Amplifikasi (CA)n repeat Regio Regulator GenAldose Reduktase pada Penderita Retinopati

Diabetika di Bali

Desak Made Wihandani1, Ni Nyoman Ayu Dewi2,K Suastika3

1,2 Bagian Biokimia PSPD FK Unud; 3Bagian Ilmu Penyakit Dalam FK Unud/RSUP Sanglah

PENDAHULUANPENDAHULUAN

Ina8,421,3254%

Wild, 2004.Diabetes CareGlobal Prevalence of Diabetes:Estimates for the year 2000 andProjection for 2030

World (Shaw, 2009)2010 = 2852030 = 43969%

Latar Belakang

neuronarc.com

Latar Belakang

• Wihandani et al (2014) telah melakukanidentifikasi polimorfisme (CA)n repeat denganmenggunakan teknik sekuensing.

• Penelitian ini tidak berhasil mengidentifikasipolimorfisme (CA)n dengan baik karenabanyak ‘noise’ pada hasil sekuensing.

• Perlu teknik khusus yg dpt mengidentifikasifragmen (CA)n repeat dengan baik

• Wihandani et al (2014) telah melakukanidentifikasi polimorfisme (CA)n repeat denganmenggunakan teknik sekuensing.

• Penelitian ini tidak berhasil mengidentifikasipolimorfisme (CA)n dengan baik karenabanyak ‘noise’ pada hasil sekuensing.

• Perlu teknik khusus yg dpt mengidentifikasifragmen (CA)n repeat dengan baik

ELEKTROFEROGRAM

(CA)22

Rumusan Masalah

1. Bagaimanakah pola pengulangan dinukleotida (CA)pada regio regulator gen ALR2 pada penderitaretinopati diabetika di Bali?

2. Apakah polimorfisme (CA)n repeat regioregulator gen ALR2 merupakan faktor risiko RDpada penderita DM tipe 2 di Bali?

Tujuan Penelitian

1. Untuk mengetahui pola pengulangandinukleotida (CA) pada regio regulator gen ALR2pada penderita retinopati diabetika di Bali di Bali

2. Untuk membuktikan polimorfisme (CA)n repeatregio regulator gen ALR2 merupakan faktor risikoretinopati diabetika pada penderita DM tipe 2 diBali?

Cara Kerja

• Isolasi DNA menggunakan GF-1 BloodExtraction (Vivantis)

• Amplifikasi (CA)n repeat sepanjang 138 bpdilakukan dengan modifikasi Ko, et al., 1995.Primer forward disisipi sisi pengenalan untukHindIII dan primer reverse disisipi sisipengenalan untuk BamHI

• PCR menggunakan kit Go Taq® Green mastermix (Promega).

• Isolasi DNA menggunakan GF-1 BloodExtraction (Vivantis)

• Amplifikasi (CA)n repeat sepanjang 138 bpdilakukan dengan modifikasi Ko, et al., 1995.Primer forward disisipi sisi pengenalan untukHindIII dan primer reverse disisipi sisipengenalan untuk BamHI

• PCR menggunakan kit Go Taq® Green mastermix (Promega).

Primer

• PrimerForward:5’NNNNNAAGCCTGAATCTTAACATGCTCTGAACC 3’

• Primer Reverse: 5’ NNNNNGGATTCGCC CAGCCC TAT ACC TAG T 3’

• PrimerForward:5’NNNNNAAGCCTGAATCTTAACATGCTCTGAACC 3’

• Primer Reverse: 5’ NNNNNGGATTCGCC CAGCCC TAT ACC TAG T 3’

Campuran PCR

• 12,5 µl 2x PCR master mix,• 1,5 ul primer forward,• 1,5 µl primer reverse,• 1 µl DNA dan• 8,5 µl ddH20• Total volume reaksi 25 µl

• 12,5 µl 2x PCR master mix,• 1,5 ul primer forward,• 1,5 µl primer reverse,• 1 µl DNA dan• 8,5 µl ddH20• Total volume reaksi 25 µl

Program PCR

• Predenaturasi pada 94oC selama 5 menit,denaturasi 94oC selama 1 menit,annealing 58oC selama 1 menit danextension 72oC selama 1 menitJumlah siklus 35

• Hasil PCR dipurifikasi menggunakan Gel/PCRDNA Fragments Extraction Kit dari Geneaid

• Predenaturasi pada 94oC selama 5 menit,denaturasi 94oC selama 1 menit,annealing 58oC selama 1 menit danextension 72oC selama 1 menitJumlah siklus 35

• Hasil PCR dipurifikasi menggunakan Gel/PCRDNA Fragments Extraction Kit dari Geneaid

Digesti

• Digesti dengan enzim restriksi BamHI selama2 jam pada suhu 37oC kemudian purifikasi

• Digesti dengan enzim restriksi HindIII selama2 jam pada suhu 37oC

• Digesti dengan enzim restriksi BamHI selama2 jam pada suhu 37oC kemudian purifikasi

• Digesti dengan enzim restriksi HindIII selama2 jam pada suhu 37oC

Hasil Penelitian

• Sebanyak 60 subyek terdiri atas 34 laki-laki(56.7%) dan 26 perempuan (43.3%)

• Terdiri atas 32 (53%) kasus dan 28 (47%)kontrol

• Sebanyak 60 subyek terdiri atas 34 laki-laki(56.7%) dan 26 perempuan (43.3%)

• Terdiri atas 32 (53%) kasus dan 28 (47%)kontrol

Karakteristik Subyek

Parameter Rerata±SD Rentang

Umur (tahun) 52,86±8,27 32 - 65

Lama DM (tahun) 6,27± 4,32 1 - 15

Tekanan Darah

Sistolik (mmHg) 131,55±14,09 100 - 170

Diastolik (mmHg) 89,0±8,10 65 - 120Diastolik (mmHg) 89,0±8,10 65 - 120

Lingkar Pinggang (cm) 90,70±9,65 66 - 113

BMI (kg/m2) 24,67±3,70 15,89 - 38,81

FBG (mg/dl) 159,99±61.94 66 - 325

PBG (mg/dl) 236,80±96,94 83 -525

HbA1c (%) 8,50±2,55 5,10 - 17,60

Hasil Amplifikasi

Digesti dan Ligasi

• Saat ini masih menunggu plasmid untukselanjutnya dilakukan ligasi fragmen yang telahdidigesti. Disimpan sampai tahap berikutnya(tahun kedua)

• Tahun kedua:Transformasi, Ekstraksi Palsmid dan Sekuensing

• Saat ini masih menunggu plasmid untukselanjutnya dilakukan ligasi fragmen yang telahdidigesti. Disimpan sampai tahap berikutnya(tahun kedua)

• Tahun kedua:Transformasi, Ekstraksi Palsmid dan Sekuensing

Kesimpulan

• Hasil amplifikasi menunjukkan pita DNAdengan ukuran yang sesuai dengan ukuranyang diharapkan (138 bp)

TERIMA KASIHTERIMA KASIH

i

Amplifikasi (CA)n repeat Regio Regulator Gen Aldose Reduktase (ALR2) pada Penderita

Retinopati Diabetika di Bali

Desak Made Wihandani1, Ni Nyoman Ayu Dewi2, K Suastika3

1,2Bagian Biokimia PSPD FK Unud, 3Bagian Ilmu Penyakit Dalam FK Unud/RSUP Sanglahdmwihandani@yahoo.co.id

Abstrak

Salah satu komplikasi kronik diabetes adalah retinopati diabetika (RD) yaitu gangguanvaskuler yang mempengaruhi mikrovaskuler retina, merupakan penyebab utama kebutaan danmerupakan komplikasi yang paling umum dari diabetes. Bukti-bukti menunjukkan bahwaterjadinya RD dipengaruhi oleh faktor genetik dan lingkungan. Polimorfisme gen ALR2merupakan salah satu faktor genetik yang berperan dalam terjadinya RD. Penelitian inibertujuan untuk mengidentifikasi polimorfisme gen ALR2 yaitu polimorfisme (CA)n repeat.Diketahui bahwa polimorfisme (CA)n repeat berbeda pada sebagian populasi dan merupakanifaktor risiko terjadinya retinopati diabetika. Sementara populasi lain ditemukan pengulanganCA yang berbeda dan tidak merupakan ifaktor risiko. Dengan demikian target penelitian iniadalah menemukan polimorfisme (CA)n repeat pada gen ALR2 dan membuktikan apakahpolimorfisme (CA)n repeat yang ditemukan merupakan faktor risiko terjadinya retinopatidiabetika.

Sebanyak 30 kasus dan 30 kontrol dipilih sebagai sampel penelitian. Pada tahun pertamatelah dilakukan isolasi DNA dan amplifikasi fragmen DNA yang mengandung (CA)n repeatdengan teknik PCR. Primer yang digunakan ditandai dengan sisi pemotongan enzim restriksiHindIII pada ujung 5’ dan BamHI pada ujung 3’. Hasil PCR kemudian dipurifikasi dan didigestimenggunakan kedua enzim restriksi tersebut. Digesti juga dilakukan terhadap plasmid pUC19.

Hasil amplifikasi menunjukkan pita DNA dengan ukuran yang sesuai dengan ukuran yangdiharapkan (138 bp). Hasil digesti produk PCR dan Plasmid disimpan pada -20oC dan akandilanjutkan pada tahun kedua.

Kata kunci : (CA)n repeat, ALR2, Retinopati diabetika

ii

Amplification of (CA)n repeat from Aldose Reduktase (ALR2) Gen Regulatory Region inDiabetic Retinopathy Patients in Bali

Desak Made Wihandani1, Ni Nyoman Ayu Dewi2, K Suastika3

1,2Department of Biochemistry, Faculty of Medicine Udayana University,3Department of Internal Medicine, Faculty of Medicine Udayana University/Sanglah General

Hospitaldmwihandani@yahoo.co.id

Abstract

Diabetic retinopathy (DR), a chronic complication of diabetes, is a vascular defect whichaffects retinal microvasculer which is responsible as the main cause of blindness and the mostcommon complication of diabetes. Genetic and environtment are factors that affect theoccurence of DR. Polymorphism of ALR2 gene is one of the genetic factor involved inpathogenesis of DR. The objective of this study is to identify the polymorphism of (CA) repeatof ALR2 gene. It was known that (CA) repeat is different among some populations, and a riskfactor for DR development. Otherwise, in other population, the repeat is not different and not arisk factor for DR. This study aimed to find the (CA)-repeat polymorphim of ALR2 gene andwhether this polymorphism is a risk factor for DR.

This is a case-control study with a total samples of 60 (30 cases and 30 controls). In thisfirst year of study, DNA isolation and PCR to amplify the DNA fragment contain the (CA)-repeat was carried out. Primers used for amplification were designed to contain site recognitionfor restriction enzyme HindIII and BamHI at 5' and 3' end respectively. PCR product and pUC19plasmid were digested using both of those enzymes.

The DNA produced from PCR is a 138 bp fragment as expected. The digested PCRproduct and plasmid will be stored at -20oC for further analysis at the second year of the study.

Key Words : (CA)n repeat, ALR2, Diabetic Retinopathy