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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NEUROCIÊNCIAS
ANDERSON HENRIQUE FRANÇA FIGUEREDO LEÃO
RATOS ESPONTANEAMENTE HIPERTENSOS (SHR) SÃO RESISTENTES A
UM MODELO ANIMAL PROGRESSIVO DA DOENÇA DE PARKINSON: UM
ESTUDO NEUROQUÍMICO E COMPORTAMENTAL.
NATAL-RN, 2016
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NEUROCIÊNCIAS
ANDERSON HENRIQUE FRANÇA FIGUEREDO LEÃO
RATOS ESPONTANEAMENTE HIPERTENSOS (SHR) SÃO RESISTENTES A
UM MODELO ANIMAL PROGRESSIVO DA DOENÇA DE PARKINSON: UM
ESTUDO NEUROQUÍMICO E COMPORTAMENTAL.
Tese apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Neurociências da
Universidade Federal do Rio Grande do
Norte como requisito parcial para
obtenção do título de Doutor em
Neurociências.
Orientadora: Profª Drª Regina Helena
Silva
NATAL-RN, 2016
Dedico este trabalho aos meus pais e
professores, que no empirismo do dia-
a-dia me encorajaram a duvidar e
questionar a natureza que me cerca.
AGRADECIMENTOS
Toda uma vida de formação educacional formal culmina para este
momento. Nunca tive dúvida, mesmo quando ainda muito jovem, que alcançaria
e encerraria esta etapa em minha vida. Mas mesmo quando o prenunciado
momento chega, parece difícil de acreditar. Um sonho de criança se torna
realidade com este trabalho, e mais do que nunca sinto o desejo de celebrá-lo.
Desejo celebrar este mérito que cabe a mim, mas que não seria possível sem a
coleção de experiências acumuladas pela vivência coletiva. Como um primata
social, devo muito do que sou e do que aprendi aos meus pares. “Do que sou”
porque se há algo definitivo e importante para o nosso self, este algo é a coleção
de memórias autobiográficas que formam a nossa identidade. “Do que aprendi”
porque aprender através da linguagem e empatia a experiência do próximo
talvez esta seja a característica mais humana de todas. A todos, que de alguma
forma contribuíram para a minha experiência nesta vida, dedico estes
agradecimentos. Mas não antes de retomar em minha memória autobiográfica
alguns momentos e pessoas marcantes.
Começando pela minha juventude, não sou adepto do saudosismo que a
maioria das pessoas alimentam e compartilham a respeito deste período de vida.
Sim, foram tempos importantes, sobretudo porque foi neste período de minha
vida que a minha identidade se firmou e o gosto pela ciência me foi despertado.
Se é que é possível despertar algo que já era tão vívido por natureza. Afinal,
nas palavras de Carl Sagan, toda criança nasce como um cientista inato, movido
por um apetite natural de explorar e aprender. Talvez a melhor forma de colocar
isto seja nos seguintes termos: fui afortunado por cruzar com educadores que
não me inibiram.
Por culpa e carma próprios, os primeiros personagens e modelos a quem
devo agradecimentos são meus pais, Zuleide Maria e Francisco de Assis. Apesar
da indignação e incompreensão do porque todo brinquedo que ganhava merecia
ser desmontado, nunca me privaram do enriquecimento ambiental necessário
para o meu amadurecimento nesta fase. Para a sorte deles, foi o que escolhi
fazer por carreira. Por outro lado, para o azar, nunca os consegui montar de
volta. Continuo “desmontando” cérebros para tentar entender as engrenagens
que o movimentam, mas ainda não consegui montar nenhum de volta. Portanto,
não posso questionar em nada as oportunidades que tive. Boa nutrição, bons
brinquedos, boa escola, bom ambiente familiar. Ainda que minhas solicitações
fossem incompreendidas (como um livro em uma língua que ainda era incapaz
de ler), ou mesmo impraticáveis (como quando me dei conta cuidando e
reproduzindo aproximadamente 25 hamsters de estimação), meus pais nunca
mediram esforços para investir em quem somos (aqui falo por mim e por meu
irmão, Arthur). A vocês, dedico e agradeço este trabalho. Obrigado por todo
investimento parental, e espero que este trabalho traga um pouco de retorno ao
que depositaram em mim. Esta é a concretização da “herança” que vocês me
deixaram.
Na escola também tive a oportunidade de cruzar com educadores que
alimentaram o meu ímpeto por perguntas e pela natureza. Agradeço à minha
professora de Biologia, Profª Karen, que uma vez ao me introduzir ao
microcosmos sob as lentes de um microscópio óptico e a história de Antonie van
Leeuwenhoek, ampliou as margens do meu mundo além de fronteiras que ainda
era incapaz de conceber. Naquele momento uma pequena mente se abriu para
um novo mundo e nunca mais retornou ao seu tamanho original. Não apenas
tive a oportunidade de ser estimulado à investigação, mas também cruzei com
educadores que me ensinaram a refinar a forma correta de se questionar a
natureza. Em especial, agradeço ao meu professor de História, Profº Eudes, que
conseguiu despertar novas formas de se encarar a natureza e o homem através
do método científico. A todos os meus professores, agradeço pelos
ensinamentos e zelo pela transmissão do conhecimento.
Em resumo, este é o histórico que me conduziu até a academia. De fato,
foi na universidade que me descobri como indivíduo e cientista. Sim, para mim a
entrada na universidade foi um marco que definiu minha personalidade em
muitos aspectos. Enquanto na escola, como de costume, qualquer criança com
interesses atípicos para aquela geração era considerada motivo de escárnio, na
universidade adquiri a segurança necessária para compreender que todo este
tempo estive seguindo o caminho correto e encontrei a motivação para busca-
lo. Como uma vez disse Steve Jobs em um de seus discursos “Não é possível
conseguir conectar os pontos olhando para frente; você apenas pode conectá-
los olhando para trás. Portato, precisamos confiar que os pontos irão se conectar
de alguma forma no futuro”. Descobri no ambiente da universidade que os meus
interesses atípicos se tornariam ferramentas importantes para a carreira que
escolhi. Aquele livro em uma língua que ainda não sabia ler estava escrito na
língua padrão utilizada para o registro ciêntífico. Aquela numerosa criação de
roedores em minha casa calhou por ser útil na manipulação e manutenção de
animais de experimentação. E, sobretudo e pela primeira vez, o meu interesse
pela natureza foi apreciado e valorizado. Portanto, devo muito à atmosfera
acadêmica parte do que sou. Agradeço, portanto, à instituição da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte, representada por seus docentes, discentes, e
servidores, por toda a experiência vivenciada em seus espaços.
Dentre estes, agradeço duplamente à Profª Drª Regina Silva e à minha
co-orientadora “informal” mais do que formal Profª Drª Alessandra Ribeiro, por
terem me dado seus votos de confiança e engajado em minha formação
científica. Pela primeira vez quando ainda aluno da graduação em Biomedicina,
recém-chegado na universidade, e completamente inexperiente a respeito da
academia. Pela segunda vez, quando confiaram na proposta que aqui se
concretiza na forma de tese ao me aceitar como seu aluno de doutorado. Não
posso negar que esta relação deu certo. Afinal, foram oito anos produtivos de
orientação que fizeram toda a minha formação acadêmica. Obrigado por todos
ensinamentos, e espero que esta relação possa se estender por muitos mais
anos sob outras formas.
Devo agradecimentos sobretudo também aos colegas de pós-graduação
veteranos, que me conduziram e orientaram neste tempo e que, além disto tudo,
se revelaram verdadeiros amigos preocupados com minha formação. Tenho
tanta confiança no que aprendi com vocês que hoje os tenho como exemplos.
Devo adminitir que me traz um certo orgulho saber que fui acompanhado por
pessoas que hoje estão muito bem encaminhadas, alguns em seus grupos de
pesquisa próprios como professores, outros ainda trilhando este caminho com
afinco. Meus eternos agradecimentos aos professores Ronaldo Santos, Geison
Izídio, e Flávio Barbosa, e doutores Ramón Hypólito, Alícia Cabral, e Valéria
Fernandes.
Agradeço também aos amigos que me acompanharam nesta jornada, em
especial aos colegas de curso e laboratório, André Medeiros, Raí Eufrásio, e
Isabella Pontes, que participaram e acompanharam de forma muito próxima
todas as principais etapas de minha vida acadêmica. Obrigado pelo
companheirismo ao longo destes anos. Aos demais amigos e colegas que
integraram o Laboratório de Estudos da Memória do Departamento de Fisiologia
da UFRN – Luiz Eduardo, Diana, Thieza, Éclinton, Carlos, Sophia, Aline, Aldair,
Bozena, Ivon, Ezequiel, Fernanda, Clarissa, Luane, Fernando, Priscila, Phiética,
Gênedy, Vanessa, Hermany, Diego – obrigado por nunca se levarem
excessivamente a sério e por tornarem o ambiente de trabalho tão agradável.
Definitivamente não compartilhamos apenas experimentos, mas também
risadas, histórias e memórias. No entanto, gostaria de dar destaque a algumas
pessoas desta equipe. Meus agradecimentos àqueles com quem pude contar
intimamente para a realização deste trabalho. Ywllianne Meurer, braço direito e
esquerdo do laboratório, e grande fonte de inspiração pessoal e profissional.
Uma das pessoas mais lindas que já conheci, capaz de te falar tudo só com um
olhar. Obrigado pelo cuidado, sobriedade e apoio. André Medeiros, a pessoa
mais doce que já tive oportunidade de conhecer, com quem pude sempre contar
nas dificuldades passadas em solo potiguar ou bandeirante. Obrigado pelos
momentos de sinceridade e cuidado, meu amigo. Anatildes Feitosa, uma força
da natureza quanto a questão é trabalho pesado. Parceira não somente quando
o trabalho pesado é no laboratório, mas também fora dele. Obrigado a todos
vocês pelo carinho e companheirismo. Grande parte do mérito desta tese cabe
a vocês.
Agradeço também aos colegas externos e colaboradores, cuja
participação e empenho foram fundamentais para o volume de dados aqui
apresentado. Sobretudo aos Profº Jeferson Cavalcante e Profª Rovena
Engelberth, do Dept. de Fisiologia da UFRN, que cederam espaço e expertise
para execução das imunohistoquímicas aqui apresentados. Ao Profº Isaltino
Conceição e à MSc Thalma Ariani, do Instituto Butantan, que forneceram o
espaço e auxílio técnico necessários para as dosagens de monoaminas aqui
apresentadas. À Profª Rosana Ribeiro e à Drª Claudenice Santos, pela expertise
e auxílio com as dosagens de peróxidos de lipídios. E finalmente, à Profª
Vanessa Abílio e seu grupo de pesquisa, pelo apoio neste projeto e por me
receberam muito bem em São Paulo.
Por fim, agradeço aos amigos e companheiros de vida, que dividiram bons
e maus momentos dessa jornada, mas que foram sobretudo meu porto seguro
nos momentos de insegurança, dúvida e frustração. Agradeço à Felipe Fiuza,
meu amigo companheiro para todos os momentos, a quem devo a leveza e a
ludicidade do dia-a-dia, assim como as discussões científicas estimulantes. À
Eugênia de Sá Freire, que nesta reta final foi minha companheira, terapeuta,
amiga, e a única capaz de tranquilizar meu coração nos momentos de ansiedade
e cansaço extremos. Seu apoio foi fundamental nesta reta final. À Thamara Melo,
que me acompanhou por uma longa jornada desde o curso de formação REUNI,
por ser uma amiga para todas as horas, em especial para os momentos que
requeriam desabafo, alívio, e uma boa dose de puxão de orelha. Obrigado a
vocês por todo apoio emocional e pessoal que me ofereceram ao longo destes
anos. A vocês reservo um lugar especial e bem protegido lá no fundo do meu
sistema límbico.
Por fim, agradeço às agências e programas de fomento federais e
estaduais CNPq, CAPES, REUNI, FAPERN e FAPESP, que financiaram o
trabalho aqui desenvolvido, e àqueles que viabilizaram todos os experimentos
aqui descritos, aos anônimos animais de experimentação que ofereceram suas
vidas para acrescentar uma pequena peça para a compreensão de uma
patologia que aflinge tantos seres humanos. Que esta tese também sirva de
homenagem e memória ao merecido bem-estar de animais de experimentação.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ............................................................................ i
LISTA DE TABELAS ........................................................................... ii
ABREVIATURAS ................................................................................. iii
RESUMO .............................................................................................. iv
ABSTRACT .......................................................................................... v
1. APRESENTAÇÃO ..................................................................... 1
2. INTRODUÇÃO GERAL ............................................................. 5
3. OBJETIVO GERAL ................................................................... 19
4. CAPÍTULO I .............................................................................. 20
4.1. Introdução ..................................................................... 21
4.2. Objetivos específicos ................................................... 24
4.3. Artigo de revisão ........................................................... 25
Abstract .................................................................... 26
1. Introduction ............................................................... 26
2. Animal models of PD ................................................ 27
3. Motor and nonmotor behavioral impairment in the
reserpine model ………………………………………..
27
4. Pharmacological and predictive quality of the
reserpine model ………………………………………..
28
5. Molecular and neurochemical features of the
reserpine model ………………………………………..
28
6. Final considerations …………………………………... 31
7. References …………………………………………….. 33
5. CAPÍTULO II ……………………………………………………….. 40
5.1. Introdução ………………………………………………..... 41
5.2. Objetivos específicos ……………………………………. 43
5.3. Manuscrito formatado para submissão …………........ 44
Abstract ………………………………………………………… 45
1. Introduction ……………………………………………….. 46
2. Material and Methods ……………………………………. 48
2.1. Animals ………………………………………………. 48
2.2. Drugs and general procedures …………………….. 48
2.3. Experimental design ………………………………… 48
2.4. Motor behavior ………………………………………. 50
2.4.1. Catalepsy test ………………………………………. 50
2.4.2. Spontaneous activity in the open field …………… 50
2.4.3. Oral movements ……………………………………. 50
2.5. TH and α-syn immunohistochemistry ……………… 50
2.6. Immunohistochemistry quantification ……………… 51
2.7. Data analysis ………………………………………… 52
3. Results ……………………………………………………... 53
3.1. Motor behavior ………………………………………. 53
3.1.1. Catalepsy test ………………………………………. 53
3.1.2. Spontaneous locomotion in the open field ………. 53
3.1.2.1. Total Distance Travelled …………………… 53
3.1.2.2. Speed above 0.05 m/s …………………….. 53
3.1.2.3. Time in the center zone ……………………. 54
3.1.3. Oral movements ……………………………………. 56
3.1.3.1. Vacuous chewing …………………………... 56
3.1.3.2. Tongue protrusion ………………………….. 56
3.2. Neurochemistry …………………………………….. 57
3.3. Correlations ………………………………………… 60
4. Discussion ………………………………………………… 61
5. References ………………………………………………… 69
6. CAPÍTULO III ………………………………………………………. 78
6.1. Introdução ……………………………………………... 79
6.2. Objetivos específicos ……………………………….. 82
6.3. Materiais e métodos …………………………………. 83
6.3.1. Animais …………………………………………...…. 83
6.3.2. Drogas ……………………………………..………... 83
6.3.3. Dosagem de dopamina, serotonina e metabólitos
por cromatografia líquida de alta eficiência (high
performance liquid chromatography – HPLC) ...........
83
6.3.4. Ensaio de Peroxidação Lipídica ........................... 84
6.3.5. Teste de catalepsia em barra ............................... 84
6.3.6. Delineamento experimental .................................. 85
6.3.6.1. Experimento I - Efeitos do tratamento
crônico com reserpina (0,1 mg/kg) em ratos
Wistar e SHR .......................................................
85
6.3.6.2. Experimento II - Efeitos do tratamento
agudo com reserpina (1 mg/kg) em ratos Wistar
e SHR ...................................................................
85
6.3.7. Análise estatística ................................................. 86
6.4. Resultados ............................................................... 87
6.4.1. Experimento I - Efeitos do tratamento crônico
com reserpina (0,1 mg/kg) em ratos Wistar e SHR ...
87
6.4.1.1. Dosagem de dopamina, serotonina e
metabólitos por Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência (High Performance Liquid
Chromatography – HPLC) ....................................
87
6.4.1.2. Catalepsia em barra ................................... 89
6.4.2. Experimento II - Efeitos do tratamento
agudo com reserpina (1 mg/kg) em ratos Wistar e
SHR ...........................................................................
90
6.4.2.1. Dosagem de dopamina, serotonina e
metabólitos por HPLC ..........................................
90
6.4.2.2. Catalepsia em barra ................................... 93
6.5. Discussão ................................................................. 94
6.6. Conclusão ................................................................ 100
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS .................................................... 101
8. REFERÊNCIAS ....................................................................... 105
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Representação esquemática dos circuitos dos núcleos da
base e alças córtico-subcorticais em indivíduos (A)
saudáveis e com (B) Doença de Parkinson ........................ 8
Figura 2:
Neurochemical and molecular events after reserpine
treatment ……………………………………………………… 32
Figura 3: Motor deficits of repeated low-dose reserpine treatment in
male and female mice ……………………………………….. 33
Figura 4: Schematic representation of the experimental design ……. 49
Figura 5: Effects of repeated administration of 0.1 mg/kg reserpine
on (A) total distance travelled, (B) time in speed above 0.05
m/s, and (C) time in the center zone in the open field test
in Wistar and SHR rats ………………………………………. 55
Figura 6: Effects of repeated administration of 0.1 mg/kg reserpine
on (A) vacuous chewing movements, and (B) tongue
protrusions in oral movement test in Wistar and SHR rats . 57
Figura 7: Effects of repeated administration of 0.1 mg/kg reserpine
on immunostaining for tyrosine hysdroxylase and α-
synuclein in the substantia nigra pars compacta (SNpc)
and dorsal striatum (dSTR) in Wistar and SHR rats ……… 58
Figura 8: Representative photomicrographs of brain coronal
sections of dorsal striatum and substantia nigra of rats
repeatedly treated with vehicle (CTR) or 0.1 mg/kg
reserpine euthanized 48h after last injection (RESt) or 15
days (RESw/d) after the last injection ………………………. 59
Figura 9: Correlation matrix for neurochemical and behavioral
parameters in WIS (upper tier) and SHR (lower tier) rats … 61
Figura 10: Delineamento experimental do Experimento reserpina
crônico (0,1 mg/kg) em ratos Wistar e SHR ........................ 85
Figura 11: Delineamento experimental do Experimento reserpina
agudo (1.0 mg/kg) em ratos Wistar e SHR ......................... 86
Figura 12: Dosagem de dopamina (DA), ácido 3,4-diidroxifenilacético
(DOPAC) e ácido homovanílico (HVA) por HPLC, e
turnover de dopamina [DOPAC+HVA/DA] no estriado de
ratos Wistar (WIS) e SHR tratados com baixas doses de
reserpina (0.1 mg/kg) ......................................................... 88
Figura 13: Dosagem de serotonina (5-HT) e ácido 5-
Hidroxiindoleacético (5HIAA) por HPLC, turnover de
serotonina [5-HIAA/5-HT], e Dosagem de malondialdeído
(MDA) por fluorimetría formado a partir da peroxidação
lipídica no estriado de ratos Wistar (WIS) e SHR tratados
com baixas doses de reserpina (0.1 mg/kg) ........................ 89
Figura 14: Latência para descer da barra no teste de catalepsia em
barra ao longo do tratamento repetido com baixas doses
de reserpina (0.1 mg/kg) ..................................................... 90
Figura 15: Dosagem de dopamina (DA), ácido 3,4-diidroxifenilacético
(DOPAC) e ácido homovanílico (HVA) por HPLC, e
turnover de dopamina [DOPAC+HVA/DA] no estriado de
ratos Wistar (WIS) e SHR tratados com uma dose aguda
de reserpina (1.0 mg/kg) ao longo do intervalo de 96h ...... 92
Figura 16: Dosagem de dopamina (DA), ácido 3,4-diidroxifenilacético
(DOPAC) e ácido homovanílico (HVA) por HPLC, e
turnover de dopamina [DOPAC+HVA/DA] no estriado de
ratos Wistar (WIS) e SHR tratados com uma dose aguda
de reserpina (1.0 mg/kg) ao longo do intervalo de 96h ........ 93
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Predictive validity of reserpine Parkinson’s disease (PD)
model effectiveness for symptomatic treatment of diferente
motor disturbances in PD ……………………………………. 29
Tabela 2:
Monoamine content depletion induced by different
reserpine treatment regimens in rodents …………………… 30
Tabela 3: Molecular changes related to oxidative stress induced by
different reserpine treatment regimens in rodents ………… 31
ABREVIATURAS
5-HIAA Ácido 5-Hidroxiindoleacético
5-HT Serotonina
6-OHDA 6-hidroxidopamina
AADC L-aminoácido aromático descarboxilase
ALDH Aldeído desidrogenase
α-syn α-sinucleína
ANOVA Análise de variância
ATP Trifosfato de adenosina
Bcl-2 (B-cell lymphoma 2)
BLA Amígdala basolateral
CA Catecolamina
CAT Catalase
CEUA Comissão de ética no uso de animais
COMT Catecol-o-metiltransferase
CPF Córtex pré-frontal
CPu Núcleo Caudado-Putamen
CTR Grupo Controle
CTX Córtex
D1 Receptor de dopamina tipo 1
D2 Receptor de dopamina tipo 2
DA Dopamina
DAB Diaminobenzidina
DAT Transportador de dopamina
DOPAC Ácido 3,4-diidroxifenilacético
DOPAL 3,4-dihidroxifenilacetaldeído
DP Doença de Parkinson
dSTR Estriado dorsal
E.P.M. Erro padrão da média
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
GABA Ácido gama-amino-butírico
GLM Modelo Linear Geral
GP Globo pálido
Gpe Globo pálido externo
GPi Globo pálido interno
GPX Glutationa peroxidase
GSH Glutationa reduzida
GSSG Glutationa oxidada
HPA Eixo hipotalâmico-pituitário-adrenal
HPC Hipocampo
HPLC Cromatografia líquida de alto desempenho
HVA Ácido homovanílico
L-DOPA L-3,4-dihidroxifenilalanina (Levodopa)
LPO Peróxido de Lipídio
MAO Monoamino oxidase
MDA Malondialdeído
MPP+ 1-metilfenilpiridina
MPTP 1-Metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina
mRNA Ácido ribonucleico mensageiro
MSN Medium Spiny Neuron
NA Noradrenalina
NAT Transportador de noradrenalina
NMDA N-Metil-D-Aspartato
NO Óxido Nítrico
PBS Solução tampão fosfato
PCA Ácido perclórico
PD Parkinson's Disease
PFC Córtex pré-frontal
RES Grupo tratado com reserpina
RESt Grupo em tratamento com reserpina
RESw/d Grupo em retirada do tratamento com reserpina
ROD Densitometria óptica relativa
ROS Espécies reativas do oxigênio
S.E.M. Standard error of mean
SDS Dodecil sulfato de sódio
SHR Spontaneously Hypertensive Rat
SN Substantia nigra
SNpc Substantia nigra pars compacta
SNpr Substantia nigra pars reticulada
SOD Superóxido dismutase
STN Núcleo subtalâmico
TBA Ácido tiobarbitúrico
TH Tirosina Hidroxilase
THA Tálamo
TNF Fator de necrose tumoral
VEI Grupo veículo
VMAT2 Transportador vesicular de monoaminas - 2
VTA Área tegmental ventral
WKY Wistar-kyoto
RESUMO
A Doença de Parkinson (DP) é um distúrbio neurodegenerativo progressivo caracterizado por sintomas motores e não motores relacionado ao envelhecimento que atualmente acomete de 1-2% da população mundial acima dos 60 anos. No Brasil, estima-se que esta acometa aproximadamente 600 mil indivíduos, configurando-se como uma enfermidade de importância para países em processo de incremento da expectativa de vida. A epidemiologia da DP revela fatores de risco intrínsecos e extrínsecos ao paciente que definem a chance de desenvolvimento do distúrbio. Mutações pontuais e polimorfismos com significado funcional são tidos como fatores genéticos predisponentes, enquanto a exposição a pesticidas e toxinas destacam-se como fatores ambientais. No entanto, poucos estudos em modelos animais focam em investigar a interação entre estes fatores. Isto pode ser alcançado comparando-se os efeitos de substâncias indutoras de parkinsonismo em linhagens de ratos com diferentes contextos genéticos. Recentemente, o tratamento repetido com baixas doses de reserpina – um inibidor irreversível do transportador vesicular de monoaminas (VMAT2) – foi proposto como um modelo progressivo para a DP. Sob este regime de tratamento, roedores apresentam, de forma progressiva, comprometimento motor, cognitivo, e alterações neuroquímicas compatíveis com a fisiopatologia da DP. Em paralelo, comparados a ratos Wistar, animais da linhagem SHR (Spontaneously Hypertensive Rats) são resistentes à indução da discinesia oral pelo tratamento agudo com reserpina e apresentam diversas altarações neuroquímicas nas vias dopaminérgicas de relevância para a DP. Em vista destes achados, nós buscamos avaliar se ratos SHR seriam resistentes aos déficits motores e alterações neuroquímicas quando submetidos ao modelo progressivo para DP induzido por reserpina. Portanto, nós submetemos ratos Wistar e SHR ao tratamento agudo (1 mg/kg) ou repetido (15 injeções de 0,1 mg/kg, em dias alternados) com reserpina e investigamos a progressão dos déficits motores nas tarefas de catalepsia em barra, discinesia oral, e atividade espontânea em campo aberto. Observamos então que, para ambos os regimes de tratamento, animais SHR se mostram resistentes ao prejuízo motor em todas as dimensões motoras avaliadas. Ainda, estas diferenças se manifestaram tanto na latência para o surgimento do comprometimento motor como para a magnitude deste. Estas alterações foram ainda acompanhadas por decréscimo na densidade óptica para a imunomarcação por imunohistoquímica da tirosina hidroxilase (TH) e incremento na de α-sinucleína na via nigro-estriatal de ambas linhagens submetidas ao tratamento com reserpina. Estas alterações neuroquímicas resultantes do tratamento com reserpina também se refletiram nos níveis de monoaminas – dopamina e serotonina – na via nigro-estriatal destes animais. De modo geral, como no comportamento motor, animais SHR apresentaram atraso para a depleção de monoaminas e menor magnitude deste efeito. Em conclusão, os resultados aqui apresentados claramente evidenciam a resiliência de ratos SHR ao modelo progressivo da DP. Estes achados expõem novos alvos potenciais para as diferenças neuroquímicas, moleculares e genéticas na linhagem SHR relevantes para o estudo da susceptibilidade à DP.
ABSTRACT
Parkinson’s disease (PD) is an aging-related progressive neurodegenerative
disorder characterized by motor and non-motor symptoms, which affects 1-2% of
the world population above 60 years old. In Brazil, this approximately 600
thousand people live with this disorder. Thus, PD is an important burden to
countries with increasing life expectancy. The epidemiology of PD highlight
intrinsic and extrinsic risk factors that are stochastic to the development of the
disorder. Predisposing genetic factors comprise punctual mutations and
polymorphisms with functional significance, while exposition to toxins is
emphasizedas environmental factors. Nevertheless, few animal studies focus on
the investigation of the interaction between these factors. Such may be
accomplished by comparing the effects of substances that cause parkinsonism
on rat strains with different genetic backgrounds. Recently, the repeated
treatment with a low-dose of reserpine – an irreversible inhibitor of the vesicular
monoamine transporter (VMAT2) – was suggested as a progressive model of PD.
Rats under this treatment regimen show progressive catalepsy behavior, oral
dyskinesia and spontaneous motor activity decrement. In parallel, compared to
Wistar rats, SHR (Spontaneously Hypertensive Rat) are resistant to acute
reserpine-induced oral dyskinesia. In view of these findings, we aimed to assess
whether SHR would be resistant to repeated reserpine-induced motor and
neurochemical deficits when submitted to the progressive model of PD. Thus, we
submitted Wistar and SHR rats to the acute (1 mg/kg) or repeated (0,1 mg/kg,
15x, every other day) treatment with reserpine and investigated the progression
of motor deficits in the catalepsy bar, oral dyskinesia, and spontaneous activity
on the open field. Our results revealed that, for both treatment regimens, SHR
rats were resistant to the motor impairment for all motor parameters assessed.
Moreover, these differences were detected for both the latency to instauration
and the magnitude of the impairment. The alterations were concomitant to a
decrement in the optical density of tyrosine hydroxylase and an increment in α-
synuclein immunostaining by immunohistochemistryin the nigro-striatal pathway
of both strains submitted to reserpine treatment. These neurochemical alterations
resulted from reserpine treatment also reflected in the levels of monoamines –
dopamine and serotonin – in the nigro-striatal pathway of these animals.
Altogether, similarly to the motor behavior, SHR rats displayed lower magnitude
and a delay to monoamine depletion. In conclusion, the current results clearly
evidence the resilience of SHR to the repeated low-dose reserpine protocol.
These findings uncover new potential underlying neurochemical, molecular and
genetic differences in the SHR strain relevant to the study of susceptibility to PD.
1
1. APRESENTAÇÃO
A Doença de Parkinson (DP) é a segunda doença neurodegenerativa
mais frequente, atrás apenas da Doença de Alzheimer. Sabe-se que atualmente
este distúrbio afeta 1-2% da população mundial acima dos 60 anos (Elbaz et al.,
2002). Por se tratar de um distúrbio progressivo e associado ao envelhecimento,
ela ocorre raramente antes dos 50 anos, apresentando um aumento agudo na
incidência apenas após os 60 anos de idade. Apesar da DP desconhecer fronteiras
raciais, territoriais, de sexo, ou socioeconômicos, esta ocorre com uma maior frequência
em homens e em indivíduos de etnia branca (Eeden, Van Den, 2003). Poucos
estudos fazem uma avaliação adequada da prevalência da DP no Brasil. No
entanto, em um estudo realizado em Bambuí-MG, estimou-se uma prevalência
de 3.3% em indivíduos acima de 65 anos (Barbosa et al., 2006). Ainda, sabe-se
que entre o período de 1960 e 2014 a expectativa de vida do brasileiro aumentou
em 25,4 anos, com indivíduos acima dos 65 anos passando a representar 7,4%
(20.590.597 indivíduos) da população (IBGE, 2010). Podemos então estimar que
a DP afeta aproximadamente 680 mil indivíduos no Brasil, configurando-se como
um importante fardo socioeconômico para países com crescente expectativa de
vida.
Descrições reminiscentes do distúrbio são encontradas em tratados
médicos egípcios, indianos, e chineses que datam de até 1000 A.C. No entanto,
a DP passou a ser estudada, caracterizada e batizada com este nome apenas
em 1887 pelo famoso fisiologista e cientista francês Jean-Martin Charcot (Goetz,
2011). Em seus tratados, Charcot fez a primeira descrição de como dissociar
clinicamente a DP de outros distúrbios motores, como a esclerose múltipla. O
nome foi escolhido em homenagem ao médico inglês James Parkinson, autor de
"Um ensaio sobre a Paralisia Agitante" (Parkinson, 1817), no qual descreve pela
primeira vez a doença na literatura médica moderna e cujo trabalho foi resgatado
por Charcot depois de aproximadamente 70 anos sob esquecimento. De forma
sucinta, Parkinson capturou o quadro clínico da doença em seus transcritos
como “Movimentos tremulosos involuntários, com poder muscular reduzido, em
membros em repouso e mesmo quando apoiados; com a propensão à curvatura
do tronco para frente, e para transpor de um ritmo de caminhada pra corrida:
estando os sentidos e intelectos não prejudicados." (Parkinson, 1817). No
2
entanto, hoje sabe-se que sua sintomatologia envolve disfunções motoras e
alterações cognitivas importantes para a qualidade de vida do paciente (Munhoz
et al., 2015).
O interesse e os esforços de Charcot fundaram o terreno para a
compreensão da fisiopatologia do distúrbio motor por Brissaud em 1895 e
Greenfield e Bosanquet em 1953, que associaram a doença, respectivamente, a
lesões do mesencéfalo e então especificamente à neurodegeneração da
substantia nigra (SN). Em 1951, a dopamina foi descoberta, porém esta não era
capaz de levar a alterações comportamentais por não atravessar a barreira
hemato-encefálica, descobrindo-se então que a L-dopa era capaz de aumentar
os seus níveis no sistema nervoso central. Em seguida, em 1952, a ocorrência
corpúsculos de Lewy na SN - formações histopatológicas resultante do acúmulo
de agregados proteicos descritas pela primeira vez por Frederic Lewy, em 1912
- tornou-se um marco fisiopatológico a DP. Estas formações junto à
neurodegeneração da substância nigra passaram então a integrar o critério
diagnóstico e a definição neurológica da DP. Finalmente, em 1958, demonstrou-
se que a reserpina (bloqueador da captação vesicular de monoaminas) é capaz
de reduzir os níveis encefálicos de dopamina e causar bradicinesia em coelhos;
ambos sendo revertidos por L-DOPA (precursor da dopamina) (Carlsson,
Lindqvist e Magnusson, 1957; Factor e Weiner, 2007). Sendo assim, a reserpina
foi a primeira droga utilizada para a obtenção de um modelo animal da DP,
permitindo o estabelecimento da relação causal entre os níveis de dopamina e o
distúrbio motor, e permitindo a investigação de intervenções farmacológicas para
a DP.
A reserpina é um alcaloide extraído da Rauwolfia serpentine capaz de
depletar o conteúdo de monoaminas no sistema nervoso central e periférico,
levando a efeitos hipotensores relevantes para o tratamento da hipertensão. O
uso clínico da reserpina foi seguido da observação de que pacientes
cronicamente tratados com esta substância desenvolviam letargia, depressão e
discinesias. Posteriormente, a reserpina foi utilizada em roedores para reproduzir
prejuízos motores e não-motores relacionados à DP, e estudar a relação destes
com o dano oxidativo causado pela depleção e metabolismo de catecolaminas.
3
Deste modo, o modelo da reserpina foi útil para esclarecer elementos
importantes da sintomatologia, neuroquímica e farmacologia da DP.
Somando-se à elevada variabilidade sintomatológica, a DP é um distúrbio
com grande suscetibilidade a fatores ambientais (Kim et al., 2005). Estudos
epidemiológicos relacionaram a exposição a agentes ambientais, incluindo
pesticidas, com o aumento no risco de desenvolvimento desta doença (Godeiro
et al., 2010; Langston et al., 1983; Noyce et al., 2012). Com isto se fortaleceu a
hipótese de que a exposição a substâncias químicas poderia produzir morte
seletiva de neurônios dopaminérgicos e contribuir para o desenvolvimento da
DP. Todavia, esta hipótese ainda preconiza uma cascata multifatorial de
interações entre exposição a elementos ambientais deletérios e predisposições
genéticas que contribuem para o estabelecimento do fenótipo parkinsoniano.
A constatação destes fatores epidemiológicos permitiu que diversos
modelos animais que mimetizassem tais exposições ambientais a toxinas
fossem sugeridos como candidatos à investigação dos mecanismos subjacentes
a progressão da DP. Produziu-se então modelos animais de neurodegeneração
com toxinas tais como a 6-hidroxidopamina (6-OHDA). 1-Metil-4-fenil-1,2,3,6-
tetrahidropiridina (MPTP), e rotenona (Deumens, Blokland e Prickaerts, 2002;
Duty e Jenner, 2011; Panov et al., 2005; Yazdani et al., 2006). No entanto, nossa
compreensão a respeito destas interações permanece ainda em estágios inciais.
Sabe-se, por exemplo, que a superexpressão através de vetores virais ou a
expressão de α-sinucleína mutada (E46K) exacerba a toxicidade e degeneração
induzida pelo tratamento sistêmico com rotenona (Mukcahy, 2012, 2013; Cannon
2013). O mesmo é válido para modelos em animais não-mamíferos, como na
Drosophila melanogaster (Varga et al. 2014). Ainda, a neuroinflamação parece
ser um fator externo importante, uma vez que a administração de
lipopolissacarído em camundongos com mutação na α-sinucleína produziu
efeitos sinérgicos sobre a neurodegeneração dopaminérgica (Gao et a. 2011).
Por outro lado, knockout para os genes LRRK2 e Parkina em camundongos não
conferiu maior sensibilidade à toxicidade do MPTP (MacLeod, 2006; Aguiar Jr.,
2013), enquanto o knockout para α-sinucleína e o gene 5-LOX – envolvido na
cascata de síntese de leucotrienos e amplificação da resposta inflamatória –
conferiu proteção à 6-OHDA e MPTP, respectivamente (Alvarez et al, 2008;
4
Chou et al., 2014). Portanto, todos estes estudos adincionam informação
importante sobre a interação gene-ambiente presente na DP.
No entanto, estes estudos focaram-se na expressão de um único gene,
que exclui a possibilidade de interações gênicas de importância para a DP. Por
exemplo, a susceptibilidade à morte neuronal pelo tratamento com MPTP estaria
associada a alelos autossômicos dominantes da linhagem C57BL/J6 de
camundongos, um achado importante para situar a importância do contexto
genético da espécie e linhagem para a produção da neurodegeneração (Hamre
et al., 1999).Em ratos, por sua vez, foi descrito que a linhagem de ratos
espontaneamente hipertensos (spontaneously hypertensive rats – SHR) é
resistente à discinesia oral induzida pelo tratamento com reserpina quando
comparados a ratos da linhagem Wistar. Estes achados foram relacionados com
diferenças celulares importantes para o sistema de proteção contra o estresse
oxidativo entre estas linhagens (Abílio et al., 2004; Queiroz, Piovezan e Frussa-
Filho, 1998).
Em síntese, a utilização do modelo crônico progressivo de DP induzido
por reserpina recentemente proposto por Fernandes et al. (2012) em animais de
diferentes linhagens (Wistar e SHR) servirá para elucidar a importância de
diferentes perfis genéticos, neuroquímicos e comportamentais para a
predisposição às alterações motoras induzidas pela exposição a substâncias
indutoras de parkinsonismo. A identificação das etapas celulares que conferem
esta resistência será futuramente útil para a prospecção de drogas candidatas
que modulem a atividade destas vias com o objetivo de conferir proteção contra
a progressão da DP.
5
2. INTRODUÇÃO GERAL
A doença de Parkinson (DP) é a doença neurodegenerativa com a
segunda maior prevalência mundial, estimada a afetar 1-2% da população
mundial acima dos 60 anos (Elbaz et al., 2002).. Dependendo do local de estudo,
a sua taxa de incidência anual varia de 110 a 330 por 100,000 indivíduos acima
dos 50 anos, aumentando para 400 a 500 depois dos 80 anos (Bower et al.,
1999). Sabe-se, porém, que a DP acomete com maior frequência homens,
quando comparados a mulheres, e indivíduos de etnia branca (Eeden, Van Den,
2003). Evidências epidemiológicas como estas apontam para a importância de
aspectos genéticos populacionais importantes para a incidência desta doença.
Estas estatísticas, portanto, definem a DP como um importante fardo
socioeconômico para países com crescente expectativa de vida.
A doença foi batizada com este nome pelo famoso fisiologista e cientista
francês Jean-Martin Charcot (Goetz, 2011). O nome foi escolhido em
homenagem ao médico inglês James Parkinson, autor de "Um ensaio sobre a
Paralisia Agitante" (Parkinson, 1817), que descreve pela primeira vez a doença
na literatura médica moderna. Entretanto, descrições semelhantes do distúrbio
são encontradas em tratados médicos egípcios, indianos e chineses que datam
de 1000 A.C. (Ruiz, 2004). Como descrito e caracterizado por Charcot, o
diagnóstico da DP é orientado pelos sinais motores que compreendem fraqueza
muscular, instabilidade postural, tremores em repouso e bradicinesia (Duty e
Jenner, 2011; Klockgether, 2004). No entanto, ainda que pouco destacadas,
alterações cognitivas também são descritas, compreendendo sintomas de
ansiedade, apatia, depressão, perda progressiva de memória e/ou demência
(Barone, 2011; Bowers et al., 2006; Ishihara e Brayne, 2006; Klockgether, 2004;
Schneider et al., 2003; Voon, Mehta e Hallett, 2011). Além destas, ainda pode-
se destacar distúrbios relacionados ao sono, tais como insônias (Comella, 2003;
Gómez-Esteban et al., 2011; Monderer e Thorpy, 2009), presença de tônus
muscular durante a fase de REM (rapid eye movement) e aumento da latência
para o sono (Medeiros et al., 2007), e anosmia ou hiposmia (Munhoz et al.,
2015).
6
A presença de déficits cognitivos é uma complicação não motora comum
na DP, e frequentemente compõe uma condição incapacitante para os
pacientes. Similarmente aos sinais motores, as características dos déficits
cognitivos na DP podem ser bastante variáveis, tanto em termos dos domínios
cognitivos prejudicados, como na ocasião de início e progressão (Klockgether,
2004; Watson e Leverenz, 2010). A DP com demência apresenta uma
prevalência de aproximadamente 30% e um risco ao longo da vida de 80%
(Aarsland, Zaccai e Brayne, 2005; Aarsland et al., 2003), enquanto que a
depressão se apresenta em comorbidade em 30-40% dos casos de DP (Barone,
2011). Do mesmo modo, estes déficits podem se apresentar em qualquer estágio
da doença, incluindo nas fases pré-motoras da DP (Mehndiratta, Garg e Pandey,
2011). Tais alterações cognitivas podem estar associadas ao fato de que áreas
envolvidas com cognição também recebem projeções dopaminérgicas (Ferro et
al., 2005; Salgado-Pineda et al., 2005; Tadaiesky et al., 2008), as quais,
conforme descrito a seguir, estão diretamente envolvidas com a fisiopatologia da
doença.
As alterações motoras são uma consequência da perda neuronal na
substância nigra pars compacta (SNpc) (Klockgether, 2004), que origina a
principal projeção dopaminérgica para os núcleos da base reguladores da
motricidade (Lotharius e Brundin, 2002). A morte desses neurônios está
associada com o surgimento de inclusões proteicas intracelulares ricas em α-
sinucleína e positivas para ubiquitina denominadas de corpos de Lewy
(Lotharius e Brundin, 2002; Mcnaught et al., 2001). Paralelamente, parte dos
déficits não motores supracitados ocorrem por dano a neurônios em outros
núcleos dopaminérgicos, como a área tegumentar ventral (VTA) – que projeta
para áreas límbicas e o córtex pré-frontal (Uhl, Hedreen e Price, 1985) – bem
como de outras neurotransmissões, como núcleos de neurônios serotonérgicos,
noradrenérgicos e colinérgicos (Tredici, Del e Braak, 2012; Uhl, Hedreen e Price,
1985). Não obstante, as manifestações motoras na DP tornam-se notórias
apenas quando há uma perda substancial (50-80%) dos neurônios
dopaminérgicos da SNpc (Gao e Hong, 2011; Hornykiewicz, 1998; Tissingh et
al., 1998). Estes, por sua vez, são a principal fonte tônica de dopamina (DA) ao
7
estriado, o núcleo de entrada em um sistema de alças cortico-subcorticais para
a regulação do programa motor denominado de núcleos da base.
As conexões intrínsecas dos núcleos da base foram elucidadas nos anos
80 e início dos anos 90, com a formulação do modelo das vias “direta” e “indireta”
(Alexander, Crutcher e DeLong, 1990; Wichmann et al., 2011). Neste modelo o
estriado e o núcleo subtalâmico (STN) recebem aferências do córtex cerebral,
enquanto o segmento interno do globo pálido (GPi) e a substância nigra pars
reticulada (SNpr) fornecem projeções para o tálamo e tronco encefálico (DeLong
e Wichmann, 2007). Os núcleos da base funcionam, portanto, como uma alça
córtico-subcortical para a focalização e mensuração da saída motora cortical.
Estas, por sua vez, são originadas a partir de diferentes populações de neurônios
estriatais (MSN – Medium Spiny Neurons) cuja atividade é diferencialmente
modulada pela DA. A via direta é uma projeção inibitória monossináptica
(GABAérgica) entre os MSNs - que contem receptores tipo D1 acoplados à
proteína G estimulatória - e neurônios GPi/SNpr. A via indireta, por sua vez, é
uma conexão polissináptica também GABAérgica, mas que por envolver duas
projeções inibitórias em série, produz efeito líquido estimulatório sobre o
GPi/SNpr. Brevemente, esta via se origina a partir de MSNs que expressam
receptores tipo D2 - acoplado à proteína G inibitória - para neurônios no
segmento externo do globo pálido (GPe), e projeções inibitórias subsequentes
entre GPe e GPi/SNpr, tanto diretamente quanto via núcleo subtalâmico (STN)
(Figura 1A). Finalmente, uma terceira via que pode ter um papel substancial no
controle dos núcleos da base é a denominada via hiperdireta, que inclui
conexões cortico-subtalâmicas. A ativação desta via resultaria no aumento da
atividade dos núcleos de saída (GPi/SNpr), levando a um tônus inibitório
aumentado sobre as vias tálamo-corticais. Ainda que estas ações estejam em
acordo com aquelas da via indireta, esta é considerada muito mais rápida que a
via indireta por contornar o processamento relativamente lento que ocorre no
estriado e GPe (Figura 1A) (DeLong e Wichmann, 2007; Rouse et al., 2001;
Wichmann et al., 2011).
8
Figura 1. Representação esquemática dos circuitos dos núcleos da base e alças córtico-subcorticais em indivíduos (A) saudáveis e com (B) Doença de Parkinson. Setas em vermelho representam projeções inibitórias, enquanto setas em verde projeções excitatórias. Figura adaptada de DeLong e Wichmann (2007), e Rouse et al. (2001). GP: globo pálido; GPi: globo pálido interno; GPe: globo pálido externo; STN: núcleo subtalâmico; SNpc: substância nigra pars compacta; SNpr: substância nigra pars reticulada.
De modo geral, a saída tônica inibitória deste circuito, originada no GPi e
SNpr, é capaz de regular a quantidade total de movimento. Portanto, uma
acentuação na atividade de resposta dos núcleos da base resultaria em redução
do movimento através da inibição dos neurônios de projeção tálamo-corticais,
enquanto a saída reduzida destes produziria aumento do movimento por
desinibição tálamo-cortical (DeLong e Wichmann, 2007; Wichmann et al., 2011).
Sendo assim, a presença das vias direta, indireta, e hiperdireta nos núcleos da
base podem ser traduzidas em consequências funcionais de importância para a
regulação da saída motora.
Tem-se proposto que a ação combinada da informação das vias direta e
indireta permite a mensuração e/ou focalização de movimentos. Por exemplo,
para alcançar a iniciação e o encerramento de um programa motor, a saída
estriatal a princípio inibiria populações neuronais específicas no GPi e SNpr
através da via direta, facilitando deste modo o movimento. Em seguida, a via
direta atuaria por desinibição dos mesmos neurônios de saída do GPi e SNpr,
resultando na terminação do movimento em execução. Em um modelo
alternativo que focaliza o programa motor, a inibição de neurônios palidais e
9
nigras relevantes através da via direta permitiria a iniciação do movimento
desejado, enquanto movimentos indesejados seriam suprimidos por aumento
concomitante da entrada excitatória para outros neurônios da GPi e SNpr pela
via indireta. Sendo assim, o equilíbrio entre as vias direta e indireta regulado pela
ação diferencial da DA fornecida pela SNpc em MSNs estriatais (DeLong e
Wichmann, 2007). Este modelo está de acordo com o proposto por Da Cunha et
al. (2009), que sugere que diferentes populações de neurônios do estriado
atuariam para selecionar a execução de programas motores corticais a partir de
estímulos que suscitam a resposta motora. Sendo assim, seria necessário a
seleção seguida de inibição e desinibição em paralelo dos diferentes programas
motores corticais. Portanto, a diminuição do tônus dopaminérgico em porções
motoras do putâmen na DP resulta em alterações funcionais compatíveis com a
modelo proposto acima. O efeito global da redução de DA no estriado é,
respectivamente, o aumento e a diminuição da atividade na via indireta e na via
direta, que ampliam o tônus inibitório sobre as projeções tálamos-corticais
reprimindo o programa motor e dificultando a iniciação do movimento (Figura 1B)
(Blandini et al., 2000; DeLong e Wichmann, 2007; Rouse et al., 2001).
Avançando além das implicações funcionais resultantes da perda de
neurônios na SNpc, a biologia molecular e genética elucidaram mecanismos
celulares de importância para a instauração da DP. Estes atribuem 5-10% dos
casos de DP à herança genética familiar, subsequentemente permitindo a
identificação de genes que orientam formas familiares raras da doença (Wood-
Kaczmar, Gandhi e Wood, 2006). Esta abordagem permitiu a identificação de
genes envolvidos em vias celulares implicadas na função sináptica (SNCA: α-
sinucleína); degradação proteica através do sistema ubiquitina-proteasoma
(Parkin e UCHL1); cadeia respiratória (PINK1); fosforilação proteica (LRRK2); e
resposta ao estresse oxidativo (DJ-1) (Wood-Kaczmar, Gandhi e Wood, 2006).
Associado a estas descrições, histórico de ansiedade e depressão, exposição a
pesticidas, vida rural, traumas cranianos, e consumo de água de poço são
frequentemente descritos como fatores de risco para o desenvolvimento do
distúrbio. (Godeiro et al., 2010; Noyce et al., 2012).
Em síntese, ainda que caracterizados separadamente, os dados
experimentais obtidos de estudos que investigam tanto a DP hereditária como
10
esporádica apontam para o metabolismo mitocondrial, estresse oxidativo,
sinalização, conformação e degradação proteica defeituosa através do sistema
ubiquitina-proteassoma como as vias finais para a degeneração dopaminérgica
(Beal, 2001; Gao & Hong, 2011; Kim et al., 2005; Lotharius & Brundin, 2002).
Finalmente, o acúmulo de proteínas defeituosas resultantes destes processos
gera agregados proteicos que definem a histopatologia da DP – constituídos
sobretudo por α-sinucleína, parkina e ubiquitina (Venderova e Park, 2012) – e
morte neuronal. Portanto, a patogênese da DP está fundamentalmente
relacionada à geração de substâncias oxidantes e acúmulo de proteínas
defeituosas. Achados como estes sugerem que exista uma interação entre
fatores intrínsecos (genéticos) e extrínsecos (ambientais) ao paciente que se
somam de forma estocástica para a expressão da doença (Kim et al., 2005).
Sendo assim, o tratamento farmacológico clínico utilizado em pacientes
portadores da DP buscar reverter as alterações funcionais decorrentes da perda
de projeções dopaminérgicas. No entanto, ainda é necessário estabelecer uma
intervenção terapêutica capazde reduzir e/ou retardar a progressão da
neurodegeneração instalada. Dentre os tratamentos sintomatológicos –
buscando a reversão dos prejuízos funcionais aos núcleos da base – podemos
destacar a administração de 3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA), um precursor da
DA que promove controle das alterações motoras por aumento da
disponibilidade de DA nos neurônios DAérgicos remanescentes (Pezzoli e Zini,
2010). No entanto, outras abordagens complementares também são utilizadas,
como: inibidores da monoamino oxidase-B (MAO-B); antagonistas de receptores
colinérgicos; agonistas dopaminérgicos; inibidores da catecol-o-metiltransferase
(COMT), como tolcapona e entacapona (Canesi et al., 2008); e amantadina, que
ainda não possui seu mecanismo de ação bem estabelecido, mas que pode ter
suas ações terapêuticas pelo antagonismo do receptor N-Metil-D-Aspartato
(NMDA) (Chaná, 2009; Duty e Jenner, 2011; Ferger et al., 2010; Gottwald e
Aminoff, 2011), reversão dos transportadores de recaptação de noradrenalina
(Sommerauer et al., 2012), potencialização da transmissão GABA (Bido, Marti e
Morari, 2011) e bloqueio da recaptação de serotonina (Paquette et al., 2012).
Apesar dos pacientes apresentarem melhora em sintomas clínicos específicos
apenas com a L-DOPA, é muito comum a combinação de alguns destes
11
tratamentos buscando compreender a diversidade dos sintomas motores e não
motores, assim como reduzir ou minimizar efeitos colaterais da L-DOPA.
Contudo, embora tais tratamentos sejam eficazes em controlar inicialmente os
sintomas, nenhum deles é capaz de deter a progressão da enfermidade (Chaná,
2009), sendo inclusive, no caso da L-DOPA, supostamente tóxicos para os
neurônios dopaminérgicos remanescentes e possivelmente contribuindo para
progressão da doença. No entanto, esta ação ainda não é definitiva, sendo tópico
de profundo debate na literatura por falta de evidências em modelos in-vivo e
estudos clínicos, e com estudos in-vitro sugerindo tanto neuroproteção quanto
toxicidade dopaminérgica a depender da metodologia empregada (Lipski et al.,
2011).
Alternativas para o tratamento da DP têm sido sugeridas e desenvolvidas
com base nos últimos achados em biologia celular e molecular da DP. Estas
novas estratégias incluem a busca por drogas neuroprotetoras ou intervenções
que sejam capazes de impedir a progressão da doença e reverter os déficits
celulares presentes. Dentre os tratamentos candidatos podem-se destacar
inibidores da MAO-B, antioxidantes, fatores tróficos, terapia genética e celular, e
antidiabéticos neuroprotetores, como a pioglitazona (Duty e Jenner, 2011; Kim
et al., 2005; Ulusoy et al., 2011). Neste contexto, novas abordagens para
produzir modelos animais progressivos da DP que reflitam a evolução da
patologia de forma mais aproximada à doença humana se tornam necessárias
para a avaliação do potencial terapêutico de novas estratégias farmacológicas
(Duty e Jenner, 2011). Além disso, estes mesmos modelos também serviriam de
alicerce para a melhor compreensão da fisiopatologia da DP, em especial dos
casos idiopáticos (Sonsalla, Zeevalk e German, 2008).
Com efeito, os modelos animais de doenças neuropsiquiátricas surgiram
com o objetivo de auxiliar a busca de fármacos com ação terapêutica de uma
determinada neuropatologia, mesmo quando os mecanismos fisiopatológicos
fossem pouco compreendidos. Para a DP existe uma grande variedade de
modelos animais, compreendendo desde roedores (Meredith, Sonsalla e
Chesselet, 2008; Sonsalla, Zeevalk e German, 2008) a primatas não-humanos
(Emborg, 2007; Li et al., 2014). Esses modelos contribuíram e ainda contribuem
para o desenvolvimento de técnicas e uso de fármacos para a melhoria da
12
qualidade de vida do portador de DP, sendo, no cenário atual, excelentes
ferramentas de investigação.
Contudo, como sugerido por Paul Willner (1984), estes estudos devem ser
classificados por critérios hierárquicos conforme o tipo de validade que
apresentam. Em ordem crescente são eles: a validade preditiva, em que as
manipulações farmacológicas – especialmente as terapêuticas, que
sabidamente influem na doença – devem ter efeito similar no modelo; a validade
de face, que requer isomorfismo sintomático entre a doença e o modelo; e a
validade de constructo, que requer a existência de constructos teóricos que
relacionem o modelo à fisiopatologia da doença. Neste sentido, ainda não foi
produzido nenhum modelo animal da DP que atenda todos os critérios de
validação, tornando-se necessário a busca por novos delineamentos que
reproduzam a multiplicidade de aspectos da DP. Atualmente, para a produção
de modelos animais da DP em roedores, em geral, duas abordagens são
adotadas: modelos que utilizam fármacos e/ou toxinas para reproduzir a
neurodegeneração e/ou depleção dopaminérgica observada na DP (Duty e
Jenner, 2011; Meredith, Sonsalla e Chesselet, 2008); e modelos que utilizam
técnicas moleculares e genéticas para alterar a expressão de um determinado
gene envolvido na DP (Dawson et al., 2010; Maries et al., 2003). Não obstante,
conforme anteriormente exposto, poucos estudos buscam estudar a interação
entre exposição a toxinas e fatores ambientais ao perfil genético do animal.
Uma das substâncias utilizadas no estudo da DP é a reserpina, um
alcaloide inibidor do transportador vesicular de monoaminas (VMAT2) extraído
da Rauwolfia serpentine capaz de depletar o conteúdo de monoaminas no
sistema nervoso central e desencadear efeitos hipotensores importantes. No
entanto, o uso clínico da reserpina foi seguido da observação de que pacientes
cronicamente tratados com esta substância desenvolviam letargia, depressão e
discinesia. Posteriormente, a reserpina foi utilizada em roedores para reproduzir
prejuízos motores e não-motores relacionados à DP, e estudar a relação destes
com o dano oxidativo causado pela depleção e metabolismo de catecolaminas
(Kim et al., 1999; Silva et al., 2002; Skalisz et al., 2002). Deste modo, o modelo
da reserpina resume elementos importantes da sintomatologia, neuroquímica e
farmacologia da DP.
13
Assim como a maioria dos modelos tóxico-farmacológicos da DP, estudos
com reserpina primeiramente utilizaram a administração aguda de uma dose alta
da substância, induzindo prontamente um comprometimento motor severo
(Baskin e Salamone, 1993; Salamone e Baskin, 1996; Steinpreis e Salamone,
1993), diferente do que ocorre ao longo da progressão da patologia em
humanos. Porém, recentemente, estudos de nosso laboratório propuseram a
administração crônica de reserpina em pequenas doses como um modelo sólido
para a produção do fenótipo parkinsoniano (Fernandes et al., 2012; Santos et
al., 2013). Até então, o tratamento repetido com baixas doses repetidas de
reserpina (Fernandes et al., 2012; Santos et al., 2013) mostrou-se capaz de
produzir déficits motores progressivos, sintomas não motores, dano oxidativo a
lipídios de membrana, depleção de monoaminas e redução na imunoreatividade
para tirosina hidroxilase (TH). Tais fatores sugeriram fortemente a validade de
face e constructo desse modelo frente à fisiopatologia da DP TH.De fato, dados
mais recentes de nosso grupo de pesquisa sugerem que tal modelo é também
útil para o estudo de novas abordagens terapêuticas que retardem a progressão
da manifestação sintomatológica da patologia, como intervenções ambientais e
agentes neuroprotetores (Brandão, 2015; Campêlo, 2013; Sarmento-Silva et al.,
2015). Estes aspectos relativos ao modelo da DP induzido por reserpina serão
explorados com maior escrutíneo no capítulo I desta tese.
Apesar da administração repetida com reserpina causar
comprometimento da função neuronal dopaminérgica na via nigro-estriatal , os
prejuízos motores produzidos por esse protocolo (com a duração de tratamento
e dose até agora testadas) são parcialmente revertidos quando a administração
é interrompida (Santos et al., 2013). Nesse sentido, o processo de recuperação
dos prejuízos motores após a interrupção do tratamento torna-se também um
alvo interessante para o estudo de possíveis intervenções terapêuticas, bem
como a investigaçãode possíveis mecanismos de adaptação plástica dos
sistemas envolvidos na DP. Por outro lado, torna-se também interessante
complementar os estudos com a administração repetida (em baixas doses) de
substâncias que induzam um comprometimento motor gradativo, porém
permanente, tal qual a patologia em humanos. Tal perfil vem sendo abordado
14
com o uso de neurotoxinas, como a 6-hidroxidopamina (6-OHDA) e o 1-metil-4-
fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina (MPTP).
A 6-OHDA é um análogo hidroxilado da DA que possui uma alta afinidade
por neurônios catecolaminérgicos, que resulta de sua recaptação preferencial
por moléculas transportadoras de DA e noradrenalina (NA). No interior dessas
células, a 6-OHDA reduz a atividade de antioxidantes endógenos, como
glutationa (GSH) e superóxido dismutase (SOD), e inibe o complexo I da cadeia
respiratória, aumentando o estresse oxidativo celular e induzindo reações de
oxidação (Schober, 2004). Após a administração da 6-OHDA observam-se
alterações motoras semelhantes às apresentadas na DP (Crofts et al., 2001;
Roeling et al., 1995; Soares-da-Silva e Azevedo, 1988). Como esta toxina é
incapaz de atravessar a barreira hematoencefálica, sua administração deve
ocorrer diretamente no sistema nervoso central. Curiosamente, a 6-OHDA
endógena é encontrada como um metabólito acumulado na urina de pacientes
que sofrem de DP (Andrew et al., 1993). Recentemente, nosso grupo avaliou os
efeitos do tratamento repetido com 6-OHDA em concentrações menores que as
usuais (10µg/µl). Neste regime de administração, foram observados
comprometimento neuronal dopaminérgico associado a uma alteração motora
progressiva, a qual foi precedida por déficits cognitivos (Santos, 2012), conforme
também observado por outros grupos (Matheus et al., 2015, 2016). Ainda, as
alterações neuronais e motoras não foram recuperadas com a interrupção do
tratamento, sugerindo que o protocolo com 6-OHDA pode ser útil para a
investigação de alterações irreversíveis na DP.
Outra toxina frequentemente utilizada é a MPTP, que apresenta ação
seletiva em neurônios dopaminérgicos. O MPTP foi descoberto em uma tentativa
malsucedida de sintetizar heroína em laboratório, que acabou por produzi-la
acidentalmente com o contaminante MPTP. Os indivíduos que se administraram
a substância passaram então a apresentar sintomas da DP três dias após o
contato com a droga. Em 1983, um grupo de jovens também fez uso dessa
droga, ocasionando sintomas semelhantes aos apresentados por portadores da
DP (Langston et al., 1983).
15
Por ser altamente lipossolúvel, a MPTP atravessa facilmente a barreira
hematoencefálica e em células gliais é oxidada à 1-metilfenilpiridina (MPP+) pela
MAO-B. O MPP+ possui grande afinidade pelo transportador de DA, sendo
facilmente conduzido ao interior de neurônios dopaminérgicos, nos quais inibirá
o complexo I da cadeia respiratória mitocondrial, interrompendo assim a cadeia
respiratória (Abou-Sleiman, Muqit e Wood, 2006). Esse processo impede a
produção de ATP, acarretando a elevação do nível de concentração de cálcio e
a liberação de radicais livres que resultará em processos apoptóticos (Hasegawa
et al., 1990; Sriram et al., 1997). Em relação aos demais modelos
farmacológicos, o uso da MPTP é o mais específico porque atua apenas em
neurônios dopaminérgicos (Beal, 2001). Entretanto, seu alto grau de toxicidade,
inclusive para o experimentador, é um importante fator limitante no seu uso em
modelos experimentais. Deste modo, os protocolos que empregam o MPTP em
ratos frequentemente utilizam a administração intracerebral, em vez de
sistêmica, para evitar a liberação de metabólitos tóxicos (Bové et al., 2005) e
também por resultarem em menor toxicidade dopaminérgica quando
administrado de forma sistêmica nesta espécie (Kalaria, Mitchell e Harik,
1987).Por fim, quando a MPTP foi descrita como substância capaz de produzir
degeneração do trato nigro-estriatal através de sua ação sobre o complexo I
mitocondrial, vários pesquisadores foram impulsionados a procurar outras
toxinas com ação mitocondrial que pudessem ser utilizadas como modelo da DP.
A partir disso foi descoberta a rotenona, o paraquat e o maneb, que atuam
inibindo o complexo I e III da cadeia respiratória (Duty e Jenner, 2011). Destes,
a rotenona é o mais amplamente utilizado por produzir lesões dopaminérgicas,
serotoninérgicas e colinérgicas nigro-estriatais, assim como lesões
noradrenérgicas no locus coeruleus (Höglinger et al., 2003) associadas a
prejuízos motores (Betarbet et al., 2000; Cannon et al., 2009; Sherer et al., 2003).
Diferentemente de todos os demais modelos com toxinas, as lesões induzidas
por essa substâncias na SNpc de ratos são acompanhadas por inclusões
citoplasmáticas pálidas e positivas à α-sinucleína e à ubiquitina, que lembram as
formações de corpos de Lewy descritas em cérebros de pacientes com a DP
(Betarbet et al., 2000; Sherer et al., 2003).
16
Genes associados a formas raras de DP hereditário e os processos
regulados por estes são alvos terapêuticos potenciais. Desta forma, a
manipulação genética dos sistemas celulares em animais representa uma
abordagem para a produção de um modelo animal que permita a avaliação de
tratamentos ou intervenções que revertam a atividade celular prejudicada.
Animais com formas mutantes ou superexpressão de genes autossômicos-
dominantes tais como a α-sinucleína e o LRRK2, e knockouts ou knockdown de
genes autossômicos-recessivos como a Parkina, DJ-1 e PINK1 podem ser
utilizados para o estudo da DP, apesar destes modelos representarem apenas
uma porção (5-10%) da população acometida pela doença (Dawson, Ko e
Dawson, 2010; Gao e Hong, 2011).
Uma limitação importante destes modelos é a ausência de degeneração
dos neurônios dopaminérgicos. A superexpressão de α-sinucleína em neurônios
dopaminérgicos (Matsuoka et al., 2001), expressão de α-sinucleína com a região
C-terminal truncada (Wakamatsu et al., 2008) e knockouts dos genes parkina,
PINK1 e DJ-1 (Tohru et al., 2010) são exemplos de tentativas neste âmbito que
não obtiveram sucesso. Contudo, estudos que produziram superexpressão de
α-sinucleína utilizando vetores virais em ratos e primatas não-humanos foram
capazes de desencadear tal neurodegeneração (Bianco et al., 2002; Kirik et al.,
2003).
Tais resultados controversos levantam questões quanto aos mecanismos
que tornam os neurônios dopaminérgicos sensíveis à superexpressão de α-
sinucleína por vetor viral, mas não em abordagens transgênicas. Possíveis
explicações envolvem a presença de fatores de resistência intrínsecos aos
neurônios dopaminérgicos de camundongos à superexpressão de α-sinucleína,
ou o contexto genético da espécie como requisito para tornar os neurônios
dopaminérgicos sensíveis às propriedades tóxicas da superexpressão (Dawson,
Ko e Dawson, 2010). Deste modo, a investigação de diferentes susceptibilidades
para indução do parkinsonismo em linhagens de roedores poderia ajudar a
esclarecer como o perfil genético destas contribuiria para a manifestação das
alterações motoras. Diferente dos estudos que utilizam animais transgênicos ou
vetores virais, a relação de variações naturais entre as linhagens - assim como
o efeito global destas variações - poderia representar melhor a diversidade
17
multigênica da doença em humanos. Portanto, abordagens como esta ajudariam
a esclarecer como fármacos e/ou toxinas podem interagir com o perfil molecular
e genético de uma determinada linhagem para culminar na manifestação das
alterações motoras.
Sabe-se, ainda, que diferentes linhagens de camundongos apresentam
susceptibilidades diferentes à lesão dopaminérgica por MPTP. Logo observou-
se que esta resistência está associada a alelos autossômicos da linhagem
C57BL/J6 (Hamre et al., 1999). Nesse contexto, a expressão de α-sinucleína na
SNpc através de um vetor viral torna ratos sensíveis à rotenona, outra toxina
ambiental que atua sobre a cadeia respiratória (Mulcahy et al., 2013). Deste
modo, torna-se evidente que a interação entre fatores genéticos e exposições a
toxinas podem se mostrar determinantes para a expressão dos déficits motores
e alterações celulares característicos da DP.
Consoante ao exposto anteriormente, por apresentarem algumas
diferenças intrínsecas relacionadas à transmissão dopaminérgica, ratos da
linhagem SHR (Spontaneously Hypertensive Rat) tem sido empregados para o
estudo de doenças relacionadas a alterações dopaminérgicas, como transtorno
do déficit de atenção e hiperatividade e a esquizofrenia (Calzavara et al., 2009;
Viggiano, Vallone e Sadile, 2004). Deste modo, ratos SHR adultos apresentam
maior quantidade de receptores para dopamina D1 e DAT no estriado
(Watanabe, Yoshiyuki et al., 1997), mas função reduzida deste último (Russell,
2003). Ainda, estes apresentam expressão reduzida de TH no córtex pré-frontal
(King et al., 2000) dentre outras alterações (para revisão, ver Viggiano et al,
2004). No entanto, deve-se destacar que os estudos supracitados foram
conduzidos pela comparação com a linhagem normotensa controle para o SHR,
o Wistar-Kyoto (WKY). Ainda que esta seja a linhagem apropriada como controle
para estudos de hipertensão inata, o WKY apresenta desregulação do eixo
hipotalâmico-pituitário-adrenal (HPA) e resposta exacerbada ao estresse. Sendo
assim, as individualidades comportamentais do WKY compreendem aumento de
imobilidade no teste de natação forçada, atividade reduzida no campo aberto, e
pior desempenho na tarefa de enterramento defensivo em comparação a outras
linhagens (Will, Aird e Redei, 2003). Portanto, o WKY passou a ser proposto como
um bom modelo para depressão, e a sua validade como controle para estudos
18
neuroquímicos de implicação comportamental para SHR passou a ser
questionada. Sendo assim, outros grupos passaram a empregar a linhagem
heterogênica Wistar como controle para estudos comportamentais com o SHR
(Abílio et al., 2004; Calzavara et al., 2009; Dommett e Rostron, 2013;
Gauthier et al., 2014; Queiroz, Piovezan e Frussa-Filho, 1998). Nestes
estudos já se evidenciou que a linhagem SHR apresenta maior liberação e
metabolização basal de dopamina na região shell do núcleo accumbens
(Santos et al., dados não publicados), e resistência à indução de discinesia oral
por reserpina, associada a um aumento da atividade da catalase, enzima de
proteção oxidativa contra o aumento do peróxido de hidrogênio resultante do
metabolismo de catecolaminas (Abílio et al., 2004; Queiroz, Piovezan e Frussa-
Filho, 1998).
Sendo assim, em vista do exposto, se aspectos genéticos são
importantes para a expressão das alterações comportamentais e
neuroquímicas relacionados à DP, esperamos que diferentes linhagens de
ratos apresentem susceptibilidade diferenciada para a indução destas
alterações por um modelo tóxico-farmacológico da DP. Deste modo, a
comparação para a indução de modelos tóxico-farmacológicos da DP em ratos
Wistar e SHR pode ser útil para a investigação das bases celulares, genéticas
e neuroquímicas de uma possível diferença de susceptibilidade à DP, com
importantes implicações para futuras estratégias preventivas e/ou terapêuticas.
A seguir, apresentaremos a aplicação do modelo progressivo para a DP
induzido pela administração de baixas doses repetidas de reserpina em ratos
Wistar e SHR. Este estudo compreenderá alterações comportamentais e
neuroquímicas de importância para a DP, que serão discutidas em termos de
valor potencial para compreensão da fisiopatologia e/ou intervenção
terapêutica.
19
3. OBJETIVO GERAL
O seguinte trabalho tem o objetivo de avaliar se diferentes linhagens de
ratos (Wistar e SHR) se comportam diferentemente quanto à susceptibilidade
para a indução de alterações comportamentais e neuroquímicas frente a um
modelo progressivo da Doença de Parkinson pela administração de uma dose
baixa de reserpina, capaz de causar depleção de monoaminas e a diminuição
da imunoreatividade para tirosina hidroxilase em áreas cerebrais de interesse
para o estudo da DP. Pretendeu-se, ao longo do tratamento, avaliar o
desenvolvimento dos prejuízos motores nas diferentes linhagens de ratos,
comparando-as para a sua susceptibilidade ao desenvolvimento dos déficits
esperados. Os testes motores aqui empregados buscaram compreender
paradigmas clássicos para a avaliação de diferentes dimensões motoras em
modelos animais de doenças neurodegenerativas. Após as avaliações motoras
os encéfalos destes animais foram destinados a análises neuroquímicas para a
investigação das diferenças celulares intrínsecas e/ou resultantes do tratamento
entre estas linhagens. O produto deste estudo será compilado em três capítulos,
que apresentarão as metodologias e objetivos específicos de cada estudo. Em
resumo, o Capítulo I – “Molecular, Neurochemical, and Behavioral Hallmarks
of Reserpine as a Model for Parkinson’s Disease: New Perspectives to a
Long-Standing Model”, consistirá em um artigo de revisão já publicado que
buscou fornecer um panorama detalhado dos principais achados clássicos e
recentes a respeito do uso da reserpina para o estudo da DP em modelos
animais. Esta revisão também buscou compilar possíveis vias neuroquímicas
pelas quais a reserpina produziria as alterações celulares e comportamentais
evidenciadas. O Capítulo II – “Spontaneously hypertensive rats (SHR) are
resistant to a reserpine-induced progressive model of Parkinson’s disease:
role of tyrosine hydroxylase and α-synuclein expression.”, será apresentado
em forma de manuscrito em formato destinado a publicação. Neste capítulo
comparamos ratos Wistar e SHR sob o tratamento com baixas doses de
reserpina e caracterizamos as alterações motoras e a expressão de tirosina
hidroxilase e α-sinucleína para o tratamento com reserpina nestas linhagens de
ratos. O Capítulo III – “Efeitos do tratamento crônico e agudo com reserpina
sobre parâmetros motores, conteúdo total de monoaminas, e peroxidação
lipídica em ratos Wistar e SHR.”, é uma extensão da caracterização das
alterações neuroquímicas encontradas no Capítulo II. Aqui buscamos ampliar as
bases neuroquímicas para as diferenças comportamentais descritas,
investigando o conteúdo total de monoaminas e seus metabólitos e a produção
de peróxidos de lipídios, um indicador de estresse oxidativo, resultante do
tratamento com reserpina nas linhagens Wistar e SHR.
20
4. CAPÍTULO I
Molecular, Neurochemical, and Behavioral Hallmarks of
Reserpine as a Model for Parkinson’s Disease: New
Perspectives to a Long-Standing Model.
“Man in his arrogance thinks himself a great
work worthy the interposition of a deity. More
humble and I think truer to consider him
created from animals.” Charles Darwin
21
4.1. INTRODUÇÃO
A administração de reserpina – um inibidor do transportador vesicular de
monoaminas (VMAT2) – a roedores foi um dos primeiros modelos animais
utilizados para investigar a fisiopatologia e potenciais tratamentos para a Doença
de Parkinson (DP). A reserpina é um alcaloide extraído da Rauwolfia serpentine,
e foi primeiramente utilizada como uma potente droga anti-hipertensiva por sua
capacidade em depletora de monoaminas (Freis, 1954; McQueen, Doye e Smirk,
1954; Peter et al., 1994). O uso crônico da reserpina para a tratamento da
hipertensão levou à observação de que pacientes cronicamente tratados
desenvolviam letargia, depressão, e discinesias motoras, implicando o sistema
monoaminérgico na patofisiologia de distúrbios motores e afetivos (Freis, 1954;
Kane e Smith, 1982). Por esta razão a reserpina foi utilizada para emular
prejuízos motores e não-motores na DP, assim como a eficiência dos atuais
tratamentos para a DP, tais como L-DOPA e agonistas dopaminérgicos (Baskin
e Salamone, 1993; Carlsson, Lindqvist e Magnusson, 1957; Carlsson e Carlsson,
1989; Colpaert, 1987; Fernagut et al., 2002; Salamone e Baskin, 1996; Skalisz
et al., 2002). No entanto, com a introdução de modelos animais tóxico-
farmacológicos e genéticos da DP, a reserpina passou a ser subutilizada para
este fim sob o argumento de uma suposta ausência de validade de constructo
com a DP (Duty e Jenner, 2011).
Apesar da robusta validade de face e preditiva, este abandono é baseado
nas observações experimentais de que (1) a reserpina não induz
neurodegeneração e agregação de proteínas (Duty e Jenner, 2011; Yadav et al.,
2012); (2) o desempenho motor, conteúdo de monoaminas, e imunoreatividade
para TH são parcialmente restaurados após interrupção do tratamento (Oe,
Tsukamoto e Nagakura, 2010; Santos et al., 2013), e (3) a reserpina é desprovida
de especificidade quanto à neurotransmissão acometida (Arora e Chopra, 2013;
Arora et al., 2011; Liu et al., 2014; Neisewander, Lucki e McGonigle, 1991).
No entanto, uma revisão detalhada da literatura clássica e moderna a
respeito das alterações celulares resultantes do tratamento com reserpina
revelam que esta reproduz elementos chave da neuroquímica e fisiopatologia da
DP. Do modo sucinto, o tratamento com reserpina é capaz de induzir (1)
depleção de monoaminas, (2) estresse oxidativo, (3) neuroinflamação, (4)
22
comprometimento com vias pró-apoptóticas, (5) redução da imunorreatividade
para tirosina hidroxilase, e aumento para α-sinucleína, (6) e supra-regulação de
receptores de DA (Fernandes et al., 2012; Lee et al., 2015; Santos et al., 2013)
(Arora e Chopra, 2013; Arora et al., 2011; El-Ghazaly et al., 2013; Liu et al., 2014;
Neisewander, Castañeda e Davis, 1994; Neisewander, Lucki e McGonigle, 1991;
Traub et al., 1986). Apesar de ainda não haver nenhuma evidência de alguns
elementos importantes da patofisiologia da DP em modelos animais de roedores
– tais como agregação proteica, dano celular permanente, e neurodegeneração
– evidências recentes apontaram para a perda de neurônios dopaminérgicos,
inibição do fluxo-autofágico, e acúmulo de proteínas em vesículas autofágicas
em um modelo animal com Drosophila melanogaster (Lee et al., 2015). Ainda, a
maioria das alterações neuroquímicas induzidas pela reserpina são claramente
reminiscentes da patofisiologia da DP e, portanto, possuem uma semelhança
satisfatória com a fenomenologia da DP.
Por outro lado, evidências experimentais com o tratamento a longo-prazo
com reserpina (1 mg/kg de reserpina em dias alternados por seis semanas)
resultaram em alterações comportamentais e neuroquímicas persistentes – por
exemplo, discinesia oral, depleção de DA, e supra-regulação de receptores D1
e D2 - até 60 dias após interrupção do tratamento (Neisewander, Lucki e
McGonigle, 1991). Portanto, não podemos descartar a possibilidade de algum
nível de dano ou morte celular irreversível após o tratamento com reserpina,
dependendo da dose e/ou duração do tratamento.
Em conformidade com o exposto, camundongos geneticamente
deficientes para o VMAT2 – que expressam apenas 5% de VMAT2 funcional –
apresentam neurodegeneração, seguido de acúmulo de α-sinucleína e redução
da imunoreatividade para o TH e o transportador de tiramina. Este camundongo
deficiente para VMAT2 também apresenta prejuízos motores sensíveis ao
tratamento do L-DOPA, aumento em duas vezes na concentração de DA no
citosol, redução na fosforilação de TH associada com o feedback
catecolaminérgico, 95% de depleção de DA, e aumento do metabolismo
(turnover) de DA (Colebrooke et al., 2006; Mooslehner et al., 2001; Taylor et al.,
2009). Ainda mais, estas alterações são acompanhadas por prejuízos não-
motores, tais como déficit em discriminação olfatória, esvaziamento gástrico
atrasado, alteração da latência para o sono, comportamento tipo ansioso e
23
depressivo dependente da idade (Taylor et al., 2009). Em resumo, todas as
alterações comportamentais e neuroquímicas em camundongos deficientes para
VMAT2 retomam os efeitos do tratamento com reserpina. Como ambos os
modelos são similares em termos de constructo funcional, nós especulamos que
algum nível de neurodegeneração é plausível com o bloqueio a longo-prazo do
VMAT2 com o tratamento com reserpina.
O prospecto exposto das alterações comportamentais, farmacológicas e
neuroquímicas induzidas pela reserpina reafirmam o seu uso como um modelo
valioso e promissor para o estudo da DP. Portanto, a subutilização da reserpina
para investigar elementos da DP deve ser reconsiderada. Ainda, é importante
destacar que o uso da reserpina tem relevância importante para a compreensão
da funcionalidade do VMAT2 na DP em humanos. Como já demonstrado,
polimorfismos em regiões promotoras do gene que aumenta a transcrição deste
transportador são protetores contra a DP (Brighina et al., 2013; Glatt et al., 2006)
e a redução em VMAT2 e o seu mRNA em neurônios nigroestriatais foram
descritos em pacientes acometidas pela DP (Harrington et al., 1996; Miller et al.,
1999). Ainda, o VMAT2 está presente em corpos de Lewy na SN de pacientes
(Yamamoto et al., 2006) e neurônios dopaminérgicos da VTA poupados na DP
carregam níveis maiores de VMAT2 (Miller et al., 1999). Finalmente, o aumento
citoplasmático de DA influencia o estado conformacional da α-sinucleína,
promovendo a estabilização de sua forma patogênica (Follmer et al., 2007; Li et
al., 2005). Portanto, a expressão funcional de VMAT2 é protetora contra a
neurodegeneração dopaminérgica, enquanto o bloqueio a longo prazo pode
representar uma abordagem interessante para a produção de modelos animais
da DP.
Esta revisão se destinará a destacar as novas perspectivas para o
modelo, e argumentar contra o consenso atual para a sua subutilização. Aqui,
nós destacamos achados experimentais que apoiam a validade de face,
preditiva, e de constructo do modelo de DP induzido por reserpina e
argumentamos contra o consenso atual para a sua subutilização. Nós também
focamos em fornecer nova perspectivas sobre o modelo pela discussão dos
principais desafios e potenciais para este modelo.
24
4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
A seguinte revisão bibliográfica teve o propósito de reunir os achados
moleculares, neuroquímicos, e comportamentais produzidos pela administração
de reserpina da literatura clássica e moderna. A compilação destas evidências
nos permitiu traçar potenciais vias celulares para a progressão do dano celular,
assim como propor alvos celulares para a investigação de novos agentes
terapêuticos para a DP. Estas evidências foram também discutidas nos termos
de validade preditiva, de face, e constructo de Paul Willner (1984), permitindo a
o delineamento de um paralelo com outros modelos toxico-farmacológicos da
Doença de Parkinson.
25
4.3. ARTIGO DE REVISÃO (DOI: 10.1111/bpa.12253) PUBLICADO NO
PERIÓDICO BRAIN PATHOLOGY (ISSN: 1750-3639).
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5. CAPÍTULO II
Spontaneously hypertensive rats (SHR) are resistant to a
reserpine-induced progressive model of Parkinson’s disease:
role of tyrosine hydroxylase and α-synuclein expression.
“We are storytelling animals, and cannot bear to acknowledge the
ordinariness of our daily lives.” Stephen Jay Gould
41
5.1. INTRODUÇÃO
Conforme anteriormente exposto, a reserpina se mostrou um fármaco útil
para o estudo das alterações neuroquímicas e investigação de tratamentos para
a DP. No entanto, parte substancial dos estudos conduzidos com esta substância
utilizaram regimes agudos de tratamento com doses altas da substância (1,0 à
5,0 mg/kg) (Baskin & Salamone, 1993; Salamone & Baskin, 1996; Steinpreis &
Salamone, 1993), diferente do que ocorre ao longo da progressão desta
patologia em humanos.
Desde modo, nosso grupo de pesquisa têm-se empenhado em um
esforço para a validação da administração repetida de reserpina em pequenas
doses (0,1 mg/kg) como um modelo sólido para a produção do parkinsonismo
em roedores. Neste regime de administração, a reserpina produziu aumento nos
níveis de peroxidação lipídica; diminuição dos níveis de tirosina hidroxilase no
estriado e substância nigra; e um perfil progressivo de comprometimento motor,
antecedido por alterações cognitivas (memória de reconhecimento) (Fernandes
et al., 2012; Santos et al., 2013). Ainda, uma única administração de reserpina
na referida dose também foi capaz de produzir déficits de medo condicionado
(Fernandes et al., 2008). Do mesmo modo, dados recentes de nosso grupo
sugerem que tal modelo também é útil para o estudo de novas abordagens
terapêuticas que retardem a progressão da manifestação sintomatológica da
patologia, como o uso de anti-oxidantes (Sarmento-Silva et al., 2015) e
enriquecimento ambiental (Campêlo, 2013).
Utilizando o protocolo agudo de administração da reserpina, Queiroz et al.
(1998) demonstrou que ratos SHR não desenvolvem a discinesia oral. Essa
alteração motora em ratos modela um distúrbio motor característico do
envelhecimento, tratamento crônico com neurolépticos ou efeito colateral do
tratamento da DP com L-dopa (Jenner, 2008; Steinpreis & Salamone, 1993).
Entretanto, a discinesia também é componente importante da DP (Jicha &
Salamone, 1991; Paillé et al., 2004). Abílio et al. (2004), então, relacionaram
essa resistência dos SHR a um aumento da atividade da catalase nesta linhagem
quando comparada a linhagem Wistar. Paralelamente, anti-oxidantes conferem
proteção contra a discinesia oral induzida por reserpina (Faria et al., 2005). O
42
tratamento repetido com baixas doses de reserpina também é capaz de induzir
um aumento progressivo na discinesia oral em ratos Wistar, que surge associado
a aumento da peroxidação lipídica no estriado (Fernandes et al., 2012).
Como anteriormente discutido, ratos SHR também apresentam diversas
alterações quanto a sua transmissão dopaminérgica (Viggiano, Vallone e Sadile,
2004). Portanto, os efeitos da reserpina sobre esta linhagem pode não estar
somente limitada a diferenças no sistema de proteção contra estresse oxidativo,
mas também quanto a diferenças na resposta farmacológica à depleção de
dopamina.
Portanto, neste trabalho propomos investigar se ratos da linhagem SHR
também se mostrarão resistentes aos efeitos motores do tratamento repetido
com baixas doses de reserpina, conforme estabelecido por Fernandes et al.
(2012). Ainda, também será estudado se diferenças para expressão dos
prejuízos motores e cognitivos estão relacionados à expressão da tirosina
hidroxilase (TH), a enzima responsável pela etapa limitante da síntese de
dopamina (Feve, 2012), e da α-sinucleína, proteína de importância
fisiopatológica para a DP e função sináptica dopaminérgica (Wood-Kaczmar,
Gandhi e Wood, 2006).
43
5.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Comparar a susceptibilidade das linhagens Wistar e SHR para o
desenvolvimento das alterações induzidas pelo tratamento repetido com uma
dose baixa de reserpina (0,1 mg/kg).
Objetivos específicos
a) Avaliar possíveis diferenças temporais e de magnitude para a expressão
das alterações motoras (catalepsia, atividade espontânea em campo aberto, e
discinesia oral) entre as linhagens Wistar e SHR ao longo e após o tratamento
repetido com reserpina.
b) Comparar os efeitos do tratamento com reserpina sobre os níveis de
tirosina hidroxilase (TH), α-sinucleína em áreas cerebrais de importância
(estriado e substantia nigra) entre as linhagens Wistar e SHR.
c) Investigar possíveis correlações entre as alterações motoras e os níveis
de TH e α-sinucleína em ambas as linhagens
44
5.3. MANUSCRITO FORMATADO PARA SUBMISSÃO.
Spontaneously hypertensive rats (SHR) are resistant to a reserpine-
induced progressive model of Parkinson’s disease: role of tyrosine
hydroxylase and α-synuclein expression.
Anderson H.F.F.Leão¹,², Ywlliane S. R. Meurer¹, Anatildes F. da Silva², André M.
Medeiros³, Clarissa L.C. Campêlo¹, Vanessa C. Abílio4, Rovena C.G.K.
Engelberth5, Jeferson S. Cavalcante5, Geison S. Izídio6, Alessandra M. Ribeiro7,
Regina H. Silva1,³.
¹Memory Studies Laboratory, Department of Physiology, Federal University of
Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brazil.
²Brain Institute, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brazil.
3Behavioral Neuroscience Laboratory, Department of Pharmacology, Federal
University of São Paulo, São Paulo, SP, Brazil.
4Clinical Neuroscience Interdisciplinary Laboratory (LiNC), Department of
Psychiatry, Federal University of São Paulo, São Paulo, Brazil
5Neurochemical Studies Laboratory, Department of Physiology, Federal
University of Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brazil.
6Laboratory of Behavioral Genetics, Department of Cellular Biology, Embryology
and Genetics, Federal University of Santa Catarina, Florianopolis, SC, Brazil
7Department of Biosciences, Federal University of São Paulo, Santos, SP, Brazil
*Corresponding Author
Departamento de Farmacologia– UNIFESP
Rua Botucatu, 862, Edifício Leal Prado, 1º.andar
CEP 04023062 - São Paulo, SP, Brasil
Email: reginahsilva@gmail.com
45
ABSTRACT
Reserpine is an irreversible inhibitor of VMAT2 that has been used to study
Parkinson’s disease (PD) and screening for antiparkinsonian treatments in
rodents. Recently, the repeated treatment with a low-dose of reserpine was
proposed as a progressive model of PD because rats under this treatment show
progressive catalepsy behavior, oral movements and spontaneous motor activity
decrement. In parallel, compared to Wistar rats, Spontaneously Hypertensive
Rats (SHR) are resistant to acute reserpine-induced oral dyskinesia. In view of
these findings, we aimed to assess whether SHR would present differential
susceptibility to repeated reserpine-induced deficits in the progressive model of
PD. We submitted male Wistar and SHR rats to repeated-reserpine treatment (15
s.c. injections of 0.1 mg/kg, every other day) and assessed motor activity in the
catalepsy test, oral movements test and spontaneous activity on the open field.
Only reserpine-treated Wistar rats presented increased latency to step down on
the catalepsy test and impaired spontaneous activity in the open field. On the
other hand, oral movements test revealed increase in oral movements in both
reserpine-treated strains, but reduced magnitude and latency to impairment
instauration in the SHR strain. We also allowed a 15-day withdrawn period to
assess motor impairment recovery. Both strains recovered motor impairment, but
SHR animals expressed reduced latencies to reach control levels. Finally, we
performed immunohistochemistry for tyrosine hydroxylase (TH) and α-synuclein
(α-syn) 48h after the last injection or 15 days after withdrawn. Reserpine-treated
animals presented a reduction in TH and an increase in α-syn immunoreactivity
in the substantia nigra and dorsal striatum, which were both recovered after 15
days of withdraw. Furthermore, SHR rats were resistant to TH decrement in the
substantia nigra, and presented reduced immunoreactivity to α-syn in the dorsal
striatum relative to Wistar rats. In conclusion, the current results show that SHR
are resilient to motor and neurochemical impairments induced by the repeated
low-dose reserpine protocol. These findings indicate that the neurochemical,
molecular and genetic differences in the SHR strain are potential relevant targets
to the study of susceptibility to PD.
KEYWORDS
Reserpine, Parkinson’s Disease, SHR, α-synuclein, tyrosine hydroxylase.
46
1. INTRODUCTION
Parkinson disease (PD) is the second most prevalent neurodegenerative
disease, estimated to affect 1-2% of those older than 60 years, and seven to ten
million people worldwide (Mayeux, 2003; Van Den Eeden, 2003). Most
importantly, it is a disorder with progressive onset and escalating deterioration of
life quality (Braak et al., 2003). Therefore, the resulting social and economic
burden to countries with increasing life expectancy nourish a growing scientific
effort to understand its physiopathology.
The disease is characterized by motor impairments including muscular
weakness, rigidity, postural instability, tremors and bradykinesia (Duty and
Jenner, 2011; Klockgether, 2004). However, non-motor alterations such as
anxiety, depression, anhedonia, deficit in executive function, dementia and sleep
disturbances are also present (Barone, 2011; Bowers et al., 2006; Comella, 2003;
Gómez-Esteban et al., 2011; Ishihara and Brayne, 2006; Schneider et al., 2003;
Voon and Dalley, 2011). The symptoms are mostly the result of the progressive
and irreversible loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra pars
compacta (SNpc) and other dopaminergic nuclei (Wood-Kaczmar et al., 2006).
Such loss of dopaminergic inputs concurrently progresses with the accumulation
of intracellular α-synuclein-rich protein inclusions, known as Lewy bodies
(Lotharius and Brundin, 2002; Mcnaught et al., 2001).
The scientific literature highlight a number of genes associated to the
heritance of PD, such as α-synuclein, parkin, PINK1, DJ-1 and LRRK.
Nevertheless, explicit inheritage explains only 10-15% of the cases (Gao and
Hong, 2011). The majority of cases are reported as idiopathic or sporadic forms,
which are associated to environmental factors, such as exposition to pesticides,
rural life, infection, head trauma, and emotional dysfunctions such as anxiety and
depression (Godeiro et al., 2010; Noyce et al., 2012). Nonetheless, these
epidemiological findings suggest that there are cumulative interactions between
genetic and environmental factors that lead to the disease instauration (Kim et
al., 2005).
Despite many animal studies approach the genetic and environmental factors of
PD, few of them investigate the interaction between those factos upon the
47
expression of the parkinsonian phenotype. A study associated the resistance to
the dopaminergic insult by MPTP to autosomic alleles of the C57BL/J6 mice
strain (Hamre et al., 1999). Similarly, SHR (Spontaneously Hypertensive Rat)
rats are resistant to the reserpine-induced oral dyskinesia. Further, this
resistence was suggested to be related to the activity of the reactive oxygen
species (ROS) protective enzyme catalase (Abílio et al., 2004; Queiroz et al.,
1998).
Reserpine is a vesicular monoamine transporter-2 (VMAT2) inhibitor
extracted from Rauwolfia serpentine, which is able to deplete monoamines in the
central nervous system and produce lethargy, depression and dyskinesia (Leão
et al., 2015). Due to these properties, the reserpine was employed to model the
motor and non-motor deficits related to PD in rodents and screen for candidate
pharmacological treatments to PD (Fernandes et al., 2012; Leão et al., 2015;
Santos et al., 2013). Briefly, the reserpine model recapitulates substantial
features of symptomatology, neurochemistry and pharmacology of the disease
(for a review, see Leão et al. 2015). Recently, we have proposed a repeated low-
dose of reserpine protocol able to produce progressive motor and non-motor
symptoms, oxidative damage to membrane lipids, monoamine depletion and
reduction in tyrosine hydroxylase staining (Fernandes et al., 2012; Leão et al.,
2015; Santos et al., 2013).
In view of these findings, we suggest that the comparison between SHR
and Wistar rats provides understanding of susceptibility mechanisms of PD.
Thus, we aimed to compare the development of motor alterations and the
neurochemical expression of tyrosine hydroxylase and α-synuclein between SHR
and Wistar rats submitted to the repeated low-dose reserpine treatment protocol.
48
2. MATERIAL AND METHODS
2.1. Animals
We used 7-month-old male Wistar and SHR rats. All animals were housed
in groups of 4–5 per cage (30 cm × 37 cm × 16 cm) under conditions of acoustic
isolation and controlled airflow and temperature (23 ± 1◦ C), with a 12 h light/12
h dark cycle (lights on 6:30 a.m.). Food and water were available ad libitum.
Animals used in this study were handled in accordance with the guidelines of the
Brazilian law for the use of animals in research (Law Number 11.794). All
procedures were approved by the local ethics committee (CEUA-UFRN,
#005/2014) and conducted to minimize animal pain, suffering or discomfort.
2.2. Drugs and general procedures
Reserpine (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) was dissolved in two
drops of glacial acetic acid and diluted in distilled water (0.1 mg/ml). Vehicle
consisted of the same amount of acetic acid and water as in the reserpine
solution. These solutions were injected subcutaneously (s.c.). We briefly handled
animals for 2 min during 3 days before the beginning of the experimental
procedures.
2.3. Experimental design
The rats from each strain (Wistar and SHR) were randomly assigned to
one of three groups: control (WIS-CTR: n = 8; SHR-CTR: n = 10), reserpine-
treated (WIS-RESt: n = 8; SHR-RESt: n = 10) and reserpine-withdrawn (WIS-
RESw/d: n = 8; SHR-RESw/d: n = 10) groups. The animals received 15
subcutaneous injections of vehicle (CTR) or 0.1 mg/kg of reserpine (RESt and
RESw/d) at a volume of 1 ml/kg body weight, every other day. The rats of the
RESt group were euthanized 48 h after the 15th injection, while CTR and RESw
animals were euthanized 15 days after the 15th injection, for
immunohistochemmical procedures. Motor behavior data from RESt and RESw/d
were considered together for analysis until RESt group was euthanized (RES
group). Rats were submitted to the following behavioral procedures (from 8h00
49
to 16h00): (1) catalepsy test before the 1st injection and every other day (8h00-
9h00) throughout the treatment and for 15 days after the last injection; (2)
evaluation of spontaneous activity in the open field after the 2nd, 6th, and 15th
injections, and 15 days after withdraw (9h00-12h00); and (3) oral movements
quantification after the 2nd, 6th, 10th and 15th injection, and 10 and 15 days after
withdraw (13h00-16h00). The behavioral tests listed were performed
approximately 48 h after the referred injection, before the animals received the
following injection (16h00-17h00). Experimental design is shown in Fig. 1A.
Figure 1
Figure 1. (A) Schematic representation of the experimental design. (B) Effects of
repeated administration of 0.1 mg/kg reserpine on catalepsy behavior in Wistar
and SHR rats. Data are expressed as mean ± SEM relative to WIS-CTR group. *
p < 0.05 comparing WIS-RES to WIS-CTR (GLM with repeated measures
followed by Sidak’s post-hoc test).
50
2.4. Motor behavior
2.4.1. Catalepsy test
The catalepsy behavior was assessed by placing the animal’s forepaws
on a horizontal bar positioned at 9 cm above the bench surface. The duration of
catalepsy, which was defined as an immobile posture, keeping both forepaws on
the bar, was measured up to a maximum of 180 s. Three trials were carried out
for each animal in each observation day and the results were analyzed
considering the mean value of the three trials.
2.4.2. Spontaneous activity in the open field
The apparatus was a circular open field arena (84 cm in diameter) with 32
cm high walls, made of wood and covered in black laminated plastic. Animals
were placed in the center of the apparatus and allowed to explore for 5 min. A
digital camera above the apparatus recorded the sessions and an animal tracking
software (ANY-maze, Stoelting, USA) registered the behavioral parameters. We
quantified the distance traveled in the arena (in meters), the time in the center of
the open field (in seconds), and the time moving above the speed of 0.05 m/s in
the apparatus (in seconds).
2.4.3. Oral movements
We individually placed rats in a wired cage (40 cm x 40.5 cm x 20 cm) with
mirrors positioned under the floor and behind the back wall of the cage to allow
behavioral quantification when the animal faced away from the observer. The
number of tongue protrusions (projection of the tongue out of the oral cavity), and
the frequency of vacuous chewing movements (mouth openings in the vertical
plane not directed toward physical material), were measured continuously for 10
min.
2.5. TH and α-syn immunohistochemistry
Upon completion of the behavioral procedures, all animals were deeply
anesthetized with intraperitoneal injection of sodium thiopental (40 mg/kg) and
51
perfused transcardially with 200 ml phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4,
containing 500 IU heparin (Liquemin, Roche, Brazil), followed by 300 ml 4.0%
paraformaldehyde in 0.1 M phosphate buffer, pH 7.4. The brains were removed
from the skull, postfixed in the same fixative solution for 2–4 h, and transferred to
a solution containing sucrose 30% in 0.1 M PBS, pH 7.4. Each brain was serially
cut in the coronal plane into 50-µm thick sections with a cryostat microtome
(Leica, Germany) at a temperature of −20◦C. The sections were placed
sequentially in five compartments (one section per compartment), with the
distance between one section and the next in the same compartment being
approximately 250-µm. All sections in the five compartments were stored in
antifreeze solution. Free-floating sections were incubated for 18–24h with a
polyclonal anti-TH (cat # AB152 Chemicon, USA, 1:10,000, as described by [24])
or anti-α-syn (cat # sc-7011-R, Santa Cruz Inc., USA, 1:500) primary antibody
raised in rabbits, containing 2% goat normal serum diluted in 0.3% Triton X-100
and 0.1 M phosphate buffer, pH 7.4. Afterwards, we incubated the sections with
the biotinylated secondary antibody anti-rabbit (1:1000; cat # S-1000 Vector
Labs, USA) obtained in goat for 2 h at room temperature, washed, and incubated
with avidin–biotin-peroxidase solution (ABC Elite kit, Vector Labs, Burlingame,
USA) for 90 min. The reaction was developed by the addition of diaminobenzidine
tetrahydrochloride (Sigma, USA) and 0.01% H2O2 in 0.1 M phosphate buffer, pH
7.4. The sections were washed (4×, 5 min) with 0.1 M phosphate buffer, pH 7.4,
between each step and at the end of the procedure. Then, the sections were
dried, dehydrated in a graded alcohol series, cleared in xylene, and cover slipped
with Entellan (Merck). The immunostainings were performed in four sessions with
balanced number of animals per group in each session, minimizing possible
differences in background between the groups due to small variations in
immunostaining. Sections were examined under brightfield illumination (Olympus
Microscope, BX-41), images were captured using a CCD camera (Nikon, DXM-
1200) and the locations of areas were determined using the atlas of Paxinos and
Watson (Paxinos and Watson, 2009).
2.6. Immunohistochemistry quantification
In order to estimate the number of dopaminergic cells in the SNpc four
sections of each animal were selected: one at the rostral level, two at medium
52
level and one at caudal level, representative of the rostrocaudal extension of each
area of interest. The exact location of the regions was determined on the basis of
the Paxinos and Watson rat brain atlas (2009). The TH+ cell count was performed
for the whole extension of the evaluated regions within each section as described
by Santos et al. (2013).
Additionally, TH and α-syn levels were assessed by analysis of relative
optical densitometry (ROD) in the dorsal striatum (dSTR) and substantia nigra
pars reticulada (SNpr) using the software Image J (Version 1.46i, NIH). Four
representative sections of the rostrocaudal extension of each region were
chosen. In each section, 5 fields evenly distributed throughout the areas of
interest and control region were analyzed. The medium pixels in the target area
were subtracted from de medium values of a control region (areas that should not
have specific TH staining) of the same tissue (cortex or corpus calosum). Finally,
all values were normalized considering the control group, in order to evaluate
proportional alterations (Santos et al., 2013).
2.6. Data analysis
All data were tested for normality by Kolmogorov-Smirnov’s test and
homogeneity of variance by Levene’s test. Parametric tests were used
accordingly to data distribution and homogeneity of variance. GLM (General
Linear Model) with repeated measures - with treatment and strain as between
subject factors and sessions as within factor - was applied to catalepsy, open
field and oral movement motor parameters to assess effects throughout
treatment and withdraw phases. A GLM was applied to immunohistochemistry
parameters with treatment and strain as between-subject factors. Both tests were
followed by Sidak’s post-hoc test to highlight differences between strain and
treatment groups. We also conducted a Pearson’s correlation test between all
motor and neurochemical parameters in each rat strain. We expressed results as
mean ± S.E.M. and p < 0.05 was considered to reflect significant differences.
53
3. RESULTS
3.1. Motor Behavior
3.1.1. Catalepsy test
GLM with repeated measures revealed effects of session
[F(15,750)=3.187; p<0.001], session*strain [F(15,750)=2.766; p<0.001],
session*treatment [F(15,750)=3.162; p<0.001], time*treatment*strain
[F(15,750)=1.950; p=0.016] interactions, and treatment [F(1,50)=4.151);
p=0.047] during the treatment phase. The same analysis to the withdraw phase
found effect of time [F(6,192)=2.120); p=0.053], and treatment [F(1,32)=3.342);
p=0.077]. Sidak’s post-hoc test yielded differences only to WIS-RES group, with
animals spending more time in the bar than any other group from 48h after the
7th injection (day 17) to 48h after the 15th injection (day 31) of reserpine (Figure
1B).
3.1.2. Spontaneous locomotion in the open field
3.1.2.1. Total Distance Travelled
GLM with repeated measures to total distance travelled in the treatment
phase revealed effects of treatment [F(1,50)=6.18; p=0.016], session
[F(2,100)=69.17; p<0.001], session*treatment [F(2,100)=3.37; p=0.038],
session*strain interactions [F(2,100)=3.21; p=0.044]. The GLM to the withdraw
phase did not found significant effects. Differences between groups in each time
point is yielded by Sidak’s post-hoc test and shown in Figure 2A. Briefly, only
WIS-RES group travelled a shorter distance relative to WIS-CTR group 48h after
the 15th injection.
3.1.3.2. Speed above 0.05 m/s
GLM with repeated measures in the treatment phase to time with speed
above 0.05 m/s revealed effects of session [F(2,100)=29.26; p<0.001], and
session*strain interaction [F(2,100)=3.08; p=0.05]. The GLM to the withdraw
phase did not found significant effects. Differences between groups in each time
54
point is yielded by Sidak’s post-hoc test and shown in Figure 2B. Briefly, only
WIS-RES group spent less time moving above 0.05 m/s relative to WIS-CTR and
SHR-RES groups 48h after the 15th injection.
3.1.3.3. Time in the center zone
GLM with repeated measures in the treatment phase to time in the center
zone of the open field revealed effects of session [F(2,100)=11.42; p<0.001], and
strain [F(1,50)=16.62; p<0.001]. The GLM to the withdraw phase did not found
significant effects. Differences between groups in each time point is yielded by
Sidak’s post-hoc test and shown in Figure 2C. Briefly, WIS-RES group spent less
time in the center of the apparatus relative to WIS-CTR and SHR-RES groups
48h after the second injection.
55
Figure 2
Figure 2. Effects of repeated administration of 0.1 mg/kg reserpine on (A) total
distance travelled, (B) time in speed above 0.05 m/s, and (C) time in the center
zone in the open field test in Wistar and SHR rats. Data are expressed as mean
± SEM relative to WIS-CTR group. * p < 0.05 compared to respective CTR group;
56
# p < 0.05 compared to respective treatment in WIS strain (GLM with repeated
measures followed by Sidak’s post-hoc test).
3.1.3. Oral movements
3.1.3.1. Vacuous chewing
GLM with repeated measures in the treatment phase to vacuous chewing
revealed effects of session [F(3,150)=13.81; p<0.001], treatment [F(1,50)=23.33;
p<0.001], session*strain interaction [F(3,150)=3.16; p=0.026]and
session*treatment interaction [F(3,150)=11.33; p<0.001], as well as a marginal
effect of session*treatment*strain [F(3,150)=2.42; p=0.068], and strain*treatment
[F(1,50)=3.17; p=0.081] interactions. The same analysis to the withdraw phase
revealed effect of session [F(1,32)=12.56; p<0.001], treatment [F(1,32)=12.56;
p=0.001], and session*treatment*strain [F(1,32)=4.83; p=0.035] and
strain*treatment [F(1,32)=4.42; p=0.043] interactions.
Differences between groups in each time point is yielded by Sidak’s post-
hoc test and shown in Figure 3A. WIS-RES presented increase in the vacuous
chewing movements relative to respective strain control from the 6th injection to
10 days after withdraw, while SHR-RES presented increase in vacuous chewing
only after the 10th injection. As well, differences in the magnitude of increase in
vacuous chewing between reserpine-treated strains occured from the 10th
injection to 15 days after withdraw, with WIS-RES presenting higher values than
SHR-RES group.
3.1.3.2. Tongue protrusion
GLM with repeated measures in the treatment phase to tongue protrusion
revealed effects of session [F(3,150)=5.15; p<0.05], treatment [F(1,50)=18.59;
p<0.001] and session*treatment interaction [F(3,150)=5.94; p<0.001], as well as
a marginal effect of strain*treatment interaction [F(1,50)=3.86; p=0.055]. The
same analysis to the withdraw phase revealed effect of time [F(1,32)=8.17;
p<0.05] and treatment [F(1,32)=8.48; p<0.05].
Differences between groups in each time point is yielded by Sidak’s post-
hoc test and shown in Figure 3B. WIS-RES groups presented increase in the
57
tongue protrusion relative to WIS-CTR from the 6th injection to 10 days after
withdraw, while SHR-RES (relative to SHR-CTR) presented increases values
only after the 10th and 15th injections. As well, no differences in the magnitude
of increase in tongue protrusion between reserpine-treated strains was detected.
Figure 3
Figure 3. Effects of repeated administration of 0.1 mg/kg reserpine on (A)
vacuous chewing movements, and (B) tongue protrusions in oral movement test
in Wistar and SHR rats. Data are expressed as mean ± SEM. * p < 0.05 compared
to respective CTR group; # p < 0.05 compared to respective treatment in WIS
strain (GLM with repeated measures followed by Sidak’s post-hoc test).
3.2. Neurochemistry
GLM to the number of TH positive neurons in the SNpc revealed effects of
treatment [F(2,54)=3.39; p=0.041] and strain [F(1,54)=7.44; p=0.009] (Figure
58
4A). All other analyses where carried with the ROD (Relative Optical Density)
values of TH and α-syn expression in the fibers of dSTR and SNpr. GLM to TH
expression in the dSTR revealed effects of treatment [F(2,54)=7.61; p=0.001] and
strain [F(1,54)=2.48; p=0.068] (Figure 4B). Differences between groups revealed
by Sidak’s post-hoc test are shown in Figure 4A,B. Sidak’s post-hoc test to the
numbe of neurons in the SNpc rvealed that only WIS-RESw/d group presented
reduction in the number of TH+ neurons in the SNpc relative to WIS-CTR.
Moreover, SHR-RESt and RESw/d groups did not present any differences to TH+
neuron count relative to SHR-CTR, and SHR-RESw/d displayed more TH+
neurons in the SNpc than WIS-RESw/d group. That is, only WIS rats presented
reductions in TH expression in the SNpc after reserpine treatment, differently
from TH expression profile in the dSTR. Moreover, WIS-RESt and SHR-RESt
groups presented a reduction in TH expression in the dSTR compared to
respective CTR groups. Nevertheless, despite there was a tendency, RESw/d
groups did not differ from CTR or RESt groups in both strains.
Figure 4
59
Figure 4. Effects of repeated administration of 0.1 mg/kg reserpine on
immunostaining for tyrosine hysdroxylase in the (A) substantia nigra pars
compacta (SNpc) and (B) dorsal striatum (dSTR), and α-synuclein in the (C)
SNpc and (D) dSTR in Wistar and SHR rats. Data are expressed as mean ± SEM
relative to WIS-CTR group. * p < 0.05 compared to respective CTR group; # p <
0.05 compared to respective treatment in WIS strain; & p < 0.05 compared to
respective RESt group (GLM with repeated measures followed by Sidak’s post-
hoc test).
GLM to the ROD values to α-syn expression in the dSTR revealed effects
of treatment [F(2,54)=5.39; p=0.008] and strain [F(1,54)=9.59; p=0.003]. α-syn
expression in the SN, on the other hand, did not reveal any protein inclusion,
fibrils or neuron body staining. For this reason, we conducted an analysis to the
ROD values to soluble α-syn expression of the SNpr, which revealed effects of
treatment [F(2,54)=5.48; p=0.007] and strain [F(1,54)=4.27; p=0.045].
Differences between groups revealed by Sidak’s post-hoc test and shown in
Figure 4C,D. Shortly, both RESt groups displayed an increase of α-syn
immunostaining in the SNpr relative to respective RESw/d groups. Data to α-syn
expression in the dSTR also revealed that both RESt groups presented an
increase in α-syn immunostaining relative to respective CTR and RESw groups.
Equally important, SHR-CTR and SHR-RESt group presented a reduction of
expression compared to respective treatment groups in the WIS strain.
Representative sections of each region analyzed are presented in Figure 5.
60
Figure 5
Figure 5. Representative photomicrographs of brain coronal sections of dorsal
striatum and substantia nigra of rats repeatedly treated with vehicle (CTR) or 0.1
mg/kg reserpine euthanized 48h after last injection (RESt) or 15 days (RESw/d)
after the last injection. Scale bar in dorsal striatum: 1000 µm; and substantia
nigra: 200 µm.
3.3. Correlations
Pearson’s correlation test was applied to all motor and neurochemical
parameters for Wistar and SHR strains. The following correlations were found to
the WIS strain: TH (dSTR) vs TH (SNpc) [r = 0.403; p = 0.037]; TH (dSTR) vs
speed > 0.05 m/s [r = 0.460; p = 0.016]; TH (dSTR) vs tongue protrusion [r = -
0.437; p = 0.037]; TH(SNpc) vs tongue protrusion [r = - 0.387; p = 0.048]; α-syn
(SNpr) vs α-syn (dSTR) [r = 0.782; p < 0.001]; catalepsy vs vacuous chewing [r
= 0.497, p = 0.008]; catalepsy vs tongue protrusion [r = 0.583; p = 0.003]; and
distance vs time in the center of the open field [r = 0.397; p = 0.001]. While for
the SHR strain, we detected correlation between: α-syn (SNpr) vs α-syn (dSTR)
[r = 0.817; p < 0.001]; distance vs α-syn (SNpr) [r = - 0.471; p = 0.013]; distance
vs catalepsy [r = 0.540; p = 0.002]; distance vs speed > 0.05 m/s [r = 0.604; p <
0.001]; and tongue protrusion vs vacuous chewing [r = 0.657; p < 0.001].
61
All correlation tests performed are summarized in Figure 6. Data for
statistically significant r values (p < 0.05) to the Wistar strain are presented in the
upper tier, while SHR strain in the lower tier, of the correlation matrix. Values for
non-significant correlations were omitted.
Figure 6
62
Figure 6. Correlation matrix for neurochemical and behavioral parameters in WIS
(upper tier) and SHR (lower tier) rats. Pearson’s r values are displayed for each
significant correlation . *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001.
4. DISCUSSION
We found that SHR are resistant to catalepsy, spontaneous locomotion
and oral movement impairment in a reserpine-induced progressive animal model
of PD. As expected, reserpine-treated Wistar rats presented a progressive
increase in the latency to step down the catalepsy bar, which was significant from
the 8th injection onwards, corroborating previous studies (Fernandes et al., 2012;
Santos et al., 2013) (Figure 1B). Nevertheless, the SHR reserpine-treated rats
presented no increase in the latency to stepdown whatsoever. That is, the SHR
63
strain revealed to be resistant to the difficulty to start a movement in the low-dose
reserpine treatment protocol. As follows, the same profile of motor impairment
was evident in the spontaneous locomotion in the open field. Despite both strains
significantly reduced locomotion and speed throughout sessions due to
habituation, only reserpine-treated Wistar rats presented impaired spontaneous
locomotion 48h after the 15th injection – to both total distance traveled and time
in speed above 0.05 m/s (Figure 2A,B). These findings corroborate our previous
studies, which found reduced spontaneous activity in the open field 48h after the
6th injection in Wistar rats as well (Santos et al., 2013).
Despite not presenting expressive motor impairment in the catalepsy and
spontaneous locomotion test, reserpine-treated SHR rats revealed some extent
of oral dyskinesia. Overall profile of motor impairment was evident in the oral
movement test as well, but SHR-RES group presented an increase in oral
movements only after the 10th injection, which remained until the 10th day of
withdraw, while WIS-RES group revealed the motor impairment after the 6th
injection until the 15th day of withdraw (Fig. 3A,B). Moreover, the magnitude of
effects on oral movements was higher in Wistar rats than in SHR rats. In a
previous study, we also report that Wistar rats submitted to such treatment
regimen present increase of oral movements after the 10th injection (Fernandes
et al., 2012). Taken together, the motor profile of both strains after reserpine
treatment revealed that the resilience to the motor impairing effect of reserpine
treatment is extended to the low-dose repeated regimen and to other motor
parameters in the SHR strain – namely, catalepsy and spontaneous activity
(Abílio et al., 2004; Queiroz et al., 1998). However, this resilience is not absolute,
and seems to progress throughout the treatment in the SHR strain.
Regarding the neurochemical analysis, we found a progressive reduction
in TH staining in the SNpc that revealed to be significant only to WIS-RESw/d
group, despite a tendency to reduction in WIS-RESt (p = 0.069) (Figure 4A).
Oppositely, the reserpine treatment did not result in any reduction of TH staining
in the SNpc of SHR rats. On the other hand, both strains presented a reduction
in the TH staining after treatment with reserpine in the dSTR, as well as a partial
recovery relative to CTR and RESt group in RESw/d groups (Figure 4B). That is,
RESw/d groups in both strains did not differ from both CTR and RESt groups.
64
The same profile of recovery is reported by Santos et al. (2013), which found total
and partial recovery of motor deficits and immunoreactivity of TH in various brain
areas, respectively, after withdrawn for 30 days of reserpine (10 injections of 0.1
mg/kg every other day).
Accordingly, Freitas et al. (2015) found that TH immunoreactivity in
reserpine treated mice (four injections of 1 mg/kg every other day) is reduced
after 2 and 20 days of withdraw, but not 60 days, in the striatum. However, no
alterations were found in TH immunoreactivity of the region comprising the SN.
This profile of progression is described for other chemically induced PD models
as well (Korecka et al., 2013; Zhu et al., 2004). Collectively, these findings
suggest a path of progression on the reserpine-induced TH decrement from the
fibers (dSTR) to the nucleus (SNpc). The study of the mechanisms envolved in
such progression is useful to investigate early PD pathology and
symptomatology, as previously proposed (Korecka et al., 2013; Santos et al.,
2013). Moreover, the progression trend here stablished recapitulates the one
observed in PD patients. That is, contemporary evidences for early PD
progression suggest that the dopaminergic function loss begins in the projection
sites, and subsequently advances to the nucleus (Cheng et al., 2010).
Furthermore, the findings highlight some degree of dissociation between
the motor impairment and the neurochemical alterations in the Wistar and SHR
strains. The reduction in TH staining in the dSTR of SHR strain was not enough
to result in the observed motor impairments. Thus, it is likely that the motor
impairing effects of reserpine treatment requires the decrement of TH in the
SNpc, as in the Wistar strain (Figure 4A,B) (Santos et al., 2013). That is in
accordance with the motor progression of PD, as the motor impairments are
observed only after the loss of a quarter of neurons in the SNpc (Arkadir et al.,
2014). Nevertheless, we do not disregard other adaptative mechanisms, because
WIS-RESw/d group, despite reduced TH+ neuron count in the SNpc, presented
recovery of motor impairment (Figure 4A). We propose that other neurochemical
alterations – than the TH expression – preclude the motor deficit in this model.
Recently, we have found that motor deficit in the reserpine-induced progressive
model of PD is time-coupled to dopamine, but not serotonin, depletion in the
striatum of both Wistar and SHR strains. Moreover, magnitude of motor deficit
65
was dependent on the extent of dopamine depletion, as Wistar rats exhibited
more severe dopamine depletion and motor impairment compared to SHR (Leão
et al., data not published). Thus, recovery of different functions may require
distinguished time intervals and depend on other neurotransmission systems. For
instance, despite full motor recovery after 30 days of reserpine withdrawn,
cognitive deficits were still current in Wistar rats (Santos et al., 2013).
In this sense, such neurochemical findings could be secondary to
alterations in catecholamine levels and metabolism imbalances. Indeed,
catecholamines regulate TH activity and expression in the cytoplasm (Dickson
and Briggs, 2013). That is, the resulting increase of DA in the cytoplasm by
reserpine treatment may reduce the TH activity in the nigrostriatal pathway.
Alternatively, NO and nitrite formation in the cytoplasm also regulates the
expression of TH (Daubner et al., 2011; Nakashima et al., 2011). In this respect,
reserpine treatment results in oxidative stress and accumulation of reactive
oxygen and nitrogen specimens, which ultimately may result in the decrement TH
expression (Arora and Chopra, 2013; Arora et al., 2011; Santos et al., 2013).
Further investigations of which phosphorylated site of TH is involved in the
regulation of TH expression in response to the treatment with reserpine is
required to clarify the mechanisms of TH downregulation. Likewise, epigenetic
studies could also help to clarify how such cellular oxidative imbalance would
modulate the expression of TH (Yang et al., 2011).
Neurochemical data for the α-syn expression in the SN did not reveal any
protein inclusion, fibrils or neuron body staining. On the other hand, an analysis
to the ROD values of soluble α-syn expression of the SNpr revealed overall
effects for treatment and strain in the dSTR and SNpr. Briefly, RES group
presented an increase in the expression of α-syn relative to CTR and RESw/d
groups in both strains, particularly in the dSTR (Figure 4C,D). In addition, SHR
rats presented a reduction of α-syn expression relative to WIS rats in the dSTR
(Figure 4D). It is well known that α-syn is localized in membranes and vesicles of
presynaptic terminals in its stable form, which occurs in a dynamic equilibrium
with its soluble form and a stable membrane-bound state (Burré, 2015). The
soluble cytosolic α-syn is a monomeric and natively unfolded protein that can
convert into β-sheet containing oligomers (protofibrils) which eventually form
66
amyloid fibrils and Lewy bodies (Burré et al., 2013). Thus, an increase in the
soluble cytosolic form of α-syn is detrimental to catecholaminergic neurons by
favoring the formation of β-sheet and protofibrils. Nevertheless, despite the
increase in α-syn immunostaining, we did not detect any sign of protein inclusions
or fibrils formation with the length of repeated reserpine treatment used here
(Figure 5).
Regardless, this is the first study to investigate the expression of α-syn in
reserpine-treated mammals. To our knowledge, only one study investigated the
effects of reserpine treatment upon α-syn expression in a Droshophila
melanogaster model which, in accordance to our findings, reported inhibition of
the autophagic flux, disruption in protein degradation, and accumulation of α-syn
rich protein aggregates (Lee et al., 2015). Likewise, VMAT2-deficient mice also
present age-dependent neurodegeneration in the SNpc, followed by α-syn
accumulation and TH immunostaining reduction (Caudle et al., 2007; Taylor et
al., 2009). Despite overall motor and neurochemical results points to a reversible
insult to the nigrostriatal pathway (Fernandes et al., 2012; Santos et al., 2013),
we do not discard some extent of neurodegeneration and α-syn rich protein
inclusions or fibrilsin longer treatment regimens. As follows, long-term VMAT2
blockade or loss of function results in irreversible neurochemical and behavioral
alterations (Neisewander et al., 1991), as well as neurodegeneration (Taylor et
al., 2011). Thus, investigation on neurodegenative markers and defective protein
accumulation are still required to clarify this matter. For instance, reserpine
treatment results in increased expression of caspase-3 (Arora and Chopra, 2013;
Liu et al., 2014) and reduction of Bcl-2 (El-Ghazaly et al., 2013; Liu et al., 2014),
which are important markers of apoptotic pathways commitment. Finally, the
increase in the α-syn found in reserpine-treated animals is a putative secondary
mechanism by which TH is downregulated. For instance, α-syn reduces TH
expression through repression of phosphorylation at Ser40 of TH (Peng et al.,
2005; Wu et al., 2011).
Regarding the strain differences, here we report that SHR strain exhibits
lower levels of α-syn in the nigro-striatal pathway (Figure 4C,D), as SHR-CTR
and SHR-RESt animals, respectively, presented reduced levels of α-syn
compared to WIS-CTR and WIS-RESt groups in the dSTR (Figure 4D). That is to
67
say, overall results for α-syn expression suggests that SHR strain expresses
reduced levels of α-syn compared to Wistar strain (Figure 4C,D). This finding
denotes a mechanism by which reserpine-treated SHR rats may cope with DA
imbalances and TH downregulation, and corroborate the findings of Chiavegatto
et al. (2009) that report reduced expression of α-syn in the hippocampus, but not
hypothalamus, of SHR rats compared to the Lewis strain.
Furthermore, α-syn is also involved in the homeostasis of DA by inhibiting
the expression and activity of TH and VMAT2 (Baptista et al., 2003; Guo et al.,
2008), and interrupting dopamine balance by causing increased cytosolic
dopamine levels (Perez et al., 2002). Conversely, catecholamine metabolites,
such as 5-S-Cysteinyldopamine, modulate α-syn expression through oxidative
stress (Aureli et al., 2014). Thus, reserpine-induced increases in catecholamine
metabolites and oxidative imbalances (Leão et al., 2015) may be in the core of
the neurochemical alterations reported here. Accordingly, SHR rats, which show
decreased imunostainning for α-syn (Figure 4D), present reduced levels of lipid
peroxide (Leão et al., unpublished data). Further, this strain’s resilience to
reserpine-induced oral movements is associated to increased catalase activity in
the striatum (Abílio et al., 2004). Thus, SHR rats appear to be better suited to
cope with oxidative imbalances resulting from reserpine treatment, which in this
study seems to reflect in different expression profiles of TH and α-syn expression
between Wistar and SHR strain.
In summary, even though we do not report any sign of α-syn positive
protein inclusions, we speculate that the behavioral and neurochemical
alterations here reported resembles a closer relationship to early PD molecular
alterations. Nonetheless, other chemically induced PD models also do not
account for this histopathological hallmark (Blesa et al., 2012; Meredith et al.,
2008). Importantly, the differences between the two strains could shed light on
these initial cellular alterations.
Correlation analyses for WIS rats showed several correlations between
neurochemical and motor parameters. For instance, TH expression in the dSTR
and SNpc negatively correlated with number of tongue protrusions, and positively
correlated with time moving above 0.05 m/s. That is, animals that presented
68
reduced TH expression spent less time moving above 0.05 m/s and displayed
more tongue protrusions. TH and α-syn expression in the SN also respectively
correlated with the expression in the dSTR, which indicates a relationship
between the expressions of these proteins in both regions of the nigrostriatal
pathway. Additionaly, duration of catalepsy correlated with both oral movement
parameters,while total distance traveled correlated with time in the center zone
of the open field (Figure 6).
These correlations suggest the dissociation of the motor behavior
parameters assessed in this study. For example, catalepsy and oral movements
may comprise a motor dimension related to the reserpine-induced dyskinesias,
while total distance traveled and time in the center zone are parameters related
to motivation to explore and anxiety rather than a strinctly motor dimension
(Jähkel et al., 2000; Shoval et al., 2016). Indeed, we report a reduction in the
exploration of the center of the open field in WIS-RES animals 48h after the 2º
injection of reserpine, and an overall increase in the exploration of this zone in
SHR strain throughout experiment (Figure 2C). These findings were expected
because SHR have consistently shown to exhibit increased exploration of
unprotected areas (Viggiano et al., 2004), as well as reserpine has shown
anxiogenic actions (Labuda and Fuchs, 2002). In a principal component analysis
study by Jähkel et al.(2000), time in the center zone was dissociated from
horizontal activity and associated to the serotonergic rather than dopaminergic
neurotransmission in mice. Thus, these behaviors may reflect the differential
action of reserpine upon monoaminergic systems. To support this rationale,
recently we have described that such treatment regimen results in a more
pronounced depletion of DA compared to 5-HT (serotonin) in the striatum of both
Wistar and SHR rats (Leão et al., data not published).
On the other hand, only one neurochemical parameter correlated
withmotor behavior in SHR rats. Specifically, α-syn expression in the SNpr
negatively correlated with total distance traveled in the open field. That is to say,
low levels of α-syn expression in the SNpr of the SHR seems to be beneficial to
the horizontal activity in this strain. The SNpr is an output nucleus of the basal
ganglia to the thalamus, with direct implication to motor behavior gating (DeLong
and Wichmann, 2007). Thus, the reported reduced expression of α-syn in this
69
strain may reflect a significant relevance to the motor profile exhibited by SHR
animals. In addition, this neurochemical parameter positively correlated with α-
syn expression in the dSTR, which – as previously found in the Wistar strain as
reported here – suggests a relationship between the expressions of these
proteins in both regions of the nigrostriatal pathway. Moreover, total distance
traveled also positively correlated with time spent moving above 0.05 m/s and
catalepsy time, while tongue protrusions positively correlated with vacuous
chewing movements. As in the Wistar strain, this finding seems to point out
distinct motor dimensions to the SHR strain. However, alternatively to the Wistar
strain, total distance taveled correlated with catalepsy time. Nevertheless, SHR
animals did not present increment in the catalepsy bar test as result of reserpine
treatment (Figure 1B). Thus, such correlation does not contradict the previous
finding, as in the SHR strain the catalepsy parameter may represent the
readiness to step down the bar, rather than difficulty to start a movement.
Therefore, overall correlations in the SHR strain points to a dissociation between
neurochemical and behavioral effects of reserpine treatment, corroborating the
different neurochemical and motor behavior profiles presented by both strains.
Likewise, TH expression in SNpc and dSTR did not correlate, suggesting a
differential effect of reserpine treatment upon the nucleus and projection site of
the nigrostriatal pathway (Figure 6). Such absence of correlation between
neurochemical and behavioral parameters are expected, because SHR strain
exhibited the neurochemical alterations compatible with PD, but not the motor
impairment. That is, the different profiles described here may result from
compensatory and/or plastic mechanisms, as previously discussed by the
reduced α-syn exprepession, resilience to the TH decrement in the SNpc, and
reduced oxidative damage exhibited by the SHR strain.
In view of such findings, it is clear that the interaction between genetic and
environmental factors is substantial to the expression of motor and cellular
alterations related to PD. Regardless of the aforementioned evidences, SHR rats
present several other cellular features to the dopaminergic system that are
relevant to the understanding of PD. For instance, SHR rats express more D1
and DAT in the striatum (Watanabe et al., 1997), but presents reduced function
of the latter (Russell, 2003). Besides, they seem to bear less TH in the pre-frontal
70
cortex (King et al., 2000) among other neurochemical alterations (For a review,
see Viggiano et al., 2004). Nevertheless, these studies were conducted with
normotensive control strain for the SHR, the Wistar-Kyoto rat (WKY). Despite the
WKY strain being the most appropriate control strain to innate hypertension
studies, this strain presents deregulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal
(HPA) axis and increased response to stress (Will et al., 2003). Thus, the WKY
was suggested as a model for depression, and its validity to behavioral studies
with SHR rats is questionable. Due to these findings, we adopted the heterogenic
Wistar rat strain, which is suggested as a more suitable control for behavioral
studies with SHR (Abílio et al., 2004; Calzavara et al., 2009; Dommett and
Rostron, 2013; Gauthier et al., 2014; Queiroz et al., 1998). Thus, the investigation
of the SHR strain neurochemical differences to the catecholaminergic system
should be extended to other parameters and rat strains.
In conclusion, here we demonstrate that SHR rats are resistant to
reserpine-induced motor impairment for a number of motor and neurochemical
parameters. Moreover, the motor impairments were followed by compatible
neurochemical alteration that reflected PD progression in Wistar strain. Motor and
neurochemical data for theSHR strain, on the other hand, revealed a dissociation
of neurochemical alterations and motor behavior. Here we highlight some of the
neurochemical differences between these strains that may be adaptative to PD
resilience. In view of these findings, we suggest the use of the SHR strain and
the reserpine protocol as valuable tools to investigate the relevance of genetic,
cellular and behavioral differences between rat strains to the of progression of
PD in animal models. Ultimately, the understanding of these differences may
endorse the discovery of novel therapeutic or preventive strategies to PD.
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79
6. CAPÍTULO III
Efeitos do tratamento crônico e agudo com reserpina sobre
parâmetros motores, conteúdo total de monoaminas, e
peroxidação lipídica em ratos Wistar e SHR.
“An experiment is a question which science poses to Nature, and a
measurement is the recording of Nature’s answer.” Max Planck
80
6.1. INTRODUÇÃO
Retomando os achados neuroquímicos e comportamentais do capítulo II,
encontramos que ratos SHR são resistentes às alterações motoras induzidas
pelo tratamento com baixas doses de reserpina – especificamente, discinesia
oral, catalepsia em barra, e atividade espontânea em campo aberto. De modo
geral, animais de ambas as linhagens apresentaram alterações neuroquímicas
compatíveis com a DP (Moreira et al., 2012; Santos et al., 2013; Testa, Sherer e
Greenamyre, 2005; Yazdani et al., 2006). Isto é, ambas as linhagens
apresentaram redução e aumento da imunoreatividade, respectivamente, para
TH e α-sinucleína no estriado dorsal em resposta ao tratamento repetido com
reserpina.
Os perfis neuroquímico e comportamental para as linhagens apontam
para uma dissociação das alterações motoras e neuroquímicas de modo que,
apesar de apresentarem as alterações compatíveis com a DP, os animais SHR
ainda assim revelaram-se resistentes aos efeitos sobre o comportamento motor.
Parte destas diferenças podem ser atribuídas a diferenças constitutivas entre as
linhagens para a expressão de TH e α-sinucleína. Isto é, apenas animais Wistar
apresentaram redução da imunoreatividade para TH na SNpc, enquanto ratos
SHR revelaram uma tendência para aumento no estriado dorsal na condição
controle. Ainda, a α-sinucleína, também se presentou reduzida no estriado dorsal
da linhagem SHR independente do tratamento.
A expressão de genes e proteínas relacionadas ao sistema
dopaminérgico de SHR tem sido extensamente estudado em relação à sua
linhagem controle normotensa Wistar-Kyoto (WKY). A partir destes estudos é
possível enumerar e propor mecanismos neuroquímicos para as alterações
comportamentais expressas pela linhagem SHR. Por exemplo, temos que
animais SHR apresentam redução da expressão de TH no córtex pré-frontal
(CPF), mas não no estriado, de ratos adultos. Entretanto, animais SHR
apresentam uma redução da expressão TH no estriado apenas entre o período
P7 e P14 pós-natal (King et al., 2000; Leo et al., 2003). Além de alterações na
expressão de TH, animais SHR também exibem maior quantidade do receptor
D1 e seu mRNA no estriado e CPF (Kirouac e Ganguly, 1993; Lim et al., 1989;
81
Papa et al., 2002; Sadile, 2000; Watanabe, Y et al., 1997). A expressão do
receptor D2, por outro lado, não é ainda bem definida. Diferentes estudos relatam
hiper-, hipo- ou expressão normal no estriado (Kirouac e Ganguly, 1993; Lim et
al., 1989; Linthorst et al., 1993; Russell, Allie e Wiggins, 2000; Sadile, 2000;
Vaughan, Buuse, van den e Roland, 1999; Watanabe, Y et al., 1997). No entanto,
parece que a função inibitória auto-receptora de D2 está aumentada nesses
animais (Linthorst et al., 1991; Russell et al., 1995). Alterações para expressão
e função também são descritas para o transportador de DA (DAT), de modo que
ratos SHR expressam mais DAT no estriado e CPF (Watanabe, Y et al., 1997),
porém com redução da função de recaptação de DA deste (Leo et al., 2003).
A alteração na expressão e função das referidas proteínas refletem-se nos
níveis de neurotransmissores nestas regiões. Por exemplo, animais SHR
apresentam aumento da liberação de DA estimulada por glutamato na
substância nigra (Warton, Howells e Russell, 2009), aumento nos níveis de DA
no estriado de ratos juvenis, e diminuição em adultos (Viggiano, Vallone e Sadile,
2004), menor liberação e metabolismo de DA no estriado (Jong, de, Linthorst e
Versteeg, 1995; Villiers, de et al., 1995), aumento da liberação tônica de DA
(Carboni et al., 2003; Howes et al., 1984), e diminuição da liberação de DA no
estriado por estimulação elétrica e níveis elevados de K+ (Jong, de, Linthorst e
Versteeg, 1995; Linthorst et al., 1990, 1991; Miller et al., 2012; Russell et al.,
1995, 1998).
No entanto, como já discutido anteriormente, ainda que a linhagem WKY
seja a apropriada como controle para estudos de hipertensão inata, o mesmo
não é verdade para estudos comportamentais, uma vez que o WKY apresenta
diversas outras alterações em relação a linhagens de ratos heterogênicas (Will,
Aird e Redei, 2003). Sendo assim, a caracterização neuroquímica e
comportamental da linhagem SHR requer a extensão para outras linhagens,
como a Wistar (Abílio et al., 2004; Calzavara et al., 2009; Dommett e Rostron,
2013; Gauthier et al., 2014; Queiroz, Piovezan e Frussa-Filho, 1998).
Portanto, neste capítulo, buscamos estender a caracterização
neuroquímica conduzida no capítulo anterior avaliando o grau de depleção
de monoaminas (dopamina e serotonina), seus metabólitos, e produção de
82
peróxidos de lipídios no estriado de ratos SHR e Wistar submetidos ao
tratamento repetido ou agudo com reserpina. Uma melhor compreensão da
relevância destas alterações neuroquímicas será fundamental para definir os
mecanismos de resistência ao prejuízo motor induzido pelo tratamento com
reserpina em animais SHR. Ainda, essa investigação permitirá situar a relevância
do metabolismo de monoaminas para a expressão dos déficits motores e danos
celulares resultantes.
83
6.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS DESTE CAPÍTULO
a) Avaliar os efeitos da administração repetida de uma dose baixa de
reserpina sobre a progressão na depleção de monoaminas (dopamina e
serotonina) no estriado de ratos das linhagens Wistar e SHR.
b) Avaliar os efeitos da administração repetida de uma dose baixa de
reserpina sobre a progressão na formação de peróxidos de lipídio e dano
oxidativo no estriado de ratos das linhagens Wistar e SHR.
c) Investigar o efeito de uma administração aguda de reserpina sobre a
evolução temporal dos déficits motores na tarefa de catalepsia em barra
em ratos das linhagens Wistar e SHR.
d) Investigar o efeito de uma administração aguda de reserpina sobre a
evolução temporal na depleção de monoaminas (dopamina e serotonina)
no estriado de ratos das linhagens Wistar e SHR.
84
6.3. MATERIAIS E MÉTODOS
6.3.1. Animais
Foram utilizados ratos machos das linhagens Wistar e SHR, com idade de
6 meses (400-500g), os quais foram mantidos no biotério setorial do Laboratório
de Estudos de Memória/Departamento de Fisiologia/UFRN acondicionados em
gaiolas plásticas (máximo 5 animais), medindo 33 x 40 x 17 cm, sob ventilação
e temperatura controladas (22 ± 1 ºC), com ciclo claro/escuro de 12h/12h (luzes
acesas às 06h30) e acesso livre à água e comida. Antes do início dos
procedimentos experimentais o projeto foi submetido e aprovado pela Comissão
de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal do Rio Grande do Norte
sob o número de protocolo 005/2014.
6.3.2. Drogas
Reserpina (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO) foi dissolvida em uma gota
de ácido acético glacial e diluída para a concentração correta em água destilada.
Veículo consistiu na mesma quantidade de ácido acético e água que na solução
de reserpina. Estas soluções foram injetadas pela via subcutânea (S.C.).
6.3.3. Dosagem de dopamina, serotonina e metabólitos por cromatografia
líquida de alta eficiência (high performance liquid chromatography –
HPLC).
Após eutanásia por decapitação foram removidos os encéfalos dos
animais dos distintos grupos experimentais, e isoladas amostras do estriado. Os
tecidos foram imediatamente pesados e homogeneizados em PCA 0,1 M
contendo isoproterenol 30 ng/ml. Os homogeneizados foram filtrados utilizando
membrana de 0,45 µM e um volume de 100 µl de cada amostra foram injetados
no equipamento. A quantificação de dopamina foi feita por HPLC acoplado a um
detector eletroquímico. As amostras foram injetadas e a separação foi feita com
uma coluna de fase reversa (Supelcosil LC-18, 100 mm x 3 mm, Supelco). Se
utilizou como fase móvel um tampão fosfato 100 mM, metanol (15% v/v), 230
85
mg/L de ácido 1-octanossulfônico e 50 mg/L EDTA, que foi perfundida a uma
taxa de 1 mL/min. Para a detecção, utilizou-se um detector amperométrico com
eletrodo de carbono, com o potencial definido em 0,7 V em relação a um eletrodo
Ag/AgCl.
6.3.4. Ensaio de Peroxidação Lipídica
Após eutanásia por decapitação foram removidos os encéfalos dos
animais dos distintos grupos experimentais, e isoladas amostras do estriado. Os
tecidos foram imediatamente pesados e homogeneizados em tampão fosfato 0.1
M (proporção 1:5), que então foram centrifugados por 15 minutos a 3500 rpm e
4-5 ºC para a obtenção de pelo menos 150 µL de sobrenadante do homogenato.
A quantificação de peróxidos de lipídios foi realizada através de uma adaptação
dos métodos de (Tanizawa, Sazuka e Takino, 1981). A reação foi iniciada pela
adição de 250 µl de SDS 3%, 1,5 ml de tampão ácido acético 2M, e 1,5 ml de
ácido tiobarbitúrico (TBA) 0.8% a 50 µl de homogenato do tecido. Finalmente, o
volume foi completado com 4 ml de água Milli Q e então aquecido 95 ºC por 60
minutos em banho maria e esfriado em água com gelo. Então, 2,5 ml de uma
mistura n-butanol:piridina (15:1) foi adicionada e agitada vigorosamente. A
quantidade de malondialdeído (MDA) formado foi medido pela reação com o
ácido tiobarbitúrico à 532 nm a partir da fase superior formada com a mistura de
n-butanol:piridina. A quantidade de MDA formada foi então medida e os
resultados expressos em nanomoles de MDA por grama (g) de tecido úmido,
pela regressão contra uma curva de concentração conhecida de MDA.
6.3.5. Teste de catalepsia em barra
O comportamento de catalepsia foi avaliado colocando-se o animal com
ambas as patas dianteiras sobre uma barra horizontal de vidro elevada 9 cm da
superfície de apoio das patas traseiras. O tempo que cada animal permaneceu
nessa posição foi quantificado em segundos, até um limite de 180 s. Foi utilizado
o valor da média de três exposições realizadas consecutivamente.
86
6.3.6. Delineamento experimental
6.3.6.1. Experimento I - Efeitos do tratamento crônico com reserpina (0,1
mg/kg) em ratos Wistar e SHR.
Os animais foram aleatoriamente distribuídos em quatro grupos: Wistar-
Veículo (WIS-VEI; n=12), Wistar-Reserpina (WIS-RES; n=26), SHR-Veículo
(SHR-VEI; n=12), SHR-Reserpina (SHR-RES; n=26). Os animais receberam 15
injeções subcutâneas de veículo (VEI) ou 0,1 mg/kg de Reserpina (RES) nos
volumes de 1ml/kg de peso corporal a cada dois dias. Durante o tratamento os
ratos foram submetidos ao teste de catalepsia em barra antes da primeira injeção
e a cada dois dias ao longo do tratamento para acompanhamento das alterações
motoras resultantes do tratamento com reserpina.
Metade dos animais pertencentes aos grupos WIS-RES e SHR-RES
foram eutanasiados 48h após a 8ª injeção (grupos: WIS-RES 8ª, e SHR-RES 8ª).
Enquanto os demais apenas 48h após a última injeção (grupos: WIS-VEI, SHR-
VEI, WIS-RES 15ª, e SHR-RES 15ª). Os experimentos foram realizados em duas
etapas, sendo a primeira e segunda etapas destinadas, respectivamente, ao
processamento para análise do conteúdo total de monoaminas e peróxido de
lipídios estriatais (ntotal=38 por etapa; WIS-VEI=6; WIS-RES 8ª=6; WIS-RES
15ª=7; SHR-VEI=6; SHR-RES 8ª=6; SHR-RES 15ª=7). Os resultados para o
teste de catalepsia em barra para ambas etapas serão apresentados
conjuntamente. A descrição do delineamento experimental segue na Figura 10.
Figura 10
Delineamento experimental do Experimento reserpina crônico (0,1 mg/kg) em ratos Wistar
e SHR.
6.3.6.2. Experimento II - Efeitos do tratamento agudo com reserpina (1
mg/kg) em ratos Wistar e SHR.
87
Ratos Wistar (n=24) e SHR (n=24) foram avaliados no teste de catalepsia
em barra nos intervalos de 3h, 6h, 12h, 24h, 48h e 96h após uma injeção s.c.
aguda de reserpina 1mg/kg, que ocorreu imediatamente após a medida basal de
catalepsia em barra (0h). Estes animais foram aleatoriamente alocados em oito
grupos - um por linhagem nos intervalos 0h, 6h, 24h e 96h (n=6 por grupo) de
avaliação da catalepsia. Imediatamente após a avaliação no teste de catalepsia
nesses intervalos, os animais foram eutanasiados por decapitação e foi
dissecado o estriado para posterior dosagem de monoaminas. A descrição do
delineamento experimental segue na Figura 11.
Figura 11
Delineamento experimental do Experimento reserpina agudo (1.0 mg/kg) em ratos Wistar e
SHR.
6.3.7. Análise estatística.
Todos os dados foram testados quanto à homogeneicidade de variância
(teste de Levene) e à normalidade (teste de Kolmogorov-Smirnov), e análises
paramétricas foram realizadas para todos os dados. Os dados referentes à
catalepsia para o experimento I foram analisados pela análise de variância
(ANOVA) com medidas repetidas, com tratamento e linhagem como fatores entre
sujeitos e o tempo como fator dentre sujeitos. Os demais dados comportamentais
e neuroquímicos foram analisados por uma ANOVA duas vias, com tratamento
e linhagem, e tempo e linhagem, como fatores entre sujeitos, respectivamente,
para os experimentos I e II. Diferenças pontuais entre os grupos foram
determinadas através do teste pós-hoc de Sidak. Os resultados foram expressos
em médias ± E.P.M. O nível de significância considerado, em todos os testes foi
de p<0,05.
88
6.4. RESULTADOS
6.4.1. Experimento I - Efeitos do tratamento crônico com reserpina (0,1
mg/kg) em ratos Wistar e SHR.
6.4.1.1. Dosagem de dopamina, serotonina e metabólitos por
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (High Performance
Liquid Chromatography – HPLC).
Para as dosagens de dopamina e seus metabólitos, uma ANOVA 2x3 –
com linhagem e tratamento como fator entre sujeitos – revelou efeitos dos
fatores: tratamento [F(2,36)=13.559, p<0.001] e linhagem [F(2,36)=16.374,
p<0.001] para os níveis de dopamina (DA) (Figura 12A); tratamento
[F(2,36)=23.372, p<0.001] para os níveis de ácido 3,4-diidroxifenilacético
(DOPAC) (Figura 12B); tratamento [F(2,36)=23.372, p<0.001] para os níveis de
ácido homovanílico (HVA) (Figura 12C); e tratamento [F(2,36)=11.359, p<0.001]
para o turnover de dopamina [DOPAC+HVA/DA] (Figura 12D). O pós-hoc de
Sidak revelou que os grupos WIS-RES 8ª e RES 15ª apresentaram depleção de
DA e DOPAC a partir de 48h após a 8ª injeção de reserpina. No entanto, animais
SHR apresentam depleção de DA e DOPAC apenas após a 15ª injeção. Ainda,
animais SHR-VEI exibiram aumento de DA e diminuição de HVA em relação ao
grupo WIS-VEI, enquanto o turnover de DA está aumentado apenas no grupo
WIS-RES 8ª. Todas as significâncias para o pós-hoc de Sidak são apontadas na
Figura 12.
89
Figura 12.
Dosagem de (A) dopamina (DA), (B) ácido 3,4-diidroxifenilacético (DOPAC) e (C) ácido
homovanílico (HVA) por HPLC, e turnover de dopamina [DOPAC+HVA/DA] no estriado de
ratos Wistar (WIS) e SHR tratados com baixas doses de reserpina (0.1 mg/kg). *p < 0.05, e
***p < 0.001 comparado ao respectivo grupo VEI na linhagem. #p < 0.05, e ###p < 0.001
comparado ao respectivo grupo WIS no tratamento. &p < 0.05 comparado ao respectivo grupo
RES 8ª na linhagem (ANOVA 2x3; pós-hoc de Sidak).
Para as dosagens de serotonina e seus metabólitos, uma ANOVA 2x3 –
com linhagem e tratamento como fator entre sujeitos – revelou efeitos para os
fatores: tratamento [F(2,36)=4.443, p=0.020] e linhagem [F(2,36)=21.705,
p<0.001] para os níveis de ácido 5-Hidroxiindoleacético (5HIAA) (Figura 13B); e
tratamento [F(2,36)=3.644, p=0.038] e linhagem [F(2,36)=3.644, p=0.038] para
o turnover de serotonina [5-HIAA/5-HT] (Figura 13C). Nenhum efeito para a
ANOVA 2x3 foi encontrado para os níveis de serotonina (5-HT) (Figura 13A). O
pós-hoc de Sidak revelou que animais SHR apresentaram níveis reduzidos de
5-HIAA em relação aos seus respectivos tratamentos na linhagem Wistar (Figura
13B). Ainda, o turnover de serotonina revelou-se aumentado no grupo WIS-RES
8ª em relação aos grupos WIS-VEI, WIS-RES 15ª, e SHR-RES 8ª.
90
Para a formação do produto da peroxidação de lipídios MDA, obtivemos
efeitos para o tratamento [F(2,36)=4.396, p=0.021] e a linhagem
[F(2,36)=12.426, p=0.001] (Figura 13D). No entanto, apenas o grupo SHR-RES
8ª exibiu aumento na formação de MDA em relação ao WIS-VEI. Ainda, os
animais SHR-VEI e SHR-RES 15ª apresentaram, respectivamente, menores
níveis de MDA em relação aos grupos WIS-VEI e WIS-RES 15ª (Figura 13D).
Todas as significâncias para o pós-hoc de Sidak são apontadas na figura 13.
Figura 13.
Dosagem de (A) serotonina (5-HT) e (B) ácido 5-Hidroxiindoleacético (5HIAA) por HPLC, (C)
turnover de serotonina [5-HIAA/5-HT], e (D) Dosagem de malondialdeído (MDA) por
fluorimetría formado a partir da peroxidação lipídica no estriado de ratos Wistar (WIS) e SHR
tratados com baixas doses de reserpina (0.1 mg/kg). *p < 0.05 comparado ao respectivo grupo
VEI na linhagem. #p < 0.05, e ###p < 0.001 comparado ao respectivo grupo WIS no tratamento.
&p < 0.05 comparado ao respectivo grupo RES 8ª na linhagem (ANOVA 2x3; pós-hoc de
Sidak).
6.4.1.2. Catalepsia em barra
Uma ANOVA 2x2 de medidas repetidas – com linhagem e tratamento
como fator entre sujeitos e tempo como fator dentre sujeitos – revelou efeito para
os fatores tempo [F(15,675)=13.980, p<0.001], tratamento [F(1,45)=17.297,
91
p<0.001], linhagem [F(1,45)=9.061, p=0.004], e interações tempo*tratamento
[F(15,675)=11.688, p<0.001], tempo*linhagem [F(15,675)=5.677, p<0.001],
tratamento*linhagem [F(1,45)=10.785, p=0.002], e tempo*tratamento*linhagem
[F(15,675)=6.180, p<0.001]. O pós-hoc de Sidak revelou que o grupo WIS-RES
apresentou aumento do tempo na barra a partir de 48h após a 7ª injeção até o
fim do tratamento em comparação aos grupos WIS-VEI e SHR-RES (p < 0.05)
(Figura 14).
Figura 14.
Latência para descer da barra no teste de catalepsia em barra ao longo do tratamento repetido
com baixas doses de reserpina (0.1 mg/kg). * p < 0.05 comparado ao grupo WIS-VEI; #p <
0.05 comparado ao grupo SHR-RES (ANOVA 2x2 de medidas repetidas; pós-hoc de Sidak).
6.4.2. Experimento II - Efeitos do tratamento agudo com reserpina (1
mg/kg) em ratos Wistar e SHR.
6.4.2.1. Dosagem de dopamina, serotonina e metabólitos por HPLC.
Para as dosagens de dopamina e seus metabólitos, uma ANOVA 2x4 –
com linhagem e tempo como fator entre sujeitos – revelou efeitos para os fatores:
tempo [F(3,47)=40.926, p<0.001], linhagem [F(3,47)=19.030, p<0.001], e
interação tempo*linhagem [F(3,47)=4.872, p=0.006] para os níveis de dopamina
(DA) (Figura 15A); tempo [F(3,47)=13.000, p<0.001] e interação
tempo*linhagem [F(3,47)=4.773, p=0.006] para os níveis de ácido 3,4-
diidroxifenilacético (DOPAC) (Figura 15B); tempo [F(3,47)=5.329, p=0.004] e
92
linhagem [F(3,47)=10.309, p=0.003] para os níveis de ácido homovanílico (HVA)
(Figura 15C); e tratamento [F(2,36)=11.359, p<0.001] para o turnover de
dopamina [DOPAC+HVA/DA] (Figura 15D).
O pós-hoc de Sidak revelou que todos os grupos 6h, 24h e 96h
apresentaram depleção de dopamina em comparação ao grupo 0h em sua
respectiva linhagem. No entanto, os animais SHR dos grupos 6h, 24h e 96h
expressaram maiores níveis de dopamina no estriado em comparação à
linhagem Wistar nos respetivos intervalos de tempo após injeção aguda de
reserpina (Figura 15A). Ainda, apenas os ratos Wistar apresentaram redução de
DOPAC após a injeção de reserpina, enquanto os animais SHR não
apresentaram redução em função do tratamento. No entanto, estes partiram de
uma condição basal baixa de DOPAC em comparação ao grupo WIS-0h (Figura
15B). Ainda, nenhuma das linhagens apresentaram efeito do tempo após o
tratamento para os níveis de HVA. Porém ratos WIS, nos intervalos de 6h e 24h,
apresentaram níveis aumentados de HVA comparado aos respectivos intervalos
de tempo na linhagem SHR e comparado ao grupo WIS-96h (Figura 15C).
Finalmente, o turnover de dopamina revelou-se aumentado nos grupos WIS-6h
e WIS-24h em comparação aos animais SHR em seus respectivos intervalos de
tempo, e em comparação aos grupos WIS-0h e WIS-96h (Figura 15D). Todas as
significâncias para o pós-hoc de Sidak são apontadas na figura 15.
93
Figura 15.
Dosagem de (A) dopamina (DA), (B) ácido 3,4-diidroxifenilacético (DOPAC) e (C) ácido
homovanílico (HVA) por HPLC, e turnover de dopamina [DOPAC+HVA/DA] no estriado de
ratos Wistar (WIS) e SHR tratados com uma dose aguda de reserpina (1.0 mg/kg) ao longo do
intervalo de 96h. *p < 0.05, e ***p < 0.001 comparado ao respectivo grupo 0h na linhagem. #p
< 0.05, e ###p < 0.001 comparado ao respectivo grupo WIS no tempo. &p < 0.05 comparado ao
respectivo grupo 6h e 24h na linhagem (ANOVA 2x4; pós-hoc de Sidak).
Para as dosagens de serotonina e seus metabólitos, uma ANOVA 2x4 –
com linhagem e tempo como fator entre sujeitos – revelou efeitos para os fatores:
tempo [F(3,47)=4.534, p=0.008] para os níveis de serotonina (5-HT) (Figura
16A); tempo [F(3,47)=5.921, p=0.002] para os níveis de ácido 5-
hidroxiindoleacético (5HIAA) (Figura 16B); e tempo [F(3,47)=3.355, p=0.028]
para o turnover de serotonina [5-HIAA/5-HT] (Figura 16C). O pós-hoc de Sidak
revelou que os grupos WIS-24h e WIS-96h apresentaram redução de 5-HT em
relação ao grupo WIS-0h (Figura 16A), enquanto que para os níveis de 5-HIAA
foi encontrado aumento apenas para o grupo WIS-24h em comparação aos
grupos WIS-0h e WIS-96h, e aumento no grupo SHR-96h em comparação ao
WIS-96h (Figura 16B). No entanto, o pós-hoc não foi capaz de detectar
diferenças entre os grupos para o turnover de serotonina (Figura 16C).
94
6.4.2.2. Catalepsia em barra
Finalmente, uma ANOVA 2x7 - com linhagem e tempo como fator entre
sujeitos – para tempo na barra no teste de catalepsia em barra revelou efeitos
para tempo [F(3,47)=12.382, p<0.001], linhagem [F(3,47)=10.006, p=0.002] e
interação tempo*linhagem [F(3,47)=5.785, p<0.001]. O pós-hoc de Sidak revelou
que houve um aumento na latência para descer da barra em relação ao
respectivo grupo 0h na linhagem para o intervalo de 12h e 24h para a linhagem
Wistar, e 12h para a linhagem SHR. Ainda, animais Wistar apresentaram maior
latência para descer da barra em relação ao grupo SHR no intervalo de 24h
(Figura 16D). Estes achados denotam um deslocamento para a direita na
duração e aumento da magnitude dos efeitos motores da reserpina em ratos
Wistar comparados ao SHR. Todas as significâncias para o pós-hoc de Sidak
são apontadas na figura 16.
Figura 16.
Dosagem de (A) dopamina (DA), (B) ácido 3,4-diidroxifenilacético (DOPAC) e (C) ácido
homovanílico (HVA) por HPLC, e turnover de dopamina [DOPAC+HVA/DA] no estriado de
ratos Wistar (WIS) e SHR tratados com uma dose aguda de reserpina (1.0 mg/kg) ao longo do
95
intervalo de 96h. *p < 0.05, e ***p < 0.001 comparado ao respectivo grupo 0h na linhagem. #p
< 0.05, e ###p < 0.001 comparado ao respectivo grupo WIS no tempo. &p < 0.05 comparado ao
respectivo grupo 6h e 24h na linhagem (ANOVA 2x4; pós-hoc de Sidak).
6.5. DISCUSSÃO
Neste capítulo abordamos as alterações motoras e neuroquímicas
durante e após o tratamento agudo (1 mg/kg) ou repetido (0,1 mg/kg, 15 injeções,
em dias alternados) com reserpina. Nossos resultados revelam que as
diferenças para as alterações comportamentais observadas entre as linhagens
podem ser explicadas em grande medida pela dinâmica de depleção de
monoaminas resultante do tratamento com reserpina. Isto é, de modo geral, ratos
SHR apresentaram diferenças temporais e de magnitude para a depleção de
monoaminas no estriado e em comparação a ratos Wistar consoantes com o
comprometimento motor em ambos os regimes de tratamento.
Para o tratamento repetido com baixas doses de reserpina descrevemos
uma depleção substancial 48h após a 8ª injeção de reserpina em ratos Wistar
que se manteve até o fim do tratamento. Animais SHR, por sua vez, desde a
condição controle apresentaram maiores níveis de DA no estriado, passando a
apresentar redução dos níveis de DA em relação ao grupo controle apenas após
a 15ª injeção (Figura 12A). Este resultado revela um atraso na ação depletora
de DA pelo tratamento com reserpina em ratos SHR relativo à linhagem Wistar.
Conforme o descrito no capitulo II e em estudos anteriores (Fernandes et al.,
2012; Santos et al., 2013), esta depleção é compatível com a expressão temporal
do prejuízo motor na tarefa de catalepsia em barra em animais Wistar. Deste
modo, apenas animais Wistar apresentaram aumento na latência para descer da
barra após a 7ª administração de reserpina, enquanto animais SHR, ainda que
não tenham apresentado nenhuma diferença estatisticamente significativa,
passaram a expressar tendência ao prejuízo motor apenas ao fim do tratamento
– aproximadamente após a 14ª injeção de reserpina (Figura 14).
Ainda, o mesmo perfil de depleção de DA foi observado para os
metabólitos DOPAC e HVA em ambas as linhagens (Figura 12B,C). Não
obstante, o turnover de DA apresentou-se intensificado apenas em ratos Wistar
96
48h após a 8ª injeção (Figura 12D). O aumento do turnover de dopamina é um
resultado frequente em animais tratados por reserpina (Brighina et al., 2013;
Gołembiowska e Dziubina, 2012; Neisewander, Castañeda e Davis, 1994), que
reflete o estado do metabolismo de dopamina aumentado pela elevação dos
níveis citoplasmáticos de DA (Asanuma, Miyazaki e Ogawa, 2003; Meiser,
Weindl e Hiller, 2013; Qi, Miller e Voit, 2008). Também descrevemos aqui uma
diminuição do metabólito HVA em animais SHR controle (Figura 12C),
compatível com outros estudos que descrevem menores níveis de HVA e
metabolismo de DA (Jong, de, Linthorst e Versteeg, 1995; Villiers, de et al.,
1995). Portanto, a associação de maiores níveis de DA com a redução da
metabolização desta pode estar na fundação das bases celulares que conferem
resistência aos prejuízos motores induzidos pela reserpina.
A literatura que investiga as bases neuroquímicas das alterações
comportamentais entre as linhagens WKY e SHR revela que esta última
apresenta aumento da liberação tônica de DA (Carboni et al., 2003; Howes et
al., 1984), diminuição da função de recaptação de DA pelo DAT (Leo et al.,
2003), armazenamento de DA prejudicado (Russell et al., 1998), e redução do
metabolismo de DA (Jong, de, Linthorst e Versteeg, 1995; Villiers, de et al.,
1995). Portanto, todas estas alterações neuroquímicas junto ao perfil de
depleção aqui apresentado corroboram a resiliência desta linhagem aos
prejuízos motores induzidos pela reserpina. Isto é, a conjetura de um cenário
celular de metabolização de DA reduzida associado à liberação constante de DA
dificultaria a depleção desta.
Adicionalmente, os níveis de DA aqui descritos estão de acordo com a
expressão de TH descrita no capítulo II. Temos que animais SHR expressaram
maior quantidade de TH na SNpc, e tendência a aumento no estriado dorsal. A
maior expressão de TH pode representar uma capacidade de maior síntese de
DA, uma vez que esta enzima é a etapa limitante da síntese de catecolaminas
(Dickson e Briggs, 2013). Reciprocamente, os níveis de TH podem também
refletir o estado dos níveis de DA citoplasmáticos, uma vez que TH é
negativamente regulado por DA (Dickson e Briggs, 2013), e é inativada por
produtos da metabolização de DA (Kuhn, Aretha e Geddes, 1999; Tekin et al.,
2014). Para esclarecer o mecanismo e estabelecer uma relação causal entre os
97
estes eventos será necessário investigar os níveis dos diferentes tipos de TH
fosforilados expressos nestas linhagens sob o tratamento com reserpina
(Dickson e Briggs, 2013; Salvatore et al., 2012; Tekin et al., 2014). A investigação
desta questão será fundamental para estabelecer um mecanismo que clarifique
como o metabolismo de DA pode ser importante para os danos celulares
produzidos na DP (Salvatore et al., 2012).
Ainda assim, nem todas as alterações observadas estão de acordo com
a literatura para as diferenças entre ratos SHR e WKY. Por exemplo, aqui
descrevemos que desde a condição basal ratos SHR apresentam aumento de
DA no estriado (Figura 12A). Este é um achado divergente para as diferenças
entre SHR e WKY, que parecem apresentar aumento dos níveis de DA apenas
na fase juvenil, mas níveis reduzidos na fase adulta (Jong, de, Linthorst e
Versteeg, 1995; Linthorst et al., 1991; Viggiano, Vallone e Sadile, 2004). Ainda,
apesar de apresentarem uma liberação tônica de DA aumentada (Carboni et al.,
2003; Howes et al., 1984), animais SHR liberam menos DA no estriado por
estimulação elétrica ou níveis elevados de K+ (Jong, de, Linthorst e Versteeg,
1995; Linthorst et al., 1990, 1991; Miller et al., 2012; Russell et al., 1995, 1998,
2000). Estas alterações parecem também estarem associadas a uma atividade
inibitória aumentada da função dos auto-receptores D2 (Linthorst et al., 1991;
Russell, 2000; Russell et al., 1995). Deve-se destacar que estas diferenças foram
encontradas em comparação com a linhagem WKY. Portanto, pontuar as
diferenças celulares em outras linhagens, como a Wistar, podem expor novos
alvos no mecanismo celular de ratos SHR para a resiliência ao tratamento com
reserpina.
Em relação ao conteúdo de 5-HT, é pouco provável que este tenha
influenciado o comportamento motor observado, uma vez que a sua medida não
foi significativamente alterada em resposta ao tratamento com reserpina em
ambas as linhagens (Figura 13A). Por outro lado, o tratamento com reserpina foi
capaz de reduzir o conteúdo estriatal do metabólito 5-HIAA apenas em animais
SHR (Figura 13B). O turnover de 5-HT, por sua vez, revelou perfil semelhante
ao de DA, com apenas animais Wistar tratados após a 8ª injeção, apresentando
aumento (Figura 13C). Até então, pouco se investigou a neurotransmissão
serotonérgica na linhagem SHR. No entanto, os resultados aqui descritos estão
98
de acordo com o descrito para as diferenças entre as linhagens SHR e WKY,
que apresentam conteúdo de 5-HT e metabólitos equivalente para o estriado
(Fan, Bruno e Hess, 2012; Fuller et al., 1983). Portanto, os efeitos do tratamento
com reserpina sobre o metabolismo de 5-HT parece resultar do efeito depletor
global da reserpina sobre as monoaminas no estriado, porém sem significado
importante para o comportamento motor.
Por fim, o ensaio para quantificação de peróxidos de lipídios demonstrou
que, de modo geral, animais Wistar não apresentaram aumento nos produtos da
peroxidação de lipídios de membrana em resposta ao tratamento com reserpina.
Não obstante, ratos SHR exibiram maiores níveis de produtos da peroxidação
de lipídios (malondialdeído - MDA) em relação à condição controle (Figura 13D).
Ainda assim, estes partiram de uma condição basal reduzida de MDA,
compatível com a maior capacidade protetora contra radicais reativos do
oxigênio como descrito por Abílio et al. (2004). Estes achados são importantes
para a expressão de alguns comportamentos motores, como por exemplo a
discinesia oral, que está relacionada à extensão do dano oxidativo produzido
pelo tratamento com reserpina (Abílio et al., 2003, 2004; Teixeira et al., 2008).
Ainda, estes dados refletem o quadro global de metabolização de monoaminas,
uma vez que a decomposição destas pela monoamino oxidase (MAO) e catecol
O-metiltransferase (COMT) resulta na produção de espécimes reativas do
oxigênio (Asanuma, Miyazaki e Ogawa, 2003; Leão et al., 2015; Meiser, Weindl
e Hiller, 2013; Qi, Miller e Voit, 2008). Sendo assim, a menor depleção e redução
do metabolismo da DA na linhagem SHR pode estar relacionada às alterações
para danos oxidativos observados entre as linhagens. Não obstante, neste
estudo não foi possível reproduzir o aumento em produtos da peroxidação de
lipídios em ratos Wistar descrita por Fernandes et al. (2012).
Para o regime agudo, por outro lado, não se confirmou o aumento nos
níveis de DA na condição controle encontrada no estudo crônico para os animais
SHR. Estas diferenças podem ser explicadas pelas diferenças nos protocolos e
regime de tratamento. De fato, ratos SHR sob condições de estresse liberam
maior quantidade de DA e expressam maior atividade de TH no estriado em
relação a animais WKY (Ikeda et al., 1984). No entanto, todas as demais
alterações de níveis de monoaminas se confirmaram e são compatíveis com o
99
previamente observado. Desta forma, ratos Wistar se mostraram mais sensíveis
à depleção de DA por uma dose aguda de reserpina tanto no aspecto temporal,
quanto na magnitude da depleção, desde 6h até 96h após a injeção (Figura 15A).
Não somente, o vale da depleção de DA se apresentou aproximadamente no
mesmo intervalo de tempo para as duas linhagens – 24h após o tratamento –
como também foi acompanhada pelo metabólito DOPAC na linhagem Wistar,
enquanto animais SHR exibiram menores níveis de DOPAC desde a condição
basal (0h) (Figura 15B). Conforme o experimento anterior, animais SHR
expressaram menores níveis de HVA, porém estes não foram alterados pelo
tratamento (Figura 15C). Ainda, o turnover de DA também foi acentuado apenas
na linhagem Wistar, 6h e 24h após o tratamento com reserpina (Figura 15D).
Deste modo, os resultados encontrados para a administração aguda de
reserpina reforçam aqueles encontrados no regime repetido, revelando menores
níveis de metabólitos e metabolização de DA em animais SHR (Jong, de,
Linthorst e Versteeg, 1995; Villiers, de et al., 1995).
Finalmente, a depleção de 5-HT ocorreu apenas na linhagem Wistar,
apesar desta apresentar-se qualitativamente reduzida na linhagem SHR em
resposta ao tratamento com reserpina (Figura 16A). Ainda, o grau de depleção
de 5-HT descrito para os animais Wistar refletiu sobre os níveis do metabólito 5-
HIAA, que foram incrementados 48h após o tratamento na linhagem Wistar
(Figura 16B), enquanto nenhuma diferença foi encontrada para o turnover de 5-
HT (Figura 16C).
Deste modo, os resultados para o comportamento de catalepsia em barra
refletem as alterações neuroquímicas encontradas. Ambas as linhagens
apresentaram aumento da latência para descer da barra com o tratamento
agudo, porém com intervalos de tempo e magnitudes de efeitos diferentes
(Figura 16D). Deste modo, ratos Wistar apresentaram o pico do efeito motor da
reserpina 24h após a injeção, enquanto animais SHR o apresentaram logo após
12h. Ainda, a magnitude do prejuízo motor foi maior na linhagem Wistar
comparada a linhagem SHR, correspondente ao grau de depleção de
monoaminas produzido nestas linhagens.
100
Os resultados derivados do regime agudo acrescentam uma informação
farmacocinética importante em relação ao tratamento repetido com baixas doses
de reserpina. O deslocamento temporal do efeito motor para a direita em ratos
Wistar pode representar respostas farmacocinéticas diferentes para estas
linhagens, de tal modo que outros mecanismos não podem ser descartados,
como uma menor ação da reserpina sobre o VMAT2 ou uma maior
metabolização da reserpina por animais SHR. Em acordo com o descrito neste
capítulo, uma menor densidade de VMAT2 no estriado já foi descrita em ratos
juvenis SHR em relação à linhagem WKY (Simchon, Weizman e Rehavi, 2010).
Portanto, para o esclarecimento definitivo desta questão ainda se torna
necessário estudos que investiguem o comportamento dose-resposta destas
linhagens ao tratamento com reserpina, assim como a investigação da
funcionalidade e ligação da reserpina ao VMAT2.
Por fim, a comparação entre os efeitos dos tratamentos agudo e crônico
aqui apresentada não se limita apenas a questões farmacocinéticas. O estudo
agudo conduzido buscou investigar o perfil temporal da ação da reserpina e
magnitude dos efeitos comportamentais entre as diferentes linhagens sob uma
condição de depleção severa de monoaminas. Já o tratamento crônico, com uma
dose dez vezes menor, serviu ao propósito de investigar as consequências de
uma condição de bloqueio contínuo e moderado do VMAT2. Neste desenho
experimental, todas as avaliações comportamentais e neuroquímicas foram
realizadas 48h após o tratamento, em uma condição de baixa nos níveis séricos
e teciduais da reserpina. Sendo assim, o aspecto temporal do efeito da reserpina
neste protocolo se torna menos relevante em detrimento da ação cumulativa e
de longo prazo do tratamento, como as alterações neuroquímicas para
parâmetros de estresse oxidativo (peroxidação lipídica) e expressão de
proteínas (TH e α-sinucleína, apresentadas no Capítulo II). Deste modo, o estudo
agudo serve para compreensão das diferenças farmacológicas e
farmacocinéticas do tratamento com reserpina nas linhagens Wistar e SHR,
enquanto o estudo crônico ao efeito cumulativo e duradouro do tratamento com
reserpina sobre parâmetros neuroquímicos e comportamentais, com base nos
resultados previamente encontrados para esse protocolo em ratos Wistar.
101
6.6. CONCLUSÃO
Em síntese, as magnitudes das alterações motoras em ambos regimes de
tratamento são compatíveis ao grau de depleção de monoaminas expresso por
animais Wistar e SHR. Ainda, a expressão do prejuízo motor e da depleção de
monoaminas estão acopladas temporalmente em ambos regimes, de modo a
sugerir fortemente que os níveis destes neurotransmissores definem o
comportamento motor apresentado. Não somente, a depleção de monoaminas
também resultou em um aumento breve correspondente do metabolismo destas,
que se extinguiu após uma condição de depleção duradoura. Estas alterações
de metabolismo, por sua vez, refletiram sobre o dano oxidativo a lipídios de
membranas apenas na linhagem SHR.
Sendo assim, a compreensão da dinâmica temporal da expressão do
conteúdo de monoaminas fornece indícios fortes para os mecanismos de
resistência ao prejuízo motor induzido pelo tratamento com reserpina na
linhagem SHR. Este estudo, portanto, situa a relevância do metabolismo de
monoaminas para a expressão dos déficits motores e danos celulares
resultantes do tratamento com reserpina, acrescentando informações relevantes
para a compreensão das alterações neuroquímica para a expressão de TH e α-
sinucleína previamente descritas. Ainda, mais uma vez as diferenças para a
expressão do comportamento motor e depleção de monoaminas confirma as
diferentes susceptibilidades aos déficits induzidos pelo tratamento repetido com
reserpina em diferentes linhagens de ratos, como anteriormente conjeturado.
Finalmente, este também serve à validação do modelo progressivo da DP
induzido pelo tratamento repetido com baixas doses de reserpina (Fernandes et
al., 2012; Leão et al., 2015; Santos et al., 2013). Neste estudo pudemos
demonstrar um comprometimento progressivo da neurotransmissão de
monoaminas – depleção de dopamina e serotonina – importante para a
expressão de alterações motoras e cognitivas relevantes para DP.
102
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS
No presente estudo, sugerimos utilização de diferentes linhagens de ratos
(Wistar e SHR) para a investigação da susceptibilidade a um modelo animal
progressivo para a DP. Ainda, propomos a investigação da progressão das
alterações motoras e neuroquímicas resultantes do tratamento nestas linhagens
para a compreensão das diferenças celulares intrínsecas e/ou resultante do
tratamento entre estas linhagens.
No capítulo I, a partir de uma minunciosa revisão da literatura,
enumeramos as variadas alterações comportamentais e neuroquímicas
resultantes do tratamento com reserpina em roedores. A compilação destes
estudos permitiu que propuséssemos mecanismos e vias celulares para o insulto
sobre a transmissão dopaminérgica produzida pelo tratamento com reserpina.
De modo geral, evidências sólidas sustentam a capacidade da reserpina em
produzir supra-regulação de receptores de dopamina, depleção de monoaminas,
estresse e dano celular, sinalização pró-inflamatória e pró-apoptótica, e
diminuição e/ou aumento na expressão de proteínas de importância para a DP.
Não somente, estas alterações são acompanhadas por déficits motores e não-
motores que refletem a sintomatologia da DP. Sendo assim, validamos o regime
de tratamento repetido com baixas doses de reserpina como uma abordagem
importante para a compreensão da progressão destas referidas alterações em
modelos animais.
Ainda, estas evidências foram discutidas nos termos de validade de face,
preditiva e constructo proposta por Paul Wilner (1984), traçando paralelos com
evidências clínicas e epidemiológicas para os déficits descritos na DP e
argumentando contra a atual subutilização desta. Deste modo, o tratamento com
reserpina tem-se mostrado útil para a investigação de tratamentos anti-
parkinsonianos, importância do metabolismo de monoaminas e o papel do
VMAT2 para a fisiopatologia, e compreensão da diversidade sintomática motora
e não-motora da DP.
Utilizamos, então, no capítulo II o regime de tratamento repetido com
baixas doses de reserpina para caracterizar a progressão motora e expressão
de TH e α-sinucleína em ratos das linhagens Wistar e SHR. O produto desta
103
investigação revelou diferenças importantes para a susceptibilidade ao
desenvolvimento dos prejuízos motores entre estas linhagens. Neste sentido,
ratos SHR se mostraram resistentes ao prejuízo motor em todas as dimensões
avaliadas – catalepsia, discinesia oral, e atividade espontânea – tanto para a
magnitude, quanto para o tempo de instauração destas. No entanto, estes
animais ainda assim apresentaram alterações neuroquímicas para a expressão
de TH e α-sinucleína compatíveis com as expressas em animais Wistar em
resposta ao tratamento com reserpina.
Não obstante, neste capítulo descrevemos diferenças constitutivas
importantes para a expressão das referidas alterações neuroquímicas na
linhagem SHR. Estes animais apresentaram maior expressão de TH na SNpc,
assim como tendência para o aumento no estriado dorsal, em comparação à
linhagem Wistar. Ainda, enquanto o tratamento foi capaz de reduzir os níveis de
TH no estriado dorsal de ambas as linhagens, esta conseguiu resultar em
decremento da expressão de TH na SNpc apenas na linhagem Wistar. Este
achado ajuda a situar uma possível ordem de comprometimento da via nigro-
estriatal neste modelo. Isto é, a regulação negativa de TH no estriado por si só
não foi suficiente para a expressão do prejuízo motor observado na linhagem
SHR. Sendo, deste modo, necessário o comprometimento dos níveis de TH na
SNpc para a obtenção do comprometimento motor, como observado em animais
Wistar. Finalmente, animais SHR ainda apresentaram redução na expressão de
α-sinucleína no estriado, apesar desta revelar-se aumentada em animais
tratados com reserpina em ambas as linhagens. Apesar da α-sinucleína ainda
ser uma proteína com função completamente não elucidada, evidências
importantes apontam para o papel desta no metabolismo de DA e função
sináptica. Portanto, a redução na expressão desta observada em animais SHR
parece conferir proteção aos prejuízos motores produzidos pelo tratamento com
reserpina.
Finalmente, no capítulo III, exploramos as alterações para os níveis de
monoaminas – DA e 5-HT – e produtos da peroxidação de lipídios nas linhagens
Wistar e SHR sob o regime agudo e repetido de tratamento com reserpina. De
modo geral, encontramos que animais SHR são resistentes à depleção de
monoaminas. Esta resistência, assim como para o comportamento motor,
104
revelou-se tanto para a magnitude quanto para o tempo até a depleção desta.
Isto é, animais SHR apresentaram menor depleção de monoaminas, assim como
levaram mais tempo para expressar esta. Estes achados estão de acordo e
parecem refletir a expressão do prejuízo motor observado nas linhagens Wistar
e SHR. Isto é, para ambos os regimes de tratamento houve um acoplamento
temporal para os efeitos de depleção de monoaminas e comprometimento motor
observado nas linhagens Wistar e SHR. Esta investigação também acrescentou
informação importante a respeito de danos a lipídios de membrana pelo
tratamento com reserpina, de modo que animais SHR apresentaram níveis
reduzidos de produtos da peroxidação lipídica desde a condição controle. Estes
dados situam a relevância do metabolismo de monoaminas para a produção e
progressão de danos celulares sob o regime de tratamento com reserpina como
mecanismos secundários e complementares à depleção de monoaminas.
Ainda, os achados obversados no capítulo III se relacionam diretamente
com aqueles descritos no capítulo II, uma vez que um cenário de aumento do
metabolismo de monoaminas pela carga citoplasmática de monoaminas é
compatível com as alterações para expressão de TH e α-sinucleína. Como
discutido no capítulo II, ambas as proteínas de interesse para a DP são
reguladas tanto pelos produtos finais destas vias, como por produtos reativos do
oxigênio produzidos pelo metabolismo de DA. No entanto, a investigação da
relação mecanicística entre estes eventos ainda permanece por ser esclarecida
e requer estudos complementares.
Em conclusão, as evidências apresentadas ao longo deste estudo
reforçam a validade e utilidade do modelo progressivo para a DP induzido pelo
tratamento repetido com baixas doses de reserpina para a melhor compreensão
das alterações neuroquímicas e comportamentais subjecentes à DP. Podemos
destacar como elementos sólidos deste modelo a capacidade de abordar a
progressão destas alterações, assim como modelar fases ou insultos prematuros
na DP. Não somente, o emprego de diferentes linhagens de ratos e a
investigação das diferenças neuroquímicas intrínsecas e/ou induzidas em
resposta a um insulto tóxico-farmacológico também se revelou uma abordagem
interessante para a identificação de passos celulares relevantes para a
105
compreensão da susceptibilidade à DP, com implicações para futuras
estratégias preventivas e/ou terapêuticas.
106
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