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ANALISI CHIMICA TOSSICOLOGICA

Master di II livello in “REACH (Registration, Evaluation, Authorisation and restriction of Chemicals – CE n.1907/2006) e normative

collegate per la gestione delle Sostanze Chimiche”;

a.a. 2013-2014

AREA CHIMICA e CHIMICO-AMBIENTALE

Fondamenti di Chimica

Analisi Chimica Tossicologica

Analisi Strumentale degli inquinanti

Identificazione e caratterizzazione delle sostanze chimiche

Il metodo QSAR e sue applicazioni nel Regolamento R EACH

Processi chimici innovativi –metodi combinatoriali e green chemistry

Chimica Tossicologica Ambientale

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Che cos’è la Chimica Analitica?Che cos’è la Chimica Analitica?

E’ l’arte e la scienza di E’ l’arte e la scienza di separareseparare, , riconoscerericonoscere le le

diverse sostanze e diverse sostanze e determinare le quantitàdeterminare le quantità

relative dei vari costituenti relative dei vari costituenti di un campione di un campione

Analisi qualiAnalisi quali--quantitativaquantitativa

Wilhem Ostwald Wilhem Ostwald (1894)(1894)

•… ai fabbricanti , agli importatori e agliutilizzatori a valle spetta l’obbligo difabbricare, immettere sul mercato outilizzare sostanze che non arrechinodanno alla salute umana o all’ambiente.

REACH (art. 1)

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Applicazioni della chimica analitica in ambito REACH:

CHIMICA ANALITICA

SALUTE e SICUREZZA SUL LAVORO

RICERCA

Favorire la sostituzione, delle sostanze chimiche che presentano maggiori pericoli e quindi rischi (“Substances of Very High Concern - SVHC”)

http://www.iss.it/life/index.php?lang=1&anno=2014&tipo=3

ANALISI AMBIENTALE

MONITORAGGIO BIOLOGICOtest biologici sui lavoratori esposti.

MISURAZIONI AMBIENTALI

http://www.lavoro.gov.it/Lavoro/SicurezzaLavoro/PrimoPiano/20110701_Lettera_Circolare.htm

Compilazione SDS – Sezione 9 proprietà fisiche e chimiche fondamentali

CARATERIZZAZIONE

delle SOSTANZE

Sviluppo di idonee metodologie per lo screening delle sostanze SVHCJournal of Chromatography B, 879 (2011) 231-233

Direct LC-ES-MS/MS determination of phthalates in physiological saline solution

http://echa.europa.eu/it/proposals-to-identify-substances-of-very-high-concern-previous-consultations

Quali sono le sostanze estremamente preoccupanti (SVHC)?Le sostanze estremamente preoccupanti comprendono tutte quelle sostanze che sono:

� cancerogene, mutagene o tossiche per la riproduzione (CMR), categoria 1A e 1B di cui al punto 3.6 dell'allegato I del regolamento (CE) n. 1272/2008;

� persistenti, bioaccumulabili e tossiche (PBT) o molto persistenti e molto bioaccumulabili (vPvB) in base ai criteri indicati nell'Allegato XIII del Regolamento REACH;

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� per le quali sono scientificamente comprovati, caso per caso, effetti gravi per la salute umana o per l'ambiente pari a quelli descritti sopra, ad es. perturbatori del sistema endocrino.

Tali sostanze vengono identificate come altamente preoccupanti dalla Commissione Europea su proposta degli Stati Membri o dell'ECHA. Le parti interessate possono esprimere commenti sulle proposte di identificazione mediante il sito dell'ECHA.

Substance IDentity (SID)

SubstanceIdentity

Pre-regi

strationSIEF

Inquiry

Registration

TestingPropos

alsHazardassessment

CSR

Evaluation

Authorisatio

n

Restriction

Annex VI

La SID “è chiave in ogni decisione presa sulle sostanze chimiche nel REACH” (R. Demi - ECHA)

La caratterizzazione di una sostanza è la raccolta di tutte le informazioni disponibili relative ai parametri che devono essere inclusi per identificare la sostanza in maniera inequivocabile

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ECHA Valutazione fascicoli (SID Identità delle sostanze)

Controllo della Conformità – (processo CCH)

Obiettivo : verificare che le informazioni fornite nelfascicolo tecnico siano conformi al REACH.

I processi di Valutazione assicurano che:

� la SID sia sufficientemente chiara affinchè la sostanza sia collegata in modo non ambiguo alla sostanza prodotta/importata dal registrante; stima se le informazioni fornite siano sufficienti e coerenti per poter identificare senza alcun dubbio la sostanza.

� le informazioni sulla SID siano consistenti e sufficienti a riconoscere la sostanza prodotta/importata dal registrante.

maggiori problemi di non conformità� Dati analitici che contraddicono le informazioni sull’identità della sostanza;� Costituenti principali non tenuti in considerazione;� Nome IUPAC e CAS si riferiscono a costituenti diversi;� Nessuna informazione sulla struttura;� Sostanza UVCB: nessuna descrizione del processo/descrizione della composizione;� Dati analitici a supporto della SID che sono non sufficienti/illegibili/assenti;� Il contro-ione non e identificato/quantificato;� Informazione sulla stereochimica non inserita;

Dei fascicoli presentati fino ad oggi il 45% ha avuto successo, mentre il restante 55% è stato considerato non valutabile, a

causa di informazioni mancanti o incoerenti.

SOSTANZE SOSTANZE UVCBUVCBSubstances ofUnknown or Variablecomposition, Complexreaction products or Biological materials

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La sostanza è completamente identificata secondo l’all. VI, punto 2 di REACH, mediante:

� lDENTIFICATORI DELLA SOSTANZA, ovvero il nome IUPAC, formula di struttura, identificatori numerici, formula molecolare, peso molecolare, ecc.

� COMPOSIZIONE CHIMICA (Purezza, Concentrazione e identificazione di ciascun componente)

� METODI ANALITICI QUALITATIVI E QUANTITATIVI e RISULTATI – DESCRIZIONE DEL METODO (Spettri UV,IR, dati cromatografici e altri dati analitici rilevanti)

Informazioni da fornire per l’identificazione delle s ostanze(All. VI punto 2 del REACH)

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GRUPPI PRINCIPALI DI SOSTANZE

sostanze con una composizione qualitativa e quantitativa definita che possono essere sufficientemente identificate in base ai parametri identificativi del REACH (allegato VI, punto 2)

SOSTANZE BEN DEFINITESOSTANZE BEN DEFINITE

SOSTANZE SOSTANZE UVCBUVCBSubstances of Unknown or Variable composition, Complex reaction productsor Biological materials

sostanze che NON possono essere sufficientemente identificate mediante i parametri suddetti.

Le sostanze possono essere suddivise in due gruppi principali:

A. sostanze monocostituente: sostanze in cui un costituente è presente a una concentrazione almeno pari all'80% (peso/peso); il restante 20% è considerato come impurezze / additivi.

B. sostanze multicostituente: sostanze composte da diversi costituenti principali presenti in concentrazioni ≥10% e <80 % (peso/peso). Tutti i costituenti presenti in una concentrazione <10% sono considerati impurezze.

C. sostanze definite dalla composizione chimica e da u lteriori identificatori/parametri (es. struttura cristallina, forma, durezza, ecc.) (per esempio i minerali inorganici) che possono essere identificate mediante la propria composizione chimica devono essere ulteriormente specificate tramite identificatori aggiuntivi per poter essere identificate.

Il successo delle analisi di laboratorio per le sostanze UVCB e quelle multicostituente richiede una combinazione di conoscenze approfondite sui processi chimici utilizzati per produrle e un set di test opportunamente selezionati per una corretta caratterizzazione.

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Informazioni analitiche:

Le informazioni analitiche ottenibili attraverso var i metodi spettroscopici (es. MS, IR, SPFT, NMR per sostanze organiche; XRD, AAS, XRF, ICP per sostanze i norganiche) sono necessarie per confermare la struttura .

Le informazioni che si ottengono da metodi cromatogra fici (es. HPLC, GC, EC, CI) servono per confermare la composizione.

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Azioni per la corretta identificazione delle sostanze

In assenza di uno o più identificatori delle sostanze (All. VI, p.2 del REACH) sarà necessario procedere alla loro acquisizione, mediante:

� INFORMAZIONI e DATI di LETTERATURA, possibilmente aggiornati

� Consultazione degli INVENTARI e delle BANCHE DATI esistenti

� ANALISI CHIMICA e STRUMENTALE per l’identificazionedei componenti e delle impurezze e la determinazione delleloro concentrazioni.

La scheda dati di sicurezza (SDS) costituisce uno strumento per trasmettere dai fornitori ai clienti le informazioni di sicurezza sulle sostanze e sui preparati pericolosi.

In Europa la struttura ed il contenuto tecnico delle schede di sicurezza è regolato dal regolamento n. 1907/2006 del Parlamento Europeo del Consiglio del 18 dicembre 2006 concernente la registrazione, la valutazione, l'autorizzazione e la restrizione delle sostanze chimiche (REACH).

Compilazione SDS – Sezione 9 proprietà fisiche e chimiche fondamentali

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La struttura della scheda di sicurezza deve essere composta dai seguenti 16 punti obbligatori:1. Identificazione della sostanza/preparato e della società/impresa2. Identificazione dei pericoli3. Composizione/informazioni sugli ingredienti4. Misure di primo soccorso5. Misure antincendio6. Misure in caso di rilascio accidentale7. Manipolazione e immagazzinamento8. Controllo dell'esplosione9. Proprietà fisiche e chimiche10. Stabilità e reattività11. Informazioni tossicologiche12. Informazioni ecologiche13. Considerazioni sullo smaltimento14. Informazioni sul trasporto15. Informazioni sulla regolamentazione16. Altre informazioni

Struttura SDS europea

SDS SEZIONE 9

Informazioni sulle proprietà fisiche e chimiche fondamentali Devono essere identificate chiaramente le seguenti proprietà facendo riferimento, se del caso, ai metodi di prova impiegati e vanno indicate le idonee unità di misura e/o condizioni di riferimento.

Se pertinente per l’interpretazione del valore numerico, è indicato anche il metodo di determinazione (ad esempio il metodo per determinare il punto di infiammabilità, metodo in vaso aperto/vaso chiuso):

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a) Aspetto: vanno indicati lo stato fisico nonché il colore della sostanza o della miscela all’atto della fornitura; b) Odore;c) Soglia olfattiva; d) pH; e) Punto di fusione/punto di congelamento; f) Punto di ebollizione iniziale e intervallo di ebollizione; g) Punto di infiammabilità; h) Velocità di evaporazione; i) Infiammabilità (solidi, gas); j) Limiti superiore/inferiore di infiammabilità o di esplosività;

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http://www.salute.gov.it/imgs/C_17_pubblicazioni_1191_allegato.pdf

LABORATORI NAZIONALI REACH

Il successo delle analisi di laboratorio richiede una combinazione di

conoscenze approfondite sull’intera procedura analitica e sui processichimici /strumentali opportunamente selezionati.

Fasi Tipiche di una Analisi

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Metodo analitico : è l’applicazione di una tecnica analitica volta a risolvere un problema analitico specifico.

Esempio: determinazione spettrofotometrica del Cr (VI) nelle acque dove può essere presente come inquinante.

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DEFINIZIONE DEL METODO ANALITICODEFINIZIONE DEL METODO ANALITICO

NECESSITA' DI:

� ESTRARRE E SEPARARE DAL RESTO DELLA MATRICE ALCUNI

picogrammi (10 -12 grammi) DI SOSTANZA

� AVERE UNO STRUMENTO SELETTIVO E SENSIBILE PER

QUANTIFICARLI ( HRGC/HRMS (e.g., Metodo EPA 1613)

Naturalmente non tutti i metodi analitici sono semplici comequello riportato precedentemente. Ad esempio, per ladeterminazione della concentrazione di diossina nel

latte:

strumentazione e reagenti chimici richiesti per l’analisi delle diossine costano complessivamente 500.000 euro, contro le poche decine di euro per una titolazione acido-base), ed il procedimento è molto più lungo e laborioso (circa 24 ore di lavoro per un’analisi delle diossine, invece che 10-15 minuti per una titolazione acido-base.

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Aggiunta 3°Standard S.R.

Aggiunta 2°Standard S.P.

ANALISI PCDD (PoliCloroDibenzo-p-Diossine) :Analisi in diluizione isotopica

CAMPIONE

Aggiunta 1°Standard

LIQUIDI

Liq/Liq-SPE

ESTRAZIONE

PURIFICAZIONE

SEPARAZIONE

ANALISI

DATO

SOLIDI

PFE-SOXHELET

1) RIPARTIZIONE H2SO4 98% X 3 volte

2) RIPARTIZIONE NaCl 5%

3) RIPARTIZIONE NaOH 20% X 3 volte

4) RIPARTIZIONE NaCl 5%

5) FILTRARE, CONCENTRARE A 1 ml

1) COLONNA SILICE MULTISTRATO

Concentrare a 1 ml

2) COLONNA ALLUMINA

Concentrare a 0.5 ml

3) COLONNA CARBONE

Concentrare a 10-50 µµµµl

T = 0.5 h

T = 2.5 h

T = 7 h

T = 17 h

T = 18 – 22 h Criteri di identificazioneLimiti di rilevabilitàRecuperi

Classificazione dei Metodi Analitici Classificazione dei Metodi Analitici (Quali (Quali –– Quantitativi)Quantitativi)

Esistono decine di migliaia di metodi analitici, che vengono usati per le più svariate

applicazioni. Risulta difficile proporre una classificazione schematica che racchiuda tutti i

metodi esistenti. Una classificazione un po’ approssimativa, ma realistica li divide in tre classi:

Sono anche definiti metodi classicimetodi classici

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Le matrici possono essere più o meno complesse in base alla lo rocomposizione:

� matrici semplici : es - acqua potabile - aria indoor

� matricimatrici complessecomplesse :: cosìcosì definite,definite, inin quantoquanto sisi riscontranoriscontrano piùpiùvariabilivariabili all’internoall’interno delladella loroloro totaletotale composizionecomposizione:: -- refluireflui industrialiindustriali-- terreniterreni –– lattelatte -- fluidifluidi biologicibiologici..

La Scelta del Metodo Analitico

E’ legata a diversi fattori quali ad es:

� qualità e quantità del campione, natura della matrice;

� qualità e quantità dell’analita, presumibilmente presente nel campione, da cui dipende la scelta del metodo chimico o la tecnica strumentale più idonea (sensibilità strumentale e analitica);

� sensibilità richiesta dai limiti di legge;

� disponibilità delle risorse umane e strumentali;

� qualità del dato analitico ottenibile (certezza del risultato analitico);

� possibilità di ricorrere a metodi riconosciuti e/o validati;

� rapporto costi/benefici.

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Natura dell'analita Tecnica analitica

Ioni inorganici (cationi e anioni) gravimetriavolumetria precipit.volumetria ox/redox

potenziometriacolorimetriapolarografia

Cromatografia ionica (I. C.)Elettroforesi capillare

Ioni inorganici (soprattutto cationi) volumetria compless.elettrogravimetria

polarografiafotometria atomica

Elementi metallici Assorbimento atomicoEmissione al plasma

Acidi e basi Volumetria neutralizzazione

Sostanze organiche spettrofotometria assorbimento (UV- VIS-IR)HPLC

HPLC-MS

Sostanze volatili gas-cromatografiagas-crom-spettrom. massa

Sostanze otticamente attive polarimetria

Scelta del metodo analitico in funzionedella natura dell'analita

QUANTITAQUANTITA ’’ DEL DEL CAMPIONECAMPIONE

LaLa quantitquantitàà didi campionecampionevieneviene spessospesso usatausata perperclassificareclassificare ilil tipotipo didi analisianalisieseguitaeseguita.. EsEs::

�� l'analisil'analisi didi 11gg didi ununcampionecampione didi terreno,terreno, perperricercarericercare unun inquinanteinquinantesospetto,sospetto, dovrebbedovrebbe essereesserechiamatachiamata macromacro analisianalisi..

��LL’’ analisianalisi didi unun campionecampionedidi 55 mgmg didi unauna polvere,polvere,sospettatasospettata didi essereessere unaunadrogadroga illecita,illecita, sarebbesarebbe unaunamicroanalisimicroanalisi..

Scelta del metodo analitico in funzionedella quantità del campione e dell’analita

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LeLe tecnichetecniche perper trattaretrattare campionicampioni moltomolto piccolipiccoli sonosonoabbastanzaabbastanza diversediverse dada quellequelle utilizzateutilizzate perper macromacro campionicampioni..

QUANTITAQUANTITA ’’ DELLDELL ’’ AnalitaAnalita

•• costituenticostituenti principaliprincipali :: quandoquando iicostituenticostituenti sonosono presentipresenti inin ununintervallointervallo didi pesopeso relativorelativocompresocompreso tratra l'l' 11%% ee ilil 100100%%

•• costituenticostituenti minoriminori:: lele speciespeciepresentipresenti nell'intervallonell'intervallo dada 00,,0101%% aa11%%

•• costituenticostituenti inin traccetracce:: quantitquantitààcompresecomprese tratra 100100 ppmppm ((00,,0101%%)) ee11 ppbppb

•• costituenticostituenti inin ultratracceultratracce ::componenticomponenti presentipresenti inin quantitquantitààinferioreinferiore aa 11 ppbppb

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La concentrazione di soluzioni molto diluite viene espressa in parti per milione (ppm)

CCppmppm (m/m) = (m/m) = massa del solutomassa del soluto

massa della soluzione massa della soluzione x 106

Parti per milione (ppm)

Cppm (v/v) = volume del solutovolume totale della soluzione

massa del soluto, gvolume totale della soluzione, mL

Cppm (m/v) =

x 106

x 106

1 ppm (m/m)

Dicendo una parte per milione, si intende che un grammo dellasostanza in questione è presente in un milione di grammi di so luzioneo di miscela totale:

1,0 g in 1.000.000 (101,0 g in 1.000.000 (10 66) g di soluzione) g di soluzione

1 mg in 1.000 g di soluzione = 1 mg in 1Kg di soluzione

(mentre 1% m/m significava 1g per 100 g di soluzione)

Dire quindi 1ppm equivale a dire :Dire quindi 1ppm equivale a dire :

1mg di soluto in 1Kg di campione1mg di soluto in 1Kg di campione

Esempio: se si sta misurando la concentraz. di una impurezza Esempio: se si sta misurando la concentraz. di una impurezza all'interno di 1Kg di un qualsiasi materialeall'interno di 1Kg di un qualsiasi materiale e si riscontra un e si riscontra un

valore pari avalore pari a 3 mg di impurezza3 mg di impurezza èpossibile esprimere questo èpossibile esprimere questo risultato risultato con un valore di 3 ppmcon un valore di 3 ppm

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1 ppm (m/v)

significa:

1,0 g in 1.000.000 mL (10 6) di soluzione

1 mg in 1.000 mL di soluzione = 1 mg in 1L di soluzione

1 ppm (v/v)

significa:

1,0 mL in 1.000.000 mL di soluzione

1 mL in 1.000 mL di soluzione = 1 mL in 1L di soluzione

Analoghi discorsi valgono per Analoghi discorsi valgono per ppm (m/v) e ppm (v/v)

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MolteMolte procedureproceduregravimetrichegravimetriche ededalcunealcune volumetriche,volumetriche,sonosono esempiesempi didideterminazionideterminazioni didi

costituenticostituenti principaliprincipali..

LeLe determinazionideterminazioni didi costituenticostituenti inin traccetracce ee ultratracceultratracce sonosono particolarmenteparticolarmenteardue,ardue, aa causacausa delledelle interferenzeinterferenze potenzialipotenziali ee delledelle contaminazionicontaminazioni.. InIn casicasiestremi,estremi, lele determinazionideterminazioni devonodevono essereessere effettuateeffettuate inin camerecamere specialispeciali cheche sonosonomantenutemantenute pulitepulite inin modomodo meticolosometicoloso ee liberelibere dada polverepolvere ee altrialtri contaminanticontaminanti..

LaLa determinazionedeterminazione deldel HgHg nell'intervallonell'intervallo ppbppb –– ppmppm inin unun campionecampione didi11 µµLL (( ≈≈≈≈≈≈≈≈ 11 mg)mg) didi acquaacqua didi fiumefiume sarebbesarebbe unauna micromicro analisianalisi didi ununcostituentecostituente inin tracciatraccia ..

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C = 1.0 x10-3 - 1.0x10-9

Limiti di legge per numerosi microinquinanti sono bassi a volte bassissimi dell’ordine di nanogrammi e/o picogrammi. Per la

loro determinazione è, quindi necessario disporre di apparecchiature estremamente sofisticate:

Benzene 1 µg/L

PCB totali

0,00006 µg/L (2008)

Aldrin 0,0001 µg/L (2008)

0,00005 µg/L (2015)

1,2,3 tricloropropano 0,001 µ g/L

D.Lgs 31/2001Acque potabili

D.M 471/99

Acque sotterranee

D.M 376/2003

Acque superficiali

Scelta del metodo analitico in funzionedella sensibilità richiesta dai limiti di legge

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E’ possibile quindi applicare un metodo chimico classico:

ANALISI VOLUMETRICA PRECIPITOMETRICA.

I cloruri nelle acque sotterranee generalmente provengono dal contatto con minerali contenenti sali sodici o potassici (NaCl, KCl), ma possono anche essere di origine organica. In quest’ultimo caso, che può essere indice di inquinamento delle falde, si verifica in genere la contemporanea presenza a concentrazioni piuttosto elevate di ammoniaca o nitriti, derivanti dalle urine e di conseguenza presenti negli scarichi fognari civili e industriali. Un'altra fonte di ioni cloruro nelle acque potabili può essere originata dai processi di disinfezione. Le acque superficiali, invece, sono ricche di cloruri se scorrono in prossimità del mare o di zone salmastre.

Cloruri nelle acque sotterranee:Il valore di parametro stabilito dal D. Lgs. 31/01 è di 250 mg/L.

Metodiche analitiche di riferimento

Esistono numerosi metodi standard indicati, sviluppati da società scientifichesocietà scientifiche e da vari Enti nazionali e internazionali.

Per ottenere risultati confrontabili e riconosciuti dalla normativa vigente in tutti i laboratori vengono applicate procedure standardizzate (metodi ufficiali o standard riconosciuti e pubblicati).

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� Contenuti in pubblicazioni governative

- EPA (United States Environmental Protection Agency)- FDA (Food and Drug Administration)

� forniti da enti di normazione- ISO (lnternational Organization for Standardization) - ASTM (American Society for Testing Materials)- UNICHIM (Associazione per l'Unificazione del Settore

dell'Industria Chimica)

� dati da organismi di competenza- ISPRA (Istituto Superiore per la Protezione e la Ricerca Ambientale)- IRSA (Istituto ricerca sulle ACQUE)- ICRAM (Istituto Centrale per la Ricerca scientifica e tecnologica Applicata al Mare)

Metodiche analitiche di riferimento

� Rapporti ISTISAN (Rapporti forniti dall’Istituto Superiore di Sanità)

� OSHA (Occupational Safety and Health Administration = Agenzia per la sicurezza e la salute sul lavoro)

� NIOHS (National Institute for Occupational Safety and Health =Istituto nazionale per la sicurezza e la salute occupazionale)

� FARMACOPEA UFFICIALE

Ma anche:

� pubblicati nella letteratura scientifica (J- Chrom., The Analyst,….)

� Interni sviluppati dal laboratorio per proprie esigenze.

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ParametriValidazione

OSHA (Occupational Safety and Health Administration = Agenzia per la sicurezza e la salute sul lavoro

FID -Rivelatore a ionizzzazione di fiamma