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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO GRANDE DO NORTE – UERN
FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE - FACS
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO - PROPEG
PROGRAMA MULTICÊNTRICO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR - PMBqBM
PAULO VICTOR PEREZ MAIA
ATIVIDADE ACARICIDA DE EXTRATO E LECTINAS DE Moringa oleifera
SOBRE Tetranychus urticae
Mossoró-RN
2018
PAULO VICTOR PEREZ MAIA
ATIVIDADE ACARICIDA DE EXTRATO E LECTINAS DE Moringa oleifera
SOBRE Tetranychus urticae
Dissertação apresentada ao Programa Multicêntrico de Pós-Graduação em Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade do Estado do Rio Grande do Norte - UERN, como um dos pré-requisitos para obtenção do grau de Mestre em Bioquímica e Biologia Molecular. Orientadora: Profa. Dra. Michele Dalvina Correia da Silva
Mossoró-RN
2018
Catalogação da Publicação na Fonte. Universidade do Estado do Rio Grande do Norte.
M217a Maia, Paulo Victor Perez ATIVIDADE ACARICIDA DE EXTRATO E LECTINAS
DE Moringa oleifera SOBRE Tetranychus urticae. / Paulo Victor Perez Maia. - Mossoró, RN, 2018. 68p.
Orientador(a): Profa. Dra. Michele Dalvina Correia da Silva.
Dissertação (Mestrado em Programa de Pós-Graduação em Bioquímica e Biologia Molecular). Universidade do Estado do Rio Grande do Norte.
1. ácaro fitófago. 2. lectina acaricida. 3. Atividade acaricida. 4. ácaro rajado. 5. Moringa oleifera. I. Silva, Michele Dalvina Correia da. II. Universidade do Estado do Rio Grande do Norte. III. Título.
PAULO VICTOR PEREZ MAIA
ATIVIDADE ACARICIDA DE EXTRATO E LECTINAS DE Moringa oleifera
SOBRE Tetranychus urticae
Dissertação apresentada ao Programa Multicêntrico de Pós-Graduação em Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade do Estado do Rio Grande do Norte - UERN, como um dos pré-requisitos para obtenção do grau de Mestre em Bioquímica e Biologia Molecular. Orientadora: Profa. Dra. Michele Dalvina Correia da Silva
Aprovado em 08/06/2018
BANCA EXAMINADORA
Profª. Dra. Michele Dalvina Correia da Silva (Orientadora) Universidade Federal Rural do Semiárido - UFERSA
Prof. Dr. Maurício Sekiguchi de Godoy (Membro Externo) Universidade Federal Rural do Semiárido – UFERSA
Profª. Drª. Patrícia Batista Barra Medeiros Barbosa (Membro Externo)
Universidade do Estado do Rio Grande do Norte - UERN
AGRADECIMENTOS
Agradeço em primeiro lugar à minha orientadora Professora Doutora Michele
Dalvina Correia da Silva, pela compreensão, ajuda e disponibilidade, durante
todo o período de duração do mestrado.
Agradeço também ao Professor Doutor Maurício Sekiguchi de Godoy, pela
colaboração importantíssima e fornecimento de seu laboratório para a realização
dos experimentos.
Agradeço à empresa TopBio que forneceu material possibilitando o
desenvolvimento dos experimentos.
Agradeço à minha família por ter me dado apoio durante o período do mestrado.
Agradeço aos meus amigos próximos, que considero irmãos, Allison Guilherme,
Hedilberto Barros, Jefferson Rodrigues e Paulo Vidal, pelo grande apoio dado às
fases difíceis da vida. Agradeço também ao meu grande amigo Iuri Bessa.
Agradeço à minha amiga Danielly Medeiros, uma pessoa excepcional que
sempre me apoiou.
Agradeço aos meus amigos Carlos Silveira, Karina Paiva, Luciano Lira, grandes
biotecnologistas, com futuros brilhantes pela frente. Agradeço à Hionne Mara,
uma pessoa maravilhosa, muito prestativa.
Agradeço à amizade valiosa de Jocileide Marinho e suas dicas sobre a pós-
graduação. Agradeço também a amizade importante de Rackel Hipólito, Ravi
Dias e Luzia Mendes, principalmente pelos encontros semanais, sempre
aliviando as tensões.
Agradeço aos colegas de laboratório, principalmente Galdino e Alricélia pela
grande ajuda nas montagens dos experimentos e na criação do ácaro rajado.
Agradeço a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior –
CAPES e à Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular – SBBq.
Sou eternamente grato a todos que participaram direta ou indiretamente da
minha formação. Muito obrigado.
“A educação é a arma mais poderosa
que você pode usar para mudar o
mundo”
Nelson Mandela
RESUMO
O Tetranychus urticae, conhecido como ácaro rajado, é uma espécie de ácaro fitófago, polífago e cosmopolita, se alimentando de mais de 1200 espécies vegetais. A alimentação de T. urticae causa o amarelecimento, necrose e queda das folhas de seus hospedeiros, consequentemente queda da produtividade e grandes prejuízos econômicos. Atualmente seu controle se dá principalmente por acaricidas químicos e ácaros predadores. Os acaricidas químicos apresentam desvantagens, como o efeito residual nos frutos, promoção de pragas resistentes e inespecificidade, causando danos a organismos benéficos e a trabalhadores do campo. Portanto, a busca por novos biopesticidas se torna necessária para um manejo integrado de pragas mais eficiente. As lectinas são proteínas de origem não imunológica que apresentam sítios de ligação à carboidratos, possibilitando uma ligação reversível à carboidratos livres, glicoconjugados ou porções glicídicas ligadas à superfície celular. Lectinas obtidas a partir de sementes da Moringa oleifera (WSMoL e cMoL) têm demonstrado eficiência no controle de insetos como Nasutitermes corniger, Aedes aegypti e Anagasta kuehniella, possivelmente por interações entre lectinas e estruturas do mesêntero dos insetos ou proteases. Esse estudo observou a atividade acaricida de extrato bruto (EB) e lectinas WSMoL e cMoL sobre diferentes estágios de desenvolvimento de T. urticae. Ensaios enzimáticos in vitro foram realizados para avaliar o efeito de WSMol sobre a atividade de proteases de T. urticae. EB apresentou influência na sobrevivência de larvas e adultos de T. urticae. cMoL não foi capaz de interferir no desenvolvimento de T. urticae. WSMoL foi capaz de causar um efeito larvicida sobre T. urticae em aplicação única (23% de mortalidade) e por contaminação do disco foliar antes da adição de larvas (54,4% de mortalidade). WSMoL atrasou o desenvolvimento e causou paralisia em larvas de T. urticae; foi capaz de interagir com proteases de adultos de T.urticae, causando um aumento na atividade enzimática de tripsina, em análise in vitro; dessa forma WSMoL apresentou um potencial acaricida contra larvas de T. urticae.
Palavras-chave: ácaro fitófago; lectina acaricida; atividade acaricida.
ABSTRACT
Tetranychus urticae known as spider mite, it is a cosmopolitan polyphagous phytophagous specie, feeding on more than 1200 plant species. As consequence from feeding of the spider mites the hosts suffers yellowing of their leaves, necrosis or even full defoliation, causing great loss of productivity and economic damages. Nowadays the control of spider mite infestations are based mainly in the use of chemical acaricides and mite predators. The chemical acaricides have significant disadvantages as residual effect on fruits, non-specificity and emergence of resistant mites. In this context, the search for new biopesticides becomes a necessity for integrated pest management efficiency. Lectins are proteins of non-immunological origin that have carbohydrate binding sites, enabling reversible bindings with free carbohydrates, glycoconjugates or glycide portions of cell surface. Moringa oleifera lectins (WSMoL and cMoL) had efficacy on the control of Nasutitermes corniger, Aedes aegypt and Anagasta kuehniella, possibly by interactions from lectins and their midgut structures or their proteases. Therefore, the present study evaluated the acaricidal effect of crude extract (CE), WSMoL and cMoL against T. urticae different development stages. In vitro enzymatic assays were performed to evaluate the effect of WSMol on the activity of T. urticae proteases. CE had effects on the survival rates of larval stage and mature T. urticae. cMoL had no effect over T. urticae development. WSMoL had a larvicidal activity against T. urticae in a single spray (23% mortality), and with foliar disc contamination before larval alocation (54,4% mortality). WSMoL delayed T. urticae larvae development and had a paralysis effect against T. urticae larvae; also promoted an increase in trypsin activity from T. urticae females; so WSMoL has a potential acaricidal activity against T. urticae larvae. Keywords: phytophagous mite; acaricidal lectin; acaricidal activity
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Fêmea adulta de T. urticae .............................................................. 15
Figura 2: Ciclo biológico do ácaro rajado. ....................................................... 16
Figura 3: Morangueiro infestado por ácaro rajado. .......................................... 18
Figura 4: Esquema de aglutinação de eritrócitos por lectina. .......................... 26
Figura 5: Folhas e frutos de Moringa oleifera. ................................................. 30
Figura 6: Taxa de eclosão de T. urticae em bioensaio ovicida após 7 dias da
aplicação dos tratamentos................................................................................ 40
Figura 7: Taxa de mortalidade de larvas de T. urticae em bioensaio larvicida de
aplicação única após 48h da aplicação dos tratamentos. ................................ 41
Figura 8: Tempo de desenvolvimento de fases imaturas de T. urticae em
bioensaio larvicida de aplicação única. ............................................................ 43
Figura 9: Taxa de mortalidade de larvas de T. urticae para o bioensaio larvicida
com contaminação total dos discos foliares, após 72h da aplicação dos
tratamentos. ..................................................................................................... 46
Figura 10: Tempo de desenvolvimento de T. urticae para o bioensaio larvicida
com contaminação total dos discos foliares. .................................................... 47
Figura 11: Taxa de mortalidade de ácaros adultos de T. urticae após 72h da
aplicação dos tratamentos para bioensaio com adultos. .................................. 50
Figura 12: Atividade de proteases totais de ácaros adultos de T. urticae em
presença e ausência de WSMoL. ..................................................................... 52
Figura 13: Atividade de tripsina de ácaros adultos de T. urticae em presença e
ausência de WSMoL. ....................................................................................... 53
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Taxa de mortalidade e eficiência agronômica para o bioensaio
larvicida de aplicação única.............................................................................. 45
Tabela 2: Taxa de mortalidade e eficiência agronômica para o bioensaio
larvicida com contaminação total dos discos foliares. ...................................... 49
Tabela 3: Taxa de mortalidade de ácaros adultos de T. urticae e eficiência
agronômica de abamectina e extrato bruto para o bioensaio com adultos. ..... 51
Sumário
1 REVISÃO DA LITERATURA ......................................................................................... 13
1.1 ÁCAROS .................................................................................................................... 13
1.1.1 TAXONOMIA DOS ÁCAROS ......................................................................... 13
1.1.2 CARACTERÍSTICAS GERAIS ....................................................................... 13
1.1.3 Tetranychus urticae .......................................................................................... 14
1.1.4 CONTROLE DE Tetranychus urticae ............................................................ 19
1.1.4.1 CONTROLE QUÍMICO .................................................................................... 19
1.1.4.2 CONTROLE ALTERNATIVO .......................................................................... 21
1.2 LECTINAS .................................................................................................................. 25
1.2.1 CONCEITO E CLASSIFICAÇÃO ................................................................... 25
1.2.2 LECTINAS COM AÇÃO CONTRA PRAGAS ............................................... 27
1.3 Moringa oleifera ......................................................................................................... 29
1.3.1 LECTINAS DA Moringa oleifera ..................................................................... 30
2. OBJETIVOS ...................................................................................................................... 32
2.1 OBJETIVO GERAL ................................................................................................... 32
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................... 32
3 MATERIAIS E MÉTODOS .............................................................................................. 33
3.1 OBTENÇÃO DE EXTRATO E LECTINAS DAS SEMENTES DA Moringa
oleifera .................................................................................................................................... 33
3.2 BIOENSAIOS ACARICIDAS ................................................................................... 34
3.2.1 OBTENÇÃO DE Tetranychus urticae ............................................................ 34
3.2.2 CRIAÇÃO E MANUTENÇÃO DE Tetranychus urticae ............................... 34
3.2.3 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL ............................................................. 35
3.2.4 BIOENSAIO OVICIDA ..................................................................................... 35
3.2.6 BIOENSAIO COM ADULTOS......................................................................... 37
3.3 ENSAIOS ENZIMÁTICOS ....................................................................................... 38
3.3.1 ATIVIDADE DE PROTEASES TOTAIS ........................................................ 38
3.3.2 ATIVIDADE DE TRIPSINA .............................................................................. 38
3.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA .......................................................................................... 39
4 RESULTADOS E DISCUSSÂO ..................................................................................... 40
4.1 BIOENSAIO OVICIDA .............................................................................................. 40
4.2 BIOENSAIO LARVICIDA ......................................................................................... 41
5.3 BIOENSAIO COM ADULTOS ................................................................................. 50
5.4 ENSAIOS ENZIMÁTICOS ....................................................................................... 52
5.4.1 ATIVIDADE DE PROTEASES TOTAIS E TRIPSINA ................................. 52
6. CONCLUSÃO ................................................................................................................... 55
REFERÊNCIAS ........................................................................................................................ 56
13
1 REVISÃO DA LITERATURA
1.1 ÁCAROS
1.1.1 TAXONOMIA DOS ÁCAROS
Lamarck separou os ácaros dos insetos em 1801, quando classificou os
artrópodes em quatro grandes grupos: Cirripedia, Crustacea, Arachnida e
Insecta. Em classificações mais recentes, os ácaros passaram a pertencer ao
reino Animalia, filo Arthropoda, sub-filo Chelicerata, classe Arachnida e
subclasse Acari. Dentro da classe Arachnida, os ácaros apresentam um maior
número de espécies, sendo animais de grande importância médica e econômica
(HICKMAN et al., 2003; MORAES; FLECHTMANN, 2008).
1.1.2 CARACTERÍSTICAS GERAIS
Morfologia
O corpo do ácaro é denominado de idiossoma, e este é subdividido em
quatro partes: o gnatossoma é a região onde abriga quelíceras e palpos; o
propodossoma abriga os dois primeiros pares de pernas anteriores; o
metapodossoma é a região onde abriga os dois pares de pernas posteriores; o
opistossoma é a região posterior ao último par de pernas dos ácaros (MORAES;
FLECHTMANN, 2008).
O formato do corpo desses animais é bastante variável, podendo ser
achatados, vermifomes ou ovoides. Estes animais também apresentam
estruturas chamadas de setas, que são órgãos sensoriais espalhados pelo
idiossoma e apêndices (MORAES; FLECHTMANN, 2008).
Os ácaros diferem dos demais aracnídeos por não apresentarem
segmentação nem subdivisões do corpo em tagmas, pela presença de
gnatossoma e presença de apenas três pares de pernas em seu primeiro estágio
móvel (MORAES; FLECHTMANN, 2008).
Reprodução e Desenvolvimento
De maneira geral, a reprodução dos ácaros normalmente se dá pela
fertilização da fêmea de forma direta, através da introdução do esperma no
oóporo da fêmea com o auxílio das quelíceras, palpo ou primeiro par de pernas,
14
ou pela introdução do esperma nos poros de introdução espermática das
fêmeas, por meio de estruturas sexuais masculinas, como o edeago ou o
espermatodáctilo. Ácaros também apresentam reprodução por partenogênese
telítoca (quando o ovo dá origem a fêmeas), arrenótoca (quando o ovo dá origem
a um macho) e em poucos casos deuterótoca (quando o ovo dá origem a machos
e fêmeas) (EVANS, 1992; MORAES; FLECHTMANN, 2008).
Os ácaros normalmente são ovíparos, mas a ovoviviparidade também é
comum. A larviparidade é observada em poucas espécies. Os ácaros
normalmente se desenvolvem em quatro estágios, a partir dos ovos: larva,
protoninfa, deutoninfa e adulto. A larva do ácaro normalmente apresenta três
pares de pernas, é livre e ativa, capaz de buscar seu alimento. A protoninfa,
assim como a larva, busca seu alimento. Esta difere da larva por normalmente
apresentar quatro pares de pernas. A deutoninfa apresenta as características
gerais não-sexuais dos adultos, diferindo destes no padrão de esclerotização e
e no tamanho (o adulto é maior e mais esclerotizado). Os ácaros levam de três
dias a semanas ou meses para completar o seu desenvolvimento de ovo a
adulto. Fatores como umidade, temperatura, luz e alimento podem ser
determinantes durante o seu desenvolvimento (MORAES; FLECHTMANN,
2008).
Alimentação
Quanto à alimentação, os ácaros apresentam uma grande variedade em
seus hábitos. Estes podem ser predadores, fitófagos, detritívoros, e podem se
alimentar de bactérias e nematoides (MORAES; FLECHTMANN, 2008).
Os ácaros fitófagos, como os da família Tetranychidae, são pragas de
grande importância em diferentes plantações de árvores frutíferas, em que estes
podem atacar diretamente o fruto ou outros órgãos da planta (HICKMAN et al.,
2003). No Brasil, o Tetranychus urticae causa sérios danos a um grande número
de plantas hospedeiras, provocando grande impacto econômico (MORAES;
FLECHTMANN, 2008).
1.1.3 Tetranychus urticae
Características gerais
15
O tetraniquídeo T. urticae é conhecido popularmente como ácaro rajado,
também chamado de ácaro de teia (em inglês, “spider mite”). O nome “ácaro
rajado” se dá pela presença das massas alimentares nos dois primeiros pares
de cecos, dando a impressão de duas faixas negras (Figura 1) (MORAES;
FLECHTMANN, 2008). Também é conhecido como “ácaro de teia” por ser capaz
de produzir teias para a proteção de seus ovos (SANCHES; NASCIMENTO,
2000). Essa espécie apresenta grande importância econômica, pois é uma
espécie cosmopolita e polífaga (MORAES; FLECHTMANN, 2008). O ácaro
rajado se alimenta de mais de 1200 espécies vegetais, desde ornamentais à
frutíferas, muitas delas com importante impacto na economia mundial. Espécies
de grande valor econômico para o Brasil entram na lista, como o algodão, arroz,
café, cana-de-açúcar, feijão, laranja, milho, soja, tomate, trigo (MIGEON et al.,
2011). Estas culturas figuram entre as maiores produções agrícolas do país, com
produção total de 3.838.785, 12.452.662, 2.776.621, 687.809.933, 3.291.312,
18.666.928, 99.546.028, 114.982.993, 4.373.047 e 4.241.602 toneladas no ano
de 2017, respectivamente (IBGE, 2018).
Figura 1: Fêmea adulta de T. urticae
Fonte: www.promip.agr.br
Reprodução e Desenvolvimento
O T. urticae é ovíparo; suas fases de desenvolvimento passam por ovo,
larva, protoninfa, deutoninfa e adulto (Figura 2). O ácaro rajado apresenta
estágios não móveis durante a mudança de certas fases, conhecidos como
16
crisálida. Entre a fase de larva e protoninfa, o estágio é denominado de proto-
crisálida; entre as fases protoninfa e deutoninfa, o estágio é denominado de
deuto-crisálida; entre a fase de deutoninfa e adulto, o estágio é denominado de
telo-crisálida. O dimorfismo sexual no T. urticae é evidenciado, pois a fêmea
apresenta uma mancha verde escura em cada lado do dorso. A fêmea (0,46 mm)
também se diferencia no tamanho em relação ao macho (0,25 mm). O ácaro
rajado se reproduz de forma sexuada e assexuadamente por partenogênese
arrenótoca (SANCHES; NASCIMENTO, 2000; MORAES; FLECHTMANN,
2008).
O ácaro rajado apresenta um desenvolvimento rápido. Uma fêmea pode
ovipositar 50 a 60 ovos em um período de 10 dias, e o tempo de vida do ácaro
dura em média 14 dias, sendo de 4 a 5 dias na fase de ovo. A temperatura
influencia seu desenvolvimento, que é mais rápido em locais de temperatura
mais elevada (SANCHES; NASCIMENTO, 2000).
Figura 2: Ciclo biológico do ácaro rajado.
Fonte: www.promip.agr.br
Bayu et al. (2017) avaliaram o desenvolvimento do ácaro rajado em
diferentes temperaturas em Phaseolus vulgaris. À temperatura constante de 25
°C o tempo médio das fases de ovo, larva, protoninfa e deutoninfa de fêmeas
17
foram de 4,6 dias, 1,9 dias, 1,7 dias e 2,2 dias, respectivamente. Dessa forma o
tempo de desenvolvimento de ovo à adulto foi de 10,4 dias.
À temperatura constante de 35 °C, o desenvolvimento de ovo à adulto de
fêmeas do ácaro rajado foi de 5,5 dias, se tornando uma praga mais intensa em
regiões mais quentes, como o semiárido brasileiro.
Alimentação
O intestino do ácaro rajado é dividido em: anterior, médio e posterior. O
intestino anterior é composto pela boca, canal pré-faringeano, faringe e esôfago.
Este tem origem ectodérmica e possui uma cutícula quitinosa rígida. O intestino
médio é composto por um ventrículo o qual se liga a cinco cecos (três craniais e
dois caudais), colo e pós-colo, este não apresenta membrana peritrófica
(ANDRÉ; REMACLE, 1984). Este é composto por tecido endodérmico e não
apresenta membrana peritrófica. O intestino posterior é composto pelo átrio anal,
que liga o pós-colo ao ânus. Este também tem origem ectodérmica,
apresentando uma cutícula quitinosa rígida (MOTHES; STEITZ, 1981; MORAES;
FLECHTMANN, 2008).
Suas quelíceras sofreram modificações dando origem à um estilete. Dessa
forma, seu hábito alimentar é estritamente fitófago, se alimentando por meio de
seu estilete, que perfura o tecido vegetal e injeta fluídos salivares nas células;
em seguida, quando seu estilete é retraído, os fluídos celulares vão para a
superfície e são sugados pela bomba faringeal. Seu estilete atinge o mesófilo
foliar, causando danos aos cloroplastos (ANDRÈ; REMACLE, 1984; MORAES;
FLECHTMANN, 2008).
É através da alimentação que o T. urticae causa sérios danos à sua espécie
hospedeira. Esse ácaro se instala inicialmente nas nervuras mais próximas ao
pecíolo, e infesta a parte inferior de folhas mais velhas. A sua alimentação causa
o amarelecimento das folhas, seguido de necrose e perfurações. Dessa forma,
a planta pode sofrer desfolha, afetando o seu desenvolvimento, produtividade e
expondo o fruto a altos níveis de radiação solar, o que pode ocasionar escaldura,
causando impactos econômicos negativos em plantações infestadas com essa
praga (Figura 3) (TANIGOSH; DAVIS, 1978; OLIVEIRA et al., 1994; SANCHES;
NASCIMENTO, 2000; MORAES; FLECHTMANN, 2008).
18
Figura 3: Morangueiro infestado por ácaro rajado.
Fonte: www.promip.agr.br
Em 2011 seu genoma foi completamente sequenciado, e nele foram
encontrados genes relacionados à polifagia e à desintoxicação, tanto na família
de genes responsáveis por essas características, quanto entre novos genes
obtidos por transferência lateral, como genes codificantes de dioxigenases
intradiol, não reportados previamente em metazoários, onde foram anotados 16
genes funcionais presentes no ácaro, enquanto em bactérias encontra-se uma
média de 1 à 7 genes (GRBIC et al., 2011).
Jonckheere et al. (2018), demonstraram a presença de proteínas salivares
secretadas de maneira hospedeiro-dependente envolvidas na alimentação do
19
ácaro rajado, onde denominaram de SHOT (“Secreted Host-responsive protein
of Tetranychidae”).
Devido as suas características de adaptação, à fitofagia, polifagia e
consequente importância econômica, o controle de T. urticae é extremamente
necessário para produtores de plantas suscetíveis a essa praga.
1.1.4 CONTROLE DE Tetranychus urticae
1.1.4.1 CONTROLE QUÍMICO
O ácaro rajado é uma praga com poucos produtos formulados para o seu
controle. Por exemplo, para uma cultura importante para a região nordeste, como
o mamão, o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento conta com 6
princípios ativos registrados: Abamectina, Azadiractina, Fenpropatrina,
Fenpiroximato, Milbemectina e Piridabem (MAPA, 2018).
Os agrotóxicos são classificados quanto a sua toxicidade segundo o
Ministério da Saúde, orientado pela Organização Pan-Americana da Saúde,
podendo ser de nível IV (pouco tóxico), III (mediamente tóxico), II (altamente
tóxico) e I (extremamente tóxico) (OPAS, 1997).
A abamectina é um acaricida inseticida amplamente utilizado contra o ácaro
rajado. Este pertence ao grupo das avermectinas, que são metabólitos
secundários do actinomiceto Streptomyces avermitilis. Assim como a
milbemectina (milbemicina), a abamectina pertence ao grupo químico das
lactonas macrocíclicas (VALENZUELA et al., 2000). Seu modo de ação se dá
por contato e ingestão, através do aumento de fluxo de íons nos canais de cloro
da placa neuromuscular dos artrópodes, os quais são controlados por glutamato
e ácido gama-aminobutírico (GABA). Como consequência, ocorre uma
hiperpolarização das membranas nervosas, causando ataxia e morte.
A abamectina é classificada como o nível de toxicidade III, assim como a
milbemectina (ABAMECTIN NORTOX, 2017). Também existem formulações de
abamectina com o composto inseticida clorantraniliprole, que atua liberando
cálcio no músculo estriado dos insetos, causando paralisia e morte; este produto
apresenta uma toxicidade mais elevada, de nível II (VOLIAM TARGO, 2018). O
MAPA apresenta 21 produtos que possuem abamectina como princípio ativo, 19
desses são indicados para o uso contra o ácaro rajado (MAPA, 2018).
20
A azadiractina é um inseticida/acaricida/nematicida pertencente ao grupo
químico dos tetranotriterpenóides, podendo ser purificada das sementes de
Azadiractha indica (nim) ou sintetizada. Este agroquímico apresenta nível de
toxicidade III e atua na inibição do crescimento e da alimentação de insetos,
ácaros e nematoides, podendo também atuar como repelente (AZAMAX, 2018).
A fenpropatrina é um inseticida/acaricida do grupo químico dos piretróides.
Estes atuam nos canais de sódio das células neurais, causando excitação
repetitiva, podendo evoluir para uma hiperexcitação do sistema nervoso, levando
à ataxia e morte. A fenpropatrina é um piretróide do tipo 2, que apresenta um
alfa-ciano em sua composição. Os piretróides do tipo 2 são mais tóxicos que os
de tipo 1. A fenpropatrina apresenta classificação de toxicidade de nível I
(SUMIRODY 300, 2018; TALSTAR 100 CE, 2018).
O fenpiroximato e o piridabem são acaricidas dos grupos químicos pirazol
e piridazinona, respectivamente. Ambos atuam como inibidores do complexo
mitocondrial NADH-coenzima Q redutase (complexo I). Embora atuem de
maneira similar, o fenpiroximato também atua como inseticida e é classificado
no nível III de toxicidade, enquanto o piridabem pertence ao nível II (ORTUS 50
SC, 2018; SANMITE EW, 2018).
O espirodiclofeno é um acaricida que bem apresentando bons resultados
na supressão do ácaro rajado no campo; este é indicado contra outras espécies
de ácaros, como ácaro vermelho (Oligonychus ilicis), praga do cafeeiro; ácaro
da leprose (Brevipalpus phoenicis), praga do cafeeiro e do citrus; ácaro da falsa
ferrugem (Phyllocoptruta oleivora), praga do citrus; ácaro purpúreo (Panonychus
citri), praga do citrus; ácaro branco (Polyphagotarsonemus latus), praga do citrus
e do mamoeiro; ácaro da necrose do coqueiro (Aceria guerreronis), praga do
coqueiro; ácaro da macieira (Panonychus ulmi), praga da macieira; ácaro
bronzeado (Aculops lycopersici), praga do tomateiro; Tenuipalpus hevea, praga
da seringueira (MAPA, 2018).
Embora o MAPA não regulamente o uso do espirodiclofeno contra o ácaro
rajado no Brasil, este acaricida tem efetividade na inibição da eclosão de ovos
de T. urticae e é utilizado em alguns países da Europa com esse fim, como
Espanha e nos países do Reino unido (ENVIDOR, 2018a; ENVIDOR, 2018b).
O espirodiclofeno é um acaricida que afeta todos os estágios de
desenvolvimento, atua inibindo a enzima acetil-CoA carboxilase, também
21
conhecida como transcarboxilase, enzima responsável por catalisar a reação de
produção de malonil-CoA a partir da adição de uma molécula de gás carbônico
fornecida pela biotina ao acetil-CoA (DEKEYSER, 2005). Dessa forma atua no
impedimento da realização de ecdises nos estágios imaturos de T. urticae, e em
fêmeas adultas, causa uma inibição da oviposição, consequentemente o número
de ovos em seu corpo é elevado dramaticamente, alterando o seu tamanho e
peso, dificultando sua mobilidade e capacidade de se alimentar, podendo causar
a morte após dias (NAUEN, 2005).
O controle do ácaro rajado com o uso de acaricidas químicos apresenta
problemas, como impactos ambientais negativos, eliminação de organismos
benéficos, bem como a eliminação de predadores naturais (BORN, 2012). Outro
grande problema do uso de acaricidas químicos é o surgimento de pragas
resistentes. Tirello et al. (2012) descreveram a ocorrência de T. urticae
multirresistentes em casas de vegetação, na Itália; o ácaro rajado apresentou
resistência aos acaricidas abamectina, hexitiazox, clofentezina e inibidores
mitocondriais.
O uso do manejo integrado de pragas é uma estratégia utilizada para evitar
os problemas ambientais causados pelos acaricidas químicos. Nesse sistema de
produção, o foco é melhorar a qualidade do alimento e diminuir o uso de
pesticidas (FACHINELLO, 2001).
As pesquisas que buscam novas estratégias para o controle do ácaro
rajado, principalmente pela utilização de substâncias naturais, são de grande
importância para fornecer alternativas de controle aplicáveis ao manejo
integrado de pragas, diminuindo os impactos negativos causados pelo uso de
acaricidas químicos.
1.1.4.2 CONTROLE ALTERNATIVO
Predadores
Os ácaros predadores da família Phytosiidae têm sido utilizados no controle
dos tetraniquídeos. Os fitosídeos podem ser classificados quanto ao tipo de
alimentação, sendo divididos em 4 grupos (McMURTRY; CROFT, 1997).
O grupo 1 é um grupo de ácaros especialistas, caracterizados por se
alimentarem apenas de teraniquídeos do gênero Tetranychus spp. O grupo 2
22
apesar de ter preferência por ácaros do gênero Tetranychus spp., podem se
alimentar de outros gêneros de tetraniquídeos, principalmente os produtores de
teia densa. O grupo 3 é classificado como generalista, podendo se alimentar de
vários gêneros de tetraniquídeos. O grupo 4 se alimenta de diferentes ácaros,
pequenos insetos e pólen (McMURTRY; CROFT, 1997).
As espécies Phytoseiulus persimilis, P. macropilis, P. longipes, Neoseiulus
californicus são destacadas quanto à utilização para o controle do ácaro rajado.
Dentre estas, no Brasil, as espécies Neoseiulus californicus e Phytoseiulus
macropilis, têm sido utilizadas no combate ao T. urticae em diferentes cultivos
como morango, pepino e maçã (WATANABE et al., 1994; MONTEIRO, 2002;
FERLA et al., 2007; POLETTI, 2010).
O ácaro predador Phytoseiulus persimilis tem sido usado no combate do
ácaro rajado em cultivos protegidos na Europa e América do Norte (LENTEREN;
VAN WOETS, 1988; LENTEREN et al., 1992) e de campo aberto nos EUA
(McMUTRY, 1991).
O N. californicus, apesar de se alimentar de ácaros do gênero Tetranychus
spp., na falta de sua presa pode também se alimentar de pequenos insetos e
pólen. Já P. macropilis é um ácaro especialista, se alimentando exclusivamente
de tetraniquídeos do gênero Tetranychus spp. Dessa forma P. macropilis,
aplicado ao controle de T. urticae, é indicado para um nível alto de infestação,
uma vez que em uma população baixa da presa o predador tende a se dispersar.
N. californicus, aplicado ao controle de T. urticae, é indicado para os estágios
iniciais de infestação (POLETTI, 2010).
O ácaro predador Neoseiulus idaeus é uma espécie de predador que
também vem sendo utilizada no controle do ácaro rajado. É uma espécie eficaz
no combate contra T. urticae em cultivos de mamão (COLLIER et al., 2004;
COLLIER et al., 2007).
A identificação da ocorrência de ácaros predadores em plantações e suas
adjacências tem grande importância na seleção de espécies para o combate do
ácaro rajado, como demonstra o trabalho de Freitas (2014), onde o autor
identificou que a espécie de ácaro predador Neoseiulus anonymus ocorria em
plantações de morangueiro e suas proximidades, no sul de Minas Gerais, e
avaliou a eficiência do uso do predador no controle do ácaro rajado em
morangueiros, obtendo resultados positivos.
23
Insetos predadores do ácaro rajado também podem ser utilizados para
realizar seu controle. As larvas do Diptera Feltiella acarisuga, já demonstrou boa
eficiência na redução da população de T. urticae em cultura de tomate protegida
(WARDLOW; TOBIN, 1990).
Lucas et al. (2003) demonstraram a capacidade predatória de adultos dos
insetos Coccinella septempunctata e Harmonia axyridis, ambos pertencentes à
ordem Coleoptera, sobre o Hemiptera Aphis citricola e o tetraniquídeo T. urticae.
Ambos consumiram as duas presas disponíveis, porém com preferência para A.
citricola, revelando o T. urticae como uma presa alternativa para os coleópteros.
Fungos entomopatogênicos
Fungos entomopatogênicos, como Beauveria bassiana, são explorados
quanto a utilização sobre o controle do ácaro rajado. Embora seja um método
seguro, apresenta a desvantagem da falta de especificidade, podendo causar
danos à organismos benéficos, como ácaros predadores (DOGAN et al., 2017).
Dogan et al. (2017) demonstraram que cepas dos fungos
entomopatogênicos Metarhizium brunneum, Lecanicillium lecanii e Beauveria
bassiana, foram capazes de causar mais de 80% de mortalidade em indivíduos
adultos de T. urticae. Porém os fungos também causaram mortalidade nos
ácaros predadores adultos de Phytoseiulus persimilis e Neoseiulus californicus.
Outros pesquisadores veem isolando cepas de fungos entomopatogênicos,
como B. bassiana, Metarhizium anisopliae, Cladosporium cladosporioides, para
fornecer mais alternativas ao controle do ácaro rajado (ÖRTÜCÜ; ALGUR, 2017;
SHIN et al., 2017).
Mecanismos de defesa vegetal
Catalani (2015) analisou o efeito do silicato de potássio em mamoeiro; a dose
testada foi capaz de estimular a produção de substâncias de defesa na planta,
que reduziram a fecundidade e a sobrevivência da fêmea do ácaro rajado.
Os jasmonatos são homônios vegetais produzidos em resposta à lesão
vegetal mecânica ou decorrente de ataque de pragas. A liberação dos
jasmonatos estimula a síntese de biomoléculas que participam da defesa da
planta (GUNDLACH et al., 1992).
24
Maserti et al. (2011) descobriu que folhas de citrus clementina tratadas com
metil jasmonato, quando infestadas com T. urticae, foram capazes de produzir
uma maior quantidade de proteínas relacionadas à defesa vegetal, como
proteínas similares à lectina, quitinase e inibidores de proteases similares à
miraculina.
Rohwer e Erwin (2010) avaliaram a resposta do T. urticae à Impatiens
wallerana, Viola x wittrockiana e Solanum lycopersicum tratadas com metil
jasmonato, e descobriram que o tratamento induziu a dispersão do ácaro rajado.
Também foi constatado que o desenvolvimento do ácaro rajado foi mais lento
em I. wallerana e V. x wittrockiana tratadas com metil jasmonato.
Substâncias de origem vegetal
Recentemente, pesquisadores têm analisado os efeitos de óleos essenciais
sobre o T. urticae. Camara e colaboradores (2015) demonstraram o efeito
repelente sobre o ácaro rajado promovido pelos óleos essenciais de duas plantas
cítricas, a laranja lima (Citrus aurantium) e a laranja pera (Citrus sinensis). Roh
et al. (2013) demonstraram que o uso dos óleos essenciais de Eucalyptus
bicostata e Eucalyptus sideroxylm apresentaram efeito acaricida, aumentando a
mortalidade de fêmeas adultas e diminuindo o número de ovos.
Benelli et al. (2017) isolaram sesquiterpenos do óleo essencial de Smyrnium
olusatrum e avaliaram seu potencial acaricida sobre T. urticae, revelando efeito
letal em adultos, por aplicação tarsal, e também atividade ovicida dos compostos.
Apesar de óleos essenciais serem compostos naturais e apresentarem
atividade acaricida, alguns podem acabar atraindo pragas indesejadas, como
demonstraram Laborda et al. (2013); nessa pesquisa, óleos essenciais obtidos
a partir de Rosmarinus officinalis e Salvia officinalis apresentaram efeito
acaricida contra adultos e também diminuíram o número de ovos em um efeito
dose dependente, porém o óleo essencial de S. officinalis promoveu atração de
moscas adultas de Ceratitis capitata.
Nesse contexto, é importante buscar também compostos naturais
constituídos por diferentes tipos de biomoléculas, como proteínas vegetais.
Alguns pesquisadores têm utilizado extratos vegetais aquosos, que são ricos
em proteínas vegetais. Pavela (2016) realizou uma triagem de 26 extratos
aquosos vegetais e avaliou o efeito acaricida sobre T. urticae; o extrato de
25
Saponaria officinalis apresentou maiores efeitos acaricidas em menores doses.
HOLTZ et al. (2016) demonstrou o potencial acaricida do extrato aquoso
produzido a partir das sementes de Moringa oleífera contra fêmeas adultas de
T. urticae.
Inibidores de proteases apresentam atividade protetora contra T. urticae,
como demonstraram Santamaria et al. (2012b), onde linhagens de Arabidopsis
thaliana transformadas, expressando os inibidores de proteases da cevada,
inibidor de tripsina (Itr1) e cistatina (Icy6), foram mais resistentes contra
infestações de T. urticae.
Muitas lectinas têm sido utilizadas contra insetos praga (VANDENBORRE et
al., 2011), é possível que estas apresentem um potencial para o controle do
ácaro rajado.
1.2 LECTINAS
1.2.1 CONCEITO E CLASSIFICAÇÃO
As lectinas são proteínas de origem não-imunológica que possuem pelo
menos um domínio não catalítico responsável por identificar e se ligar
reversivelmente à carboidratos específicos, onde as lectinas que possuem dois
ou mais domínios de reconhecimento à carboidrato (DRC) apresentam a
capacidade de aglutinar células e precipitar glicoconjugados (Figura 4)
(GOLDSTEIN et al., 1980; PEUMANS; VAN DAMME, 1995; NÓBREGA, 2011);
um exemplo bem conhecido de lectina com mais de um DRC é a ricina, lectina
obtida a partir das sementes de Ricinus communis, que apresenta dois DRC,
onde estes reconhecem e se ligam à D-galactose, e um domínio catalítico com
capacidade de inativar a síntese proteica quando ligada ao ribossomo
(STILMARK, 1888; RUTENBER et al., 1991) .
26
Figura 4: Esquema de aglutinação de eritrócitos por lectina.
Fonte: Acervo pessoal
As lectinas podem ser classificadas de acordo com suas propriedades de
aglutinação ou precipitação de glicoconjugados, em merolectinas, hololectinas,
superlectinas e quimerolectinas (PEUMANS; VAN DAMME, 1998).
As merolectinas apresentam apenas um domínio de ligação a carboidrato
específico; dessa forma são incapazes de aglutinar células e precipitar
glicoconjugados (PEUMANS; VAN DAMME, 1998).
As hololectinas constituem o maior grupo de lectinas, estas apresentam no
mínimo dois domínios de ligação a carboidrato específico, idênticos ou similares;
portanto possuem a habilidade de aglutinar células ou precipitar glicoconjugados
(PEUMANS; VAN DAMME, 1998).
As superlectinas contêm no mínimo dois sítios de ligação a carboidratos com
especificidades distintas, permitindo a ligação a carboidratos diferentes
(PEUMANS; VAN DAMME, 1998).
As quimerolectinas possuem pelo menos dois domínios funcionais, um é
relacionado à atividade catalítica e os demais à ligação com carboidrato
27
específico. Dependendo do número de domínios de ligação a carboidrato, as
quimerolectinas podem atuar como merolectinas ou hololectinas (PEUMANS;
VAN DAMME, 1998).
Lectinas são proteínas ubíquas, podendo ser encontradas em praticamente
todos os organismos, como bactérias (ESHDAT et al., 1978), fungos
(GALLEGOS et al., 2014), animais (BELARDI; BERTOZZI, 2015) e em muitos
vegetais (RUDIGER; GABIUS, 2002). Lectinas vegetais têm sido amplamente
reveladas como moléculas biocidas contra fungos (VAZ et al., 2010), bactérias
(CARVALHO et al., 2015), vírus (ZHOU et al., 2018), protozoários (JEBALI et al.,
2014), nematódeos (RÍOS-DE ÁLVAREZ et al., 2012) e insetos praga
(OLIVEIRA et al., 2017). É possível que a habilidade de plantas se defenderem
contra ataques de pragas esteja associada às funções in vivo dessas lectinas
(VANDENBORRE et al., 2011).
1.2.2 LECTINAS COM AÇÃO CONTRA PRAGAS
As lectinas desempenham suas atividades biológicas através da habilidade
de se ligarem a carboidratos específicos (PEUMANS; VAN DAMME, 1995),
característica que as tornam proteínas de interesse pelo seu extenso leque de
aplicabilidades.
Vandenborre et al. (2011) listaram um grande número de lectinas com
atividades entomotóxicas, descrevendo famílias de lectinas com grande valor
biotecnológico, como as lectinas relacionadas a Galanthus nivalis, lectinas de
algumas leguminosas e lectinas relacionadas a heveína. A lectina purificada a
partir do bulbo de Galanthus nivalis (GNA) possivelmente é a mais estudada. A
GNA tem a capacidade de se ligar especificamente com manose presente na
região n-terminal de glicoproteínas, resíduo presente em grande quantidade em
glicoproteínas de insetos (HESTER et al., 1995; SCHACHTER, 2009). Cana-de-
açúcar, arroz, trigo, batata e tabaco são exemplos de cultivares geneticamente
modificadas para expressão de GNA, a qual promove um aumento na resistência
dessas cultivares contra pragas (VANDENBORRE et al., 2011).
McCafferty et al. (2008) introduziram o gene de expressão de GNA em um
cultivar de mamão. Com a expressão de GNA, houve a redução do número de
28
ovos e dos danos causados no mamoeiro transgênico pela alimentação do
Tetranychus cinnabarinus, quando comparado com o mamoeiro não modificado.
Lectinas purificadas a partir de leguminosas têm sido obtidas principalmente
a partir das sementes dos vegetais. Estas lectinas normalmente apresentam
especificidade para carboidratos que não estão presentes nas plantas, como o
antígeno Thomsen–Friedenreich (um dissacarídeo de galactose ligado a ácido
N-acetil neuramínico), glicoproteínas contendo galactose e/ou ácido siálico
(VANDENBORRE et al., 2011).
Powell (2001) demonstrou que a lectina ligadora de manose, purificada a
partir de Canavalia ensiformis (ConA), quando introduzida na dieta dos insetos
Tarophagous proserpina e Nilaparvata lugens, promoveu altos índices de
mortalidade; os mesmos insetos não apresentaram índices de mortalidade
significativos quando tratados com uma dieta contendo outra lectina ligadora de
manose, purificada a partir de Pisum sativum (PSA).
A maioria das lectinas relacionadas à heveína apresenta especificidade por
quitina, um polímero sintetizado por fungos, nematoides e artrópodes
(MERZENDORFER, 2006). Essas lectinas são consideradas ferramentas
biocidas seguras para os mamíferos, pois estes não apresentam quitina em sua
constituição (VANDENBORRE et al., 2011).
Sá et al. (2009) demonstraram o efeito deletério de lectinas purificadas a
partir de casca e do cerne de Myracrodruon urundeuva (MuBL e MuHL,
respectivamente) sobre larvas de Aedes aegypti. Onde o efeito deletério sobre
as larvas de A. aegypti pode ter relação com as interações específicas de MuBL
e MuHL com quitina e N-acetilglicosamina.
Napoleão et al. (2013) demonstraram o efeito inseticida de MuLL contra
Sitophilus zeamais; a lectina introduzida na dieta desses insetos promoveu altos
índices de mortalidade e atividade reduzida de enzimas digestivas, sugerindo
que o efeito da lectina se deu a partir da inibição de enzimas digestivas.
De forma geral, lectinas com diferentes especificidades a carboidratos têm
promovido ação inseticida sobre espécies de diferentes ordens; por exemplo,
lectinas glicose/manose ligantes (como a ConA e a GNA) têm ação inseticida
sobre Lacanobia oleracea (Lepidoptera), Acyrthosiphon pisum (Hemiptera) e
Myzus persicae (Hemiptera) (Fitches et al., 1997; Sauvion et al., 2004; Sauvion
et al., 1996); lectinas galactose específicas (como as lectinas de sementes de
29
Sphenostylis stenocarpa e as lectinas de folhas e raízes de Bauhinia monandra
- BmoLL e BmoRoL) têm ação inseticida sobre Callosobruchus maculatus
(Coleoptera), Zabrotes subfasciatus (Coleoptera) e Nasutitermes corniger
(Isoptera) (Machuka et al., 2000; Macedo et al., 2007; Souza et al., 2011).
O mecanismo de ação inseticida de diversas lectinas, com diferentes
especificidades a carboidratos, não está ainda claro. Mas estes e outros autores
apontam que lectinas têm sido resistentes a ação proteolítica de enzimas
intestinais de insetos (OLIVEIRA et al., 2011), e sugerem que elas (1) podem
interagir com moléculas da membrana peritrófica dos insetos, interferindo na sua
permeabilidade, promovendo consequentemente diminuição na absorção e
também perda de nutrientes (SÁ et al., 2009), ou (2) podem interagir com
enzimas digestivas interferindo em sua atividade e causando desequilíbrio
metabólico (NAPOLEÃO et al., 2013), ou ainda (3) podem ultrapassar a
membrana peritrófica e interagir com as células do epitélio intestinal,
promovendo apoptose ou impedindo absorção de nutrientes (HAMSHOU et al.,
2010). Li et al., (2009) demonstrou que após ingestão da lectina do gérmen de
trigo (WGA) pela Drosophila melanogaster houveram alterações na expressão
de genes de células do mesêntero, onde os genes alterados são relacionados a
digestão, desintoxicação, metabolismo energético, metabolismo de quitina e à
organização do citoesqueleto.
Nesse contexto, lectinas capazes de se ligar especificamente com quitina,
como as lectinas obtidas a partir das sementes da Moringa oleifera (WSMoL e
cMoL) (COELHO et al., 2009; OLIVEIRA et al., 2011), que possam ter a
capacidade de interagir com glicoproteínas presentes no intestino, ou
diretamente com o epitélio intestinal do alvo, capazes de resistir a proteases,
apresentam potencial para o controle do ácaro rajado.
1.3 Moringa oleifera
M. oleifera é uma planta originária da Ásia (PIO CORRÊA, 1984). Esta
espécie apresenta grande importância econômica, uma ampla variedade de
aplicações na alimentação pelo alto valor nutricional de folhas e sementes
(FERREIRA et al., 2008), e ainda usos medicinais, como a utilização de
sementes e raízes com atividade antiespasmódica e anti-inflamatória
30
(CÁCERES et al., 1992). É também utilizada em tratamento de água turva, a
partir da aplicação das sementes (GERDES, 1996).
A moringa apresenta diversas atividades biológicas descritas na literatura
científica, como atividade antioxidante (FALOWO et al., 2017), atividade
antitumoral (ASADUZZAMAN et al., 2018), atividade bactericida (DOUGHARI et
al., 2007), atividade cardioprotetora (RANDRIAMBOAVONJY et al., 2016),
atividade antifúngica (NETO et al., 2017), atividade hipoglicemiante (CHEN et
al., 2017), atividade inseticida (OLIVEIRA et al., 2011), atividade acaricida
(HOLTZ et al., 2016).
Figura 5: Folhas e frutos de Moringa oleifera.
Fonte: University of Florida, 2018
As sementes de M. oleifera apresentam uma grande quantidade de lipídeos
e proteínas (GALLÃO et al., 2006), entre elas se encontram as lectinas WSMoL
e cMoL (COELHO et al., 2009; OLIVEIRA et al., 2011).
1.3.1 LECTINAS DA Moringa oleifera
WSMoL (Water soluble Moringa oleifera lectin) é uma lectina com alta
solubilidade em água, sendo esta um arranjo oligomérico constituído por
subunidades de 5 kDa; em sua forma nativa tem massa molecular de 60 kDa,
31
formada por três peptídeos de massa molecular de 10, 20 e 30 kDa; apresenta
especificidade de ligação à frutose, glicose, manose, N-acetilglicosamina e
rafinose; também tem habilidade de se ligar a quitina, podendo ser purificada por
cromatografia em coluna de quitina (COELHO et al., 2009; PAIVA et al., 2011;
MOURA et al., 2016). WSMoL já apresentou atividade larvicida contra Aedes
aegypti, com uma concentração letal para 50% da população de larvas (CL-50%)
de 0,197 mg/ml (COELHO et al., 2009). WSMoL também apresentou atividade
termiticida contra Nasutitermes corniger, quando utilizada nas concentrações de
1 e 1,5 mg/ml (PAIVA et al., 2011). Oliveira et al., (2017) avaliou o efeito de
WSMoL sobre larvas de Anagasta kuehniella, observando um efeito inibitório em
sua digestão, comprovado pela diminuição do peso das larvas e ensaios
bioquímicos. Embora WSMoL tenha apresentado um efeito negativo sobre o
desenvolvimento larvar, não afetou a taxa de sobrevivência das larvas.
cMoL (coagulant Moringa oleifera lectin) é uma lectina solúvel em solução
de NaCl 0,15 M, possui uma subunidade de 26,5 kDa, com especificidade de
ligação à glicose, manose e é capaz de se ligar à quitina. Sua purificação se dá
por cromatografia em coluna de goma guar. Apresenta resistência térmica,
podendo manter sua estrutura nativa quando submetida a um aquecimento de
80 °C durante 30 min (PAIVA et al., 2011; LUZ et al., 2013). cMoL apresentou
atividade termiticida contra Nasutitermes corniger, quando utilizada nas
concentrações de 1 e 1,5 mg/ml (PAIVA et al., 2011). cMoL também apresentou
atividade inseticida contra Anagasta kuehniella, em que as concentrações 0,5%,
1% e 2% (p/v) diminuíram o ganho de peso das larvas em um efeito dose
dependente; além disso, cMoL aumentou a duração do desenvolvimento do
inseto em 15 dias e a mortalidade de pupas em 27,6%, quando administrada na
concentração de 1% (p/v). As enzimas digestivas de A. kuehniella digeriram a
lectina somente após uma incubação de 24h (uma incubação de 12h não revelou
a digestão da lectina). O efeito inseticida de cMoL foi atribuído a sua capacidade
de ligação a quitina, através da qual a lectina poderia interagir com glicoproteínas
intestinais ou até mesmo com a membrana peritrófica dos insetos (OLIVEIRA et
al., 2011).
32
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar o extrato bruto e as lectinas WSMoL e cMoL, obtidos a partir de
sementes da Moringa oleifera, quanto ao potencial acaricida sobre Tetranychus
urticae.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar a taxa de eclosão dos ovos de T. urticae expostos às lectinas
WSMoL e cMoL, obtidas a partir das sementes de M. oleifera.
Avaliar a taxa de mortalidade do extrato salino e das lectinas WSMoL e
cMoL, obtidos a partir de sementes da M. oleifera, sobre larvas de T.
urticae.
Avaliar a influência do extrato salino e das lectinas WSMoL e cMoL,
obtidos a partir de sementes da M. oleifera, sobre o desenvolvimento das
larvas de T. urticae.
Avaliar a eficiência agronômica do extrato salino e das lectinas WSMoL
e cMoL, obtidos a partir de sementes da M. oleifera, sobre larvas de T.
urticae.
Avaliar a taxa de mortalidade do extrato salino e das lectinas WSMoL e
cMoL, obtidos a partir de sementes da M. oleifera, sobre adultos de T.
urticae.
Avaliar a eficiência agronômica do extrato salino e das lectinas WSMoL
e cMoL, obtidos a partir de sementes da M. oleifera, sobre adultos de T.
urticae.
Quantificar a atividade de proteases totais e tripsina em homogenato de
ácaros adultos de T. urticae, na ausência e na presença da lectina
WSMoL.
33
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 OBTENÇÃO DE EXTRATO E LECTINAS DAS SEMENTES DA Moringa
oleifera
O extrato foi obtido a partir da farinha das sementes em solução salina (NaCl
0.15 M) 10% (p/v), com agitação magnética constante (6 h à 25 °C), em seguida
filtrado em gaze e centrifugado (8.000 rpm durante 20 min à 4 °C). O precipitado
foi descartado e o sobrenadante foi utilizado como Extrato Bruto (PAIVA;
COELHO, 1992).
A purificação das lectinas da M. oleifera se deu no Laboratório de
Glicoproteínas, pertencente ao Departamento de Bioquímica do Centro de
Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE).
WSMol foi obtida através de purificação a partir de um extrato preparado com
a farinha das sementes em água destilada 10% (p/v), com agitação magnética
(16 h à 4 °C). O extrato foi filtrado em gaze e centrifugado à 3000 x g durante 15
minutos. O sobrenadante obtido após a centrifugação foi submetido à um
fracionamento salino, utilizando sulfato de amônio em uma saturação de 60%,
em seguida a fração foi submetida à centrifugação e o precipitado foi diluído em
solução salina (NaCl 0.15 M). O precipitado ressuspendido foi dialisado contra
solução salina durante 8h à 4 °C. Em seguida a fração dialisada foi submetida à
uma cromatografia em coluna de quitina (80 mg de proteínas para uma coluna
de 18 x 1,5 cm) equilibrada em fluxo de 3 mL/min com solução salina. WSMoL
foi eluída com ácido acético 1M e dialisada contra água destilada durante 8h 4°C.
(COELHO et al., 2009; OLIVEIRA et al., 2017). A atividade hemaglutinante foi
avaliada (PAIVA; COELHO, 1992) e a concentração proteica foi medida pelo
método de Lowry (LOWRY et al., 1951).
cMoL foi obtida através de purificação a partir de um extrato preparado com
a farinha das sementes em solução salina (NaCl 0.15 M) 10% (p/v), com agitação
magnética (6 h à 25 °C). O extrato foi então submetido ao fracionamento salino
com adição de sulfato de amônio à uma saturação de 60%, durante 4 h em
temperatura ambiente. Em seguida foi centrifugado (12.000 g durante 20 min à
4 °C) e o precipitado foi submetido à diálise contra solução salina. A fração foi
então submetida à uma cromatografia em coluna de goma guar (10 mg de
34
proteínas para uma coluna de 10 x 1.0 cm) equilibrada em um fluxo de 20 mL/h
com solução de NaCl 0.1 M. cMoL foi eluída com solução de NaCl 0.3 M e
posteriormente dialisada em NaCl 0,15 M (LUZ et al., 2013). A atividade
hemaglutinante foi avaliada (PAIVA; COELHO, 1992) e a concentração proteica
foi medida pelo método de Lowry (LOWRY et al., 1951).
3.2 BIOENSAIOS ACARICIDAS
Os bioensaios acaricidas foram realizados em parceria com o Laboratório de
Seletividade de Produtos Químicos, do setor de Fitossanidade do Departamento
de Ciências Vegetais (DCV) da Universidade Federal Rural do Semi-Árido
(UFERSA).
3.2.1 OBTENÇÃO DE Tetranychus urticae
Os ácaros rajados foram coletados em mamoeiros de fazendas localizadas
nos municípios de Baraúnas – RN e Governador Dix-Sept Rosado – RN, bem
como fornecidos pela empresa TopBio Sistemas Biológicos, localizada em
Mossoró - RN.
Folhas contendo ácaros foram coletadas e postas em envelopes de papel
Kraft (18,5 cm x 24,8 cm). O material foi rapidamente transportado para o
Laboratório de Seletividade de Produtos Químicos, na UFERSA, para
identificação dos ácaros, criação e posterior realização de experimentos
(Adaptado de POLETTI, 2008).
3.2.2 CRIAÇÃO E MANUTENÇÃO DE Tetranychus urticae
Os ácaros foram mantidos em plantas de feijão-de-porco (Canavalia
ensiformes), previamente cultivadas e mantidas em casa de vegetação, no DCV
da UFERSA.
A criação dos ácaros foi realizada em ambiente laboratorial. As plantas
infestadas foram acondicionadas em estufa incubadora BOD sob condições
controladas de luminosidade (fotoperíodo de 12 h), temperatura (25 ± 2 ºC) e
umidade relativa (70 ± 10 %). As plantas foram substituídas sempre que
35
necessário para a manutenção da população; para realizar a transferência dos
ácaros, folhas das plantas infestadas foram podadas e sobrepostas às folhas
das plantas novas não infestadas (Adaptado de POLETTI, 2008).
3.2.3 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Os bioensaios foram realizados por delineamento inteiramente casualizado
constituído por grupos com 20 repetições (discos foliares) para cada tratamento,
utilizando 5 organismos para cada repetição (ovo, larva ou adulto), totalizando
100 indivíduos por tratamento.
Para o bioensaio ovicida, foram avaliados as lectinas WSMoL e cMoL, os
controles positivos espirodiclofeno e abamectina, e os controles negativos NaCl
0,15 M e água destilada.
Para o bioensaio larvicida, foram realizados dois experimentos. O primeiro
avaliou as lectinas WSMoL e cMoL, os controles positivos espirodiclofeno e
abamectina, e os controles negativos NaCl 0,15 M e água destilada. O segundo
bioensaio larvicida avaliou a lectina WSMoL e o extrato bruto, bem como os
controles negativos água destilada e NaCl 0,15 M.
Para o bioensaio com adultos foram avaliadas as lectinas WSMoL e cMoL,
que por não apresentarem resultados significativos, não foram demonstrados em
gráficos. Em um segundo experimento, o extrato bruto foi avaliado, bem como o
controle positivo abamectina e os controles negativos água destilada e NaCl 0,15
M.
As concentrações utilizadas das lectinas foram de 1 mg/ml; o extrato bruto
foi utilizado em uma concentração proteica de 16,3 mg/ml; os controles positivos,
abamectina e espirodiclofeno, foram preparados conforme as recomendações
do fabricante, 21,6 mg/L e 168 mg/L, respectivamente.
3.2.4 BIOENSAIO OVICIDA
O bioensaio ovicida foi realizado com a confecção de 20 discos foliares de
feijão de porco, para cada tratamento, cada disco com diâmetro de 0.8 cm, onde
foram dispostas 3 fêmeas adultas para a postura dos ovos, durante um período
de 8 a 12 horas. Após a postura dos ovos as fêmeas foram retiradas e em
36
seguida foram selecionados 5 ovos por disco, eliminando os demais com o
auxílio de agulha, totalizando 100 ovos para cada tratamento; os discos foram
colocados em placas de Petri de 15 cm de diâmetro e foram rodeados por
algodão umedecido para evitar a fuga dos ácaros, caso houvesse eclosão de
ovos.
Foi realizada a aplicação dos compostos a serem avaliados sobre os discos;
a aplicação dos compostos foi realizada com pulverizador pressurizado manual,
calibrado para pulverizar aproximadamente 1,5 ± 0,5 mg dos compostos por cm².
Após a pulverização, os discos foliares contendo os ovos foram transferidos para
placas de Petri de 8,0 cm de diâmetro, forradas com esponja umedecida para a
manutenção da umidade dos discos foliares e substituindo o algodão umedecido
para evitar o escape dos ácaros.
Após a transferência, as placas contendo os ovos foram acondicionadas em
câmara climatizada (BOD) sob condições controladas de luminosidade
(fotoperíodo de 12 h), temperatura (25 ± 2 ºC) e umidade relativa (70 ± 10 %)
(Adaptado de POLETTI, 2008). A avaliação se deu com o auxílio de microscópios
estereoscópios durante um período de 7 dias, com avaliações periódicas a cada
24 h após as aplicações.
3.2.5 BIOENSAIO COM LARVAS
O bioensaio larvicida foi realizado com a confecção de 5 discos foliares de
feijão de porco, com diâmetro de 4 cm, onde foram dispostas 20 fêmeas adultas,
por disco, para a postura dos ovos, durante um período de 24 horas. Após a
postura dos ovos as fêmeas foram retiradas e foi aguardada a eclosão dos ovos
para a seleção das larvas. Em seguida foram confeccionados 20 discos foliares
de feijão de porco, para cada tratamento, cada disco com diâmetro de 0,8 cm,
que foram utilizados para abrigar 5 larvas por disco, totalizando 100 larvas por
tratamento, transferidas com auxílio de pincel com cerdas finas; os discos
contendo as larvas foram colocados em placas de Petri de 15 cm de diâmetro e
foram rodeados por algodão umedecido para evitar a fuga das larvas.
Foi realizada a aplicação dos compostos a serem avaliados sobre os discos;
a aplicação dos compostos foi realizada com pulverizador pressurizado manual,
calibrado para pulverizar aproximadamente 1,5 ± 0,5 mg dos compostos por cm².
37
Após a pulverização, os discos foliares contendo as larvas foram transferidos
para placas de Petri de 8,0 cm de diâmetro, forradas com esponja umedecida
para a manutenção da umidade dos discos foliares e substituindo o algodão
umedecido para evitar o escape dos ácaros. Em um segundo ensaio, visando a
interação do ácaro com WSMoL por alimentação, os discos foram pulverizados
até serem completamente contaminados pela solução de WSMoL, e após a
secagem dos discos as larvas foram transferidas.
Após a transferência, as placas contendo as larvas foram acondicionadas
em câmara climatizada (BOD) sob condições controladas de luminosidade
(fotoperíodo de 12 h), temperatura (25 ± 2 ºC) e umidade relativa (70 ± 10 %)
(Adaptado de POLETTI, 2008). A avaliação do bioensaio larvicida se deu com o
auxílio de microscópios estereoscópios em um período de 48 h, com avaliações
periódicas em 1 h, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h e 48 h após as aplicações. A avaliação do
segundo bioensaio larvicida se deu com o auxílio de microscópios
estereoscópios em um período de 72 h, com avaliações periódicas em 3h, 6h,
12 h, 24 h, 48 h, 72 h após as aplicações. As larvas foram avaliadas como
mortas, quando as mesmas não apresentavam capacidade de se mover quando
estimuladas com pincel de cerdas finas.
3.2.6 BIOENSAIO COM ADULTOS
O bioensaio com adultos foi realizado com confecção de 20 discos foliares
de feijão de porco, para cada tratamento, cada disco com 1,2 cm de diâmetro.
Em cada disco foram abrigados 5 adultos, totalizando 100 indivíduos para cada
tratamento. Os adultos foram transferidos a partir das plantas de criação com
auxílio de pincel de cerdas finas; os discos foram colocados em placas de Petri
de 15 cm de diâmetro e foram rodeados por algodão umedecido para evitar a
fuga dos adultos.
Foi realizada a aplicação dos compostos a serem avaliados sobre os discos;
a aplicação dos compostos foi realizada com pulverizador pressurizado manual,
calibrado para pulverizar aproximadamente 1,5 ± 0,5 mg dos compostos por cm².
Após a pulverização, os discos foliares contendo os adultos foram transferidos
para placas de Petri de 8,0 cm de diâmetro, forradas com esponja umedecida
38
para a manutenção da umidade dos discos foliares e substituindo o algodão
umedecido para evitar o escape dos ácaros.
Após a transferência, as placas contendo os adultos foram acondicionados
em câmara climatizada (BOD) sob condições controladas de luminosidade
(fotoperíodo de 12 h), temperatura (25 ± 2 ºC) e umidade relativa (70 ± 10 %)
(Adaptado de POLETTI, 2008). A avaliação foi realizada em um período de 7
dias, com avaliações periódicas em 3 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h,
144 h, 168 h, após as aplicações.
3.3 ENSAIOS ENZIMÁTICOS
3.3.1 ATIVIDADE DE PROTEASES TOTAIS
A atividade de proteases de T. urticae adultos foi determinada conforme uma
adaptação das metodologias descritas por Azeez et al. (2007) e Santamaría et
al. (2015). Adultos foram coletados em pequeno volume de solução gelada de
NaCl 0,15 M. O material foi macerado e centrifugado (a 10.000 rpm, por 10 min).
O homogenato proteico obtido teve o teor de proteína total quantificado pelo
método de Lowry (LOWRY et al., 1951). O homogenato foi submetido à
quantificação de atividade de proteases totais, utilizando tampão de reação com
pH de 7,5. A quantificação de proteases totais foi realizada utilizando o
homogenato adicionado (50 µL) à solução tamponante (PBS 0.1 M ph 7.5)
contendo azocaseina a 0,6% como substrato; em seguida, Triton X-100 (100 µL)
foi adicionado e, após incubação (3 h, 37 ºC), a reação foi encerrada com 200
µL de ácido tricloroacético a 10 %. Após nova incubação (30 min, 4 ºC) seguida
de centrifugação (a 10.000 rpm, por 10min), a absorbância foi verificada (366
nm). O mesmo procedimento foi realizado na presença de WSMoL (50 µL; 1mg
mL-1). Uma unidade de atividade de protease foi definida como a quantidade de
enzima que promoveu um aumento de 0,01 na absorbância (Azeez et al., 2007).
Os ensaios foram realizados em duplicata.
3.3.2 ATIVIDADE DE TRIPSINA
39
A atividade de tripsina foi determinada por incubação (30 min, 37 °C) do
homogenato em tampão Tris-HCl, pH 8,0 (50 µL) com solução de WSMoL a 1
mg mL-1 (30 µL), Tris-HCl 0.1 M (135 µL, 120 µL ou 105 µL) e 8 mM BapNA - N-
benzoil-DL-arginil-ρ-nitroanilida (15 µL). A atividade da tripsina foi determinada
por medição de absorbância a 405 nm (Leitor de Microplacas) (KAKADE et al.,
1969). Uma unidade de atividade de tripsina foi definida como a quantidade de
enzima que hidrolisou 1 nmol de BApNA por minuto. O controle foi realizado por
incubação (60 min, 37 °C) do extrato (50 µL) com 135 µL de Tris-HCl e 8 mM de
BapNA (15 µL) (KAKADE et al., 1969). Os ensaios foram realizados em
duplicata.
3.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados obtidos nos ensaios acaricidas foram submetidos às análises
estatísticas no software Graphpad Prism®. A avaliação da eficiência dos
tratamentos foi calculada pela fórmula de Abbott (NAKANO et al., 1981); os
resultados gerados pelos ensaios biocidas e testes de eficiência foram
submetidos ao teste de normalidade e em seguida comparados pelo teste de
Kruskal Wallis a 5 % de probabilidade (THEODORSSON-NORHEIM, 1986). A
análise estatística dos dados obtidos nos ensaios enzimáticos na presença das
lectinas WSMoL foi realizada pelo teste de t-student (p<0,05) (Programa
GraphPad Prism®).
Fórmula de Abbott:
%𝐸 = {(𝑇 − 𝐼)
𝑇} ∗ 100
E= eficiência dos tratamentos em porcentagem;
T= número de insetos vivos na testemunha;
I= número de insetos vivos no tratamento.
40
4 RESULTADOS E DISCUSSÂO
4.1 BIOENSAIO OVICIDA
O bioensaio ovicida não revelou atividade significativa das lectinas cMoL
e WSMoL. O único resultado significativo (p< 0,05) foi observado com o uso do
acaricida espirodiclofeno, que inibiu em 89% a taxa de eclosão de ovos de T.
urticae (Figura 6). Abamectina também não apresentou inibição da eclosão de
ovos.
Figura 6: Taxa de eclosão de T. urticae em bioensaio ovicida após 7 dias da aplicação dos tratamentos.
ABM: abamectina; EDF: espirodiclofeno; cMoL: coagulant Moringa oleifera lectin;
WSMoL: Water soluble Moriga oleifera lectin; H2O: água destilada; NaCl: NaCl 0.15
M; Letras indicam diferença estatística quando p< 0,05.
Pottelberge et al. (2008) avaliaram a resistência do ácaro rajado ao
espirodiclofeno, expondo linhagens suscetíveis e resistentes ao agroquímico. A
linhagem resistente demonstrou forte resistência no estágio larval, porém
manteve suscetibilidade no estágio embrionário. Uma avaliação enzimática
mostrou que a resistência pode estar ligada à atividade de monooxigenases,
onde a linhagem resistente demonstrou uma atividade enzimática de citocromo
P450 monoxigenase, significativamente maior que a linhagem suscetível.
Silva et al., (2012) demonstrou que o espirodiclofeno não foi tóxico ao
ácaro predador Neoseiulus californicus, onde os ovos do predador não foram
41
inviabilizados e não foi constatada mortalidade de suas larvas. Resultado
interessante para o uso do espirodiclofeno em um manejo integrado com a
espécie de ácaro predador.
4.2 BIOENSAIO LARVICIDA
No bioensaio larvicida de aplicação única, foi observado um efeito
acaricida da lectina WSMoL, promovendo letalidade sobre larvas de T. urticae.
A taxa de mortalidade de WSMoL (23%) foi estatisticamente equivalente a taxa
de mortalidade da Abamectina (34%), onde ambas diferiram dos demais
tratamentos (p< 0,05). cMoL não apresentou atividade letal significativa (11%)
(Figura 7).
Figura 7: Taxa de mortalidade de larvas de T. urticae em bioensaio larvicida de aplicação única após 48h da aplicação dos tratamentos.
ABM: abamectina; EDF: espirodiclofeno; cMoL: coagulant Moringa oleifera lectin;
WSMoL: Water soluble Moriga oleifera lectin; H2O: água destilada; NaCl: NaCl 0.15 M;
Letras indicam diferença estatística quando p< 0,05.
Em corroboração com Pottelberge et al. (2008), o presente estudo
demonstrou baixa suscetibilidade de larvas do ácaro rajado ao acaricida
espirodiclofeno.
42
Sato et al., (2005) avaliou a resistência de T. urticae à abamectina.
Durante a seleção de linhagens suscetíveis foi determinada uma concentração
de abamectina, capaz de eliminar 50% de uma população (CL50), de 0,17 mg/L.
Linhagens resistentes foram selecionadas com uma CL50 de 58,1 mg/L.
Utilizando concentração recomendada pelo fabricante, de 21,6 mg/L, o
presente trabalho obteve uma taxa de 34% de mortalidade sobre a fase larval de
T. urticae. Onde possivelmente os ácaros utilizados apresentam alguma
resistência à abamectina.
Stumpf e Nauen (2002) demonstraram que as enzimas citocromo
oxigenases P450 dependentes e glutationa s-transferase são importantes
marcadores de resistência, uma vez que em linhagens de T. urticae resistentes
à abamectina, a atividade enzimática destas é maior quando comparadas à
linhagens suscetíveis.
Riga et al. (2014) promoveram a expressão recombinante de uma enzima
citocromo p450 (CYP392A16) de ácaros resistentes (mantidos em uma pressão
seletiva com aplicações de abamectina à 10 mg/L) e avaliaram a sua atividade
catalítica sobre a abamectina, que após uma hidroxilação, gerou um produto
menos tóxico ao ácaro rajado.
Sato et al. (2005) notaram que a resistência do ácaro rajado à abamectina
caiu após 6 meses na ausência de pressão de seleção, onde inicialmente se
tinha uma população com 75% dos indivíduos resistentes e após 6 meses a
quantidade de indivíduos resistentes caiu para 15%.
Stumpf e Nauen (2002) constataram que a resistência de uma linhagem
brasileira de T. urticae à abamectina diminuiu após 6 meses de manutenção em
laboratório, juntamente com os níveis de atividade enzimática de glutationa s-
transferase e citocromo oxigenases P450 dependente, ao passo que uma
linhagem holandesa de T. urticae manteve os níveis de resistência.
WSMoL em concentração de 1 mg/ml apresentou atividade tóxica, porém
não muito intensa. Uma forma de biodisponibilização mais adequada, como a
produção de uma planta transgênica talvez possa levar a resultados mais
eficazes.
Gatehouse et al., (1997) avaliaram o efeito da lectina de Galanthus nivalis
(GNA) sobre Lacanobia oleracea em diferentes tipos de administração, como
adição da lectina em dieta artificial, folhas de batateiro transgênico retiradas da
43
planta e alimentação direta nas folhas batata transgênica em casa de vegetação.
As três formas de biodisponibilização de GNA para L. oleracea afetaram o seu
desenvolvimento, mas apenas biodisponibilização em batatas transgênicas em
casa de vegetação afetou a sobrevivência de L. oleracea.
No bioensaio larvicida de aplicação única, também foi avaliado o tempo
que a larva levou até dar início à primeira ecdise, entrando no estágio de proto-
crisálida. Apenas a abamectina mostrou um efeito significante no atraso da
primeira ecdise (Figura 8).
Figura 8: Tempo de desenvolvimento de fases imaturas de T. urticae em bioensaio larvicida de aplicação única.
ABM: abamectina; EDF: espirodiclofeno; cMoL: coagulant Moringa oleifera lectin;
WSMoL: Water soluble Moriga oleifera lectin; H2O: água destilada; NaCl: NaCl 0.15 M;
Asterisco indica diferença estatística quando p< 0,05.
O efeito da abamectina sobre o desenvolvimento do ácaro rajado pode
ser explicado pelo efeito neurotóxico e consequente paralisia causada nas
larvas. Uma vez que o animal tem suas funções motoras prejudicadas, como
perda do movimento da bomba faringeal, este não consegue se alimentar e por
consequência não adquire nutrientes necessários para o seu desenvolvimento,
permanecendo em estágio larval por tempo prolongado (WOLSTENHOLME;
ROGERS, 2005; ABAMECTIN NORTOX, 2017).
44
O tempo de desenvolvimento do ácaro rajado pode variar de acordo com
a temperatura e hospedeiro.
Shih et al., (1976) observou que a fase larval de T. urticae durou em média
0,6 dias em Phaseolus lunatus, à uma temperatura de 27±1°C.
Moro et al., (2012) observou que a fase larval de T. urticae durou de 0,9 a
1,2 dias em diferentes cultivares de mamão, à uma temperatura de 26±1°C.
Bayu et al., (2017) observou que a fase larval de T. urticae durou em
média 1,8 dias em Phaseolus vulgaris, à uma temperatura constante de 25°.
No presente trabalho foi notado que a maioria das mudanças de fase de
larva para o estágio de proto-crisálida se deu entre 12h à 24h, com exceção do
grupo exposto à abamectina, por causa do efeito retardante sobre seu
desenvolvimento, mantendo os indivíduos de T. urticae em seu estágio larval.
Também foi avaliada a eficiência agronômica em cada avaliação, de
acordo com a fórmula de Abbot (Tabela 1). Abamectina e WSMoL apresentaram
28,26% e 16,30% de eficiência após 48 horas da aplicação. Embora tenham
apresentado baixa eficiência, foram estatisticamente diferentes (p< 0,05) dos
demais tratamentos.
45
Tabela 1: Taxa de mortalidade e eficiência agronômica para o bioensaio larvicida de aplicação única.
ABM: abamectina; EDF: espirodiclofeno; cMoL: coagulant Moringa oleifera lectin; WSMoL: Water soluble Moriga oleifera lectin; EP: erro
padrão; %E: eficiência agronômica em porcentagem; Letras indicam diferença estatística entre os tratamentos na mesma coluna, quando p<
0,05.
Assumindo que o ácaro rajado precisa ingerir WSMoL para que seu efeito tóxico seja evidenciado, é provável que a baixa
eficiência do método de biodisponibilização da lectina tenha influenciado na eficácia da sua atividade biológica. O experimento
também evidencia que WSMoL não tem alta toxicidade quando aplicada diretamente sobre o dorso do ácaro, sugerindo baixa
toxicidade por contato.
Tratamentos Tempo (horas)
1 3 6 12 24 48
ABM Média ± EP 2 ± 1,37ª 6 ± 2,55a 8 ± 2,67a 19 ± 4,46a 25 ± 4,78 a 34 ± 4,61a
%E 2 6 8 19 24,24 28,26
EDF Média ± EP 0 ± 0a 0 ± 0a 0 ± 0b 0 ± 0b 0 ± 0b 3 ± 1,63b
%E 0 0 0 0 0 0
cMoL Média ± EP 0 ± 0a 0 ± 0a 0 ± 0b 0 ± 0b 5 ± 1,98b 11 ± 3,39b
%E 0 0 0 0 4,04 2,19
WSMoL Média ± EP 0 ± 0a 0 ± 0a 2 ± 1,37b 2 ± 1,37b 6 ± 2,55b 23 ± 4,17a
%E 0 0 2 2 5,05 16,30
46
A ação acaricida de WSMoL foi intensificada no bioensaio larvicida com
contaminação total do disco foliar, onde os discos foram completamente
cobertos com a solução lectínica, e após a secagem, as larvas foram postas nos
discos. No mesmo ensaio foi avaliada a atividade acaricida do extrato salino de
M. oleifera, que também revelou atividade biocida (Figura 9).
WSMoL apresentou uma taxa de mortalidade larval de 54,4%; O extrato
bruto apresentou uma taxa de mortalidade de 38,4%.
Figura 9: Taxa de mortalidade de larvas de T. urticae para o bioensaio larvicida com contaminação total dos discos foliares, após 72h da aplicação dos tratamentos.
WSMoL: Water soluble Moringa oleifera lectin; H2O: água destilada; NaCl: NaCl 0.15
M; EB: extrato bruto; Letras indicam diferença estatística quando p< 0,05.
WSMoL já apresentou atividade inseticida contra, Aedes aegypti,
Anagasta kuehniella e Nasutitermes corniger, onde a capacidade de se ligar à
quitina foi apontado como fator importante para o desempenho da sua atividade
biológica (COELHO et al., 2009; PAIVA et al., 2011; OLIVEIRA et al., 2017).
A quitina é um alvo interessante para atividade pesticida, uma vez que é
um polímero sintetizado por fungos, nematódeos e artrópodes
(MERZENDORFER, 2006). Algumas lectinas com capacidade de ligação à
quitina têm demonstrado atividade biocida contra pragas através de diferentes
mecanismos de ação.
Lima et al. (2018) avaliou a interação de lectinas de Myracrodruon
47
urundeuva (MuBL e MuLL), enzimas digestivas de operários de Nasutitermes
corniger, descobrindo que as ambas as lectinas foram capazes de inibir a
atividade de proteases e carboidrases. Foi observada também a interação entre
MuBL e MuLL imobilizadas e proteínas de transporte apolipoforina e
transportadores ABC.
Napoleão et al. (2011) demonstrou que as lectinas de M. urundeuva
apresentaram ação antibacteriana contra bactérias presentes no intestino de N.
corniger, onde tal atividade biológica também tem importância na ação inseticida
apresentada pelas lectinas.
Chen et al. (2018) demonstrou que uma lectina ligadora de quitina, obtida
a partir de Solanum integrifolium, foi capaz de diminuir o potencial de membrana
mitocondrial em células sf21, uma linhagem celular obtida a partir de ovário de
Spodoptera frugiperda, causando assim uma inibição do crescimento celular.
No bioensaio larvicida com contaminação total do disco foliar, WSMoL foi
capaz de atrasar o desenvolvimento larvar de T. urticae, prolongando o tempo
que a larva levou para realizar ecdise (Figura 10).
Figura 10: Tempo de desenvolvimento de T. urticae para o bioensaio larvicida com contaminação total dos discos foliares.
WSMoL: Water soluble Moringa oleifera lectin; H2O: água destilada; NaCl: NaCl 0.15
M; EB: extrato bruto; Asterisco indica a diferença estatística quando p< 0,05.
48
O tempo prolongado para realizar a primeira ecdise pode estar
relacionado com um efeito paralisante promovido por WSMoL, sobre as larvas
do ácaro rajado, onde o efeito foi observado e não quantificado. O efeito
paralisante foi similar ao efeito observado em larvas tratadas com abamectina.
Efeito também descrito em outros agroquímicos como bifentrina e fenpropatrina,
compostos neurotóxicos pertencente ao grupo dos piretróides (SUMIRODY 300,
2018; TALSTAR 100 CE, 2018).
Já foi demonstrada a capacidade de WSMoL promover alterações no
intestino médio de larvas de A. aegypt (COELHO et al., 2009) e também
capacidade de diminuir a atividade enzimática de enzimas digestivas em larvas
de A. kuehniella (OLIVEIRA et al., 2017).
Oliveira et al. (2017) demonstraram que durante a digestão in vitro de
WSMoL, por enzimas digestivas de A. kuehniella, é gerado um peptídeo de peso
molecular de 10 kDa correspondente a um oligômero de WSMoL, propondo
mobilidade distinta in vivo devido a formação de diferentes arranjos oligoméricos
em condições fisiológicas, onde o oligômero de WSMoL de 10 kDa teria a
capacidade de atravessar a membrana peritrófica de A. kuehniella e
desempenhar função tóxica às células do epitélio intestinal (MOURA et al.,
2016).
Se uma forma oligomérica de WSMoL for capaz de atravessar o epitélio
intestinal e atingir a hemolinfa, esta pode ser destinada a qualquer parte do corpo
do animal e desempenhar sua função tóxica, visto que os tetraniquídeos
apresentam um sistema circulatório lacunar, onde todos os órgãos são banhados
pela hemolinfa (MORAES; FLECHTMANN, 2008).
A eficiência agronômica de WSMoL e extrato bruto de moringa sobre as
larvas, foi avaliada para o bioensaio larvicida com contaminação total do disco
foliar (tabela 2).
49
Tabela 2: Taxa de mortalidade e eficiência agronômica para o bioensaio larvicida com contaminação total dos discos foliares.
Tratamentos Tempo (horas)
3 6 12 24 48 72
WSMoL Média ± EP 8,8 ± 2,60a 12 ± 3,65a 24,8 ± 4,8a 34,4 ± 5,47a 47,2 ± 5,87a 54,4 ± 5,6a
%E 9,16 12,60 26,05 36,44 48,71 54,05
EB Média ± EP 6,4 ± 2,99a 9,6 ± 3,08a 10,4 ± 3,08a 12 ± 3,26b 15,2 ± 3,87b 38,4 ± 6,72b
%E 2,60 6,08 6,14 2,77 2,88 16,09
WSMoL: Water soluble Moringa oleifera lectin; EB: extrato bruto; %E: eficiência agronômica; EP: erro padrão; Letras indicam
diferença estatística quando p< 0,05.
Com uma disponibilidade maior de WSMoL, a atividade larvicida da lectina foi significante a partir de 3h de exposição, atingindo
seu potencial máximo, de 54,4% de eficiência, em 72h de exposição. O extrato bruto, apesar de ter causado uma taxa de mortalidade
de 38,4% após 72 horas, apresentou uma eficiência agronômica de 16,09%.
50
5.3 BIOENSAIO COM ADULTOS
WSMoL e cMoL foram testadas em aplicação única contra ácaros adultos.
Ambas as lectinas não apresentaram atividade biocida significativa (p< 0,05).
Espirodiclofeno também não foi capaz de afetar a sobrevivência dos ácaros
adultos.
Em um segundo experimento, onde o extrato bruto foi avaliado, após 72h
abamectina e o extrato bruto apresentaram 44,5% e 26,25% de mortalidade,
respectivamente (Figura 11).
Figura 11: Taxa de mortalidade de ácaros adultos de T. urticae após 72h da aplicação dos tratamentos para bioensaio com adultos.
ABM: abamectina; H2O: água destilada; NaCl: NaCl 0.15 M; EB: extrato bruto;
Letras indicam diferença estatística quando p< 0,05.
Holtz et al. (2016) demonstraram o potencial acaricida do extrato obtido a
partir das sementes de M. oleifera, onde o extrato foi produzido utilizando água
destilada como solvente (10% p/v), agitado durante 30 minutos e filtrado em
papel filtro. Sob essas condições foi observado uma taxa de mortalidade, após
72h, de 37,97% em fêmeas adultas, já no presente trabalho a taxa de
mortalidade, utilizando o extrato bruto preparado a partir de sementes de M.
oleifera, foi de 26,25%.
A análise de eficiência demonstrou baixa eficiência da abamectina
(38,70%) e ausência de eficiência do extrato bruto (Tabela 3).
51
Tabela 3: Taxa de mortalidade de ácaros adultos de T. urticae e eficiência agronômica de abamectina e extrato bruto para o bioensaio com adultos.
Tratamentos Tempo (horas)
3 6 12 24 48 72
ABM Média ± EP 11 ± 3,40ª 12,25 ± 3,41a 12,25 ± 3,41a 12,25 ± 3,41a 23 ± 3,68a 44,5 ± 5,63a
%E 12 13 13 13 26,04 38,70
EB Média ± EP 1 ± 1b 2 ± 2b 2 ± 2b 3 ± 2,18b 9,75 ± 4,26b 26,25 ± 4,48a
%E 0 0 0 0 0 0
EB: extrato bruto; %E: eficiência agronômica; EP: erro padrão; a,b: indica a diferença estatística na significância “p< 0,05”
Abamectina apresentou baixa eficiência, chegando ao máximo de 38,70% após 72h, já o extrato bruto não apresentou
eficiência agronômica, uma vez que o NaCl 0,15 M, utilizado como testemunha, apresentou uma taxa de mortalidade similar quando
comparado ao tratamento.
Para a eficiência de um produto químico ser relevante em condições laboratoriais, esta deve atingir um mínimo de 80%. Em
nenhuma das análises de eficiência agronômica de abamectina (sobre larvas e adultos), foi observado uma taxa de eficiência
relevante, reiterando a necessidade da pesquisa de novos princípios ativos para o controle do ácaro rajado.
52
5.4 ENSAIOS ENZIMÁTICOS
5.4.1 ATIVIDADE DE PROTEASES TOTAIS E TRIPSINA
O homogenato preparado a partir de ácaros adultos de T. urticae
apresentou uma quantidade de 0,280 mg/ml de proteínas.
A atividade de proteases totais na presença e ausência de WSMoL foram
de 33,3 e 35,78, respectivamente (Figura 11), de forma que as duas condições
não foram diferentes estatisticamente (p<0,05), indicando que WSMoL não
interferiu na atividade de proteases totais de fêmeas adultas de T. urticae.
A atividade de tripsina na presença e ausência de WSMoL foram de 0,191
e 0,415, respectivamente (Figura 12), onde WSMoL conseguiu interferir na
atividade de tripsina, aumentando sua atividade proteolítica (p<0,05).
Figura 12: Atividade de proteases totais de ácaros adultos de T. urticae em presença e ausência de WSMoL.
S/WSMoL: sem adição de WSMoL; C/WSMoL: com adição de WSMoL; Asterisco
indica diferença estatística quando p<0,05.
53
Figura 13: Atividade de tripsina de ácaros adultos de T. urticae em presença e ausência de WSMoL.
S/WSMoL: sem adição de WSMoL; C/WSMoL: com adição de WSMoL; Asterisco
indica diferença estatística quando p< 0,05.
Inibidores de proteases já demonstraram capacidade de reduzir os danos
causados por pragas em plantas; Hilder et al. (1987) demonstraram que plantas
de Nicotiana tabacum modificadas geneticamente, contendo o gene codificante
do inibidor de tripsina (CpTI) de Vigna unguiculata, foram mais resistentes
quando infestadas por larvas de Heliothis virescens.
Santamaria et al. (2012a) descobriram que proteases de T. urticae,
pertencentes às famílias C1 similares à catepsina L e B, e C13 (legumaína) são
mais expressas nas fases móveis do ácaro, sugerindo a participação destas nos
processos digestivos do ácaro rajado.
Santamaria et al. (2012b) demonstraram que linhagens de Arabidopsis
thaliana transformadas, expressando os inibidores de proteases da cevada,
inibidor de tripsina (Itr1) e cistatina (Icy6), foram mais resistentes contra
infestações de T. urticae.
Santamaria et al. (2015) perceberam que fêmeas adultas de T. urticae que
se alimentaram de A. thaliana que expressavam inibidores de tripsina e
catepsinas B e L, expressaram mais genes das proteases catepsinas B e L,
54
legumaínas e proteases aspárticas, relacionando a resposta como uma primeira
linha de defesa do ácaro rajado à proteínas de defesa de plantas.
Algumas lectinas atuam como inibidores de proteases. Lima et al. (2018)
demonstrou o potencial inibidor de proteases e carboidrases de MuBL e MuLL,
que foram capazes de interagir com proteases de N. corniger.
De acordo com Lacerda et al. (2017) a lectina obtida a partir das sementes
de Abelmoschus esculentus apresentou efeito tóxico contra a mosca das frutas
Ceratitis capitata e os nematódeos-das-galhas Meloidogyne incognita e
Meloidogyne javanica. A lectina foi caracterizada e classificada como um inibidor
de proteases tipo Kunitz, sendo capaz de inibir a atividade de tripsina,
quimotripsina e papaína.
WSMoL já apresentou capacidade de interagir com proteases de
diferentes organismos. De acordo com Oliveira et al. (2017), WSMoL foi capaz
de inibir a atividade enzimática de A. kuehniella. Medeiros (2016) demonstrou a
capacidade de WSMoL interferir na atividade de proteases de nematódeos
gastrintestinais de caprinos. No presente trabalho WSMoL foi capaz de
influenciar na atividade enzimática de tripsinas de T. urticae, podendo interferir
em seu processo digestivo.
55
6. CONCLUSÃO
O extrato bruto preparado a partir das sementes de M. oleifera, utilizando
o solvente NaCl 0,15 M, apresentou taxa de mortalidade às fêmeas adultas e
larvas de T. urticae.
A lectina cMoL, obtida a partir das sementes de M. oleifera, não
apresentou atividade acaricida relevante nesse trabalho.
A lectina WSMoL, também obtida a partir de sementes de M. oleifera,
apresentou atividade acaricida significante sobre larvas de T. urticae; também
interferiu na atividade enzimática de tripsina de T. urticae e ainda foi observado
um efeito paralisante sobre T. urticae, quando WSMoL foi disponibilizada para
as larvas do ácaro rajado, utilizando uma metodologia de contaminação total do
disco foliar; dessa maneira, a lectina WSMoL apresenta um potencial a ser
explorado para o controle do ácaro Tetranychus urticae.
56
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