta ahora, es el hongo más adecuado para su uso
biotecnológico en P. taeda en VPM y SJ en vivero, tanto en su uso como inóculo miceliar
como por la cantidad de carpóforos frescos que pueden cosecharse en campo para la
formulación de otro tipo de inóculo.
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