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La possibilita’ di conoscere i genideriva dalla capacita’di manipolarli:

-isolare un gene (enzimi di restrizione)

-clonaggio (amplificazione) vettori

-sequenziamento

-funzione

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Il gene o la sequenza genica isolata deve

essere inserita all’interno di un vettore chepermette l’amplificazione (aumento delnumero di copie) della sequenza stessa, inmodo che il gene diventi manipolabile

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COSTRUZIONE DI VETTORI DI

CLONAGGIO

- Plasmidi (fino a 10kb)

- Vettori fagici (fino a 15 Kb)- Vettori cosmidici (fino a 45 Kb)

- BAC (basati sul fattore F di E.Coli, insertofino a 300 Kb)

- PAC (basati sul genoma fagico P1, fino a

120 Kb)- YAC cromosomi artificiali di lievito (inserto

fino a 2 Mb)

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Proprieta’ di un vettore di clonaggio

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Vettore d’espressione

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Vettori

fagicie cosmidi

Alta afficienzadi infezione e quindidi trasferimento delgene clonato

all’internodella cellula batterica

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YAC, cromosomi artificiali di lievito o minicromosomi,

inseriti nelle cellule attraverso microiniezione o liposomi,ospitano fino a500 Kb di DNA

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BACcromosomibatterici

artificiali

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Genotecao libreriagenomica

-amplificare frammentio geni

-identificare geni

-determinare nuovi geni-contiene geni nellaloro forma nativa consequenze regolative ed

introni-ogni vettore porta unpezzo del genoma, etutti i vettori insieme

rappresentano tutto ilgenoma

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Genoteca di c-DNA:genoteca di sequenze

espresse

-ogni vettore portaun c-DNA, quindiun trascritto genico,

e tutti i vettoriinsiemerappresentano tuttoil trascrittoma

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Caso 1. Si conosce la funzione del gene ma non

la sequenza genica ne’ la proteina

IDENTIFICAZIONE DEI CLONI PERCOMPLEMENTAZIONE

La complementazione funzionale è ilprocesso mediante il quale una particolaresequenza di DNA è in grado di compensare

la mancanza di una funzione in una cellulamutante, ripristinando così il fenotipoWild-type.

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Yeast to human: rescue

CDK=chinasi

ciclinadipendente

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Poiche’ conosco le sequenze a monte e a valle del pezzo digenoma clonato, mi posso costruire dei primers che

permettono di amplificre e sequenziare l’inserto

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Caso 2: se e’ nota la sequenza delgene posso costruire una sonda diDNA / RNA che andra’ ad ibridare con

la sequenza genica

Caso 3: non conosco la sequenzagenica ma conosco la sequenzaaminoacidica anche qui

costruisco una sonda a DNA/RNA,tenendo conto della degenerazione del

codice genetico

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SAGGI DI IBRIDAZIONESTANDARD E SAGGI INVERSI

• STANDARDCOLONY-BLOT

SOUTHERN BLOT

NORTHERN BLOTIBRIDAZIONE IN SITU SU TESSUTO O CROMOSOMI

• INVERSI (MARCATURA DEL TARGET)MICROARRAY DI DNA

MICROARRAY DI OLIGONUCLEOTIDI

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L’IMPIEGO DI SONDE BASATE SU ACIDI NUCLEICI E’

UNO STRUMENTO FONDAMENTALE PER LA GENETICAMOLECOLARE

SI SFRUTTA LA CAPACITA’ DELLE MOLECOLE DIACIDO NUCLEICO A SINGOLO FILAMENTO DI

FORMARE MOLECOLE A DOPPIO FILAMENTO

IBRIDAZIONE

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I SAGGI PIU’ COMUNI DI IBRIDAZIONE PREVEDONO L’USO DISONDE

SONDE:MOLECOLE DI ACIDO NUCLEICO A SINGOLO O DOPPIOFILAMENTO MARCATE

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sequenza di DNA genomico o di c-DNA

Sonda (probe) marcata di 15-100 nt

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- PER INDIVIDUARE LA PRESENZA DEL GENE CHE SI STA

CERCANDO

- PER OSSERVARE LA PRESENZA DI UN TRANSGENE INSERITO NEI

CROMOSOMI (PRESENZA O ASSENZA)

- PER OSSERVARE TRASLOCAZIONI CROMOSOMICHE

- PER OSSERVARE LE DIMENSIONI DEL TARGET (NON OSSERVABILI

CON ALTRE TECNICHE)

- PER OSSERVARE LA COLLOCAZIONE SUBCROMOSOMICA O NEL

TESSUTO O NELLA CELLULA DEL TARGET

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COLONY-BLOT

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Chromosome walkingIl risultato dello screening di una libreria di cDNA ma,

specialmente di una libreria genomica è quasi sempre

un clone che non comprende l’intero gene. Per isolare ilgene intero si utilizza una tecnica chiamata chromosomewalking. Questa tecnica presuppone che la libreria siaformata da cloni parzialmente sovrapposti tra loro. Latecnica consiste nell’utilizzare il cDNA isolato comesonda con cui si sonda una nuova libreria (di solitogenomica) Il risultato di questo screening dovrebbe daredei nuovi cloni una parte dei quali si estenderàulteriormente verso il 5’, il 3’ o entrambe le direzioni. I

cloni più esterni saranno nuovamente utilizzati comesonde per isolare nuovi cloni che si estendono al 5’ o al3’ ecosì via fino ad isolare l’intero gene.

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La reazione di amplificazione del

DNA o PCR