ANÁLISES TOXICOLÓGICASANÁLISES TOXICOLÓGICAS

Paula Christiane Soubhia

Laboratório de Toxicologia

Centro de Controle de Intoxicações

INTRODUÇÃO AO PLANEJAMENTO DE ANÁLISESINTRODUÇÃO AO PLANEJAMENTO DE ANÁLISES

NOÇÕES PARA A PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS NOÇÕES PARA A PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS

Laboratório de Análises Toxicológicas – LATLaboratório de Análises Toxicológicas – LATAuxílio ao diagnóstico de intoxicaçõesAuxílio ao diagnóstico de intoxicações

Análises quali/quanti

Administração de antídotos

Diagnóstico diferencial

Prognóstico – nomogramas

Biomonitorização

Pesquisas: toxinologia, toxicocinética,

analíticas

InformaçõesInformações

História

Indivíduo: anamnese

Síndrome tóxica

Agente tóxico suspeito

Quantidade

Circunstância

Horário da intoxicação

PESQUISA DO AGENTE

PESQUISA DO AGENTE

TÓXICOTÓXICO

1) Direcionamento – o que pesquisar e onde?

2) Tipos de matrizes biológicas

3) Preparação da amostra

- Liberação dos analitos da matriz

- Remoção de interferentes endógenos

- Técnicas de extração

- Aumento da seletividade e sensibilidade

4) Técnicas

CCD

Cromatografia em fase gasosa

Cromatografia líquida

Planejamento da análise Planejamento da análise AMOSTRAAMOSTRA

MÉTODOMÉTODO

Tipos de Amostras Tipos de Amostras

UrgênciaUrgência Controle Controle terapêuticoterapêutico

ForenseForense OcupacionOcupacionalal

DopingDoping Amostras Amostras alternativasalternativas

SangueSangue SangueSangue VíscerasVísceras SangueSangue SangueSangue SuorSuor

UrinaUrina SalivaSaliva Produtos Produtos diversosdiversos

UrinaUrina UrinaUrina MecônioMecônio

Lav. GástricoLav. Gástrico Humor Humor vítreovítreo

SalivaSaliva UnhaUnha

ProdutoProduto CabeloCabelo

MedicamentMedicamentosos

Ar Ar exaladoexalado

SalivaSaliva

SangueSangue

Sangue total, soro e/ou plasmaSangue total, soro e/ou plasma

Matriz complexaMatriz complexa

AnticoagulanteAnticoagulante

HemóliseHemólise

Volume: menor disponibilidadeVolume: menor disponibilidade

Correlação com o efeito Correlação com o efeito

Período de detecção:Período de detecção:

Etanolemia: assepsia com degermante sem álcool.Etanolemia: assepsia com degermante sem álcool.

UrinaUrina

Triagens qualitativas Triagens qualitativas

Disponível em grandes volumesDisponível em grandes volumes

Coleta não invasivaColeta não invasiva

> Chance de encontrar a substância> Chance de encontrar a substânciaPresença de produtos de biotransformação Presença de produtos de biotransformação DulteraçãoDulteraçãoTriagemTriagemSó indicativo de uso Só indicativo de uso

Quantificação Quantificação

correção com creatininacorreção com creatinina

Conteúdo gástricoConteúdo gástrico

Análises qualitativas Análises qualitativas

Coletar a 1ª porçãoColetar a 1ª porção

Grande volume disponívelGrande volume disponível

Agente tóxico em grandes Agente tóxico em grandes

concentrações e não concentrações e não

biotransformadobiotransformado

Amostra Amostra

ESTABILIDADEESTABILIDADE

MatrizMatriz

Tipo de agente tóxico: medicamentos, metais, Tipo de agente tóxico: medicamentos, metais,

praguicidaspraguicidas

ARMAZENAMENTOARMAZENAMENTO

PeríodoPeríodo

Tubos especiais: mTubos especiais: metais (HNOetais (HNO33 10%, água deionizada) - 10%, água deionizada) -

complexaçãocomplexação

Praguicidas (acetona) - resíduosPraguicidas (acetona) - resíduos

ANÁLISES TOXICOLÓGICASANÁLISES TOXICOLÓGICAS

APLICAÇÃOAPLICAÇÃO ÁREASDiagnóstico clínico

Forense

Doping

Controle terapêutico

Biomonitorização

O QUE SE ESPERA ENCONTRARO QUE SE ESPERA ENCONTRAR

PROD INALTERADO/BIOTRANSFORMADOPROD INALTERADO/BIOTRANSFORMADO

QUALIQUALI

TRIAGEMTRIAGEM

QUANTIQUANTI

sensibilidadesensibilidade

TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS EM TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS EM ANÁLISES TOXICOLÓGICASANÁLISES TOXICOLÓGICAS

A preparação de amostras pode ser A preparação de amostras pode ser

considerada como uma série de operações considerada como uma série de operações

unitárias necessárias para que determinada unitárias necessárias para que determinada

substância (analito) possa ser detectada substância (analito) possa ser detectada

pela técnica analítica de escolha.pela técnica analítica de escolha.

ANÁLISES TOXICOLÓGICAS ANÁLISES TOXICOLÓGICAS Técnicas analíticasTécnicas analíticas

CromatográficasCromatográficas

EspectrométricasEspectrométricas

ImunoensaiosImunoensaios

EspectrotométricasEspectrotométricas

ColorimétricasColorimétricas

EQUIPAMENTOS DE CROMATOGRAFIAEQUIPAMENTOS DE CROMATOGRAFIA

Técnicas analíticas Finalidade

CCD/HPTLC Triagem medicamentos, drogas abuso, praguicidas

CG Medicamentos, drogas, praguicidas, solventes

HPLC Medicamentos, drogas, praguicidas, solventes

Espectrometria de Absorção Atômica (EAA)

Metais (Pb, Cd, As, Hg)

ICP Traços

Espectrometria de massas Peso molecular e características estruturais da amostra

Espectrofotometria Substância inalterada, produtos de biotransformação e indicadores biológicos

Colorimetria Medicamentos

Imunoensaios Triagem e confirmação

Eletroforese capilar Praguidas – glifosato, paraquat, drogas de abuso

Típicas operações em preparação de Típicas operações em preparação de amostras:amostras:

A) Liberação dos analitos da amostraA) Liberação dos analitos da amostra

B) Remoção de interferentes endógenosB) Remoção de interferentes endógenos

C) Técnicas de extraçãoC) Técnicas de extração

D) Aumento da seletividade e sensibilidadeD) Aumento da seletividade e sensibilidade

A) Liberação dos analitos da amostraA) Liberação dos analitos da amostra

Analito na matrizAnalito na matriz

- conjugado- conjugado

- livre- livre

BIOTRANSFORMAÇÃOMaconha - 9THC

CH3

OCH3

CH3

OH

C5H11

Delta-9-Tetraidrocanabinol (THC)

C

OCH3

CH3

OH

C5H11

OOH

Ácido 11-nor-delta-9-THC-COOH

C

OCH3

CH3

OH

C5H11

OO ác ido glicurônico

Ácido 11-nor- delta -9 -THC-COOH conjugado

SUBSTÂNCIAS CONJUGADAS SUBSTÂNCIAS CONJUGADAS

HidróliseHidrólise

- Alcalina- Alcalina

- Ácida- Ácida

- Enzimática- Enzimática

HIDRÓLISE ALCALINA HIDRÓLISE ALCALINA

Ácido 11-nor- delta -9 -THC-COOH conjugado

3CH

nicoC

OCH3

OH

C5H11

OO ácido glicurô

Ácido 11-nor-delta-9-THC-COOH

C

OCH3

CH3

OH

C5H11

OOH

60°C

NaOH

-Vantagens:

-processo mais rápido

-custo baixo

- Desvantagens:

-degradação de analitos

não estáveis

p.ex. benzodiazepínicos

-Vantagens:

-processo mais rápido

-custo baixo

- Desvantagens:

-degradação de analitos

não estáveis

p.ex. benzodiazepínicos

HIDRÓLISE ENZIMÁTICA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA

Esteróides Anabólicosconjugados Esteróides Anabólicos

livres55°C/1 hora

Beta glucuronidase

-Vantagens:Vantagens:

-não degrada os analitos

- Desvantagens:- Desvantagens:

-custo mais alto

-maior tempo de reação

-controle mais rigoroso das condições

-enzimas podem ser inibidas por substâncias presentes nas

amostras

-Vantagens:Vantagens:

-não degrada os analitos

- Desvantagens:- Desvantagens:

-custo mais alto

-maior tempo de reação

-controle mais rigoroso das condições

-enzimas podem ser inibidas por substâncias presentes nas

amostras

B) B) Remoção de interferentes endógenosRemoção de interferentes endógenos

Uma matriz biológica consiste de muitos Uma matriz biológica consiste de muitos componentes, como proteínas, lipídios, componentes, como proteínas, lipídios, carboidratos que podem interferir na análise.carboidratos que podem interferir na análise.

B) B) Remoção de interferentes endógenos Remoção de interferentes endógenos - - PROTEÍNAS -PROTEÍNAS -

Matriz: sangue total/plasmaMatriz: sangue total/plasma

Determinação: fármacos (ligado/livre)Determinação: fármacos (ligado/livre)

Método: precipitação/desnaturaçãoMétodo: precipitação/desnaturação

Finalidades: precipitação em contato com a fase móvel Finalidades: precipitação em contato com a fase móvel

e obstruir a coluna cromatográficae obstruir a coluna cromatográfica

AgentesAgentes precipitantes- alteração da precipitantes- alteração da solubilidade na solução aquosasolubilidade na solução aquosa

Ácidos: formação de sais insolúveis com a forma catiônica ormação de sais insolúveis com a forma catiônica

das proteínasdas proteínas

Ácido tricloroacético e ácido perclórico

Solventes orgânicos: Solventes orgânicos: solventes que são miscíveis em água como acetona, metanol, etanol e acetonitrila podem abaixar a solubilidade de proteínas.

Sais: retirada da água de solvatação e diminuição da Sais: retirada da água de solvatação e diminuição da

solubilidade das proteínas – efeito salting-out : solubilidade das proteínas – efeito salting-out : ssulfato de amônio

C) Técnicas de extraçãoC) Técnicas de extração

1) Extração líquido-líquido (LLE)

2) Extração em fase sólida (SPE)

3) Extração por head space (HS)

4) Micro extração em fase sólida (SPME)

5) Derivação

C) Técnicas de extração C) Técnicas de extração

Transferir os analitos (matriz original) de

forma adequada para análise em

instrumentação cromatográfica

ExtraçãoExtração

Propriedades físico-químicas (analitos, interferentes e Propriedades físico-químicas (analitos, interferentes e

matriz)matriz)

PolaridadePolaridade

SolubilidadeSolubilidade

Estabilidade química e térmicaEstabilidade química e térmica

Clean-up – interferentes endógenos ou exógenosClean-up – interferentes endógenos ou exógenos

Concentração – sensibilidadeConcentração – sensibilidade

Tempo: 80% da análiseTempo: 80% da análise

1) Extração líquido-líquido (LLE)1) Extração líquido-líquido (LLE)

Extração direta do material biológico com um solvente imiscível com a água.Extração direta do material biológico com um solvente imiscível com a água.

Fenômeno: partiçãoFenômeno: partição

Coeficiente de partição/distribuição: Coeficiente de partição/distribuição: K= CK= C22/C/C11

pH fase aquosapH fase aquosa

proporção vol. das fasesproporção vol. das fases

↑↑ da fase extratorada fase extratora

2 ou mais extrações2 ou mais extrações

ELLELL

urina

Solvente orgânicourina

Drogas/ metabólitos

Agitação

Centrifugação Separação da fase orgânica

Extrato

Solvente extratorSolvente extrator

Solubilidade da substância (ordem de polaridade – série Solubilidade da substância (ordem de polaridade – série

eluotrópica)eluotrópica)

Baixa viscosidade – interação com a matrizBaixa viscosidade – interação com a matriz

Baixo ponto de ebuliçãoBaixo ponto de ebulição

Corrosão em equipamentosCorrosão em equipamentos

ToxicidadeToxicidade

Menos polares: matrizes biológicasMenos polares: matrizes biológicas

CustoCusto

Aditivos e estabilizadores de solventesAditivos e estabilizadores de solventes

ESCOLHA DOS SOLVENTES ESCOLHA DOS SOLVENTES

Drogas ácidas e neutras acetato de etila, diclorometano, éter-isopropanol 7:3,

n-hexano-éter 1:1, entre outros.

Drogas básicas e neutras álcool isoamílico 1 ou 2% em n-hexano, éter etílico,

diclorometano, n-hexano-acetato de etila 7:3, etc

Praguicidas n-hexano, éter de petróleo

Metais metil-isobutilcetona (Pb-pirrolidina ditiocarbamato de

amônia)

INFLUÊNCIA DO pH NA SOLUBILIDADEINFLUÊNCIA DO pH NA SOLUBILIDADE

Substâncias de caráter básico – extração básicaEx. anfetaminas

Matriz

Anfetamina

CH2 CH

CH3

NH

H

OH --Forma ionizada

neutro

CH2 CH

CH3

NH

H

Ajuste do pHAjuste do pHNaOH 2%NaOH 2%

Impurezas ácidasConvertidos em ânions

INFLUÊNCIA DO pH NA SOLUBILIDADEINFLUÊNCIA DO pH NA SOLUBILIDADE

Substâncias de caráter ácido – Extração ácida

Ex. ácido 11-nor-delta -9-THC-COOH

ácido 11-nor-delta -9-THC-COOH

C

OCH3

CH3

OH

C5H11

OOH

NeutroC

OCH3

CH3

OH

C5H11

OOH

H+

Ajuste do pHAjuste do pHHCl 5%HCl 5%

Impurezas Impurezas básicas cátionsbásicas cátions

AJUSTE DE pHAJUSTE DE pH

Drogas ácidas e neutras

Soluções ácidas (HCl diluido, NH4Cl saturado, tampão

acetato, tampão fosfato) Tampões sólidos (fosfato)

Drogas básicas e neutras

Soluções alcalinas (NaOH diluído, NH4OH diluido,

Na2CO3, Na3BO3, tampão fosfato, tampão borato)

Tampões sólidos (carbonato/bicarbonato)

ELLELL

= molécula de água

+ NaCl

Na+ Cl-

CH2 CHCH3

NH

H

+

Efeito Salting-outEfeito Salting-out

Melhora do coeficiente de Melhora do coeficiente de

partição/distribuição entre um solv. partição/distribuição entre um solv.

orgânico e a aquosaorgânico e a aquosa

Diminui a formação de emulsõesDiminui a formação de emulsões

Aumenta a recuperação do analitoAumenta a recuperação do analito

Melhora do coeficiente de Melhora do coeficiente de

partição/distribuição entre um solv. partição/distribuição entre um solv.

orgânico e a aquosaorgânico e a aquosa

Diminui a formação de emulsõesDiminui a formação de emulsões

Aumenta a recuperação do analitoAumenta a recuperação do analito

Vantagens - ELLVantagens - ELL

Fácil execuçãoFácil execução

Não requer instrumentação Não requer instrumentação

especialespecial

Boa seletividadeBoa seletividade

Grande variedade de sistemas Grande variedade de sistemas

de extraçãode extração

Desvantagens - ELLDesvantagens - ELL

Amostras com alta afinidade com a fase aquosaAmostras com alta afinidade com a fase aquosa

Impurezas do solventeImpurezas do solvente

Formação de emulsõesFormação de emulsões

Toxicidade do solvente extratorToxicidade do solvente extrator

Grandes volumes de amostra e solvente – resíduosGrandes volumes de amostra e solvente – resíduos

Procedimento trabalhoso e demoradoProcedimento trabalhoso e demorado

Difícil automaçãoDifícil automação

2) EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA2) EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA

Extração em Fase Sólida (SPE) A técnica de SPE é a mais utilizadas no preparo de amostras, tanto quando se quer pré-concentrar compostos de interesse, quanto em casos em que se pretende simplesmente separá-los de constituintes que possam interferir na análise.

Fluído biológico é misturado com um adsorvente e Fluído biológico é misturado com um adsorvente e posteriormente eluido com solvente apropriado.posteriormente eluido com solvente apropriado.

Mecanismo de retenção das substânciasMecanismo de retenção das substâncias AdsorçãoAdsorção PartiçãoPartição

Mecanismos de dessorçãoMecanismos de dessorção Solvente orgânicoSolvente orgânico Dessorção térmicaDessorção térmica

EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDAEXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA

ETAPASETAPAS

1.1.Condicionamento:Condicionamento: Umidificação e ativação dos Umidificação e ativação dos

2.2.Adição da amostraAdição da amostra: Retenção quantitativa do : Retenção quantitativa do

composto de interesse e remoção de parte da matrizcomposto de interesse e remoção de parte da matriz

3.3.LavagemLavagem: Remoção da maioria dos componentes : Remoção da maioria dos componentes

da matriz, o que aumenta a seletividadeda matriz, o que aumenta a seletividade

4.4.EluiçãoEluição: Eluição quantitativa do composto de : Eluição quantitativa do composto de

interesse na colunainteresse na coluna

Metanol +

tampão fosfato

1

Amostra + água + PI + tampão

fosfato

BE

PI

Interf.

COC

2

Água + HCl 0,1M + metanol

3

Diclorometano/ isopropanol / NH3

(80:20:2)

4

EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDAEXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA

EFS aparatoEFS aparato

PREENCHIMENTOPREENCHIMENTO

Fase sólida - Fase sólida - empacotada em coluna (cartuchos)empacotada em coluna (cartuchos)

NaturezaNaturezaPolímeros porososPolímeros porosos

Tipos de colunas (SPE)Tipos de colunas (SPE)

APOLARES/fase reversa: octadecil, octil, fenilAPOLARES/fase reversa: octadecil, octil, fenil

INTERAÇÕES NÃO-POLARES (Van der Waals)INTERAÇÕES NÃO-POLARES (Van der Waals)

SiC8

Octil

SiPH

Fenil

SiCHCiclohexil

Tipos de colunas (SPE)Tipos de colunas (SPE)

Si C N

H O

CNCianopropil

Si NH

H

H

O

NH2

Aminopropil

Si O

OH

O

H

H

NH

2OHDiol

POLARES/fase normal: cianopropil, diolPOLARES/fase normal: cianopropil, diol

INTERAÇÕES tipo hidrofílica: dipolo-dipolo, pontes HINTERAÇÕES tipo hidrofílica: dipolo-dipolo, pontes H

Tipos de colunas (SPE)

- TROCA IÔNICA- INTERAÇÕES IÔNICAS (Eletrostáticas)

SiC

O

O-+NH3 R

CBAÁcido

carboxílico

Si

SO3- +NH3

SCXÁcido

benzenosulfônico

Si N+(CH3)3-SO3 R

SAXTrimetil

aminopropil

FATORES QUE AFETAM A EXTRAÇÃO EM FATORES QUE AFETAM A EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDAFASE SÓLIDA

pHpHTipo de amostraTipo de amostraVolume de amostraVolume de amostraTratamento do adsorventeTratamento do adsorvente

CondicionamentoCondicionamentoLavagemLavagemDessorção (eluição)Dessorção (eluição)

EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDAEXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDAVANTAGENS / VANTAGENS / DESVANTAGENSDESVANTAGENS

Redução do volume da amostra e do solvente extratorRedução do volume da amostra e do solvente extrator Maior rapidez na análiseMaior rapidez na análise Aumento de eficiência da extração (recuperação)Aumento de eficiência da extração (recuperação) Não formação de emulsõesNão formação de emulsões Volume de evaporação diminuídoVolume de evaporação diminuído Maior facilidade de automaçãoMaior facilidade de automação Maior seletividadeMaior seletividade Boa reprodutibilidadeBoa reprodutibilidade Várias possibilidades de adsorventes e solventesVárias possibilidades de adsorventes e solventes Alto custo, importaçãoAlto custo, importação Viscosidade da amostra afeta o fluxoViscosidade da amostra afeta o fluxo

3) EXTRAÇÃO POR 3) EXTRAÇÃO POR HEAD SPACEHEAD SPACE

DETERMINAÇÃO DE VOLÁTEIS

Amostra (urina, sangue ou saliva) + sulfato de sódio + PI

ESTUFA 70°C 30 min GC

seringa

4) MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA 4) MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME(SPME)

-Baseado na partição do analito entre a fibra de extração e a matriz (amostra)

61 2 3 4 5

SPMESPME

MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME) Fibras comercialmente disponíveis Fibras comercialmente disponíveis

Fase estacionária

(espessura do filme)

Abreviação Aplicação geral

Polidimetilsiloxano (100 m) PDMS Compostos não-polares, voláteis

Polidimetilsiloxano (30um) PDMS Não-polares, voláteis e semi-voláteis

Polidimetilsiloxano (7um) PDMS Não-polares, semi e não voláteis

Polidimetilsiloxano divinilbenzeno (65um)

PDMS-DVB Polar

Poliacrilato (85um) PA Polar, uso geral, voláteis

Carboxeno-polidimetilsiloxano (75um, 85um)

CAR-PDMS Voláteis

Carbowax- divinilbenzeno (65um, 75um)

CW-DVB Polar, voláteis

MICRO EXTRAÇÃO EM FASE MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)SÓLIDA (SPME)

Fatores que afetam a eficácia de extração por Fatores que afetam a eficácia de extração por

SPME:SPME:

Dimensões da fibra (comprimento, espessura);Dimensões da fibra (comprimento, espessura);

Temperatura de extração;Temperatura de extração;

Efeito da matriz (presença de sal, pH);Efeito da matriz (presença de sal, pH);

Velocidade de agitação;Velocidade de agitação;

Tempo de extração.Tempo de extração.

MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)

Vantagens da SPME sobre a SPE e extração Vantagens da SPME sobre a SPE e extração

líquido-líquido:líquido-líquido:

SimplicidadeSimplicidade

PráticoPrático

RápidoRápido

Extração sem utilização de solventesExtração sem utilização de solventes

Pode ser automatizado.Pode ser automatizado.

5) Derivação5) DerivaçãoObjetivos:Objetivos:

- CG- CG

- Aumento da volatilidade e diminuição da - Aumento da volatilidade e diminuição da

polaridadepolaridade

- Redução da degradação térmica- Redução da degradação térmica

- Aumento da resposta do detector – adição de - Aumento da resposta do detector – adição de

grupamentos funcionaisgrupamentos funcionais

- Melhora da separação e a sensibilidade- Melhora da separação e a sensibilidade

DERIVAÇÃODERIVAÇÃO

N

C

CH3

OO H

O CO

N

C

CH3

OO CH2CF2CF3

O CO

PFP/PFPA

70°C 20 min

PFP: PentafluoropropanolPFPA: Anidrido pentafluoropropiônico

Ex. Benzoilecgonina: Aumento da sensibilidade para detectores detector

de captura eletrônica

REFERÊNCIASREFERÊNCIAS

1) MCDOWALL, R.D. Sample preparation for

biomedical analysis. J. Chromatogr. B, 492, p.3-58,

1989.

2) WONG, S.H., SUNSHINE, I. Handbook of Analytical

therapeutic drug monitoring and toxicology. CRC

Press, 1997.

3) THEODORIDIS, G., KOSTER, E.H.M., JONG, G.J. Solid

phase microextraction for the analysis of biological

samples. J. Chromatogr. B, 745, 49-82, 2000.