ANALISI CITOFLUORIMETRICA

E SUE APPLICAZIONI IN AMBITO BIOMEDICO

ANALISI CITOFLUORIMETRICA

E SUE APPLICAZIONI IN AMBITO BIOMEDICO

Definizione

CITOFLUORIMETRIA oo CITOMETRIA A FLUSSO

Metodica di laboratorio che permette un’analisi automatica di sospensioni cellulari monodispersesospensioni cellulari monodisperse

misurando le caratteristiche citologiche e/o biochimichecaratteristiche citologiche e/o biochimiche all’interno di un flusso laminare

che interseca una sorgente luminosa, acquisendo e memorizzando piu’ parametri (volume, granulosita’, fluorescenzavolume, granulosita’, fluorescenza) per ogni cellula acquisita

Principi di funzionamento

• Sistema fluidico (focalizzazione idrodinamica)

• Sistema ottico (laser Argon 488nm)

• Sistema elettronico (software CellQuest)

Sistema Fluidico

Sistema Ottico

Sistema Elettronico

Parametri

• LIGHT SCATTERING

(Forward and Side Scatter)

• FLUORESCENZA

(FITC, PE, PerCP, Cy5.5, Alexa, Biotina, PI, APC, ...)

Light Scattering

Sangue periferico

Fluorescenza

Plot FITC/PE/Per CP

Intensita’ F proporzionale ai siti di legame

IMMUNOFLUORESCENZA

DIRETTA

Marcatori(linfocitari): la nomenclatura CD

Si considera membro di un Cluster differentiation un Marcatore di superficie che:

• identifica un particolare tipo cellulare o un certo stadio differenziativo

• ha una struttura biochimica definita

• è riconosciuto da un gruppo di MoAb diversi

Informazioni aggiornate

www.courseware.vt.edu/users/kdelgert/ (www.bsi.vt.edu/immunology)

www.ncbi.nlm.nih.gov/prow

Applicazioni

1. determinazione dei marcatori di differenziamento cellulare, di superficie, intracitoplasmatici e intranucleari

2. valutazione del contenuto cellulare di DNA

3. discriminazione tra cellule vive, cellule apoptotiche e necrotiche

4. predisposizione per la separazione cellulare

Immunofenotipo

Permette di IDENTIFICARE,NUMERARE E CARATTERIZZARE gli elementi acquisiti

in caso di antigenti specifici l’immunofenotipo può rispondere a

domande su diagnosi, prognosi

e malattia residua minima

Marcatori B-lineage

TdT

CD79a

CD19

CD10

CD20

CD22

Cu

SmIg

Marcatori T-lineage

CD7

CD2

CD5

CD3

CD1

CD4

CD8

TdT

TCR

Marcatori granulocitopoiesi

CD34

CD13

CD33

CD117

CD11b

CD16

CD66b

CD66c

CD15

Marcatori monocitopoiesi

CD34

CD13

CD33

CD14

CD11b

CD16

CD66b

CD66c

CD15

Marcatori eritrocitopoiesi

CD34

CD45

CD33

CD71

CD105

CD36

GPA

Gating

CD 45

ANTIGENE PAN LEUCOCITARIO, ovvero ESPRESSO CON CARATTERISTICA

INTENSITA’ SU LEUCICITI PERIFERICI MA ESPRESSO IN MODO ANOMALO

SU CELLULE BLASTICHE

Espressione CD45Linfociti Monociti

Cellule immature

Granulociti maturi

Granulociti immaturiEritrociti

Scelta degli antigeni e Criteri di Positività

•ALTA SENSIBILITA’ (es.CD19 nelle ALL-B)

•ALTA SPECIFICITA’ (es.CD34, CD133)

•Positività?

Characteristic phenotype of B-precursor ALL with most common chromosomal aberrations

MLL/AF4 TEL/AML1 Hyperdiploidy BCR/ABL E2A/PBX1

t(4;11) t(12;21) t(9;22) t(1;19) CD45 Dim Dim Neg Neg/dim Dim CD19 Pos Pos Pos Pos Pos CD34 Pos Pos Pos Pos/neg Neg CD22 Neg/dim Dim/pos Pos Dim/pos Pos/dim CD20 Neg Neg Dim/pos Dim/pos Dim/pos CD24 Neg Pos Pos Pos Pos CD10 Neg Pos Bright Bright Neg/dim TDT Pos Pos Pos Pos Pos cyIg Neg Neg Neg Neg Pos CD15 Often dim Neg Neg Neg Neg CD65 Often dim Neg Neg Neg Neg CD13 Mostly neg Often pos

and/or (CD33) Neg pos and/or

(CD33) Neg

CD33 neg Often pos and/or (CD13)

Neg and/or (CD13)

Neg

CD66c Neg Neg Pos Pos Neg CD9 Pos Neg NV NV Pos NG2 Pos Neg Neg Neg Neg

CD135 NV Neg NV NV NV CD25 NV NV NV Pos NV CD38 NV NV NV Dim NV

Derived from ; Antigen expression patterns reflecting genotype of acute leukemias (Review) O.Hrusak and A.Porwit-MacDonald Leukemia 2002

ALL-T

ALL-TCD1a, CD2, CD3, cyCD3, CD4, CD5, CD7, CD8, TdT ,(CD34)

ALL-B, common

ALL-B, commonCD10, CD19, CD20, CD22, CD24, CD34, DR, IgM,

cyIgM, Kappa, lambda, TdT, (CD15)

ALL-B, B matura

ALL-B, B maturaCD10, CD19, CD20, CD22, CD24, CD34, DR, IgM,

cyIgM, Kappa, lambda, TdT

LAP

LAPMPO, CD11b, CD13, CD14, CD15, CD16, CD33, CD34, DR,

CD41, CD56, CD61 (CD2)

LAPG+15 dopo terapia con ATRA

ESORDIO:popolazione blastica

G+15:popolazione matura

LAM

Midollo osseo, liquido cefalorachidiano

BM liquor

Midollo osseo, sangue periferico, liquido cefalorachidiano

BM PB liquor

Neuroblastoma

DATI RICERCA

•Ciclo cellulare e apoptosiPession et al., Targeted inhibition of NMYC by peptide nucleic acid in N-myc amplified human neuroblastoma cells: cell-cycle inhibition with induction of neuronal cell differentiation and apoptosis, Int J Oncol. 2004 Feb;24(2):265-72.

•DifferenziamentoPession et al., MLL-AF9 oncogene expression affects cell growth but not terminal differentiation and is downregulated during monocyte-macrophage maturation in AML-M5 THP-1 cells, Oncogene. 2003 Nov 27;22(54):8671-6.

VANTAGGI dell’ANALISI citofluorimetrica :

• multiparametricità• possibilità di mettere in relazione più caratteristiche

della stessa cellula• analisi di grandi quantità di cellule

• riproducibilità ed affidabilità statistica delle acquisizioni

• grande sensibilità• rapidità di analisi

• possibilità di ulteriori analisi a posteriori

Conclusioni

La citofluorimetria completa il repertorio della diagnosi emato-oncologica :

• Identifica la malattia residua minima

• Distingue la ripresa di malattia VS da iperproduzione del midollo

• Determina la presenza di malattia disseminata (ALL latente, santuari exramidollari)