anaerobna digestija lignoceluloznih materialov s ... · anaerobna digestija lignoceluloznih...

Jernej Rotar

Anaerobna digestija lignoceluloznih materialov s predobdelavo z glivami lesne trohnobe

Diplomsko delo

Maribor, september 2014

Anaerobna digestija lignoceluloznih materialov s

predobdelavo z glivami lesne trohnobe

Diplomsko delo univerzitetnega študijskega programa I. stopnje

Študent: Jernej Rotar

Študijski program: univerzitetni študijski program I. stopnje Kemijska

tehnologija

Predvideni strokovni naslov: diplomirani inţenir kemijske tehnologije (UN)

Mentor: red. prof. dr. Zdravko Kravanja

Komentor: dr. Lidija Čuček, univ. dipl. inţ. kem. teh.

Maribor, september 2014


I

IZJAVA

Izjavljam, da sem diplomsko delo izdelal sam, prispevki drugih so posebej označeni. Pregledal sem literaturo s področja diplomskega dela po naslednjih geslih:

Vir: COBIB-COBISS (http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?ukaz=getid)

Gesla: Število referenc

anaerobna digestija IN bioplin 11

vsebnost lignina 14

glive bele lesne trohnobe 15

Vir: Google Učenjak

Gesla: Število referenc

lignocellulosic materials IN composition 5

Skupno število pregledanih člankov: 17

Skupno število pregledanih knjig: 2

Maribor, september 2014 Jernej Rotar

Podpis


II


III

Zahvala

Zahvaljujem se mentorju red. prof. dr. Zdravku Kravanji za strokovno pomoč in vodenje pri opravljanju diplomskega dela. Prav tako se zahvaljujem komentorici dr. Lidiji Čuček za pomoč in nasvete pri opravljanju eksperimentalnega dela ter pri pisanju diplome. Hvala tudi Andreji Nemet in Vuku Radojkoviču, ki sta mi pomagala in svetovala pri opravljanju eksperimentalnega dela.

Zahvala gre tudi prof. dr. Francu Pohlevnu iz Biotehniške fakultete Oddelka za lesarstvo Univerze v Ljubljani za predobdelavo substratov z glivami in drugo strokovno pomoč. Zahvaljujem se tudi podjetju Petrol d. d., Ljubljana, Bioplinarna Ihan in Perutnini Ptuj, Bioplinarna Draţenci za inokulum, piščančji gnoj in koruzno silaţo ter Nacionalnemu laboratoriju za zdravje okolje in hrano za izposojo plinskega kromatografa.

Posebna zahvala gre tudi druţini, ki mi je omogočila študij in me ves čas študija spodbujala.


IV


V

Anaerobna digestija lignoceluloznih materialov s predobdelavo z

glivami lesne trohnobe

Povzetek

Lignocelulozni materiali (les, slama, stebla alternativnih rastlin, različni agroţivilski ostanki) lahko vsebujejo velik deleţ lignina, ki ga bakterije teţko predelujejo v bioplin. Zato ostane lignin neizkoriščen pri anaerobni razgradnji materiala. S predobdelavo z različnimi glivami ga je mogoče pretvoriti v obliko, ki je primernejša za bakterije. Tako predobdelan lignin bakterije bolje izkoristijo in ga laţje predelajo v bioplin.

V laboratorijskem merilu smo ţeleli izboljšati učinkovitost proizvodnje bioplina iz lignoceluloznih materialov. Kot substrat smo uporabili les, ki smo ga predhodno predobdelali z glivama Trametes versicolor in Hypoxylon fragiforme. Naredili smo tudi nekaj mešanic substrata s piščančjim gnojem ter proučili vpliv na proizvodnjo bioplina. Za primerjavo smo uporabili rezultate, dobljene z uporabo neobdelanih substratov ter čiste celuloze in inokuluma. Proučevali smo vpliv deleţa lignina v lignoceluloznih materialih na količino nastalega bioplina v procesu anaerobne digestije. Poleg tega smo spremljali potek anaerobne digestije in nastajanja bioplina ter časovno spremembo vsebnosti lignina v lignoceluloznih materialih obdelanih z glivo in med procesom anaerobne digestije.

Ugotovili smo, da je pri anaerobni digestiji obdelanega lesa nastalo nekoliko več bioplina kot pri neobdelanem. Če primerjamo predobdelavo z glivama, je proizvodnja bioplina iz predobdelanega materiala z glivo Hypoxylon fragiforme višja, kot iz predobdelanega materiala z glivo Trametes versicolor. Dodatek piščančjega gnoja k lesu pa ima učinkovit vpliv na donos bioplina.

Ključne besede: lignocelulozni materiali, lignin, bioplin, predobdelava z glivami, anaerobna digestija

UDK: 628.336.6:678.034(043.2)


VI

Anaerobic digestion of lignocellulosic materials by fungi pre-

treatment

Abstract

Lignocellulosic materials (wood, straw, stalks of alternative crops, various agri-residues) may contain large proportions of lignin that are difficult for bacteria to convert into biogas. Therefore, lignin remains non-utilised during the anaerobic decompositions of material. However, following pre-treatment with different fungi lignin it could be converted into a form which is more suitable for the bacteria. Pre-treated lignocellulosic material is easier to be used by bacteria and the material could be more easily converted into biogas.

On the laboratory scale the efficiencies of biogas from lignocellulosic materials were attempted at being improved. Wood was used as a substrate, which was pre-treated with the fungi Trametes Versicolor and Hypoxylon fragiforme. Also several mixtures of a substrate with chicken manure were analysed, and the impacts were studied of those mixtures on biogas production. The results obtained by using untreated substrates, pure cellulose and inoculum were used for comparison. The influences of lignin proportions within the lignocellulosic material were studied in regard to the quantities of biogas produced during the anaerobic digestion process. The progress of anaerobic digestion and biogas formation were monitored as well as temporal variations of the lignin content in those lignocellulosic materials pre-treated by fungi and during the anaerobic digestion process.

It was discovered that slightly more biogas was produced during the anaerobic digestion of pre-treated wood tham during that of non pre-treated wood. Biogas production from the pre-treated material with fungus Hypoxylon fragiforme was higher than that pre-treated with a fungus Trametes versicolor. The addition of chicken manure to the wood had an effective impact on biogas yield.

Key words: lignocellulosic materials, lignin, biogas, fungi pre-treatment, anaerobic digestion

UDK: 628.336.6:678.034(043.2)


VII

Kazalo

1 Uvod ................................................................................................................................ 1 2 Teoretični del ................................................................................................................... 3

2.1 Lignocelulozni materiali .......................................................................................... 3 2.2 Glive bele lesne trohnobe ......................................................................................... 5

2.2.1 Gliva Trametes versicolor ................................................................................ 6 2.2.2 Gliva Hypoxylon fragiforme ............................................................................. 6

2.3 Anaerobna digestija.................................................................................................. 7 2.3.1 Substrati anaerobne digestije ............................................................................ 8 2.3.2 Proces anaerobne digestije ................................................................................ 9 2.3.3 Parametri anaerobne digestije ........................................................................... 9 2.3.4 Bioplin ............................................................................................................ 10

3 Metode dela ................................................................................................................... 11 3.1 Cepitev lignina z glivo ........................................................................................... 11 3.2 Določanje trdne snovi ............................................................................................ 11 3.3 Priprava zmesi za fermentacijo .............................................................................. 13 3.4 Merjenje volumna nastalega bioplina .................................................................... 16 3.5 Merjenje sestave bioplina ....................................................................................... 16 3.6 Določanje vsebnosti lignina ................................................................................... 16

4 Eksperimentalni del z rezultati in diskusijo .................................................................. 19 4.1 Cepitev lignina z glivo ........................................................................................... 19 4.2 Proces anaerobne digestije ..................................................................................... 19

4.2.1 Določanje vsebnosti trdne snovi ..................................................................... 20 4.2.2 Priprava zmesi za fermentacijo ....................................................................... 21

4.3 Volumen bioplina ................................................................................................... 23 4.4 Sestava bioplina ..................................................................................................... 27 4.5 Vsebnost lignina ..................................................................................................... 31

4.5.1 Vsebnost lignina v neobdelanih bukovih briketih .......................................... 32 4.5.2 Vsebnost lignina v obdelanih bukovih briketih z glivo .................................. 32 4.5.3 Časovna odvisnost vsebnosti lignina za vzorce iz anaerobne digestije .......... 34

5 Zaključek ....................................................................................................................... 35 6 Literatura ....................................................................................................................... 37 7 Priloge ........................................................................................................................... 41

7.1 Izračunane prostornine nastalega bioplina na gram trdne snovi ............................ 41 7.2 Izmerjeni volumski deleţi metana in ogljikovega dioksida nastalega bioplina ..... 46 7.3 Časovna odvisnost vsebnosti lignina v vzorcih iz anaerobne digestije ................. 49

8 Ţivljenjepis .................................................................................................................... 51


VIII

Seznam tabel

Tabela 2-1: Kemijska sestava nekaterih lignoceluloznih materialov (po viru [12]) .............. 4

Tabela 4-1: Določanje vsebnosti trdne snovi za trdne materiale .......................................... 20

Tabela 4-2: Določanje vsebnosti trdne snovi za tekoče materiale ........................................ 21

Tabela 4-3: Določene vrednosti, izračunane in dejanske zatehte substratov za prvo nastavitev .............................................................................................................................. 22

Tabela 4-4: Določene vrednosti, izračunane in dejanske zatehte substratov za drugo nastavitev .............................................................................................................................. 23

Tabela 4-5: Meritve in izračuni deleţa ekstrahiranih snovi za neobdelane bukove brikete . 32

Tabela 4-6: Meritve in izračuni deleţa kislinsko netopnega lignina za neobdelane bukove brikete .................................................................................................................................... 32

Tabela 4-7: Meritve in izračuni deleţa ekstrahiranih snovi za obdelane bukove brikete ..... 33

Tabela 4-8: Meritve in izračuni deleţa kislinsko netopnega lignina za obdelane bukove brikete .................................................................................................................................... 33

Tabela 7-1: Izračunane celokupne prostornine nastalega bioplina na gram trdne snovi za posamezne vzorce iz prve in druge nastavitve od 1. do 10. dne .......................................... 41

Tabela 7-2: Izračunane celokupne prostornine nastalega bioplina na gram trdne snovi za posamezne vzorce iz prve in druge nastavitve od 11. do 20. dne ......................................... 42

Tabela 7-3: Izračunane celokupne prostornine nastalega bioplina na gram trdne snovi za posamezne vzorce iz prve in druge nastavitve od 21. do 28. dne ......................................... 43

Tabela 7-4: Izračunane dnevne prostornine nastalega bioplina na gram trdne snovi za posamezne vzorce iz prve in druge nastavitve od 1. do 14. dne ........................................... 44

Tabela 7-5: Izračunane dnevne prostornine nastalega bioplina na gram trdne snovi za posamezne vzorce iz prve in druge nastavitve od 15. do 28. dne ......................................... 45

Tabela 7-6: Izmerjeni volumski deleţi metana in ogljikovega dioksida nastalega bioplina za 2., 7. in 12. dan fermentacije ................................................................................................. 47

Tabela 7-7: Izmerjeni volumski deleţi metana in ogljikovega dioksida nastalega bioplina za 15., 22. in 28. dan fermentacije ............................................................................................. 48

Tabela 7-8: Meritve in izračuni deleţa ekstrahiranih snovi za vzorce iz anaerobne digestije ............................................................................................................................................... 49

Tabela 7-9: Meritve in izračuni deleţa kislinsko netopnega lignina za vzorce iz anaerobne digestije ................................................................................................................................. 49


IX

Seznam slik

Slika 2-1: Struktura zgradbe lignoceluloznega materiala (po viru [13]) ................................ 3

Slika 2-2: Gliva Trametes versicolor (vir [24]) ...................................................................... 6

Slika 2-3: Gliva Hypoxylon fragiforme (vir [27]) ................................................................... 7

Slika 2-4: Shema procesa anaerobne digestije (po viru [31]) ................................................. 8

Slika 3-1: Shema nastavitve eksperimenta za anaerobni proces .......................................... 13

Slika 4-1: Bukovi briketi z glivo H. fragiforme po 18. dneh cepitve ................................... 19


X

Seznam diagramov

Diagram 4-1: Povprečna celokupna prostornina bioplina na gram suhe trdne snovi brez inokuluma za prvo nastavitev ............................................................................................... 24

Diagram 4-2: Povprečna dnevna prostornina bioplina na gram suhe trdne snovi brez inokuluma za prvo nastavitev ............................................................................................... 25

Diagram 4-3: Povprečna celokupna prostornina bioplina na gram suhe trdne snovi brez inokuluma za drugo nastavitev ............................................................................................. 26

Diagram 4-4: Povprečna dnevna prostornina bioplina na gram suhe trdne snovi za drugo nastavitev .............................................................................................................................. 27

Diagram 4-5: Časovna odvisnost povprečne vsebnosti metana za vzorce iz prve nastavitve ............................................................................................................................................... 28

Diagram 4-6: Časovna odvisnost povprečne vsebnosti ogljikovega dioksida za vzorce iz prve nastavitve ...................................................................................................................... 29

Diagram 4-7: Časovna odvisnost povprečne vsebnosti metana za vzorce iz druge nastavitve ............................................................................................................................................... 30

Diagram 4-8: Časovna odvisnost povprečne vsebnosti ogljikovega dioksida za vzorce iz druge nastavitve .................................................................................................................... 31

Diagram 4-9: Časovna odvisnost povprečne vsebnosti lignina v vzorcih iz anaerobne digestije ................................................................................................................................. 34


XI

Uporabljeni simboli in kratice

mč masa čaše (g)

mdej.g dejanska zatehta piščančjega gnoja (g)

mdej.l dejanska zatehta lignoceluloznega materiala (g)

mfp masa filter papirja (g)

mg določena masa piščančjega gnoja (g)

mi določena masa trdne snovi inokuluma (g)

ml določena masa trdne snovi lignoceluloznega materiala (g)

mlig masa lignina (g)

mlig + p + fp masa lignina s petrijevko in filter papirjem (g)

mp masa petrijevke (g)

msi masa suhe snovi inokuluma s čašo (g)

msp masa suhe snovi s petrijevko (g)

mss masa suhe snovi po ekstrakciji (g)

mss + p + fp masa suhe snovi s petrijevko in filter papirjem (g)

mv masa zatehtane snovi (g)

mvp masa vzorca s petrijevko (g)

mzg potrebna zatehta piščančjega gnoja (g)

mzl potrebna zatehta lignoceluloznega materiala (g)

n število paralelk (-)

V volumen potreben v zmesi (l)

Vpv volumen potrebnega dodanega pufra in vode (l)

Vsi volumen inokuluma vzet za sušenje (l)

Vzi potreben volumen dodanega inokuluma (l)

wes deleţ ekstrahiranih snovi (%)

wlig vsebnost kislinsko netopnega lignina (%)

wTS masni deleţ trdne snovi (%)

TS povprečni masni deleţ za določen vzorec (%)

Grški simboli

∆Hr reakcijska entalpija (J/mol)

γTS vsebnost trdne snovi inokuluma (g/l)

γ TS povprečna vsebnost trdne snovi inokuluma (g/l)

ρg gostota piščančjega gnoja (g/l)

ρi gostota inokuluma (g/l)

ρv gostota vode (g/l)


XII

Kratice

1, 2, 3, 4,5 vzorci neobdelanih bukovih briketov

CE1, CE2 vzorca pozitivne kontrole (čista celuloza)

G6, G7, G8, G9 vzorci neobdelanih bukovih briketov in piščančjega gnoja v

različnih razmerjih

HF1, HF2 vzorci obdelanih bukovih briketov z glivo H. fragiforme

IN1, IN2 vzorca negativne kontrole (inokulum)

INSG vzorec koruzne silaţe in piščančjega gnoja

TV1, TV2, TV3,

TV4, TV5, TV6,

TV7, TV8, TV9,

TV10

vzorci obdelanih bukovih briketov z glivo T. versicolor

TVG1, TVG2,

TVG3, TVG4

vzorci obdelanih bukovih briketov z glivo T. versicolor in piščančjim

gnojem v različnih razmerjih


1

1 Uvod

Ţiva bitja potrebujemo za svoje delovanje energijo. Za vsako delo, ki ga ţelimo opraviti, je potrebno vloţiti določeno količino energije. Energijo pa naše telo pridobi iz hrane s pomočjo številnih kemijskih reakcij. Ko opravimo neko delo, oddamo v okolico toploto. Energija tako ves čas kroţi in se je ne da ustvariti ali uničiti, ampak se pretvarja iz ene oblike v drugo [1].

Tudi vsi ostali industrijski procesi potrebujejo za proizvodnjo in delovanje energijo. Ti viri energije so fosilna goriva (nafta, premog, zemeljski plin, lignit), jedrska goriva, biogoriva (bioplin, biodizel, bioetanol, biomasa) in drugi obnovljivi viri energije. Fosilna in jedrska goriva so neobnovljivi viri energije, zato ker se zaloge porabljajo hitreje kakor nastajajo nove, oziroma so njihove zaloge končne. Fosilna goriva nastajajo iz davno odmrlih bioloških snovi, za razliko od biogoriv, ki nastanejo iz nedavno odmrle biološke snovi in so obnovljivi viri energije. To je tudi bistvena razlika med obnovljivimi in neobnovljivimi viri energije. Tako se z uporabo obnovljivih virov energije zmanjša raba neobnovljivih virov in poveča trajnost oskrbe z energijo [2][3].

V svetu prihaja do naraščanja proizvodnih odpadkov, kot so biomasa, gnoj, komunalni odpadki, zeleni odpadki, rastlinski material itd. Proizvodni odpadki pa so eden od glavnih okoljevarstvenih problemov. Z izkoriščanjem odpadkov za proizvodnjo biogoriv obenem naredimo veliko korist za naše okolje. Prav tako pa je uporaba biogoriv bolj prijazna do okolja, saj zmanjša emisije toplogrednih plinov in s tem vpliv na globalno segrevanje [2][4]. V zadnjih letih je proizvodnja biogoriv iz različnih bioproduktov ena izmed pomembnejših industrijskih panog. Zato je na tem področju veliko raziskav [5].

Biogoriva se uporabljajo za ogrevanje stanovanjskih in drugih stavb, za proizvodnjo pare ter električne energije in za pogon prevoznih sredstev [6]. Eno izmed pomembnejših biogoriv je bioplin, ki nastane s procesom anaerobne digestije iz organskih snovi v odsotnosti kisika [7]. Njegova energetska uporabnost je velika in je odvisna od naravnega vira ter potreb po obliki energije [2].

Ker večina biomasnega odpada vsebuje manjše ali večje količine lignina, smo se osredotočili na proizvodnjo bioplina iz lignoceluloznih materialov. Lignocelulozni materiali so les, slama, stebla alternativnih rastlin in različni agroţivilski ostanki. Lignocelulozni materiali zraven hemiceluloze in celuloze, ki je glavni vir proizvodnje bioplina, vsebujejo tudi velik deleţ lignina, katerega bakterije v procesu anaerobne digestije teţko predelujejo v bioplin. Ker ţelimo material čim bolj izkoristiti, smo lignocelulozni material predobdelali z glivami bele lesne trohnobe, katere pretvorijo lignin v obliko, ki je primernejši za bakterije [5][8]. S pomočjo predobdelave lesa z glivami oz. razgradnje lignina, omogočimo laţji dostop do celuloze in hemiceluloze, ki se razkraja za proizvodnjo bioplina. Material smo predobdelali z glivama Trametes versicolor in Hypoxylon fragiforme. Kot substrat smo uporabili les, in sicer bukove brikete. Les smo uporabili zato, ker nas zanima ali je moţno odpad lesne biomase, ki je posledica letošnjega ţleda, s pomočjo te metode izkoristiti za proizvodnjo bioplina.

Cilj diplomskega dela je poiskati eksperimentalni način, kako izboljšati učinkovitost proizvodnje bioplina iz lignoceluloznih materialov in primerjati rezultate dobljene s predobdelavo z različnimi glivami. Spremljali smo potek anaerobne digestije in nastajanja bioplina ter časovno spremembo vsebnosti lignina v lignoceluloznih materialih obdelanih z glivo in med procesom anaerobne digestije. Za primerjavo so sluţili rezultati, dobljeni z uporabo neobdelanih substratov ter čiste celuloze in inokuluma [3].


2

Naredili smo še proizvodnjo bioplina iz obdelanega in neobdelanega lesa z dodatkom piščančjega gnoja v različnih razmerjih in tako analizirali vpliv na nastajanje bioplina [9].

Predpostavka ali hipoteza problema je ta, da je moţno s predobdelavo oziroma s pomočjo encimov glive razbiti lignin, da ga bakterije lahko pretvorijo v bioplin. Če gledamo iz ekonomskega vidika je hipoteza ta, da pride do povečanja proizvodnje bioplina in s tem do dodatne dodane vrednosti proizvodnje bioplina.


3

2 Teoretični del

V teoretičnem delu so predstavljeni lignocelulozni materiali, iz katerih smo proizvajali bioplin, glive bele lesne trohnobe, s pomočjo katerih smo lignocelulozni material predobdelali, in proces anaerobne digestije oz. proizvodnja bioplina.

2.1 Lignocelulozni materiali

Lignocelulozne materiale predstavljajo predvsem olesenele rastline in so najpogostejša snov za proizvodnjo biogoriva oz. bioplina. Najdemo jih v večini gozdarskih, kmetijskih in ţivilskih odpadkih in so obnovljivi ter poceni viri energije [10]. So neodporni na različne biotične dejavnike (bakterije, glive, ţuţelke) in abiotične dejavnike (ogenj, toplota, vremenski vplivi, mehanski dejavniki) in jih zato lahko deformiramo ali razgradimo. Encimi mikroorganizmov lahko razgrajujejo lignocelulozne materiale s hidrolizo, oksidacijo in dehidracijo ogljikovih hidratov, ki so glavna komponenta strukture lignoceluloznega materiala [3][11].

Lignocelulozni materiali imajo edinstveno kemijsko sestavo in kemijske ter fizikalne lastnosti. Zraven ţe omenjenih polimerov ogljikovih hidratov, to sta celuloza in hemiceluloza, jih sestavljajo še aromatski polimeri lignina in majhen deleţ ekstraktov [12]. Polimeri, ki so tesno povezani med seboj, tvorijo celični kompleks rastlinske biomase. Kot je prikazano na sliki 2-1 [13] celuloza tvori ogrodje, ki jo obdajata hemiceluloza in lignin [10].

Slika 2-1: Struktura zgradbe lignoceluloznega materiala (po viru [13])


4

Glavna sestavina lignoceluloznih materialov je celuloza, saj predstavlja največji masni deleţ snovi. Celuloza je linearni homopolimer ponavljajočih se enot glukoze (β-D-glukopiranoze) povezanih z β – 1,4 glikozidnimi vezmi. Njena kemijska formula je (C6H10O5)n, pri čemer n predstavlja število monomernih enot. Dolgoveriţne celulozne polimere med seboj povezujejo vodikove in Van der Waalsove vezi, ki omogočijo pakiranje celuloze v mikrofibrile. S vzporednim povezovanjem verig celuloze z vodikovimi vezmi, nastanejo kristalinične strukture (slika 2-1). Kristalinična struktura predstavlja pribliţno 2/3 celotne celuloze, zato imajo mikrofibrili urejeno strukturo. Ostali deleţ celuloze je neurejena amorfna struktura, ki je v stiku s hemicelulozo in ligninom. Takšna sestava daje celulozi pomembni lastnosti, to sta slaba topnost in teţka razgradljivost [10][12].

Hemiceluloza je linearen in razvejan heterogen polimer sestavljen iz makromolekul sladkorja pentoze in heksoze (slika 2-1). Pentoze so L-arabinoza in D-ksiloza, heksoze pa D-glukoza, D-galaktoza in D-manoza. Sestavni del hemiceluloze pa so še ocetna, glukuronska in ferulična kislina [10][12]. Monomeri so med seboj povezani z 1-3, 1-6 in 1-4 glikozidnimi vezmi. Za razliko od celuloze hemiceluloza nima kristalinične strukture in je zato veliko bolj neurejena in razvejana z niţjo stopnjo polimerizacije. Zaradi svoje strukture hemiceluloza laţje hidrolizira kot celuloza [3][10][14].

Lignin je zelo zapletena tridimenzionalna molekula in je heteropolimer (slika 2-1). Sestavljen je iz treh aromatičnih hidroksicinamilnih alkoholov, in sicer iz koniferil alkohola, sinapila in p-kumarila, ki so med seboj povezani z etrskimi, C-C in C-O-C vezmi [3]. Ti alkoholi se med seboj razlikujejo po številu metoksi skupin na aromatskem obroču [5][3]. Naloga lignina je, da zagotovi trdnost celični steni, da omogoča vodno neprepustnost in da tvori fizikalno-kemijske pregrade proti mikrobnim napadom. Zaradi svoje molekularne sestave so izredno odporni na kemijsko in encimsko degradacijo. Zato skupaj s hemicelulozo tvorita ovojnico okrog celuloze in preprečita njeno razgradnjo. S celulozo in hemicelulozo je tesno povezan s fizikalnimi vezmi. Glive bele trohnobe so edini organizmi, ki so sposobni razgraditi lignin. Razgradijo ga na ogljikov dioksid in vodo [10][12][14].

Vsebnost polimerov ogljikovih hidratov in lignina se v lignoceluloznih materialih razlikuje od rastline do rastline. Poleg tega se vsebnost lahko razlikuje glede na starost, stopnjo rasti in drugih pogojev. Ampak je v večini primerov vodilni strukturni polisaharid celuloza, kateri sledita hemiceluloza in lignin [10]. Kemijska sestava nekaterih lignoceluloznih materialov je prikazana v tabeli 2-1 po viru [12].

Tabela 2-1: Kemijska sestava nekaterih lignoceluloznih materialov (po viru [12])

Lignocelulozni

material

Celuloza [%] Hemiceluloza

[%]

Lignin [%] Ekstrakti [%]

Listavci 43-47 25-35 16-24 2-8

Iglavci 40-44 25-29 25-31 1-5

Slama 30 50 15 5

Koruzni storţ 45 35 15 5

Koruzno steblo 35 25 35 5

Kemijsko sestavo lignoceluloznih materialov lahko določamo po različnih metodah, vendar pa nam nobena metoda ne prikaţe absolutno zanesljivih rezultatov, saj vsaka metoda daje drugačne vsebnosti [3]. Tekom eksperimentalnega dela smo določali vsebnost lignina v bukovih briketih, zato nas je zanimala vsebnost lignina v bukvi in sicer je vsebnost lignina v bukvi po viru [15] 22 %, po viru [16] pa mlada bukev vsebuje 29,2 ± 0,27 %, zrela bukev pa 22,3 % lignina.


5

Lesna biomasa je glavna surovina za celulozno in papirno industrijo. Les v obliki drv pa je običajno vir energije za ogrevanje prostorov. Pri gorenju lignoceluloznega materiala dobimo največ energije iz lignina. S fermentacijo oz. anaerobno digestijo lignoceluloznih materialov lahko pridobimo biogoriva, s katerimi lahko nadomestimo fosilna goriva, ki so neobnovljivi vir energije [17].

Ker je lesna biomasa razgradljiv material oz. nanj vplivajo biotični dejavniki, se lahko na njem razraščajo glive. Ob tem pa je pomembna tudi razvrstitev lesnih vrst glede na naravno odpornost. Bukev spada med neodporne vrste lesa na naravno odpornost po viru [18]. Bukev ima tudi veliko zmoţnost vodne vpojnosti [18], zato omogoča dobro razrast gliv.

2.2 Glive bele lesne trohnobe

Glive lesne trohnobe se hranijo z lesom kot organskim materialom in s tem povzročijo razgradnjo oz. trohnenje lesa. Imajo pomembno vlogo pri kroţenju snovi v naravi, saj razgradijo lesno biomaso v enostavnejše produkte (CO2, H2O, minerali) in s tem izboljšajo kakovost humusa in strukturo tal [5].

Glive uporabljajo za razkroj encime kot biokatalizatorje, kateri prodrejo v notranjost biomase. Ti encimi so specifični in lahko delujejo pod milimi reakcijskimi pogoji, pri čemer pa ne povzročajo nastanka škodljivih snovi in so okolju prijazni [14]. Da lahko gliva razvije svoje ţivljenje, potrebuje številne pogoje, ki se razlikujejo glede na vrsto glive. Ţivljenjsko pomembni pogoji so [19]:

hrana, katero dobi iz celuloze in lignina,

optimalna vlaţnost lesa (med 35 in 60 %),

relativna zračna vlaţnost (okrog 90 %),

ustrezna temperatura (od 20 do 25 °C),

prisotnost kisika,

kisle vrednosti pH (od 2 do 7,5),

temnejše okolje.

Glive lesne trohnobe se lahko razdelijo glede na vrsto razpada, ki ga povzročijo. Tako so najpomembnejše skupine gliv:

glive rjave trohnobe,

glive mehke trohnobe,

glive bele trohnobe.

Glive, ki povzročajo belo trohnobo razkrajajo lignin in se pri tem les obarva belo, ker nam v preostanku ostane večina celuloze (celuloza je bele barve). Glive bele trohnobe pogosteje najdemo na listavcih, kot iglavcih. Pri rjavi trohnobi glive razkrajajo celulozo in hemicelulozo, preostanek pa je oksidiran lignin, kateri daje rjavo barvo. Glive mehke trohnobe opravljajo podobne naloge kot glive rjave trohnobe. Pri mehki trohnobi pride do razgradnje lesnih polisaharidov, rezultat pa je vse bolj mehak les. Glive rjave in mehke trohnobe ne morejo razkrajati lignina, zato ostane lignin nedotaknjen. Poleg barvnih sprememb glive močno poslabšajo mehanske lastnosti lesa, kot so trdnost, elastičnost, zmanjša se tudi masa, gostota, kalorična vrednost in pride do povečanja vpojnosti vode v les. V končni fazi razgradnje les popolnoma razpade v obliki vlaken [19].

Z delignifikacijo lignoceluloznih materialov, s pomočjo gliv bele trohnobe, lahko izboljšamo proizvodnjo iz ekonomskega vidika v papirni in lesni industriji ter v proizvodnji biogoriv, bioplastike, fermacevtskih izdelkov in encimov. Pride do boljšega izkoristka celuloze, saj odstranimo oviro v obliki lignina [5].


6

Pri razkroju lignina z glivami bele trohnobe pride do oksidativnega aerobnega procesa, in sicer je njegova razgradnja zunajcelična, ker je polimer lignina prevelik za endocitozo. Pomembnejši encimi, ki jih glive bele trohnobe potrebujejo za razgradnjo lignina so hidrolitični encimi (1,4-β-D-glukanaza, egzo-1,4-β-D-glukanaza, ksilanaza) in zunajcelični encimi (lignin peroksidaza, mangan peroksidaza, lakaza). Pri procesu razgradnje oz. oksidacije lignina nastanejo nestabilni in reaktivni kationski prosti radikali ligninskih podenot, ki povzročijo spontane cepitve makromolekul v manjše enote [5][20].

Najbolj znane glive bele trohnobe so: štorovka (Armillariella mellea), jelov koreničnik (Heterobasidion annosum), borov plutač (Phellinus pini), kresilna goba (Fomes fomentarius), pisana ploskocevka (Trametes versicolor), bukov ostrigar (Pleurotus ostreatus) in ogljena kroglica (Hypoxylon fragiforme) [19][21]. Za predobdelavo lesa smo uporabili glivi pisano ploskocevko (Trametes versicolor) in ogljeno kroglico (Hypoxylon fragiforme). Glivo H. fragiforme smo izbrali zato, ker zelo hitro prerašča substrat [22]. Zaradi primerjave smo izbrali še glivo T. versicolor, saj so v prejšnjih raziskavah [5][23] dokazali, da gliva T. versicolor dovolj hitro razrašča substrat za raziskovalne namene.

2.2.1 Gliva Trametes versicolor

Pisana ploskocevka (Trametes versicolor), prikazana na sliki 2-2 [24], je pri nas zelo razširjena gliva bele lesne trohnobe. Ima drug nad drugim skupinsko rastoče pahljačaste trosnjake, ki so strehasto poravnani. Klobuk ima proţno ţilav, okrogel, širok od 2 do 8 cm. Površina je kolobarjasta in pisano obarvana iz naslednjih barv: siva, rumenkasta, modrikasta in rjavkasta. Klobuk je na robu valovit in svetlejši. Trosovnica oz. spodnji del je cevast in ima okrogle bele rumenkaste pore [25].

Goba se priraste na odmrla debla ali štore listavcev. Ker trosnjaki prezimijo, raste skoraj celo leto. Je neuţitna in tudi zdravilna, ker vsebuje polisaharide in terpene, ki učinkujejo predvsem proti raku in drugim boleznim [25]. Deluje tudi proti virusu HIV [26].

Slika 2-2: Gliva Trametes versicolor (vir [24])

2.2.2 Gliva Hypoxylon fragiforme

Gliva ogljena kroglica (Hypoxylon fragiforme) je prikazana na sliki 2-3 [27]. Ima klobuk v nepopolni obliki kroglice ali polkroga in je podobna jagodi. Je roţnato do opečnato rdeče barve. Ima trdo, hrapavo in bradavičasto površino ter debelo zunanjo plast. Mlade glive H.


7

fragiforme so lahko različnih barv, ki z leti počrnijo zaradi izvrţenih črnih trosov. Ima od 0,5 do 3 cm širok trosnjak, ki je tik pod površino gobe [28].

Gliva H. fragiforme je neuţitna. Raste v mnoţicah na lubju ali skorji odpadlih vej in drevesnih ostankov, predvsem na bukvah. Je ena izmed vrst, ki najhitreje napade odmrli les [29].

Slika 2-3: Gliva Hypoxylon fragiforme (vir [27])

2.3 Anaerobna digestija

Kot je ţe v uvodu omenjeno, pri procesu anaerobne digestije nastane iz organskih materialov s pomočjo mikroorganizmov v odsotnosti kisika bioplin, ki ima visoko vsebnost metana in ogljikovega dioksida. Pri tem nam ostane presnovljeni material ali digestat, ki ga lahko uporabimo za izboljšanje rodovitnosti tal in pridobivanje komposta. Ima pa nizko stopnjo gnojenja, saj je energijsko izčrpan [2]. Mikroorganizmi, ki jih uporabimo pri anaerobni digestiji so anaerobne bakterije, ki omogočijo s svojimi encimi razgradnjo kompleksnih makromolekul v mikromolekule [14]. Zaradi laţjega dostopa bakterij in encimov do energijsko bogatih molekul je potrebno substrat predobdelati oz. razgraditi ali spremeniti komponente, ki ovirajo njihov dostop [3]. V lignoceluloznih materialih je to lignin. Zato smo naš substrat predobdelali z glivami bele trohnobe.

Pri izvedbi anaerobne digestije pa je potrebno upoštevati še zunanje in obratovalne parametre, ki odločilno vplivajo na potek samega procesa [14]. V naravi se proces anaerobne digestije pojavlja v mnogih vodnih okoljih in v ţelodcu preţvekovalcev. Industrijsko pa bioplin proizvajamo v bioplinarni, kjer vodimo organski material v bioreaktor oz. digestor, kjer se nahaja bakterijsko bogata snov (inokulum) in tako lahko poteče fermentacija ob določenih zagotovljenih pogojih [2]. Iz tone biorazgradljivih organskih odpadkov lahko industrijsko pridelamo do 450 m

3 metana, ki je glavna sestavina

bioplina [30]. Proces anaerobne digestije iz vsakdana je prikazan na sliki 2-4 [31].


8

Slika 2-4: Shema procesa anaerobne digestije (po viru [31])

Proizvodnja bioplina oz. anaerobna digestija je podrobneje predstavljena v naslednjih podpoglavjih.

2.3.1 Substrati anaerobne digestije

Substrat za proizvodnjo bioplina je biorazgradljiva organska snov in sicer so te organske snovi v večini primerov lignocelulozni materiali.

Najpogostejši substrati anaerobne digestije so [2]:

kmetijski organski odpadki,

organski odpadki prehrambene, lesne, farmacevtske in druge industrije,

komunalni odpadki,

ţivinska gnojevka in blato,

namensko pridelane energetske rastline (npr. koruza - silaţa).

Največjo korist naredimo, če proizvajamo biogorivo iz odpadkov. S tem pripomoremo k boljšemu okolju, saj se z leti odpadki kopičijo in povečujejo. Zato namenska pridelava rastlin za proizvodnjo biogoriva ni tako potrebna in jo je bolje uporabiti za prehrano.

Ţivinska gnojevka ţe vsebuje nekaj anaerobnih bakterij, zato ima ţe rahlo prednost pred ostalimi substrati. Ima pa slab donos metana, zato jo po navadi mešamo z ostalimi substrati in izvajamo ko-digestijo, kar je tudi najpogostejši način proizvodnje bioplina v bioplinarnah [2].

Pomembna lastnost substratov je vsebnost suhe trdne snovi, saj se zaradi vsebnosti tekočine lahko izvaja mokra ali pa suha digestija. Ker ţivinska gnojevka vsebuje velik deleţ vode, se zato uporablja za mokro digestijo in ji voda sluţi kot topilo za ostale sosubstrate. Obenem pa omogoča mešanje, homogenost in transport surovin [2]. Zaradi tega pogosteje uporabljamo mokro digestijo. Suha digestija je podobna kompostiranju, saj je potrebno mletje na manjše kose. Potrebno pa je tudi mešanje, kar pa je pri suhi snovi teţje omogočiti [30].


9

2.3.2 Proces anaerobne digestije

Proces anaerobne digestije omogočijo anaerobne bakterije, katere dodamo substratu v obliki inokuluma. Med procesom pride do metabolnih reakcij oz. bakterije proizvedejo encime, s katerimi omogočijo katalizirane reakcije. Proces je razdeljen na 4 osnovne korake v katerih se snovi delijo na manjše enote in prehajajo iz makromolekul v mikromolekule. Donos bioplina se s časom povečuje, tako pri vsakem naslednjem koraku nastane več bioplina [2].

Prvi korak je hidroliza med katero se proizvede zelo malo bioplina. V tem procesu pride do razgradnje polimerov v monomere in oligomere. Hidrolitične bakterije proizvajajo encime celulaze, celobiaze, ksilanaze in amilaze, ki razgradijo polisaharide (celulozo) v monosaharide (glukozo). Proizvedejo tudi encime lipaze in proteaze, ki pretvorijo lipide v maščobne kisline in proteine v aminokisline. Hitrost anaerobne digestije z lignoceluloznimi materiali določa hidroliza, saj je ta stopnja najpočasnejša [2].

Naslednji korak je kislinska geneza, kjer se razgradnja nadaljuje. Nastali monomeri se s pomočjo acidogenih bakterij pretvorijo v metanogene substrate. Monosaharidi, aminokisline in maščobne kisline se razgradijo v vodik, ogljikov dioksid, acetat, alkohole (etanol) in hlapne maščobne kisline (propionat, laktat, butirat, sukcinat). V tej stopnji se zniţa pH fermentacijske zmesi, saj nastanejo kisline [2][14]. Razpad glukoze v procesu kislinske geneze je prikazan z naslednjo kemijsko reakcijsko enačbo [14]:

C6H12O6 → 2C2H5OH + 2CO2 (2.1)

Sledi korak acetogeneza, v katerem pride do razgradnje hlapnih maščobnih kislin in alkoholov nastalih v procesu kislinske geneze. Oksidirajo v metanogene substrate, in sicer razpadejo na vodik, ogljikov dioksid in acetat [2].

Zadnji korak nastanka bioplina je metanogeneza, kjer se tvori metan. Ta nastane s pomočjo metanogene bakterije arheje, in sicer na 2 načina. Pri prvem načinu razpade acetat na metan in ogljikov dioksid. S tem načinom nastane večina metana. Pri drugem načinu pa z redukcijo vodika in ogljikovega dioksida nastane metan in voda. Zadnja dva koraka, acetogeneza in metanogeneza, po navadi potekata vzporedno [2][14].

Pri procesu anaerobne digestije se sprošča zelo malo toplote, saj večina energije ostane v obliki metana [2].

2.3.3 Parametri anaerobne digestije

Pri procesu anaerobne digestije je potrebno upoštevati številne parametre in določiti njihov optimum za najbolj učinkovito in ekonomično proizvodnjo bioplina. Pomembno je ustvariti primerne pogoje za rast in dejavnost mikroorganizmov, ki so zelo občutljivi [2].

Ker je proces fermentacije oz. digestije anaeroben, je potrebno omogočiti strogo odsotnost kisika [2]. Med pomembnejše parametre pa prištevamo še temperaturo, pH vrednost, vsebnost amoniaka in hlapnih maščobnih kislin, oskrbo s hranili za mikroorganizme, prisotnost in količino inhibitorjev (zaviralcev) ter kovin, mešanje, zadrţevalni čas ter razmerje ogljika in dušika [2][3][14].

Glede na uporabljene mikroorganizme moramo izbrati ustrezno temperaturno območje. In sicer lahko izberemo psihrofilno (< 20°C), mezofilno (30-42°C) in termofilno (43-55°C) temperaturno območje [2]. Mikroorganizmi, ki smo jih izbrali v našem eksperimentu, so aktivni v mezofilnem območju. Kot je ţe omenjeno v prejšnjem podpoglavju, v procesu anaerobne digestije poteka veliko encimsko kataliziranih reakcij, encimi pa so proteini in sta njihova obstojnost ter učinkovitost zelo odvisni od temperature [3]. Nihanje temperature slabo vpliva na anaerobno digestijo, zato je pomembno, da med procesom vzdrţujemo konstantno temperaturo. Od temperature pa so odvisni tudi nekateri parametri, saj se pri


10

višji temperaturi poveča toksičnost amoniaka in topnost sestavin, učinkovito se uničijo patogeni organizmi ter zmanjša se zadrţevalni čas in je tako proces hitreje končan [2]. Zadrţevalni čas je časovni interval, v katerem mikroorganizmi razgradijo substrat [14].

Stopnja kislosti oz. bazičnosti močno vpliva na obstojnost metanogenih mikroorganizmov, ki so pomembni za nastanek metana. Optimalna vrednost pH območja za proces anaerobne digestije je nekje med 6,8 in 7,2. Na vrednost pH pa vplivajo nastali ogljikov dioksid in hlapne maščobne kisline, ki pH zniţajo, ter amoniak, ki pH zviša [2][14]. Z dodatkom pufra k zmesi lahko preprečimo gibanje vrednosti izven optimalnega pH območja [3].

Za intenzivnejši stik med substratom in mikroorganizmi pa je potrebno mešanje, s katerim tudi vplivamo na razmerje ogljika in dušika. Mikroorganizmi veliko hitreje porabljajo ogljik in zaradi tega lahko pride do akumulacije amoniaka, katerega posledice so ţe omenjene. Z mešanjem onemogočimo tudi nastanek koncentracijskih in temperaturnih gradientov [14].

2.3.4 Bioplin

Glavni proizvod anaerobne digestije iz organskih snovi je energetsko bogata snov bioplin. Njegova sestava je lahko različna in je odvisna od vrste ter sestave substrata in od prej naštetih parametrov. Glavno energijsko vsebnost daje metan, saj se pri zgorevanju metana sprošča energija. To je prikazano z naslednjo eksotermno kemijsko reakcijsko enačbo [3]:

CH4 + O2 → CO2 + 2H2O ∆Hr = - 890 kJ/mol (2.2)

Metana je v bioplinu od 50 do 70 %. Bioplin sestavljajo še: ogljikov dioksid (25-45 %), vodna para (2-7 %), kisik (< 2 %), dušik (< 2 %), amoniak (< 1 %), vodik (< 1 %) in vodikov sulfid (< 1 %). Je vnetljiv plin, ki ima povprečno gostoto 1,22 kg/Nm

3, povprečno

maso 1,29 kg/Nm3 in kurilno vrednost okrog 21 MJ/Nm

3 [2].

Predvsem se uporablja za proizvodnjo električne energije in toplote, kot gorivo za pogon prevoznih sredstev in za še nekatere energijske produkte. Lahko ga dovajamo tudi v plinovod in ga lahko stisnemo na enak tlak kot zemeljski plin [2].

Za uporabo ga je potrebno prečistiti, in sicer je potrebno odstraniti oz. adsorbirati vodikov sulfid in vodne hlape. Vodikov sulfid lahko tvori korozivno ţveplovo kislino in s tem uniči strojno opremo, voda pa je lahko nevarna pri plinskih šobah [14].

Bioplin je eden od najčistejših goriv, saj ima zelo majhen vpliv na okolje in zdravje ţivih organizmov [14]. Je obnovljivo gorivo in je eden izmed glavnih obnovljivih nadomestkov fosilnega goriva nafte, zato je njegova proizvodnja v zadnjih letih zelo narasla [3].


11

3 Metode dela

Pri eksperimentalnem delu smo uporabili naslednje metode: cepitev in obraščanje lignina z glivo, določevanje trdne snovi s sušenjem na peščeni kopeli in v sušilniku, priprava zmesi za fermentacijo oz. anaerobno digestijo, merjenje volumna nastalega bioplina in sestave nastalega bioplina s plinskim kromatografom ter določevanje vsebnosti lignina po Klasonovi metodi. Te metode so podrobneje opisane v naslednjih podpoglavjih, obenem pa so predstavljene enačbe po katerih smo izračunavali dobljene vrednosti.

3.1 Cepitev lignina z glivo

Ker ţelimo izvesti predobdelavo lignoceluloznega materiala z glivo, smo morali na substrat nacepiti glivo. Da smo lahko izvedli cepitev lignina z glivo, smo morali zagotoviti ustrezne pogoje, da je gliva lahko obrasla lignin.

Za substrat smo uporabili lignocelulozni material, in sicer ţagovino oz. steljo za zajce iz mehkega lesa in pa zdrobljene bukove brikete. Pripravili smo več različnih vzorcev in paralelk, za obdelavo z dvema različnima glivama bele trohnobe Hypoxylon fragiforme in Trametes versicolor. Vzorce smo pripravili tako, da smo v steklene kozarce zatehtali 30 g substrata in dodali med 70 in 80 ml vode [3]. Vodo smo dodali zato, ker glive za svojo rast potrebujejo vlaţen material. Kozarce smo pokrili s steriliziranimi pločevinastimi pokrovi, katerim smo predhodno naredili luknjo, v katero smo zatlačili vato. S takimi pokrovi smo zagotovili aerobne pogoje za ţivljenje gliv. Tako pripravljene vzorce skupaj s kozarci smo nato sterilizirali oz. avtoklavirali.

Pripravili smo 24 vzorcev za obdelavo z glivama na naslednji način:

8 vzorcev ţagovine (stelja za zajce iz mehkega lesa),

12 vzorcev zdrobljenih bukovih briketov,

4 vzorce mešanic bukovih briketov in ţagovine (10 % celotne mase je predstavljala ţagovina).

Na Biotehniški fakulteti Univerze v Ljubljani so nam nacepili glivi H. fragiforme in T. versicolor. V vsak kozarec so pod sterilnimi pogoji nacepili 3 micelije glive na različnih mestih. V polovico kozarcev (4 kozarce ţagovine, 6 kozarcev bukovih briketov in 2 kozarca mešanice) obeh substratov so nacepili glivo H. fragiforme, v preostalo polovico kozarcev pa glivo T. versicolor. Torej smo imeli v eni polovici vzorcev nacepljeno glivo H. fragiforme, v drugi pa glivo T. versicolor. Vzorce smo ustrezno označili in zapisali datum cepitve.

Da so se glive razrasle, je bilo potrebno zagotoviti sobno temperaturo med 22 in 25 °C ter nekaj časa. Vzorce nacepljene z glivo smo pustili pribliţno 3 tedne, da so glive ustrezno prerasle substrat in potem smo lahko nadaljevali z eksperimenti.

3.2 Določanje trdne snovi

Da smo lahko pripravili zmes za fermentacijo in izmerili vsebnost lignina, smo morali predhodno določiti vsebnost trdne snovi. Vsebnost trdne snovi smo določili: neobdelanim bukovim briketom, obdelanim bukovim briketom z obema glivama, inokulumu, piščančjemu gnoju in koruzni silaţi.


12

Vsebnost trdne snovi smo določili tako, da smo natančno zatehtali določeno maso snovi v petrijevke in jih dali sušit v sušilnik na 105 °C do konstantne mase. Minimalno smo sušili pribliţno 3 ure. Po končanem sušenju smo posušen material najprej ohladili v eksikatorju, da ni prišlo do vezave vlage, in potem skupaj s petrijevkami stehtali. Da smo lahko dobili maso suhega materiala, je bilo potrebno predhodno stehtati še petrijevko. Nato smo izračunali deleţ trdne snovi po naslednji enačbi:

(3.1)

kjer so:

wTS – masni deleţ trdne snovi (-)

msp – masa suhe snovi s petrijevko (g)

mp – masa petrijevke (g)

mvp – masa vzorca s petrijevko (g)

Vedno smo posušili več paralelk in nato izračunali povprečje po naslednji enačbi:

̅ ∑

(3.2)

kjer sta:

TS – povprečni masni deleţ za določen vzorec (-)

n – število paralelk (-)

Vsebnost trdne snovi za tekoči material, v našem primeru je to bil inokulum, smo določili tako, da smo najprej izmerili okrog 20 ml inokuluma v čašo in dali sušit na peščeno kopel v digestoriju. Na peščeni kopeli smo sušili tako dolgo, da je vsa tekočina izhlapela. Nato smo tako izsušen inokulum dali sušit še v sušilnik na 105 °C do konstantne mase. Po končanem sušenju smo čašo z inokulumum ohladili v eksikatorju in nato stehtali. Tudi v tem primeru smo predčasno stehtali maso čaše, da smo lahko določili trdno snov inokuluma. Trdno snov inokuluma smo izračunali po naslednji enačbi:

(3.3)

kjer so:

γTS – vsebnost trdne snovi inokuluma (g/l)

msi – masa suhe snovi inokuluma s čašo (g)

mč – masa čaše (g)

Vsi – volumen inokuluma vzet za sušenje (pribliţno 20 ml) (l)

Ker smo imeli več paralelk, smo tudi tukaj izračunali povprečje, in sicer smo to naredili po naslednji enačbi, ki je podobna enačbi 3.2:

̅ ∑

(3.4)

kjer je:

γ TS – povprečna vsebnost trdne snovi inokuluma (g/l)


13

3.3 Priprava zmesi za fermentacijo

Za izvedbo anaerobne digestije smo si pripravili poskus, kot je prikazano na sliki 3-1

Slika 3-1: Shema nastavitve eksperimenta za anaerobni proces

V veliko posodo z destilirano vodo smo namestili potopni termostatski grelnik, ki je segreval vodo na ţeleno temperaturo. To temperaturo smo nastavili glede na izbrani inokulum, saj moramo mikroorganizmom glede na njihovo vrsto omogočiti ustrezno delovno temperaturo. Uporabili smo inokulum iz Bioplinarne Ihan (Petrol d.d., Ljubljana) in Bioplinarne Draţenci (Perutnina Ptuj d.d.). Dve vrsti inokuluma smo uporabili zato, da smo testirali učinkovitost uporabe neobdelanih in predhodno obdelanih materialov pri čim več različnih pogojih. Inokulum smo pred uporabo pustili vsaj en dan v kopeli na zahtevani temperaturi, da se je organska snov dodatno razgradila. Dobljeno zmes inokuluma iz Bioplinarne Draţenci smo še predhodno precedili skozi mreţico, da smo zmanjšali vpliv organskih snovi in da smo imeli čim bolj homogen vzorec. Le-ta inokulum je bil zelo gost in nehomogen, vseboval pa je tudi lignocelulozni material steljo. Inokulum iz Bioplinarne Ihan je bil redek in homogen in ga ni bilo potrebno precediti. Za inokulum iz bioplinarne Ihan smo vzdrţevali konstantno temperaturo pri 38 °C [3][23], za inokulum iz bioplinarne Draţenci pa pri 42 °C [9].

250 ml erlenmajerice, v katere smo pripravili ţelene zmesi za fermentacijo, smo potopili v vodno kopel. Erlenmajerice so imele poseben stranski izhod (»erlenmajerice z olivo«), na katerega smo namestili plinotesno plastično cev. Preko plastične cevi smo fermentor povezali s 50 ml bireto, ki je bila napolnjena z destilirano vodo in obrnjena s širšim koncem navzdol ter potopljena v posodo z vodo. Po plastični cevi smo nastajajoč bioplin tako vodili in zajemali v biretah. V biretah je le-ta izpodrival vodo in na ta način smo lahko izmerili volumen nastalega bioplina [3][14].

Erlenmajerice smo na vrhu zaprli s plinotesnimi posebnimi pokrovi, ki so imeli na sredini septo iz silikona in teflona. Septa je omogočila prebadanje z iglo, da smo lahko na začetku eksperimenta prepihali vzorce in med analizo merili nastale pline [14].

Pripravili smo več različnih zmesi za fermentacijo. Potrebno je bilo določiti koliko trdne snovi in volumna izbrati za uspešen potek procesa. Prevelika vsebnost trdne snovi bi vodila k večji proizvodnji plinov in posledično bi teţje zajemali bioplin v 50 ml birete, saj bi preveč intenzivno nastajal in bi med merjenji lahko nastalo več bioplina, kot je prostornina birete. Druga teţava s preveliko vsebnostjo trdne snovi je tudi oteţeno mešanje. Po drugi strani pa premajhna vsebnost ne bi omogočila tako intenzivne proizvodnje. Vsebnost trdne snovi v posamezni bireti smo izbrali na podlagi prejšnjih poskusov [3][9]. Pri vseh nastavitvah smo se odločili, da bo razmerje suhe trdne snovi med lignoceluloznim


14

materialom in inokulumum 50 % : 50 %, ker to razmerje zagotavlja uspešen potek eksperimenta [9].

Prvo nastavitev smo naredili za predobdelane bukove brikete z glivo T. versicolor in H. fragiforme. V erlenmajerice smo zatehtali substrate (lignocelulozni material in inokulum) tako, da smo imeli 1,5 g trdno snov ter dodali pufer in vodo, da je bilo v zmesi 70 ml tekočine [3]. Glede na določeno trdno snov smo lahko preračunali potrebne zatehte za lignocelulozne materiale (enačba 3.5) in inokuluma (enačba 3.6.).

̅ (3.5)

kjer sta:

mzl – potrebna zatehta lignoceluloznega materiala (g)

ml – določena masa trdne snovi lignoceluloznega materiala (g)

̅ (3.6)

kjer sta:

Vzi – potreben volumen dodanega inokuluma (l)

mi – določena masa trdne snovi inokuluma (g)

Koliko pufra in vode je še potrebno dodati za 70 ml tekočine v zmesi, pa smo izračunali po naslednji enačbi:

(3.7)

kjer so:

Vpv – volumen potrebnega dodanega pufra in vode (l)

V – volumen potreben v zmesi (v tem primeru 70 ml) (l)

ρv – gostota vode (g/l)

ρi – gostota inokuluma (za poenostavitev smo predpostavili, da je gostota inokuluma enaka gostoti vode) (g/l)

Pufer in vodo smo dodali tako, da smo določili minimum potrebne dodane tekočine. Ta vrednost je predstavljala dodatek pufra vsem vzorcem. Pri preostalih vzorcih, ki so presegali minimum, pa smo dodali še vodo in sicer potrebno razliko [3].

Pufer smo dodali zato, da smo vzdrţevali optimalno vrednost pH v fermentacijski zmesi in smo na ta način preprečili kislinsko inhibicijo v procesu. Pripravili smo si ga tako, da smo v 1 l bučko zatehtali naslednje sestavine: 1 g NH4Cl, 0,1 g NaCl, 0,1 g MgCl2·6H2O, 0,05 g CaCl2·2H2O in 0,4 g K2HPO4·3H2O [32]. Potem smo bučko dopolnili z destilirano vodo do oznake in s pomočjo magnetnega mešala zmes mešali dokler se vsa trdna zmes ni raztopila [3].

Pri prvi nastavitvi smo pripravili naslednje vzorce:

1. 0,75 g obdelanih bukovih briketov z glivo T. versicolor + 0,75 g inokuluma + pufer in voda, 8 paralelk

2. • 0,75 g obdelanih bukovih briketov z glivo H. fragiforme + 0,75 g inokuluma + pufer in voda, 1 paralelka • 1,5 g obdelanih bukovih briketov z glivo H. fragiforme + 1,5 g inokuluma + pufer in voda, 1 paralelka


15

3. 0,75 g neobdelanih bukovih briketov + 0,75 g inokuluma + pufer in voda, 3 paralelke 4. 0,75 g celuloze + 0,75 g inokuluma + pufer in voda, 1 paralelka (pozitivna kontrola) 5. 0,75 g inokuluma + pufer in voda, 1 paralelka (negativna kontrola)

Pri teh nastavitvah smo uporabili inokulum iz biplinarne Ihan, zato smo fermentorje potopili v vodno kopel s temperaturo 38 °C in jih nato prepihovali pribliţno tri minute z argonom. Prepihovanje smo izvedli z namenom, da smo iz erlenmajeric odstranili zrak (kisik) [3].

Pri drugi nastavitvi smo pripravili zmesi s pomočjo obdelanih briketov z glivo T. versicolor, vendar smo pri tem pripravili različne mešanice z inokulumom, piščančjim gnojem in koruzno silaţo, katere smo dobili v bioplinarne Draţenci, ter proučili vpliv na proizvodnjo bioplina. V tem primeru smo se odločili, da bomo imeli 2,5 g trdne snovi (lignocelulozni material, inokulum, gnoj) in 75 ml vode [9]. Potrebne zatehte za trdni material (bukovi briketi, gnoj, koruzna silaţa) in inokulum smo izračunali enako kot pri prvi nastavitvi po enačbah 3.5 in 3.6. Prav tako smo na enak način določili potreben dodatek volumna pufra in vode, vendar je tokrat bil potreben volumen tekočine v zmesi 75 ml. Enačba je bila naslednja:

(

)

(3.8)

kjer so:

mg – določena masa piščančjega gnoja (g)

mzg – potrebna zatehta piščančjega gnoja (g)

ρg – gostota piščančjega gnoja (predpostavili smo, da je gostota piščančjega gnoja enaka gostoti vode) (g/l)

Pripravili smo naslednje zmesi:

1. 1,25 g obdelanih bukovih briketov z glivo T. versicolor + 1,25 g inokuluma + pufer in voda, 2 paralelki

2. 1,25 g neobdelanih bukovih briketov + 1,25 g inokuluma + pufer in voda, 2 paralelki 3. 1,25 g obdelanih bukovih briketov z glivo T. versicolor in piščančjega gnoja v različnih

razmerjih (70 % : 30 % in 30 % : 70 %) + 1,25 g inokuluma + pufer in voda, 4 paralelke

4. 1,25 g neobdelanih bukovih briketov in piščančjega gnoja v različnih razmerjih (70 % : 30 % in 30 % : 70 %) + 1,25 g inokuluma + pufer in voda, 4 paralelke

5. 1,25 g koruzne silaţe in piščančjega gnoja v razmerju 30 % : 70 % + 1,25 g inokuluma + pufer in voda, 1 paralelka

6. 1,25 g celuloze + 1,25 g inokuluma + pufer in voda, 1 paralelka 7. 1,25 g inokuluma + pufer in voda, 1 paralelka

Pri tej nastavitvi smo uporabili inokulum iz bioplinarne Draţenci, kateri je bil dejaven pri 42 °C. Vsi ostali postopki so bili enaki kot pri prvi nastavitvi.

Tako pripravljene zmesi smo enkrat dnevno ročno premešali, saj smo s tem izboljšali stik med substratom in mikroorganizmi, kar je pospešilo in izboljšalo pretok in nastanek plinov [3].


16

3.4 Merjenje volumna nastalega bioplina

Volumen nastalega bioplina smo merili z 50 ml biretami na 0,1 ml natančno. Bioplin smo ujeli v birete preko plastičnih cevi, kot je prikazano na sliki 3-1. Birete so bile napolnjene z vodo in nastali bioplin je izpodrival vodo iz biret. Iz razlik med nivojema vode smo lahko določili proizvodnjo nastalega bioplina [3].

Volumen nastalega bioplina smo merili vsak dan. Zabeleţili smo odčitek volumna in uro ter datum odčitavanja. Na začetku procesa anaerobne digestije je bilo potrebno meriti volumen pogosteje, vsaj dvakrat na dan, saj je bioplin nastajal zelo hitro. Ko je plin izpodrinil skoraj vso vodo iz birete, smo cevko preščipnili s posebnimi škarjami, da smo prekinili iztok bioplina in napolnili bireto z vodo [3].

3.5 Merjenje sestave bioplina

S prenosnim plinskim kromatografom Micro gas chromatograph Varian CP4900 smo analizirali nastale pline pri anaerobni digestiji. Kromatograf je imel iglo, katero smo zapičili preko septe v fermentor. Nato je odvzel majhen volumen vzorca in ga analiziral s pomočjo kolon PPQ in MS5. Nosilni plin kolone PPQ je helij in določa ogljikov dioksid, metan, zrak (seštevek dušika, kisika, argona) in vlago. Kolona MS5 pa s pomočjo nosilnega plina argona določa vsebnost vodika, kisika, dušika, metana in ogljikovega monoksida. Plinski kromatograf smo povezali s prenosnim računalnikom, da smo lahko spremljali in kalibrirali vrednosti sestave s programom Galaxie [14].

Vsebnost nastalega bioplina smo analizirali vsaj enkrat tedensko. Osredotočili smo se na dva glavna plina in sicer na metan in ogljikov dioksid.

3.6 Določanje vsebnosti lignina

Za določanje vsebnosti lignina obstaja več metod, ki dajejo različne rezultate. Zaenkrat ne obstaja univerzalna metoda, ki bi dala absolutno zanesljive rezultate. Metode določanja lignina se v osnovi delijo na invazivne in neinvazivne metode. Neinvazivne metode izkoriščajo kemijske lastnosti lignina in temeljijo na absorbciji sevanja elektromagnetnega valovanja pri čemer ne pride do spremembe vzorca med analizo. Za razliko od neinvazivnih metod, pride pri invazivnih metodah do razgradnje vzorca, saj se pri teh metodah izvaja topljenje vzorca, ekstrakcija, hidroliza in porabljajo razni oksidanti [33]. Med invazivne metode spada tudi Klasonova metoda, ki je ena od najpogosteje uporabljenih metod in jo je bilo v našem laboratorijskem merilu mogoče izvesti. Ker so to metodo določanja lignina uporabili ţe v prejšnjih raziskavah [3], smo se tudi mi odločili za določanje lignina po tej metodi.

Po Klasonovi metodi smo določili vsebnost lignina v neobdelanih bukovih briketih in v predobdelanih bukovih briketih z glivama T. versicolor in H. fragiforme. Izvedli smo še analize za časovno spremljanje vsebnosti lignina za vzorce pri katerih je potekala anaerobna digestija. Ker so ti vzorci vsebovali inokulum, smo določili še vsebnost lignina v inokulumu.

Določanje vsebnosti lignina po Klasonovi metodi smo izvedli po naslednjih korakih. Najprej smo izvedli dvostopenjsko ekstrakcijo z acetonom in destilirano vodo po standardu TAPPI Standard T 264 cm-07 [34]. Pripravili smo si vrečke iz pole filtrnega papirja v katere smo zatehtali pribliţno 1 g suhega substrata za analizo in ga zavili ter poloţili v Soxhletov aparat. Za analiziran substrat smo pred tem določili vsebnost trdne snovi po opisanem postopku v razdelku 3.2. Nad Soxhletovim aparatom smo namestili povratni vodni hladilnik, v bučko pod Soxhletovim aparatom pa smo odmerili 300 ml 99,5 % acetona. Bučko smo potopili v posodo s parafinskim oljem, katerega smo segreli na


17

grelniku na 105 °C. Parafinsko olje smo uporabili zato, ker ima temperaturo vrelišča nad 105 °C. Vrelišče acetona je 56 °C [35]. Tako nastavljena temperatura parafinskega olja je omogočila, da je topilo naredilo pribliţno 4 cikle na uro. Ekstrakcijo z acetonom smo izvajali dobre 4 ure.

Po končani ekstrakciji smo vzorec vzeli iz Soxhletove aparature in ga prenesli v 1 l erlenmajerico. Substratu smo dodali 500 ml vroče vode in tako pripravljeno raztopino vreli 1 uro. Nato smo vsebino prefiltrirali s pomočjo vakuumske filtracije, pri čemer smo raztopino spirali z vročo vodo. Pri filtraciji smo uporabili filter papir za počasno filtracijo (140 s) Whatman No. 42 MN 640D. Filtrat smo skupaj s filtrnim papirjem prenesli v petrijevke in dali sušit za 4 ure v sušilnik na 105 °C do konstantne mase. Pred tem smo stehtali petrijevke in filtrni papir, da smo lahko po končanem sušenju in hlajenju za stehtan vzorec določili deleţ ekstrahiranih snovi.

Maso suhe snovi po ekstrakciji smo izračunali po naslednji enačbi:

(3.9)

kjer so:

mss – masa suhe snovi po ekstrakciji (g)

mss + p + fp – masa suhe snovi s petrijevko in filter papirjem (g)

mfp – masa filter papirja (g)

Deleţ ekstrahiranih snovi pa smo izračunali po enačbi 3.10:

(3.10)

kjer sta:

wes – deleţ ekstrahiranih snovi (-)

mv – masa zatehtane snovi (g)

Za določitev vsebnosti kislinsko netopnega lignina smo izvedli hidrolizo ekstrahiranega vzorca z 72 % H2SO4 po standardu TAPPI Standard T 222 om-06 [36]. Ţveplovo kislino smo pripravili tako, da smo v 1 L bučko odmerili 300 ml destilirane vode in počasi dodajali 665 ml pribliţno 96 % H2SO4. Zaradi močnega segrevanja smo imeli bučko potopljeno v mrzlo vodo. Po dodatku H2SO4 smo bučko dopolnili z destilirano vodo do oznake in dobljeno 72 % H2SO4 hladili v mrzli vodi.

Posušen ekstrahiran vzorec smo prenesli v 100 ml čašo in dodali 15 ml 72 % H2SO4/g vzorca. Tako pripravljene vzorce smo dobro premešali in pustili stati vsaj 10 ur. Vzorec smo nato prenesli v 1 L erlenmajerico in dodali 575 ml destilirane vode/g vzorca, tako da smo dobili pribliţno 3 % H2SO4. To raztopino smo nato vreli s pomočjo gorilnika pribliţno 4 ure. Potem smo raztopino ponovno prefiltrirali z vakuumsko filtracijo in spirali z vročo vodo. Dobljen filtrat smo nato s filter papirjem in petrijevko sušili v sušilniku pri temperaturi 105 °C do konstantne mase (pribliţno 4 ure). Po sušenju do konstantne mase in hlajenju smo filtrat skupaj s filter papirjem in petrijevko stehtali ter določili vsebnost kislinsko netopnega lignina.

Masa, katero dobimo po sušenju, je masa lignina in jo izračunamo na naslednji način:

(3.11)

kjer sta:

mlig – masa lignina (g)


18

mlig + p + fp – masa lignina s petrijevko in filter papirjem (g)

Deleţ kislinsko netopnega lignina v vzorcu pa določimo po naslednji enačbi:

(3.12)

kjer je:

wlig – vsebnost kislinsko netopnega lignina (-)


19

4 Eksperimentalni del z rezultati in diskusijo

V tem poglavju so predstavljene meritve, izračuni in rezultati ter diskusije na podlagi dobljenih rezultatov. Podrobnejši opisi samega eksperimentalnega dela so predstavljeni v prejšnjem poglavju. Nekatere meritve so zaradi večje nazornosti podane v prilogi v 7. poglavju.

4.1 Cepitev lignina z glivo

Preraščanje gliv na substratu bukovih briketov se je začelo pojavljati nekje po 10. dnevu cepitve. Sprva se je okrog cepičev pojavil bel kosmat venček oz. je prišlo do vznika micelija. Kulture gliv se na vseh substratih niso razrasle. Razrasle so se samo na bukovih briketih, v nekaterih kozarcih bolj in v drugih manj. Nekoliko hitreje se je začela razraščati gliva H. fragiforme kot pa gliva T. versicolor. To je tudi pričakovano, saj je gliva H. fragiforme ena od najhitrejših gliv, ki napade odmrli les. Na sliki 4-1 sta prikazana vzorca bukovih briketov z glivo H. fragiforme po 18. dneh cepitve. Bela kosmata površina na substratu bukovega lesa predstavlja kulturo glive H. fragiforme.

Slika 4-1: Bukovi briketi z glivo H. fragiforme po 18. dneh cepitve

V vzorcih z ţagovino oz. s steljo za zajce iz mehkega lesa se gliva ni uspela razviti in prerasti substrata. Tudi na vzorcih, kjer smo dodali k bukovim briketom 10 % ţagovine, glivi nista uspeli v celoti razrasti ţagovine. Torej lahko sklepamo, da ţagovina (stelja za zajce) vsebuje določene inhibitorne komponente, ki onemogočajo rast teh dveh vrst gliv.

Ker sta glivi prerasli samo substrat bukovih briketov, smo nadaljnje eksperimentalne analize opravljali samo z bukovimi briketi.

4.2 Proces anaerobne digestije

Za pripravo vzorcev za fermentacijo oz. anaerobno digestijo smo najprej določili vsebnost trdne snovi substratom, kateri so sestavljali vzorec. S pomočjo tega smo lahko preračunali potrebne zatehte substratov ter dodatek pufra in vode glede na ţelene vrednosti trdne snovi in tekočine v vzorcu. Ko smo pripravili vzorce in nastavili sam eksperiment ter zagotovili potrebne pogoje, smo spremljali proces z merjenjem volumna nastalega bioplina in sestavo nastalih plinov.


20

4.2.1 Določanje vsebnosti trdne snovi

Pred vsako nastavitvijo procesa anaerobne digestije smo določili vsebnost trdne snovi za: neobdelane bukove brikete, obdelane bukove brikete z glivo T. versicolor in glivo H. fragiforme, inokulum iz bioplinarne Ihan in bioplinarne Draţenci, piščančji gnoj in koruzno silaţo. Podrobnejši potek določanja trdne snovi je predstavljen v razdelku 3.2.

Meritve in rezultati določanja vsebnosti trdne snovi za trdni material (neobdelani bukovi briketi, obdelani bukovi briketi z glivo T. versicolor in glivo H. fragiforme, piščančji gnoj in koruzno silaţo) za prvo in drugo nastavitev so prikazani v tabeli 4-1. Za določanje trdne snovi pri obdelanih bukovih briketih smo vzeli kozarce v katerih se je gliva najboljše razrasla in sicer smo iz vsakega kozarca vzeli 2 paralelki. Pri ostalih vzorcih smo pri določanju vzeli 3 paralelke.

Tabela 4-1: Določanje vsebnosti trdne snovi za trdne materiale

Vzorec Paralelka mp [g] mvp [g] msp [g] wTS [%] TS [%]

Neobdelani bukovi briketi

1 50,7775 52,6071 52,4715 92,59

92,56 2 49,2236 51,1467 51,0012 92,43

3 55,5057 57,5073 57,3603 92,66

Obdelani bukovi briketi z glivo

T. versicolor (kozarec 1)

1 55,8172 57,8737 56,4048 28,57 28,92

2 48,1737 50,2507 48,7815 29,26



1 48,2249 50,1332 48,7791 29,04 28,75

2 50,7774 53,1349 51,4485 28,47



1 47,3373 49,5843 48,0391 31,23 30,99

2 55,5054 57,6220 56,1562 30,75


H. fragiforme (kozarec 1)

1 48,2249 49,9910 48,6524 24,21 24,00

2 49,5880 51,4539 50,0320 23,80

Piščančji gnoj

1 49,1237 51,4478 50,2610 48,94

62,00 2 48,2620 50,3170 49,8629 77,90

3 55,5067 57,6300 56,7629 59,16

Koruzna silaţa

1 48,1578 49,4610 48,6821 40,23

42,84 2 59,4117 60,1550 59,7553 46,23

3 47,3378 48,4407 47,8017 42,06

Simboli v tabeli 4-1 predstavljajo:

mp – masa petrijevke (g)

mvp – masa vzorca s petrijevko (g)

msp – masa suhe snovi vzorca in petrijevke (g)

wTS – masni deleţ trdne snovi (%)

TS – povprečni masni deleţ za določen vzorec (%)

Vsebnost trdne snovi v z glivami obdelanih bukovih briketih je veliko manjša kot pri neobdelanih briketih, kar je pričakovano, saj smo morali za cepitev glive omogočiti vlaţen material (pribliţno 70 % vlaţnost). Obdelani bukovi briketi z glivo H. fragiforme imajo v primerjavi z obdelanimi bukovimi briketi z glivo T. versicolor niţjo vsebnost trdne snovi.


21

Gliva H. fragiforme je namreč intenzivneje in hitreje razrasla substrat ter posledično razgradila več snovi.

Vsebnost trdne snovi za piščančji gnoj in koruzno silaţo je bilo teţje določiti, saj je snov zelo nehomogena in pride do odstopanj. Velika odstopanja se pojavijo predvsem pri piščančjem gnoju, saj se na enih mestih pojavljajo večji kosi gnoja na drugih pa stelja.

Meritve in rezultati za določanje vsebnosti trdne snovi za tekoči material (inokulum) za

prvo in drugo nastavitev so prikazane v tabeli 4-2.

Tabela 4-2: Določanje vsebnosti trdne snovi za tekoče materiale

Vzorec Paralelka mč [g] Vsi [ml] msi [g] γTS [g/ml] γ TS [g/ml]

Inokulum iz

bioplinarne

Ihan

1 103,8798 20 104,5396 0,0330

0,0316 2 98,2671 20 98,8865 0,0310

3 101,7760 21 102,4214 0,0307

Inokulum iz

bioplinarne

Draţenci

1 50,2658 20 51,6937 0,0714

0,0715 2 48,8294 20 50,2200 0,0695

3 50,1830 20 51,6571 0,0737

Simboli v tabeli 4-2 predstavljajo:

mč – masa čaše (g)

Vsi – volumen inokuluma pred sušenjem (l)

msi – masa suhe snovi inokuluma s čašo (g)

γTS – vsebnost trdne snovi inokuluma (g/l)

γ TS – povprečna vsebnost trdne snovi inokuluma (g/l)

4.2.2 Priprava zmesi za fermentacijo

Zmes in aparaturo za fermentacijo smo pripravili po postopku iz razdelka 3.3. Določene vrednosti, izračunane in dejanske zatehte substratov glede na trdno snov za prvo nastavitev so prikazane v tabeli 4-3.

Simboli predstavljajo:



mdej.l – dejanska zatehta lignoceluloznega materiala (g)




Vzorce za prvo nastavitev smo označili na naslednji način:

o TV1 – TV8: obdelani bukovi briketi z glivo T. versicolor + inokulum + pufer in voda

o HF1 – HF2: obdelani bukovi briketi z glivo H. fragiforme + inokulum + pufer in voda

o 1 – 3: neobdelani bukovi briketi + inokulum + pufer in voda


22

o CE+IN1: celuloza + inokulum + pufer in voda

o IN1: inokulum + pufer in voda

Tabela 4-3: Določene vrednosti, izračunane in dejanske zatehte substratov za prvo nastavitev

Vzorec ml [g] mzl [g] mdej.l [g] mi [g] Vzi [ml] Vpv [ml]

TV1 0,75 2,59 2,6009 0,75 23,8 45

TV2 0,75 2,59 2,5820 0,75 23,8 45

TV3 0,75 2,59 2,5902 0,75 23,8 45

TV4 0,75 2,61 2,6078 0,75 23,8 45

TV5 0,75 2,61 2,6309 0,75 23,8 45

TV6 0,75 2,61 2,6183 0,75 23,8 45

TV7 0,75 2,42 2,4396 0,75 23,8 45

TV8 0,75 2,42 2,4327 0,75 23,8 45

1 0,75 0,81 0,8038 0,75 23,8 47

2 0,75 0,81 0,8068 0,75 23,8 47

3 0,75 0,81 0,8202 0,75 23,8 47

HF1 0,75 3,125 3,2908 0,75 23,8 45

HF2 1,5 6,25 6,2642 1,5 47,6 19

CE+IN1 0,75 0,75 0,7651 0,75 23,8 47

IN1 - - - 0,75 23,8 47

Pri vzorcih od TV1 do TV8 smo vzeli obdelane bukove brikete z glivo T. versicolor tako, da smo za prve tri paralelke uporabili kozarec 1, za naslednje tri kozarec 2 in za zadnji dve kozarec 3. Pri vzorcu CE+IN1 predstavlja ml maso celuloze, in ker celuloza vsebuje 100 % trdne snovi, je ta masa tudi potrebna zatehta.

Vsem vzorcem smo dodali 45 ml pufra, razen vzorcu HF2 smo dodali 19 ml pufra. Ta vrednost sicer ni minimalna vrednost, saj je minimalna vrednost 19 ml. Ker je 19 ml nizka vrednost dodatka pufra za preprečitev inhibicije procesa in ker je le pri tem vzorcu vsebnost trdne snovi v vzorcu drugačna, te količine nismo uporabili pri vseh vzorcih s trdno snovjo 1,5 g (0,75 g trdne snovi lignoceluloznega materiala oz. celuloze in 0,75 g trdne snovi inokuluma). Kot preostanek potrebnega dodatka Vpv smo dodali vodo.

Pri drugi nastavitvi pa smo uporabili sledeče oznake:

o TV9 – TV10: obdelani bukovi briketi z glivo T. versicolor + inokulum + pufer in voda

o 4 – 5: neobdelani bukovi briketi + inokulum + pufer in voda

o TVG1 – TVG4: obdelani bukovi briketi z glivo T. versicolor + piščančji gnoj + inokulum + pufer in voda

o G6 – G9: neobdelani bukovi briketi + piščančji gnoj + inokulum + pufer in voda

o INSG: koruzna silaţa + piščančji gnoj + inokulum + pufer in voda

o CE+IN2: celuloza + inokulum + pufer in voda

o IN2: inokulum + pufer in voda


23

Določene vrednosti, izračunane in dejanske zatehte substratov glede na trdno snov za drugo nastavitev so prikazane v tabeli 4-4, kjer je:



mdej.l – dejanska zatehta lignoceluloznega materiala (g)

mg – masa piščančjega gnoja (g)

mzg – potrebna zatehta piščančjega gnoja (g)

mdej.g – dejanska zatehta piščančjega gnoja (g)




Tabela 4-4: Določene vrednosti, izračunane in dejanske zatehte substratov za drugo nastavitev

Vzorec ml [g] mzl [g] mdej.l [g] mg [g] mzg [g] mdej.g [g] mi [g] Vzi

[ml]

Vpv [ml]

TVG1 0,375 1,295 1,2928 0,875 1,4 1,4316 1,25 17,5 57

TVG2 0,375 1,295 1,2902 0,875 1,4 1,5150 1,25 17,5 57

TVG3 0,875 2,82 2,8396 0,375 0,6 0,5782 1,25 17,5 57

TVG4 0,875 2,82 2,8196 0,375 0,6 0,7151 1,25 17,5 57

TV9 1,25 4,35 4,3590 - - - 1,25 17,5 56

TV10 1,25 4,35 4,3616 - - - 1,25 17,5 56

4 1,25 1,35 1,3417 - - - 1,25 17,5 59

5 1,25 1,35 1,3508 - - - 1,25 17,5 59

G6 0,875 0,945 0,9370 0,375 0,6 0,5854 1,25 17,5 59

G7 0,875 0,945 0,9482 0,375 0,6 0,5852 1,25 17,5 59

G8 0,375 0,405 0,4018 0,875 1,4 1,5033 1,25 17,5 58

G9 0,375 0,405 0,3992 0,875 1,4 1,5479 1,25 17,5 58

INSG 0,375 0,875 0,8751 0,875 1,4 1,3425 1,25 17,5 58

CE+IN2 1,25 1,25 1,2509 - - - 1,25 17,5 59

IN2 - - - - - - 1,25 17,5 59

Obdelane bukove brikete za prva dva vzorca TVG smo vzeli iz kozarca 1, za druga dva vzorca TVG pa iz kozarca 3. Za vzorca TV9 in TV10 pa smo vzeli obdelane bukove brikete iz kozarca 2. Pri vzorcu INSG predstavlja ml maso koruzne silaţe, pri CE+IN2 pa maso čiste celuloze.

Vsem vzorcem smo dodali 56 ml pufra, kar je minimalna vrednost potrebne dodane tekočine. Preostanek potrebnega volumna Vpv je predstavljala voda.

4.3 Volumen bioplina

Vsem vzorcem smo merili volumen nastalega bioplina po opisanem postopku v razdelku 3.4. Iz razlik med nivojema vode v bireti smo lahko izračunali nastali bioplin. Določili smo dnevno in celotno prostornino nastalega bioplina za vsak vzorec. Za laţjo primerjavo rezultatov meritev med različnimi nastavitvami, smo preračunali volumne nastalega


24

bioplina na 1 g suhe trdne snovi. To smo naredili tako, da smo volumen bioplina delili z določeno maso suhe trdne snovi. Pri prvi nastavitvi je bila ta masa 0,75 g (razen pri vzorcu HF2 je masa 1,5 g), pri drugi nastavitvi pa 1,25 g.

Rezultati dnevne in celokupne prostornine nastalega bioplina na gram suhe trdne snovi za posamezne paralelke so podani v prilogi 7.1.

Povprečna celokupna prostornina nastalega bioplina na gram suhe snovi za vzorce iz prve nastavitve so prikazane na diagramu 4-1. Prikazana je za prvih 25 dni, saj se je proizvodnja v večini paralelk po 25 dneh zaustavila.

Diagram 4-1: Povprečna celokupna prostornina bioplina na gram suhe trdne snovi brez inokuluma

za prvo nastavitev

Zaradi laţjega pregleda in primerjave med vzorci, smo za enake vzorce izračunali povprečje. TV predstavlja vzorec s substratom obdelanih bukovih briketov z glivo T. versicolor in sicer je TV povprečje paralelk pri katerih je potekala anaerobna digestija vsaj 25 dni (TV2, TV3, TV6, TV8), saj smo pri ostalih vzorcih (TV1, TV4, TV5, TV7) proces zaustavili zaradi določanja lignina. Vzorec 123 predstavlja povprečje vzorcev 1, 2 in 3 oz. vsebuje substrat neobdelanih bukovih briketov. HF pa je povprečje vzorcev HF1 ter HF2 in sicer substrata obdelanih bukovih briketov z glivo H. fragiforme.

Pri vzorcih iz prve nastavitve med paralelkami prihaja do manjših odstopanj in so rezultati delno ponovljivi. Pri negativni kontroli čistega inokuluma (vzorec IN1) je nastalo nekaj bioplina, kar se ne bi smelo zgoditi, saj inokulum naj ne bi vseboval organsko razgradljive snovi. Zato lahko sklepamo, da je inokulum iz bioplinarne Ihan vseboval nekaj organsko razgradljivega materiala.

Največ bioplina je kot pričakovano nastalo pri fermentaciji čiste celuloze, saj so mikroorganizmi neovirano prišli do celuloze in jo razgradili. Vidimo, da je prostornina nastalega bioplina pri čisti celulozi v primerjavi z lignoceluloznim materialom veliko višja. Torej ima lignin velik vpliv na proizvodnjo bioplina.

0

50

100

150

200

250

300

350

0 5 10 15 20 25

Pro

sto

rnin

a b

iop

lin

a [

ml]

Čas [d]

Povprečna celokupna prostornina bioplina

TV

HF

123

CE+IN1

IN1


25

Pri obdelanih bukovih briketih je proizvodnja bioplina v povprečju nekoliko višja kot pri neobdelanih bukovih briketih. To tudi potrjuje našo tezo, saj gliva pripomore k razgradnji lignina in posledično imajo mikroorganizmi laţji dostop do celuloze in hemiceluloze. Če primerjamo obdelavo z glivama, več bioplina nastane pri obdelavi lignoceluloznega materiala z glivo H. fragiforme kot pa z glivo T. versicolor. Iz tega lahko sklepamo, da gliva H. fragiforme hitreje razgraja lignin in bolj učinkovito vpliva na proizvodnjo bioplina. To smo lahko opazili ţe pri preraščanju substrata z glivo, saj je gliva H. fragiforme hitreje in bolj intenzivno prerasla substrat.

Povprečne dnevne prostornine nastalega bioplina na gram suhe snovi za vzorce iz prve nastavitve so prikazane z naslednjim diagramom 4-2.

Diagram 4-2: Povprečna dnevna prostornina bioplina na gram suhe trdne snovi brez inokuluma za

prvo nastavitev

Iz diagrama je lepo razvidno, da je največ bioplina nastalo v začetku procesa anaerobne digestije, to je od tretjega pa nekje do desetega dne. Na začetku je potrebno, da se mikroorganizmi prilagodijo pogojem, zato v prvih dneh bioplin še skorajda ni nastajal. Potem je proizvodnja bioplina skokovito narasla in nato postopoma upadala. Po petnajstih dneh se je proizvodnja v večini vzorcev popolnoma ustavila. Predvidevamo, da je to posledica nastanka fenolnih in drugih toksičnih skupin, ki inhibirajo proces [3]. Zaradi tega pride do odmiranja mikroorganizmov in ustavitve procesa. Razen pri celulozi se je proizvodnja v 23. dnevu spet pojavila, a se je po dveh dneh hitro ustavila. Sklepamo, da je to lahko posledica mešanja in je substrat spet prišel v stik z mikroorganizmi.

Povprečne celokupne prostornine nastalega bioplina na gram suhe snovi za vzorce iz druge nastavitve so prikazane z diagramom 4-3. Vzorca TV30G70 in TV70G30 predstavljata povprečje substrata sestavljenega iz 30 % mase bukovih briketov obdelanih z glivo T. versicolor in 70 % mase piščančjega gnoja ter obratno. TV30G70 predstavlja povprečje

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 5 10 15 20 25

Pro

sto

rnin

a b

iop

lin

a [

ml]

Čas [d]

Povprečna dnevna prostornina bioplina

TV

HF

123

CE+IN1

IN1


26

paralelk TVG1 in TVG2, TV70G30 pa povprečje iz TVG3 in TVG4. TV predstavlja povprečje paralelk TV9 in TV10, 45 je povprečje paralelk 4 in 5. G30 in G70 vsebujeta substrat iz neobdelanih bukovih briketov in piščančjega gnoja v razmerju 30 % : 70 % in obratno. G30 je povprečje paralelk G6 in G7, G70 pa je povprečje paralelk G8 in G9.

Diagram 4-3: Povprečna celokupna prostornina bioplina na gram suhe trdne snovi brez inokuluma

za drugo nastavitev

Pri nekaterih vzorcih, ki so vsebovali piščančji gnoj, je med paralelkami prišlo do kar velikih odstopanj in vsi vzorci niso bili ponovljivi. To je posledica nehomogenosti piščančjega gnoja.

Iz diagrama je razvidno, da je največ bioplina nastalo pri čisti celulozi, kar je pričakovan rezultat. Tudi v tem primeru je nekaj bioplina nastalo iz inokuluma, torej je tudi inokulum iz bioplinarne Draţenci vseboval nekaj organsko razgradljive snovi. A je ta vrednost v primerjavi z ostalimi vzorci zanemarljiva. Najmanj bioplina je nastalo iz neobdelanih bukovih briketov. Če primerjamo neobdelane in obdelane bukove brikete z glivo, je pri obdelanih nastalo veliko več bioplina, kar potrjuje našo hipotezo in dobljen rezultat iz prve nastavitve. Pri mešanicah lignoceluloznega materiala z gnojem je prišlo do večje proizvodnje bioplina. Torej dodatek piščančjega gnoja ima pozitiven vpliv na proizvodnjo bioplina. V obeh primerih (obdelani bukovi briketi, neobdelani bukovi briketi) je prišlo do večjega donosa bioplina pri razmerju 70 % gnoja in 30 % lignoceluloznega materiala. Nepričakovano pa je nastalo več bioplina iz neobdelanih bukovih briketov v mešanici z 70 % piščančjega gnoja, kot pa iz obdelanih bukovih briketov in 70 % piščančjega gnoja. Sklepamo, da je to posledica nehomogenosti piščančjega gnoja.

V bioplinarni Draţenci pridobivajo bioplin po navadi iz 70 % piščančjega gnoja in 30 % koruzne silaţe, zato smo za primerjavo dodali vzorec s koruzno silaţo (INSG). Če odštejemo vzorec pozitivne kontrole (CE+IN1) in paralelko G8, je proizvodnja pri vzorcu

0

100

200

300

400

500

600

0 5 10 15 20 25

Pro

sto

rnin

a b

iop

lin

a [

ml]

Čas [d]

Povprečna celokupna prostornina bioplina

TV

45

TV70G30

TV30G70

G30

G70

INSG

CE+IN2

IN2


27

INSG najvišja. Torej dobimo v povprečju iz bukovih briketov manjši volumen bioplina kot pa iz koruzne silaţe.

Na diagramu 4-4 so prikazani povprečne dnevne prostornine nastalega bioplina na gram suhe snovi za vzorce iz druge nastavitve.

Diagram 4-4: Povprečna dnevna prostornina bioplina na gram suhe trdne snovi za drugo nastavitev

Diagram 4-4 je podoben diagramu 4-2. Največ bioplina je, enako kot pri prvi nastavitvi, nastalo v začetku procesa. Natančneje je nastajanje bioplina bilo najbolj intenzivno od tretjega pa do petnajstega dne.

Če primerjamo obe nastavitvi, je proizvodnja bioplinov pri drugi nastavitvi večja kot pa pri prvi. Tudi sam proces fermentacije je potekal pri drugi nastavitvi dlje in intenzivneje. Sklepamo, da je to zato, ker smo pri drugi nastavitvi zatehtali ve

anaerobna digestija lignoceluloznih materialov s ... · anaerobna digestija lignoceluloznih...

Documents